CN102695526A - 用于神经元特异性的体内连续dopa合成的新型病毒载体构建体 - Google Patents

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安德斯·比约克伦德
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Abstract

本发明涉及包含编码两种多肽的序列的单载体表达***，所述两种多肽诸如酪氨酸羟化酶(TH)和GTP-环化水解酶1(GCH1)。这两种多肽可应当优选地以3∶1至15∶1之间，诸如3∶1至7∶1之间的比率表达。本发明可用于治疗儿茶酚胺缺乏症，诸如多巴胺缺乏症包括但不限于帕金森氏病。此外，本发明提供了递送载体构建体的方法，以便将儿茶酚胺产生增加限制在有需要的细胞中。

Description

用于神经元特异性的体内连续DOPA合成的新型病毒载体构建体
本申请是要求申请号为61/259,502的美国临时申请优先权的国际申请。本申请中引用的所有专利和非专利文献都以它们的全部内容通过引用合并至本文中。
技术领域
本发明涉及包含编码将在靶细胞中差异表达的两种多肽的多核苷酸序列的病毒载体构建体，尤其是单rAAV载体构建体。本发明还涉及包含所述载体的药物组合物，以及至人脑组织的递送，并涉及所述载体用于治疗与儿茶酚胺功能失调相关的疾病的医疗用途。具体地，本发明涉及对多巴胺缺乏相关的疾病，诸如帕金森氏病和相关功能障碍的治疗。
背景技术
帕金森氏病侵害30岁以上年龄的人。平均发病年龄为约60岁。主要的临床症状是强直、运动迟缓和静止性震颤。另外，该疾病可以表现出一系列其他症状诸如低血压、认知损害、姿势不稳定和许多其他症状。
该疾病主要是由大脑中黑质纹状体多巴胺能***(使用多巴胺(DA)作为其信号传导物质的神经细胞，位于脑干的黑质中，投射到壳核和尾状核)的变性引起的基底神经节功能障碍。该功能障碍在多年的时间内是进行性的。
目前的治疗标准基于通过添加L-多巴(其在脑中转化为多巴胺)，或其他多巴胺受体刺激剂替代多巴胺。尽管目前针对多巴胺缺乏的替代的治疗策略在疾病的早期阶段经常非常有效(至多达7-10年)，但最终大多数患者开始经历逐减的治疗反应和渐增的不良事件。这些中问题最大的是L-多巴诱发的运动障碍，该运动障碍似乎是采用目前的首选药，L-多巴，或多巴胺激动剂治疗所导致的。由于归因于近年来治疗的改进，患有帕金森氏病的患者往往带病存活越来越长的时间，L-多巴诱发的运动障碍尤其是对于疾病早发的患者带来了越来越多的问题。目前对于运动障碍的治疗选择很少，并且这些治疗经常很复杂，并且其使用有限制。
已经在帕金森氏病的临床前动物模型中进行测试的一种方式是通过使用基因治疗方式在多巴胺缺乏最多的壳核和尾状核中获得局部多巴胺替代来改进经典的药理学多巴胺替代策略。该方式称为“酶替代策略”。此治疗的基本原理来源于对帕金森氏病(PD)患者的临床观察，所述临床观察提示由口服L-DOPA药物治疗诱发的严重异常不主运动(即，运动障碍)可以通过经由静脉内或十二指肠途径输注L-DOPA或DA激动剂来缓解。因此，目前的假说是运动障碍的发展至少部分归因于口服L-DOPA递送模式所产生的DA的间断性脉冲式供应。这些患者还通过大幅度减少在“关闭”状态所花费的总时间而从连续DA刺激受益。
对于多巴胺的产生三种不同的酶是必不可少的，即，酪氨酸羟化酶(TH)，GTP-环化水解酶1(GCH1)和芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)。前两种调控由酪氨酸(一种膳食氨基酸)产生L-DOPA，而AADC将L-DOPA转化为多巴胺。这些酶中没有一种对于多巴胺能神经元是独特的，而是也可以存在于非-多巴胺能细胞中。将这些酶添加至去神经支配的靶区域可以导致局部产生L-DOPA或多巴胺。相对于常规的口服治疗(其中L-DOPA血浆水平(以及脑水平)是波动的)，这种策略的优势可以是其提供L-DOPA的持续产生。其还将治疗局部化在需要替代的脑区域，而身体的其他部分不“被治疗”，产生有利的效应与副作用比。
下面的评论提供了已发表的使用这种方式的临床前数据：
1.通过使用多rAAV载体的转导可以在壳核和尾状核中获得所有三种基因
的表达[Kaplitt MG，et al：Long-term gene expression and phenotypiccorrection using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain；Nat Genet 1994 8 148-54；Mandel RJ，et al：Characterization of intrastriatalrecombinant adeno-associated virus-mediated gene transfer of human tyrosinehydroxylase and human GTP-cyclohydrolase I in a rat model of Parkinson′sdisease；J Neurosci 1998 18 4271-84；Shen Y，et al：Triple transduction withadeno-associated virus  vectors expressing tyrosine hydroxylase，aromatic-L-amino-acid decarboxylase，and GTP cyclohydrolase I for genetherapy of Parkinson′s disease；Hum Gene Ther 2000111509-19].
