CN101905020B - 一种猪瘟活疫苗的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪瘟活疫苗的生产方法。本发明包括以下技术步骤：(1)猪瘟兔化弱毒株的克隆与鉴定；(2)克隆株种毒的繁殖；(3)生产用细胞的繁殖；(4)生产用病毒液的繁殖；(5)配苗、分装和冻干。本发明具有生产工艺简单、稳定，病毒免疫原性和遗传稳定性好，外源病毒污染风险小，检验方便，生产成本低等特点，利用本发明生产的猪瘟活疫苗遗传稳定性好、纯净性高、免疫原性强。
Description
技术领域
本发明涉及猪瘟活疫苗的生产方法，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性、致死性的猪传染病，在世界上很多国家和地区均有发生，给畜牧业生产带来了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为法定通报性疫病，我国将其划为一类动物传染病。
目前世界上主要有3种效果较好的猪瘟活疫苗，即日本的GPE株、法国的Thiverval株和中国的兔化弱毒株(C株)，其中兔化弱毒株应用最为广范并为世界上许多国家猪瘟的控制和消灭做出了重要贡献。目前，我国也实行强制免疫猪瘟弱毒活疫苗作为控制猪瘟的主要手段。
虽然三种疫苗均能有效用于猪瘟防制，但也都存在着一定不足。其中GPE株、Thiverval株是用猪源传代细胞系生产的，其存在已知或未知外源病毒污染的风险较大，一旦控制不好，很容易导致某种已有的或新发现的传染病大面积流行。其中兔化弱毒活疫苗目前有两种生产工艺，第一种工艺是用兔体生产，取接种家兔的组织或***或脾脏制苗，该工艺可以有效避免外源病毒污染，同时保证了病毒的遗传稳定性，病毒毒力不返强，但需要使用大量家兔，质量控制难度较高且生产成本较高；第二种工艺是应用牛、羊原代细胞或猪传代细胞生产，该工艺避免大量使用实验动物，但存在外源病毒污染的风险(因为牛、羊原代细胞或猪传代细胞对很多已知或未知的外源病毒易感)并且病毒遗传稳定性稍差，病毒有独立返强的风险。另外，猪瘟兔化弱毒是经过兔体连续传代驯化而成的，种毒并未经过克隆纯化，因次不同批次的种毒对同一批家兔或同一批次的种毒对不同批次的家兔感染性和免疫原性往往存在一定差异。由此可见，亟需一种新的猪瘟活疫苗生产工艺来克服已有的几种疫苗存在的不足。
发明内容
本发明的目的是克服猪瘟活疫苗现有生产工艺的不足之处，提供一种用克隆化猪瘟兔化弱毒种毒接种兔源细胞或常用细胞进行细胞培养，收获病毒液生产猪瘟活疫苗的方法。该方法具有生产工艺简单、易于质量控制、外源病毒污染风险小、生产成本低等特点。利用本发明生产的猪瘟活疫苗遗传稳定性好、纯净性高、病毒效价高、免疫原性强。本发明是用猪瘟兔化弱毒株病毒经过病毒基因拯救技术获得的一株猪瘟兔化弱毒克隆株CSFV CC-2，该病毒株已于2010年7月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4059，将CSFV CC-2通过兔源细胞和/或常用细胞进行细胞培养，收获病毒液；将收获的病毒液加入常用的冻干保护剂，充分混合后分装后经冷冻真空干燥而制成冻干活疫苗，每头份含毒量不低于6000TCID50或400RID。包括以下技术步骤：
1猪瘟兔化弱毒的克隆与鉴定
CGMCC No.4059猪瘟兔化弱毒克隆株病毒是通过应用病毒基因拯救法将猪瘟兔化弱毒进行克隆，获得高度适应兔源细胞或常用细胞、基因型单一并且能稳定遗传的纯系猪瘟兔化弱毒株病毒。
1.1猪瘟兔化弱毒的克隆
用病毒基因拯救法进行。
(1)病毒RNA提取：RNA提取试剂盒提取猪瘟兔化弱毒细胞培养液的总RNA；
(2)全基因组cDNA克隆：
①设计几对引物分别进行RT-PCR扩增，分别进行纯化、回收，电泳检测扩增产物；
②将PCR产物分别克隆到载体上，转化感受态细胞；
③挑取转化成功的菌落，大量培养，提取重组质粒，双向测序鉴定；
④将重组质粒，酶切，纯化；
⑤将纯化产物连接，得到全基因组cDNA；
⑥将全基因组cDNA克隆到载体上，转化感受态细胞；
⑦筛选重组载体，扩大培养，提取重组质粒，酶切，纯化，得到大量全基因组cDNA；
