CN102703506A

CN102703506A - α1,2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪及其生产方法与应用

Info

Publication number: CN102703506A
Application number: CN2012100329679A
Authority: CN
Inventors: 张宇; 陈建文; 张运海; 李运生; 章孝荣; 韩春杨; 章美玲; 张远亮; 随刘才; 周娜汝; 陶佳; 吴蓉花
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2012-02-10
Filing date: 2012-02-10
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明公开了一种α1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪及其生产方法与应用。本发明针对猪α1，2-岩藻糖转移酶基因构建了RNAi慢病毒表达载体，包装慢病毒颗粒后，感染猪胎儿成纤维细胞，以该转基因细胞系为核供体，生产了基因组整合有一段α1，2-岩藻糖转移酶基因的RNAi核苷酸序列的克隆猪，为进一步研究该基因的功能以及培育抗仔猪腹泻与水肿病猪新品种奠定了基础。

Description

α1,2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪及其生产方法与应用

[技术领域]

本发明涉及一种α1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪及其生产方法与应用，属于转基因生物育种领域。

[背景技术]

在养猪业中，断奶前后断奶仔猪腹泻(post-weaning diarrehea，PWD)与水肿病(edema disease，ED)是一种重要的传染病。此病从仔猪出生到断奶这一阶段的死亡率高达11.5％～29.5％，给养猪业造成了极大地经济损失。当前一些对仔猪腹泻与水肿病的预防性措施，如提高管理水平、改善卫生环境、注射药物以及亚单位疫苗接种，尽管在一定程度上减少了病况的发生与流行，但并没有从根本上去寻求解决，找到一种全新的仔猪腹泻与水肿病的预防与控制策略迫在眉睫。从长远来看，采用遗传学方法从遗传本质上提高猪对病原的抗性，开展抗病育种具有治本的功效。产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)是引起仔猪断奶后水肿与腹泻病、生长发育不良甚至死亡的主要病原菌，其致病因子主要是肠毒素和黏附素。黏附素(adhesion)又称菌毛(fimbriae)或定居因子(colonization factor)，是ETEC菌体表面的一种纤毛样突出物，能与宿主小肠上皮细胞刷状缘相应受体结合，细菌在仔猪小肠黏膜上黏附、定居、繁殖，并产生肠毒素，通过渗透，引发组织胺的释放，导致血管壁损伤，水分大量渗出而引起水肿与腹泻病。因此，PWD和ED产生的前提条件是该细菌能否定植在宿主肠道粘膜表面，仔猪对该病原的易感性则在很大程度上取决于其小肠粘膜上皮细胞上是否存在F18菌毛的受体以及具有显性遗传特性。研究表明， α1，2-岩藻糖转移酶(α1，2-fucosyltransferas，FUT1)基因是ECF18受体蛋白基因的最佳候选基因。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达，以其周期短、效率高和低成本的优点，是研究基因功能、防治病毒、治疗疾病和改良品种制备转基因动物的理想途径之一。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA会发生降解而导致基因表达沉默。鉴于在基因沉默方面的高效性和简单性，该技术已被广泛作为探索基因功能和基因治疗等领域的工具。

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对***细胞和非***细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。目前慢病毒也被广泛地应用于RNAi的研究中，但是在哺乳动物中的研究并不多。现阶段将目的基因导入靶细胞和组织的方法主要包括真核表达质粒的转染和病毒载体介导的基因转移方法等。与真核表达质粒相比，利用高效的慢病毒***，病毒载体介导的基因转移可以整合入宿主的基因组中，具有更好的稳定性。质粒的转染效率明显低于慢病毒载体，因为质粒转染不少属于瞬时表达，目的基因常常随时间的延长而发生丢失，会随着有丝***而吸收或者导致核酸酶活性的升高，而且质粒不能转染非***细胞。慢病毒载体介导的RNAi具有高效，稳定和特异性很强的特点，它能在哺乳动物的受体细胞实现长时间稳定的效应。