2.TH的效力取决于GCH1(其产生辅因子四氢生物蝶呤，BH4)。Mandel及其同事已经通过使用微量透析测量L-多巴的水平证明了此机制[Mandel RJ，et al：Characterization of intrastriatal recombinant adeno-associatedvirus-mediated gene transfer of human tyrosine hydroxylase and human GTP-cyclohydrolase I in a rat model of Parkinson′s disease；J Neurosci 1998 184271-84].
3.在帕金森氏病的猴模型(MPTP-模型)中，AADC的表达可以导致口服L-多巴更有效的转化，并且通过此机制改善了猴UPDRS运动评分(UPDRS是帕金森症状的标准临床评价量表)中的功能[Bankiewicz KS，et al：Long-term clinical improvement in MPTP-lesioned primates after genetherapy with AAV-hAADC；Mol Ther 2006 14 564-70].
4.所有三种基因的表达可以导致帕金森氏病的大鼠模型[Shen Y，et al：Tripletransduction with adeno-associated virus vectors expressing tyrosinehydroxylase，aromatic-L-amino-acid decarboxylase，and GTP cyclohydrolaseI for gene therapy of Parkinson′s disease；Hum Gene Ther 2000 11 1509-19]和猴模型[Muramatsu S，et al：Behavioral recovery in a primate model ofParkinson′s disease by triple trahsduction of striatal cells withadeno-associated viral vectors expressing dopamine-synthesizing  enzymes.Hum Gene Ther 2002 13 345-54]两种模型中改善的功能。
5.TH和GCH1的表达足以获得可以导致帕金森氏病的大鼠模型中功能改善的纹状体L-多巴水平并且还可以显著地减少L-多巴诱发的运动障碍[Kirik D，et al：Reversal of motor impairments in parkinsonian rats bycontinuous intrastriatal delivery of L-dopa using rAAV-mediated genetransfer；Proc Natl Acad Sci 2002 99 4708-13；Carlsson et al：Reversal ofdyskinesias in an animal model of Parkinson′s disease by continuous L-DOPAdelivery using rAAV vectors；Brain 2005128559-69]。然而，这些研究的进行使用了两个单独的AAV血清型2载体，每个载体包含GCH1基因或TH基因，均在大的合成启动子(包含兔γ-球蛋白内含子的鸡b-肌动蛋白启动子，其前面是来自巨细胞病毒启动子的增强子元件，称为鸡b-肌动蛋白，CBA，启动子)的控制下。像这样，就没有办法在细胞水平上控制两种基因的表达比率；启动子也不可能使表达限于神经元。
关于本发明领域内的现有技术状态，Sun等人(2004)，记述了一种非-AAV病毒表达载体，其具有两个转录单元，每个都受神经元特异性启动子调控。其没有描述两个单元的相对转录水平。在体外当用3-基因和4-基因载体两者转导时表达TH和GCH-1的细胞的量相当。在两种情况下，TH和GCH-1均在不同的转录物上。在4-基因载体中，GCH-1从IRES位点(在VMAT-2ORF之后)翻译。
Shen等人2000记述了用AAV-TH、AAV-AADC和AAV-GCH-1共转导HEK-293细胞。在滴定研究中，293细胞用AAV-TH和AAV-AADC以及不同量的AAV-GCH-1转导。结果显示随着AAV-GCH-1的滴度增加L-多巴和多巴胺两者均增加。AAVGCH-1以最多与AAV-TH相同的滴度测试。所记载的比率为1∶10、1∶2和1∶1(AAV-GCH-1∶AAV-TH)。以1∶1比率的两种载体(具有和不具有AAV-AADC)进行体内基因治疗。
Kirik等人，2002和Carlsson等人2005记述了AAV-TH和AAVGCH1的1∶1混合物的共同给药，其中AAV-TH的滴度为AAV-GCH-1的约3.5倍(1∶3.5的比率)。这些文献中没有一篇说明为什么使用这种比率。
US 7,419,829(Oxford Biomedica)记述了一种突变的WPRE元件及其在三基因载体(EIAV)中的用途，在该载体中TH、AADC和GCH-1被IRES序列分开。该WPRE元件可以将三种基因的表达提高到相同的程度。
WO 96/05319(Arch Development)记述了双顺反子载体，其在5’逆转录病毒LTR中具有IRES位点或启动子，其控制上游和下游顺反子两者的表达。在采用成纤维细胞的双重转导实验中，他们公开了TH活性为242.6pmol/mg/min以及GCH1活性为35.8pmol/mg/min。基于活性，这转换为两种酶之间1∶6.8的比率。另外，该文献记述了为实现最大TH活性的最适BH4浓度(500QM)。TH转导的细胞中超过50QM BH4时L-DOPA的浓度最大，并且使用更高浓度的BH4不会进一步增加。