(3)体外RNA转录；
(4)体外RNA脂质体转染细胞；
(5)培养传代，荧光抗体检测呈阳性，则克隆成功，命名为CSFV CC-2(该病毒株已于2010年7月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.4059)；
1.2克隆株的鉴定
经鉴定，克隆株CSFV CC-2具有以下特性：
(1)对细胞的适应性：将CSFV CC-2接种兔源细胞进行细胞培养并取样测定毒价，经转瓶培养最高毒价≥106.0TCID50/0.1ml，经微载体或悬浮培养最高毒价≥106.8TCID50/0.1ml；将CSFV CC-1接种常用细胞进行细胞培养并取样测定毒价，经转瓶培养最高毒价≥105.0TCID50/0.1ml，经微载体或悬浮培养最高毒价≥106.0TCID50/0.1ml；
(2)遗传稳定性：将CSFV CC-2经兔源细胞连续传代并进行基因序列测定，第30代与第1代克隆化种毒核苷酸同源性为99.9％，氨基酸同源性为100％；将CSFV CC-2经常用细胞连续传代并进行基因序列测定，第30代与第1代克隆化种毒核苷酸同源性为99.5％，氨基酸同源性为99.9％；
(3)生物学特性：将CSFV CC-2进行猪瘟抗体抑制试验，猪瘟抗体能特异性抑制该种毒的荧光产生；将CSFV CC-2以15TCID50(或1RID)/只的剂量静脉接种健康家兔，结果95％产生定型热或轻型热；
(4)免疫原性：将CSFV CC-2以150RID/只的免疫剂量肌肉接种非免疫健康猪，抗体平均最高滴度达到1∶128，平均持续时间为400d；免疫后2周攻1ml猪瘟石门血毒(105MLD/1ml)，100％保护，最高体温≤41％且持续不超过3d；
(5)安全性：将CSFV CC-2(≥105.0TCID50/0.1ml)10ml注射家兔、100ml注射猪、5ml注射豚鼠、1ml注射小鼠均不引起死亡；
2疫苗的制备
2.1种毒的繁殖
将CSFV CC-2种子批种毒接种生长良好的兔源细胞或常用细胞的种子批细胞，培养3～4天后收毒，作为生产用种毒；
种毒检验：按《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版三部.中国农业出版社，2006，本发明文件中简称为《中国兽药典》)进行检验，应符合无菌检验和外源病毒检验标准规定；
2.2生产用细胞的传代与培养
种子批细胞经消化、分散后，进行细胞培养，形成单层或生长至合适密度时，用于继续传代或接种病毒；
细胞检验：按《中国兽药典》规定进行检验，应符合生产、检验用细胞标准规定；
2.3生产用病毒液的繁殖
将生产种毒接种生长良好的生产用细胞，进行细胞培养，3～4天后收获病毒液，-15℃以下保存；
生产用病毒液检验：按《中国兽药典》规定进行检验，应符合无菌检验和外源病毒检验标准规定；并且每ml含毒量不少于60000(或4000RID)；
2.4配苗、分装和冻干
将检验合格的病毒液，加入适当稳定剂和抗菌素，混匀，定量分装，每头份含毒量不低于6000TCID50(或400RID)，冷冻真空干燥即成；
成品检验：按《中国兽药典》规定进行检验，应符合无菌检验和外源病毒检验标准规定；用10头份注射敏感子猪，应不引起明显症状；每头份含毒量不少于6000TCID50(或400RID)。
本发明涉及的一些专用词的界定：
1.兔源细胞：是指兔原代细胞或传代细胞；
2.常用细胞：是指牛睾丸原代细胞、羊睾丸原代细胞、羊肾原代细胞、牛BT细胞系、猪SK-6细胞系、猪ST细胞系、猪PK-15细胞系、猪IBRS-2细胞系；
3.细胞培养：是指细胞在适宜的温度和密度下，经转瓶培养或细胞微载体培养或细胞悬浮培养。
本发明的积极意义
本发明通过将猪瘟兔化弱毒克隆，获得高度适应细胞并且能稳定遗传的纯系种毒，再接种细胞进行细胞培养，生产病毒液，最后配苗、分装、冻于。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)相对于已有技术，本发明克隆、纯化了种毒，保证了种毒的遗传和生物表现型的单一性，提高了疫苗的遗传稳定性和生物安全性；