为了进一步研究FUT1基因的功能以及探索一条利用RNAi技术培育抗仔猪腹泻与水肿病的猪新品种，我们针对猪FUT1基因的编码区选取了4个不同位点的片段，在Invitrogen公司商品化的载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR和 pLenti6.3/V5-DEST^TM的基础上，构建了4个关于FUT1基因的RNAi慢病毒表达载体。将构建好的真核表达载体利用脂质体共转染293T细胞，通过Real-timePCR和Western Blot的方法综合筛选出2条针对FUT1基因有效的RNAi靶位点，选取干扰效应最显著的第3个靶位点来构建慢病毒表达载体并包装成慢病毒。将该RNAi慢病毒颗粒感染梅山猪胎儿成纤维细胞，并添加一定浓度的灭稻瘟素(Blasticidin，BSD)筛选出稳定细胞系。通过体细胞核移植技术生产了基于该转基因细胞系的克隆胚胎，并选择同期发情的皖北黑猪作为待孕受体母猪，将经体外培养得到的早期胚胎植入母猪体内妊娠后，获得了α1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的克隆猪。

[发明内容]

本发明要解决的技术问题是提供一种α1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪。

本发明要解决的另外一个技术问题是提供通过转基因生物育种，生产α1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪的方法。

对于α1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪，本发明采用的技术方案是，将该猪的基因组整合了一段α1，2-岩藻糖转移酶基因的RNAi核苷酸序列，使得该基因在表达过程中发生转录后水平的沉默。

对于生产α1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪的方法，本发明采用的技术方案是，包括以下步骤：

(1)借助基因工程方法构建猪α1，2-岩藻糖转移酶基因的RNAi慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST-EmGFP-FUT1；

(2)通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出α1，2-岩藻糖转移酶基因被高效沉默的猪胎儿成纤维细胞系；

(3)利用体细胞核移植技术进行克隆猪的生产。

作为优选，上述生产方法步骤(1)的基本过程为：

以猪α1，2-岩藻糖转移酶基因的编码区作为靶位点，设计合成相应的互补的两条miRNA寡核苷酸单链，经退火形成双链后，连接到RNAi表达载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR上，并在目的片段上下游分别分别添加酶切位点Asc1和Pme1，然后PCR扩增EmGFP+FUT1片段，约930bp，连接至慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST^TM，命名为pLenti6.3/V5-DEST-EmGFP-FUT1。

本发明α1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪可用于培育抗仔猪腹泻与水肿病猪新品种。

本发明的有益效果是：

RNAi技术以其在基因沉默方面周期短、效率高和低成本的优点，是探索基因功能和基因治疗等领域的理想途径之一。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA会发生降解而导致基因表达沉默。试验首次将该技术应用于大动物体水平上探索FUT1基因的功能，以及培育抗仔猪腹泻与水肿病猪新品种的研究。

在构建慢病毒载体方面，与传统shRNA载体相比，试验通过miRNA RNAi载体***运用micro RNA(miRNA)结合更多细胞内源机制元素，在细胞中更高效的表达RNA发夹结构，实现更高效的基因沉默。质粒中含有pol II启动子，这是一种人的巨细胞病毒早期即刻启动子，可高水平构成性表达miRNA，并且能在大多数哺乳动物细胞株中表达。此外，该质粒可同时表达报告基因EmGFP和目的miRNA，所以EmGFP与miRNA的表达具有100％的相关性，这使得miRNA的表达可在任何细胞类型中进行示踪。

以该转基因细胞系作为供体细胞进行核移植，所获得的克隆胚胎经验证可以在体外培养发育至囊胚，并与对照组相比无显著差异。最后，选择重构后经体外培养得到的早期胚胎植入待孕受体母猪妊娠，获得了8头转基因克隆猪，且转基因的阳性率为100％，为进一步研究FUT1基因的功能以及培育抗仔猪腹泻与水肿病猪新品种奠定了基础。

[具体实施方式]