上面提及的参考文献中没有一篇记述了具有编码TH和GCH-1两者的构建体的AAV载体。现有技术中所有的编码TH和GCH-1两者的单载体***均在包含大得多的核酸片段的病毒载体中制备。现有技术的单载体***大多数另外包含编码AADC的表达构建体。对于临床目的来说，AAV载体相对于基于HSV、EIAV和逆转录病毒的单载体***存在许多优势。另外，缺少AADC也是相对于现有技术的一个优势，因为这导致转导细胞中生成L-DOPA而不是生成DA。
发明内容
本发明的目的是开发用于治疗现有治疗策略不足或现有治疗与严重的副作用有关和/或被治疗的个体发生针对所述治疗的耐受性的功能障碍的新型分子工具。更具体地，本发明涉及一种新型表达构建体，其调控参与儿茶酚胺生物合成的酶的水平，因此在用于在需要的受试者中恢复正常儿茶酚胺平衡的方法中是有用的。
具体地，本发明涉及所述表达构建体在神经功能障碍的治疗方法中的用途，所述神经功能障碍优选不可治愈的退行性神经功能障碍，其中大多数患者在延长的治疗期间经历逐减的治疗反应和渐增的不良事件。
本发明主要涉及帕金森氏病的治疗，其中现有治疗策略涉及L-DOPA或其他多巴胺受体刺激剂的给药。现有治疗尤其在该疾病的早期阶段有效，但在延长的治疗期间大多数患者发生L-多巴诱发的运动障碍。运动障碍的发展据认为与L-DOPA或其他多巴胺受体刺激剂的非连续递送有关。本发明的主要目的是通过以减少任何不良反应的连续速率向需要的部位局部供应对于特别是帕金森氏病的治疗所必需的化合物来改进现有治疗。
本发明涉及一种将被局部施用至中枢神经***的单载体表达***，其包含编码两种多肽的两种多核苷酸，其中所述载体表达***能够差异性地表达两种编码的多肽，从而获得对于给定神经功能障碍的最佳治疗必需的被表达多肽的准确比例。
在第一个方面，本发明涉及一种单载体表达***，其包含
a)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，以所述载体不包含编码芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列为条件，或
b)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述载体是腺相关病毒载体(AAV)，或
c)表达盒，所述表达盒包含启动子、第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述启动子与所述第一核苷酸序列可操作地连接，并且其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，或
d)表达盒，所述表达盒包含第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列连接至所述翻译起始核苷酸序列，所述翻译起始核苷酸序列连接至所述第二核苷酸序列——的序列的侧翼是5’和3’末端重复序列，并且其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述末端重复序列包含能够指导可操作地连接的多肽表达的序列。
在另一个方面，本发明涉及一种单载体表达***，包含
a)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同，条件是所述载体不包含编码芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或
b)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同，其中所述载体是腺相关病毒载体(AAV)，或
c)表达盒，所述表达盒包含启动子、第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述启动子与所述第一核苷酸序列可操作地连接，并且其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同，或
d)表达盒，所述表达盒包含第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列连接至所述翻译起始核苷酸序列，所述翻译起始核苷酸序列连接至所述第二核苷酸序列——的序列的侧翼是5’和3’末端重复序列，并且其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同，其中所述末端重复序列包含能够指导可操作地连接的多肽表达的序列。
在某些实施方案中，载体可以是腺相关病毒载体(AAV)。在优选的实施方案中，本发明包括载体构建体内的调控元件，诸如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，以便调控编码多肽的差异性表达。在某些实施方案中，多肽的差异性表达对于DOPA的连续流动以用于帕金森氏病的预期治疗是有利的。所述载体在哺乳动物细胞中，优选在神经元细胞中起作用也是有利的。
其中有可能差异性地表达编码两种或更多种多肽的多核苷酸的单载体构建体还可以用于其他应用诸如治疗其他功能障碍，其中需要两种或更多种多肽之间的特异性化学计量。