(2)相对于已有技术，本发明克隆、纯化了种毒，生产的病毒液毒价更高，单位体积内的疫苗有效成分含量更高；
(3)相对于已有技术，本发明克隆、纯化了种毒，疫苗免疫原性更稳定、可靠；
(4)相对于已有的兔体制苗技术，本发明避免了饲养动物、观测动物等长时间、高强度劳动，降低了生产成本，同时降低了细菌、霉菌和支原体污染的风险。
附图说明
图1猪瘟病毒兔化弱毒株(细胞源)7个cDNA片段。
图2图中箭头所示猪瘟病毒兔化弱毒株(细胞源)克降后在RK-13细胞上的荧光染色斑。
具体实施例
本发明的实施例为进一步描述本发明的技术方案，但不构成对本发明的限制。
实施例1猪瘟兔化弱毒的克隆与鉴定
1.猪瘟兔化弱毒的克隆
用病毒基因拯救法进行。
(1)病毒RNA提取：用TRIzol Reagent试剂盒(购自Invitrogen公司)提取猪瘟兔化弱毒细胞培养液的总RNA；
(2)全基因组cDNA克隆：
1)设计7对引物(序列1～14，表1)分别进行RT-PCR扩增，其扩增产物分别进行纯化、回收，琼脂糖电泳检测扩增产物(图1)，结果出现目标条带，表明扩增成功；
表1用于扩增猪瘟病毒兔化弱毒株(细胞源)全基因组的引物序列
2)将纯化回收的目的基因片段分别克隆至pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)，转化感受态大肠杆菌JM109(购自Promega公司)；
3)转化后的大肠杆菌涂布于含有X-Gal和IPTG的AMP+ LB琼脂平板，37℃培养12～16h；随机挑取3-4个自色单菌落，接种于AMP+ LB液体培养基，37℃振荡培养12～16h；用Wizard Plus Minipreps DNA Purification System试剂盒(购自Promega公司)提取重组质粒，送至北京华大中生科技发展有限公司双向测序鉴定，结果与设计的目的基因片段序列一致。
4)大量培养转化的大肠杆菌，用试剂盒大量提取重组质粒，分别用核酸内切酶(购自NEB公司)酶切，纯化；
5)将纯化产物依次用T4DNA连接酶(购自NEB公司)连接，得到全基因组cDNA；
6)将全基因组cDNA克隆到pGEM-T Easy载体上，转化感受态大肠杆菌JM109；
7)转化后的大肠杆菌涂布于含有X-Gal和IPTG的AMP+ LB琼脂平板，37℃培养12～16h；随机挑取3-4个白色单菌落，接种于AMP+ LB液体培养基，37℃振荡培养12～16h；用试剂盒提取重组质粒，送公司双向测序鉴定，结果与目标序列一致。
8)将转化后的大肠杆菌扩大培养，大量提取重组质粒，用核酸内切酶酶切，纯化，得到大量全基因组cDNA；
(3)体外RNA转录：ATP溶液2μl、CTP溶液2μl、GTP溶液2μl、UTP溶液2μl、10×Reaction Buffer 2μl、线性化模板DNA 3μg、酶混合液2μl，加无Rnase水补充至20μl；在PCR仪中，39℃反应2h；
(4)体外RNA脂质体转染细胞：将6孔细胞板长满80％左右的RK-13细胞；用Opti-MEM培养基(购自GIBCO公司)小心稀释转录RNA；将10μl LipofectamineTM 2000(购自GIBCO公司)加入到240μl Opti-MEM培养基中，轻柔混合，室温下孵育5min；再与稀释的RNA轻柔混均，室温下孵育20min；将转染混合液加入到漂洗过的6孔细胞板中，轻柔摇动培养板，使混合液完全覆盖细胞表面，放入37℃的5％CO2培养箱中作用6h；细胞单层用MEM(无双抗、无血清)培养液漂洗三遍，加入1％MEM培养液(无双抗)，置于37℃的5％CO2培养箱中培养72h；
(5)培养传代：按常规方法将转染后的病毒液盲传2～3代，用猪瘟荧光抗体检测，结果呈阳性(图2)，则表明克隆成功，命名为CSFV CC-2；
2.克隆株的鉴定
经鉴定，克隆株CSFV CC-2具有以下特性：
(1)对细胞的适应性：将CSFV CC-2接种RK-13细胞进行细胞培养并取样测定毒价，经悬浮培养最高毒价≥106.8TCID50/0.1ml；
(2)遗传稳定性：将CSFV CC-2经RK-13细胞连续传代并进行基因序列测定，第30代与第1代克隆化种毒核苷酸同源性为99.9％，氨基酸同源性为100％；