一.FUT1基因RNAi片段的设计与表达载体构建

登陆网址http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnai express/，使用Invitrogen公司的在线设计软件Invitrogen′s RNAi Designer，将猪FUT1基因编码区的核苷酸序列(GeneBank登录号：U70883.2)输入。软件给出10个长度为21nt的片段序列，起始位点不同，以星级数提示对此靶点的作用潜力。使用BLAST排除和其他编码序列/EST同源的序列，使得设计的靶mRNA与猪细胞内已知的任何基因没有同源性，从而尽量排除shRNA非特异性抑制其它基因片段的可能。从中选取4个最佳片段和并一段不针对任何基因的阴性对照片段，并依次命名为FUT1-1、FUT1-2、FUT1-3、FUT1-4以及NC。

合成相应的互补的两条miRNA寡核苷酸单链，互补的miRNA寡核苷酸单链经退火形成双链，BsaI酶切Invitrogen公司商品化的pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miRRNAi表达载体，用T4DNA连接酶连接退火形成的双链与酶切后的质粒载体，转化、摇菌、提取质粒并测序，分别构建成pcDNA6.2-EmGFP-FUT1-1，pcDNA6.2-EmGFP-FUT1-2，pcDNA6.2-EmGFP-FUT1-3，pcDNA6.2-EmGFP-FUT1-4和pcDNA6.2-EmGFP-NC载体。

二.FUT1基因过表达载体的构建

根据猪FUT1基因序列的编码区设计引物，上游引物FUT1-F1：5′GTCAgaattcGCCACCATGTGGGTCCCCAGCCG 3′，带有EcoRI酶切位点，下游引物 FUT1-R1：5′GAATgtcgacGAAGGCCCAGCCAACATCTG 3′，带有SalI酶切位点。以Trizol法提取新鲜的猪肺脏组织总RNA，并以此为模板进行RT-PCR，PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃30s，60℃30s，68℃1min，共30个循环，最后68℃延伸10min。将PCR扩增的FUT1基因片段与真核表达载体pEGFP-N1分别用EcoRI和SalI进行双酶切，纯化后，T4DNA连接酶进行连接，转化至大肠杆菌DH5α，菌液PCR鉴定阳性克隆，抽提质粒进行酶切鉴定，将菌液PCR和酶切鉴定均呈阳性的样品送至生物公司进行测序，保留测序正确的克隆。

三.RNAi有效靶点的筛选

转染前一天，利用胰蛋白酶消化293T细胞，接入24孔板，分别使细胞置于500μl的DMEM+10％FBS培养基，5％CO₂、95％湿润空气、37℃培养。转染前细胞调整至80％的培养密度，转染当天，从293T细胞中移除培养基，分别换上新鲜的400μl DMEM+10％FBS培养基(不含抗生素)，37℃孵育。

1)RNAi有效靶点mRNA水平的筛选

a)0.1μg过表达载体与0.7μg的4个干扰载体及阴性对照pcDNA6.2-NC与50μl opti MEM混匀后，室温放置5min；b)10μl Lipofec tamin^TM2000加入到250μl不含抗生素和血清的opti MEM培养基，混匀后，室温放置5min；c)二者混合后室温放置20min；37.5℃，5％CO2培养箱培养4-6h，更换培养基为含10％FBS的DMEM培养基。转染48h后，荧光显微镜观察细胞的转染效率。Trizol法裂解细胞，提取RNA，反转录成cDNA，使用SYBR Green荧光定量PCR法检测各个干扰载体的干扰效率。PCR条件为：95℃2min，95℃20s，58℃15s，72℃20s，共30个循环。PCR结束后，进行熔解曲线实验，升温温度从60℃到95℃。用2^-ΔΔCt法进行基因表达的相对定量，外源验证各靶位点在mRNA水平的干扰效率。