在另一个方面，本发明涉及一种用于分别确定GTP环化水解酶1多肽(SEQID NOs.1、2、3、4、5和6)与酪氨酸羟化酶多肽(SEQ ID NOs.7、8、9、10、11、12、13和14)，或它们的变异体的表达比率的方法，所述多肽由如本文所定义的载体编码，所述方法包括测量：
a.所述多肽的酶活性，或
b.产生的BH4的量，或
c.所述多肽的表达量，或
d.分别与GTP环化水解酶1和酪氨酸羟化酶的多肽相对应的转录mRNA的水平。
在本发明的某些实施方案中，所述比率优选地通过确定表达的mRNA的量来测量，更优选通过确定表达的蛋白的量或通过确定表达的TH(酪氨酸羟化酶)和GCH1(GTP环化水解酶1多肽)酶的活性来测量。表达的TH和GCH1酶的比率在15∶1至1∶1之间，优选在10∶1至3∶1之间，更优选在8∶1至3∶1之间，更优选在7∶1至4∶1之间，诸如在7∶1至5∶1之间，例如6∶1。(详见图3)。
在另一个方面，本发明涉及分离的宿主细胞，其包含如本文以上定义的载体。
在其他方面，本发明涉及本发明的载体表达***、载体的多核苷酸和编码的多肽的医疗用途。
优选地，所述医疗用途用于治疗神经***的疾病、功能障碍或损害，更优选治疗退行性神经功能障碍诸如帕金森氏病。
在其他方面，本发明涉及用本发明的载体转化或转导的分离的宿主细胞，且涉及能够产生本发明的感染性病毒颗粒的包装细胞系。
在一个方面，本发明的载体用作药剂。
此外，本发明涉及一种药物组合物，其包含如本文以上定义的载体和药学上可接受的载体或稀释剂。
在一个方面，所述药物组合物用于帕金森氏病的治疗方法中，所述组合物包含单载体表达***和用于将所述载体递送至基底神经节的制剂，其中所述单载体表达***包含
a)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，条件是所述载体不包含编码芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或
b)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述载体是腺相关病毒载体(AAV)，或
c)表达盒，所述表达盒包含启动子、第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述启动子与所述第一核苷酸序列可操作地连接，并且其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，或
d)表达盒，所述表达盒包含第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列连接至所述翻译起始核苷酸序列，所述翻译起始核苷酸序列连接至所述第二核苷酸序列——的序列的侧翼是5’和3’末端重复序列，并且其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述末端重复序列包含能够指导可操作地连接的多肽表达的序列。
在另一个方面，本发明涉及施用本发明的药物组合物的方法，其中所述药物组合物通过注射、通过例如片剂口服、通过喷雾剂、经皮肤或通过吸入给药。所述注射优选地是颅内、脑内、玻璃体内、鼻内、静脉内、肌内、脊柱内、腹膜内、皮下或推注(bolus injection)或连续注射。
还提供了一种试剂盒，其包括本发明的药物组合物，所述试剂盒还包括施用本发明的药物组合物的说明书。
附图说明
图1：(A)本发明的连续DOPA-递送策略的概况。(B)使用传统双-载体***的比较实施例，所述双-载体***缺少控制GCH和TH的相对表达水平的可能性。
图2：载体构建体。生成基因构建体以从单载体基因组表达酪氨酸羟化酶(TH)和GTP环化水解酶1(GCH-1)两者。为了实现超过GCH1基因的增加的TH表达，添加土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。两种基因受人突触蛋白1启动子(SYN-1)驱动，并且使用SV40多聚腺苷酸序列(pA)增强运输。完整的基因序列***在来自AAV-血清型2的反向末端重复序列(ITR)之间。
图3：对TH功能的BH4和GCH1依赖性的建模。在rAAV5-TH和rAAV5-GCH1载体以不同的比率混合的6组中，体内和体外TG酶活性测量与TH蛋白测量的半定量Western印迹一起的数据值通过将数量归一化成Z-分值而统一成为单一读数变量。这产生可以直接进行比较和建模的无因次量。(a)体内和体外TH酶活性的以及TH蛋白水平的单个Z-分值，其作为rAAV5-TH和rAAV5-GCH1转导后在DA耗竭的纹状体中BH4合成的函数作图。此运算揭示当作为纹状体BH4水平的函数作图时，来自三个测定的结果实际上汇集成一个通用模式。(b)作为注射的gc rAAV5-GCH1的函数作图的纹状体BH4水平。纹状体中的BH4水平不随着rAAV5-GCH1的滴度增加而线性增加，而是显示在3.6E9gc以上明显饱和。(c)将TH酶功能的三种实验的Z-分值聚合成单个模型，作为纹状体BH4水平的函数作图。(d)三次TH功能实验的平均Z-分值，其作为注射的rAAV5-GCH1的基因组拷贝数的函数作图。B-D中的实线表示使用改良的列文伯格-马夸尔特(Levenberg-Marquardt)算法，在应用饱和模型y＝Ax/(B+x)+C之后实现的非线性拟合。