(3)生物学特性：将CSFV CC-2进行猪瘟抗体抑制试验，猪瘟抗体能特异性抑制该种毒的荧光产生；将CSFV CC-2以15TCID50(或1RID)/只的剂量静脉接种健康家兔，结果95％产生定型热或轻型热；
(4)免疫原性：将CSFV CC-2以150RID/只的免疫剂量肌肉接种非免疫健康猪，抗体平均最高滴度达到1∶128，平均持续时间为400d；免疫后2周攻1ml猪瘟石门血毒(105MLD/1ml)，100％保护，最高体温≤41％且持续不超过3d；
(5)安全性：将CSFV CC-2(≥105.0TCID50/0.1ml)10ml注射家兔、100ml注射猪、5ml注射豚鼠、1ml注射小鼠均不引起死亡；
实施例2疫苗的制备
1.种毒的繁殖
将CSFV CC-2种子批种毒接种生长良好的RK-13种子批细胞，培养3～4天后收毒，作为生产用种毒；
种毒检验：按《中国兽药典》规定进行检验，结果符合无菌检验和外源病毒检验标准规定；
2.生产用细胞的传代与培养
种子批细胞RK-13经消化、分散后，进行细胞悬浮培养，生长至合适密度时，用于继续传代或接种病毒；
细胞检验：按《中国兽药典》规定进行检验，结果符合生产、检验用细胞标准规定；
3.生产用病毒液的繁殖
将生产种毒接种生长良好的生产用细胞，进行细胞悬浮培养，3～4天后收获病毒液，-15℃以下保存；
生产用病毒液检验：按《中国兽药典》规定进行检验，结果符合无菌检验和外源病毒检验标准规定；并且每ml含毒量＞60000TCID50(或4000RID)；
4.配苗、分装和冻干
将检验合格的病毒液，加入适当稳定剂和抗菌素，混匀，定量分装，每头份含毒量不低于6000TCID50(或400RID)，冷冻真空干燥即成；
成品检验：按《中国兽药典》规定进行检验，结果符合无菌检验和外源病毒检验标准规定；用10头份注射敏感子猪，结果不引起明显症状；每头份含毒量＞6000TCID50(或400RID)。
实施例3疫苗的制备
1.种毒的繁殖
将CSFV CC-2种子批种毒接种生长良好的SK-6种子批细胞，培养3～4天后收毒，作为生产用种毒；
种毒检验：按《中国兽药典》规定进行检验，结果符合无菌检验和外源病毒检验标准规定；
2.生产用细胞的传代与培养
种子批细胞SK-6经消化、分散后，进行细胞悬浮培养，生长至合适密度时，用于继续传代或接种病毒；
细胞检验：按《中国兽药典》规定进行检验，结果符合生产、检验用细胞标准规定；
3.生产用病毒液的繁殖
将生产种毒接种生长良好的生产用细胞，进行细胞悬浮培养，3～4天后收获病毒液，-15℃以下保存；
生产用病毒液检验：按《中国兽药典》规定进行检验，结果符合无菌检验和外源病毒检验标准规定；并且每ml含毒量＞60000TCID50(或4000RID)；
4.配苗、分装和冻干
将检验合格的病毒液，加入适当稳定剂和抗菌素，混匀，定量分装，每头份含毒量不低于6000TCID50(或400RID)，冷冻真空干燥即成；
成品检验：按《中国兽药典》规定进行检验，结果符合无菌检验和外源病毒检验标准规定；用10头份注射敏感子猪，结果不引起明显症状；每头份含毒量＞6000TCID50(或400RID)。
Claims (2)
1.一种猪瘟活疫苗的生产方法，其特征是用猪瘟兔化弱毒株病毒经过病毒基因拯救技术获得的一株猪瘟兔化弱毒克隆株CSFV CC-2，该病毒株已于2010年7月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4059，将CSFV CC-2通过常用细胞进行细胞培养，收获病毒液；将收获的病毒液加入常用的冻干保护剂，充分混合后分装后经冷冻真空干燥而制成冻干活疫苗，每头份含毒量不低于6000TCID50或400RID。
2.按照权利要求1所述的一种猪瘟活疫苗的生产方法，其特征是制备猪瘟活疫苗所用一株CGMCC No.4059猪瘟兔化弱毒克隆株病毒是通过应用病毒基因拯救技术将猪瘟兔化弱毒进行克隆，获得高度适应常用细胞、基因型单一并且能稳定遗传的纯系猪瘟兔化弱毒株病毒。
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