2)RNAi有效靶点蛋白水平的验证

将已成功构建好的RNAi载体和阴性对照载体pcDNA6.2-EmGFP-NC用DraI单酶切，切除原有载体中的EmGFP，电泳回收大片段，并将该片段进行自连，转化至大肠杆菌DH5α，进行菌液PCR鉴定，抽提质粒进行测序鉴定，构建成了不含有EmGFP基因的四个RNAi载体和pcDNA6.2-NC载体。转染前一天，利用胰蛋白酶消化293T细胞，接入6孔板，分别使细胞置于2ml DMEM+10％FBS培养基，5％CO₂、95％湿润空气、37℃培养。

转染前保证细胞培养密度达到80％，转染当天，从293T细胞中移除培养基，分别换上新鲜的1.5ml DMEM，37℃孵育。a)0.5μg过表达质粒与3.5μg的4个干扰载体及阴性对照pcDNA6.2-NC与250μl DMEM混匀后，室温放置5min；b)20μl Lipofectamin^TM2000加入到480μl不含抗生素和血清的DMEM培养基，混匀后，室温放置5min；c)二者混合后室温放置20min；37.5℃，5％CO2培养箱培养4-6h，更换培养基为含10％FBS的DMEM培养基。转染72h后，荧光显微镜观察细胞的转染效率。裂解细胞中的总蛋白，对其进行Western blot，外源验证各靶位点在蛋白水平的干扰效率。

四.RNAi有效靶点慢病毒表达载体的构建

设计引物，在目的片段上下游分别分别添加酶切位点Asc1和Pme1，以干扰效应最显著的3号靶位点片段的pcDNA6.2-EmGFP-FUT1-3载体为模板，PCR扩增EmGFP+FUT1-3片段，约930bp。PCR反应条件：95℃预变性3min，94℃30s，56℃30s，68℃1min，共30个循环，最后68℃延伸10min。回收PCR产物，连接至酶切后的Invitrogen公司商品化的慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST^TM，转化、摇菌、提取质粒并测序验证，构建成pLenti6.3/V5-DEST-EmGFP-FUT1-3载体。

五.RNAi载体的慢病毒包装

复苏早代次的293T细胞(代数低于20代)于10cm皿中，转染前调整细胞融合度至80％，按1∶5的比例传至15个poly-(D-lysine)(PDL)包被的10cm皿中，10ml(DMEM+10％FBS+1％P/S)培养液，37℃、5％CO₂细胞培养箱中继续培养约24h。转染前的2-3h，将培养基换成5ml不含抗生素的DMEM+10％FBS。转染时，无菌离心管内加入250μl无血清与抗生素的opti MEM培养基，然后向其中加入所制备的各DNA溶液，即慢病毒表达质粒6μg、包装质粒Lentiviral Packaging Mix 6μg，混合均匀。在另一无菌离心管中加入250μl无血清的DMEM培养基，向其中加入Lipofectamine 2000转染试剂24μl，轻轻混匀，室温下温育5分钟。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。混匀后，在室温下温育20分钟，37.5℃，5％CO2培养箱培养4-6h，更换培养基为含10％FBS的DMEM培养基。转染48h后，收集293T细胞上清液(第一次收液)。细胞更换新鲜的完全培养基，继续培养至72-80h，收集病毒上清，与第一次收集的混合，4℃、3000rpm离心10min，除去细胞碎片以0.45μm醋酸纤维素膜的滤器过滤上清液，得到慢病毒液，1ml/管进行分装，-80℃保存。

六.猪胎儿成纤维细胞转基因细胞系的建立

将处于对数生长期的目的细胞进行胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。将细胞悬液(细胞数约为5×10⁴)接种于6-well中，37℃、5％CO₂浓度的培养箱培养细胞至密度达到约80％。根据最佳MOI值测定的结果选择合适的MOI值，加入适宜量的慢病毒，同时加入浓度终为6μg/ml的Polybrene增强感染，24h后换成没有病毒和Polybrene的完全培养基继续培养，感染48-72h后观察细胞中EmGFP的表达情况，并拍照记录感染结果。选择荧光率较高的细胞，加入终浓度为 8μg/ml的Blasticidin进行药物筛选，持续观察细胞的生长情况，筛选前期由于细胞大量死亡会释放有害物质，因此需每1-2天换一次培养基。在加药后的5天左右，细胞数量锐减，此后可2-3天换液一次，持续筛选2周后，把抗生素浓度降到筛选浓度的50％进行维持培养，约2-3周后将稳转的细胞扩增，得到的细胞一部分进行冻存为后续的实验做准备，一部分收样进行检测。