图4：运动功能的恢复。在一系列行为实验中测试完全的单侧DA去神经支配的动物。基于它们在圆筒实验(a)和药物诱发的旋转(d，e)中的能力，它们进行假手术(sham surgery)(Les-Sham组)或接受治疗性单rAAV载体(TH-GCH1)。在圆筒实验(a)和踏步实验(b)中在5周内发现TH-GCH1组中完全恢复。在整个实验期间保持了这种恢复。在走廊实验(c)中也发现这种恢复，而在安非他明(d)和阿朴***(e)诱发的旋转中恢复是部分的。复杂运动功能的恢复诸如在爬梯实验中也是显著的(f)。*＝与Les-Sham组显著不同。
图5：转基因表达和DA合成的事后分析(Post mortem analysis)。rAAV注射至6-OHDA引起损害的动物中后6个月，使用免疫组织化学在生物化学上评价单rAAV TH-GCH1载体的功能。免疫组织化学揭示了TH(a)和GCH1(b)转基因两者的稳定表达。这种表达与DOPA(c中的实心条)和BH4(d中的实心条)两者非常有效的生成相偶联，达到比在未处理纹状体中(d中的空心条)高得多的程度。多巴胺水平也显著复原(e)并且中间代谢物DOPAC的水平恢复至正常的50％(f)，并且终末代谢物HVA(g)升高至正常水平的两倍。
图6：具有本发明的一个实施方案的构建体的载体图谱。
图7：关于运动功能恢复的剂量响应关系。在AAV注射前，完全的单侧DA去神经支配的动物在走廊实验中测试(称为损害基线)。此后，基于它们的能力，将它们平均分至4组中。所有发生损害的动物接受等体积但浓度不断增加的rAAV5-TH:GCH1载体[5μl]的立体定向注射。这形成下面的4个剂量组；0.7％[9.1E8gc]，3.4％[4.6E9gc]，9.8％[1.3E10gc]，100％[1.3E11gc]。包括相同大小的、未处理的、年龄匹配的对照组作为所有时间点处的参照。然后在AAV注射后12周时对动物在走廊测试中再测试。在接受较高载体浓度的两个治疗组中观察到完全恢复，即，低至1.3E10gcrAAV5-TH:GCH1.4.6E9gc载体的剂量导致50％恢复，而源于9.1E8gc剂量的恢复显著较小。*＝在两维析因方差分析，然后Tukey’s HSD事后检验中显著不同。
图8：细胞外多巴胺水平的微量透析定量。完全的单侧DA去神经支配的动物分成两组(TH-GCH1组和仅6-OHDA损害)。然后TH-GCH1组中的动物接受全滴度rAAV5-TH:GCH1载体的立体定向注射。无损害的、未处理的年龄匹配的动物也包括在该研究(未处理的对照(Intact Ctrl))中。至少6个月后，使用在线微量透析定量细胞外多巴胺水平。在损害对照组中细胞外多巴胺水平降低接近90％。另一方面注射rAAV5-TH:GCH1后，细胞外多巴胺水平恢复至未处理动物的两倍以上。*＝在单因素方差分析，然后Tukey’s HSD事后检验中，与损害对照显著不同。
定义
激动剂：本文中使用的术语‘激动剂’是指结合细胞的受体并引起细胞应答的药物。
生物学活性：术语‘生物学活性’当在本文中与由本发明的载体构建体编码的酶结合使用时，是指所述酶的酶活性，意指催化特定酶促反应的能力。具体地，生物学活性是指酪氨酸羟化酶(TH)和GTP-环化水解酶(GCH-1)的酶活性。
生物学活性片段：术语“生物学活性片段’当在本文中使用时，是指包括酶的多肽的一部分，其分享全长多肽的生物学活性。片段的生物学活性可以比天然全长多肽的酶活性小、大或与其相同。
生物学活性变异体：术语“生物学活性变异体’当在本文中使用时，是指蛋白质诸如酶的多肽部分，其具有与天然全长蛋白相同的生物学活性。片段的生物学活性可以比天然全长多肽的酶活性小、大或与其相同。
儿茶酚胺功能失调：术语儿茶酚胺功能失调当在本文中使用时是指与健康个体中的相同参数相比，儿茶酚胺合成、调节、储存、释放、摄取或代谢的异常。具体地，儿茶酚胺功能失调是多巴胺功能失调，诸如多巴胺缺乏。本领域技术人员能够诊断儿茶酚胺功能失调。
认知损害：本文中使用的术语‘认知损害’是指具有不佳精神功能的状况，与意识模糊、健忘和难以集中注意力有关。
保守置换：本文定义的术语‘保守氨基酸置换’是指这样的置换，通过所述置换，一个氨基酸置换另一个具有一种或多种共同的化学和/或物理特性的氨基酸。氨基酸可以根据共同的特性进行分组。保守氨基酸置换是用预定的氨基酸组内的一种氨基酸替换同一组内另一种氨基酸，其中预定组内的氨基酸显示出相似或基本相似的特性。
功能障碍(disorder)：本文使用的术语‘功能障碍’是指疾病或医学问题，并且是损害身体功能的生物体的异常状况，与特定的症状和体征有关。其可以由外界因素诸如侵入的生物体导致，或其可以由内部功能失调导致，诸如受损的儿茶酚胺产生或运输。具体地，功能障碍当在本文中使用时是多巴胺产生的功能失调或多巴胺的异常生理浓度。
表达：编码多肽的核酸序列的术语‘表达’意指该核酸序列转录为mRNA和/或该核酸序列的导致产生该蛋白质的转录和翻译。
表达盒：术语’表达盒‘当在本文中使用时是指提供蛋白质体内合成所需的所有元件的基因组序列。这可以包括，但不一定限于，驱动DNA转录为mRNA的序列，即，启动子序列，包括用于兴趣蛋白的基因组序列的开放阅读框和能够使mRNA多聚腺苷酸化的3’非翻译区。
哺乳动物细胞中起作用：术语‘哺乳动物细胞中起作用’当在本文中使用时，意指当被引入至哺乳动物细胞中时导致翻译成生物学活性多肽的序列，例如核苷酸序列诸如载体。
基因治疗：本文使用的术语‘基因治疗’是指将基因***至个体的细胞和组织中以治疗疾病。
核酸序列：术语核酸序列当在本文中使用时是指具有两个或更多个的核苷酸碱基的单链或双链，包括，不限于，脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、DNA或RNA的类似物、mRNA和cDNA。
可操作地连接：术语‘可操作地连接’当在本文中使用时表示编码一个或多个兴趣多肽的核酸序列和转录调控序列以下面的方式连接使得核酸序列当被引入至细胞中时能够表达。
帕金森氏病：在本文中使用的术语‘帕金森氏病’(也称为帕金森病或PD)是指中枢神经***的退行性功能障碍，其经常损害患者的运动技能、语言和其他功能。帕金森氏病属于一类称为运动功能障碍的病症。其特征为肌肉强直、震颤、身体运动迟缓，以及在极端的病例中，身体不能运动。PD是慢性的和进行性二者的。
药用剂：术语’药用剂‘或’药物‘或’药剂‘是指可以在患者的疾患(malady)、痛苦(afflication)、病症(condition)、疾病(disease)或损伤(injury)的治疗(包括预防、诊断、缓解或治愈)中使用的任何治疗性或预防性试剂。治疗上有用的遗传决定子、肽、多肽和多核苷酸可以包含在术语药品或药物的含义范围内。当在本文中使用时，″治疗剂”，″药用剂″或″药物″或“药剂”是一种生物活性剂。
药物组合物：或药物、药剂或试剂是指当适宜地施用于患者时能够引起期望的治疗效应的任何化学或生物学物质、化合物或组合物。一些药物以无活性形式销售，其在体内转化为具有药物活性的代谢物。为了本发明的目的，术语″药物组合物″和″药剂″涵盖无活性药物和活性代谢物。
多肽：术语’多肽‘当在本文中使用时是指包含至少两个氨基酸的分子。氨基酸可以是天然的或合成的。’寡肽‘在本文中被定义为长度不大于100个氨基酸的多肽。术语“多肽”还意指包括蛋白质，即，包含至少一个多肽的功能性生物分子；当包含至少两个多肽时，这些可以形成复合体，共价连接或可以非共价连接。蛋白中的多肽可以被糖基化和/或被脂质化和/或包含辅基。
多核苷酸：本文使用的术语‘多核苷酸’是指这样的分子，其是由在链中共价连接的核苷酸单体构成的有机聚合物分子。“多核苷酸”当在本文中使用时是指包含至少两个核酸的分子。核酸可以是天然发生的或修饰的，诸如锁核酸(LNA)，或肽核酸(PNA)。多核苷酸当在本文中使用时通常属于
i)包含预定的编码序列的多核苷酸，或
ii)编码预定的氨基酸序列的多核苷酸，或
iii)编码由多核苷酸(i)或(ii)编码的多肽的片段的多核苷酸，其中所述片段具有如本文所规定的至少一种预定的活性；和
iv)其互补链在严格条件下与如(i)、(ii)和(iii)中任一项所定义的多核苷酸杂交并编码多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或其片段具有如本文所规定的至少一种预定的活性；和
v)包含与多核苷酸(iii)或(iv)的核苷酸序列简并的核苷酸序列的多核苷酸；或此类多核苷酸的互补链。
启动子：本文使用的术语‘启动子’是指促进特定基因转录的DNA区。启动子典型地位于它们调控的基因附近，在同一条链的上游。
蛋白质：本文使用的术语‘蛋白质’是指有机化合物，也称作多肽，其是具有至少，和优选地多于两个氨基酸的肽。通用术语氨基酸包含天然氨基酸和非天然氨基酸两者，它们中的任一个可以是‘D’或‘L’异构体形式。
序列同一性：在一个实施方案中序列同一性是通过利用神经营养因子前体(proneurotrophin)活性调节肽的片段确定的，所述神经营养因子前体活性调节肽包含至少25个连续氨基酸并且具有与本发明的任一SEQ ID NO的氨基酸序列至少80％，诸如85％，例如90％，诸如95％，例如99％相同的氨基酸序列，其中同一性百分比用Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的算法GAP、BESTFIT或FASTA使用缺省空位权重(default gap weights)来确定。
下面的术语用来描述两个以上的多肽之间的序列关系：″预定序列″、″比较窗″、″序列同一性″、″序列同一性百分比″和″实质上的同一性″。
″预定序列″是用作序列比较基础的定义序列；预定序列可以是较大序列的子集，例如，作为在序列表中给出的全长DNA或基因序列的片段，所述全长DNA或基因序列诸如选自由SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22组成的群组的多核苷酸序列，或可以包含完整DNA或基因序列。通常，预定序列的长度为至少个20核苷酸，经常为至少个25个核苷酸长度，并且常常为至少50个核苷酸长度。
由于两个多核苷酸可以每个(1)包含两个多核苷酸之间相似的序列(即，完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)可以进一步包含两个多核苷酸之间不同的序列，两个(或多个)多核苷酸之间的序列比较典型地通过在“比较窗”内比较两个多核苷酸的序列来进行，以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。“比较窗”当在本文中使用时，是指至少20个连续核苷酸位置的概念片段，其中多核苷酸序列可以与至少20个连续核苷酸的预定序列进行比较，并且其中比较窗内的多核苷酸序列部分可以包含与预定序列(不包含添加或缺失)相比20％以下的添加或缺失(即，空位)，用于两个序列的最佳比对。
用于比对比较窗的序列的最佳比对可以通过Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.)，或通过仔细检查进行，并且选择由各种方法生成的最佳比对(即，在比较窗内产生最高的同源性百分比)。