七.目的片段整合鉴定与FUT1基因RNAi效率的检测

分别对建立的非转基因细胞和慢病毒感染的细胞用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，PCR检测目的基因在转基因细胞中的整合情况。PCR反应条件为：94℃3min，94℃30s，58℃30s，72℃10s，共35个循环。

Primer Express 3.0软件以跨内含子的方式设计FUT1基因引物、内参基因HPRT1引物。分别对慢病毒感染的3组细胞即RNAi组、阴性对照组以及空白对照组用Trizol裂解提取总RNA，并经RNA-free DNaseI处理，以避免基因组DNA污染，然后反转录为cDNA，RT-PCR验证退火温度，使用SYBR Green荧光定量PCR法检测各个载体的干扰效率。PCR条件为：95℃预变性10min，95℃15s，60℃1min，共30个循环。PCR结束后，进行熔解曲线分析，升温温度从60℃到95℃。用2^-ΔΔCt法进行基因表达的相对定量。

九.转基因克隆胚胎的生产与移植

体外成熟的猪***脱除卵丘后，在体视镜下挑选排出第一极体且卵周隙明显的***，同时用显微操作液TCB(HEPES缓冲的含7.5μg/mlCB，2％FBS的TCM199)洗涤准备的体细胞，将***和转基因细胞一起放入显微操作碟的核移植操作液TCB中，并将操作碟置于装有38.5℃恒温热台的显微操作台。去核采用盲吸法，即用固定针吸持***，用注射针拨动使***使极***于5点处，去核针从3点钟位置进针，吸取第一极体及其周围约1/5-1/4可能含有***核的胞质，之后用去核针吸取转基因细胞(直径约15-20μm，折光性强，圆形，光滑的)，从去核切口进入***透明带下注入，轻轻点压透明带，使体细胞与胞质膜紧密接触。操作完后将重构卵转移到石蜡油覆盖好的T2液滴中，在38.5℃的恒温箱中中恢复30min。融合和化学辅助激活：将T2中已恢复好的重构卵在化学辅助激活液(PZM-3+10μg/mL CHX+10μg/mL CB)激活10min，然后分批移入融合/激活液中洗涤3遍，每批10枚放入已经铺满融合液的融合槽内，用拉制的很细的实心玻璃针拨动重构胚胎，使供体细胞-受体***膜接触面与与电场方向垂直，用CF-150B融合仪(BLS，匈牙利)施加单个156v/mm，100μs的直流电脉冲诱导融合同时电激活，随后用T2(HEPES缓冲的含2％FBS的TCM199)培养液洗涤3遍，立即转入盖矿物油的T2中，30min后在体视镜下判定融合。将融合的重构胚用胚胎培养液洗涤3遍后转入预平衡4h以上的胚胎培养滴PZM3内，每个培养滴50μl培养10-15枚胚胎。在38.5℃、5％CO₂、100％湿度条件下培养，胚胎发育至二细胞、四细胞期时，选择同期发情的皖北黑猪作为待孕受体母猪进行胚胎移植。

Claims

1.α2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪，其特征在于，该猪的基因组整合了一段α1，2-岩藻糖转移酶基因的RNAi核苷酸序列，使得该基因在表达过程中发生转录后水平的沉默。

2.根据权利要求1所述猪的生产方法，包括以下步骤：

(3)利用体细胞核移植技术进行克隆猪的生产。

3.根据权利要求2所述的生产方法，所述步骤(1)的基本过程为：

4.α1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪在培育抗仔猪腹泻与水肿病猪新品种中的应用。