术语″序列同一性″是指在比较窗内两个多核苷酸序列是相同的(即，基于核苷酸-对-核苷酸比较)。术语″序列同一性百分比″通过如下计算：在比较窗内比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)的位置数目以产生匹配位置的数目，匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比。术语″实质上的同一性″当在本文中使用时表示多核苷酸序列的特性，其中所述多核苷酸包含这样的序列，该序列与预定序列相比，在至少20个核苷酸位置的比较窗内、经常在至少25-50个核苷酸的比较窗内具有至少85％序列同一性、优选至少90至95％序列同一性、更普遍地至少99％序列同一性的序列，其中序列同一性百分比通过在比较窗内将预定序列与多核苷酸序列比较来计算，所述多核苷酸序列可以包含预定序列的总计20％以下的缺失或添加。预定序列可以是较大序列的子集，例如，作为本文举例说明的全长SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22多核苷酸序列的片段。
当应用于多肽时，氨基酸序列的同一性程度是由氨基酸序列共享的位置处的相同氨基酸数目的函数。氨基酸序列的同源性或相似性程度是由氨基酸序列共享的位置处(即，结构相关的)氨基酸数目的函数。
术语“不相关的”或“非同源的”序列意指与另一序列享有小于40％同一性的序列，尽管与本发明的多肽相比优选小于25％。术语″实质上的同一性″意指两个肽序列，当最佳比对时，诸如通过程序GAP或BESTFIT使用缺省空位权重比对，享有至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性或更高的序列同一性(例如，99％序列同一性)。优选，不相同的残基位置由于保守氨基酸置换而不同。
保守氨基酸置换是指具有相似侧链的残基的可交换性。例如，一组具有脂族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸，一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；且一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
另外，基于如本文下面所定义的预定数目的保守氨基酸置换还确定了变异体。保守氨基酸置换当在本文中使用时涉及一个氨基酸(预定的氨基酸组内)替换另一氨基酸(同一组内)，其中所述氨基酸显示出相似或实质上相似的特性。
在如本文应用的术语“保守氨基酸置换”的含义内，在本文下面指出的氨基酸组内，一种氨基酸可以替换另一种氨基酸：
i)具有极性侧链的氨基酸(Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr和Cys，)
ii)具有非极性侧链的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro和Met)
iii)具有脂族侧链的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile)
iv)具有环状侧链的氨基酸(Phe、Tyr、Trp、His、Pro)
v)具有芳族侧链的氨基酸(Phe、Tyr、Trp)
vi)具有酸性侧链的氨基酸(A sp、Glu)
vii)具有碱性侧链的氨基酸(Lys、Arg、His)
viii)具有酰胺侧链的氨基酸(Asn、Gln)
ix)具有羟基侧链的氨基酸(Ser、Thr)
x)具有含硫侧链的氨基酸(Cys、Met)，
xi)中性、弱疏水性氨基酸(Pro、Ala、Gly、Ser、Thr)
xii)亲水性酸性氨基酸(Gln、Asn、Glu、Asp)，和
xiii)疏水性氨基酸(Leu、Ile、Val)
因此，根据本发明，其变异体或片段可以在其序列或片段的相同变异体内，或在其序列或片段的不同变异体之间，包含至少一个置换，诸如彼此相独立地引入的多个置换。
从上面的概述中很明显，相同变异体或其片段可以包含来自如本文上面所定义的一个以上保守氨基酸组的一个以上保守氨基酸置换。
至少一个氨基酸的添加或缺失可以是优选2至250个氨基酸，诸如10至20个氨基酸，例如20至30个氨基酸，诸如40至50个氨基酸的添加或缺失。然而，50个氨基酸以上的添加或缺失，诸如50至100个氨基酸的添加，100至150个氨基酸的添加，150-250个氨基酸的添加，也包含在本发明内。缺失和/或添加可以彼此相独立地是序列内和/或序列末端处的缺失和/或添加。
根据本发明的多肽片段，包括其任何功能性等效物，在一个实施方案中可以包含少于250个氨基酸残基，诸如少于240个氨基酸残基，例如少于225个氨基酸残基，诸如少于200个氨基酸残基，例如少于180个氨基酸残基，诸如少于160个氨基酸残基，例如少于150个氨基酸残基，诸如少于140个氨基酸残基，例如少于130个氨基酸残基，诸如少于120个氨基酸残基，例如少于110个氨基酸残基，诸如少于100个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，诸如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，诸如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，诸如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，诸如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基。
“功能等效”当在本发明中使用时，根据一个优选实施方案，通过参照预定的序列片段的相应功能性来确定。
TH或GCH-1的功能等效物或变异体将被理解为，因为随着***、缺失和包括保守置换的置换的数目和范围增加而表现出与优选的预定的TH或GCH-1序列逐渐不同的氨基酸序列。这种差异被测量为优选的预定序列与片段或功能等效物之间的同源性下降。
SEQ ID NO：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的所有片段或功能等效物包括在本发明的范围内，无论它们显示的与本文公开的各个预定的TH和GCH-1序列的同源性程度。其原因是TH和GCH-1的一些区域可容易发生突变，或能够完全缺失，而对得到的片段的结合活性没有任何显著的影响。
通过置换获得的功能性变异体可以很好地显示出一定形式或程度的天然TH和GCH-1活性，尽管如果含有功能上相似的氨基酸侧链的残基被置换，则可能具有较小的同源性。就此而言，功能相似是指侧链的主导特征诸如疏水性、碱性、中性或酸性，或是否存在立***阻效应。因此，在本发明的一个实施方案中，同一性程度并不是片段作为根据本发明的优选的预定片段的变异体或功能等效物的主要量度。
氨基酸序列之间的同源性可以使用熟知的计分矩阵来计算，所述计分矩阵诸如BLOSUM 30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、BLOSUM 50、BLOSUM55、BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM 65、BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85和BLOSUM 90中的任一个。
与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的片段分别具有同源性的片段，当它们与所述预定片段序列分别优选至少约90％同源，例如至少92％同源，诸如至少94％同源，例如至少95％同源，诸如至少96％同源，例如至少97％同源，诸如至少98％同源，例如至少99％同源时，被认为落入了本发明的范围内。根据本发明的一个实施方案，同源性百分比是指同一性百分比。
当根据本文使用的含义确定功能等效时可能考虑的其他因素是i)抗血清检测根据本发明的TH或GCH-1片段的能力，或ii)在检测中功能上等效的TG或GCH-1片段与相应的TH或GCH-1片段竞争的能力。一种确定已知氨基酸序列内的免疫原性活性氨基酸序列的方法已经由Geysen在US 5,595,915中描述，该文献通过引用加入本文中。
另外一种可适用的用于确定肽片段的结构和功能关系的适宜方法由US6,013,478描述，其通过引用加入至本文中。此外，检测氨基酸序列与受体部分结合的方法是技术人员已知的。
除了引入至优选的预定的TH或GCH多肽或其片段的任意位置中的保守置换以外，还可能需要在此类多肽的任何一个或多个位置中引入非保守置换。
导致形成TH或GCH-1的功能等效片段的非保守置换将例如i)在极性方面基本上不同，例如用具有非极性侧链的残基(Ala、Leu、Pro、Trp、Val、Ile、Leu、Phe或Met)置换具有极性侧链的残基诸如Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn或Gln或带电荷的氨基酸诸如Asp、Glu、Arg或Lys，或用带电荷的或极性的残基置换非极性的残基；和/或ii)在对多肽主链取向的作用方面基本上不同，诸如Pro或Gly被另一个氨基酸置换或另一个氨基酸置换Pro或Gly；和/或iii)在电荷方面基本上不同，例如用带负电荷残基诸如Glu或Asp置换带正电荷的残基诸如Lys、His或Arg(且反之亦然)；和/或iv)在空间位阻方面基本上不同，例如用体积大的残基诸如His、Trp、Phe或Tyr置换具有较小侧链的残基例如，Ala、Gly或Ser(且反之亦然)。
通过置换氨基酸获得的变异体在一个优选实施方案中可以基于氨基酸侧链取代基的疏水性和亲水性值以及相对相似性，包括电荷、尺寸等来获得。考虑了多种前述特性的示例性的氨基酸置换是本领域技术人员熟知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
除了本文所述的变异体以外，可以构想立体化学上类似的变异体以模拟变异体结构的关键部分并且此类化合物也可以以与本发明的变异体相同的方式使用。这可以通过本领域技术人员已知的建模和化学设计技术来实现。要理解的是所有这些立体化学类似的构建体都落入了本发明的范围内。
在进一步的实施方案中，本发明涉及功能性变异体，所述功能性变异体包含具有下述亲水性值或亲水指数(hydrophilic index)的置换氨基酸，所述亲水性值或亲水指数在其置换的氨基酸的值的+/-4.9内，例如+/-4.7内，诸如+/-4.5内，例如+/-4.3内，诸如+/-4.1内，例如+/-3.9内，诸如+/-3.7内，例如+/-3.5内，诸如+/-3.3内，例如+/-3.1内，诸如+/-2.9内，例如+/-2.7内，诸如+/-2.5内，例如+/-2.3内，诸如+/-2.1内，例如+/-2.0内，诸如+/-1.8内，例如+/-1.6内，诸如+/-1.5内，例如+/-1.4内，诸如+/-1.3内，例如+/-1.2内，诸如+/-1.1内，例如+/-1.0内，诸如+/-0.9内，例如+/-0.8内，诸如+/-0.7内，例如+/-0.6内，诸如+/-0.5内，例如+/-0.4内，诸如+/-0.3内，例如+/-0.25内，诸如+/-0.2内。
亲水性和亲疏水性(hydrophilic and hydropathic)氨基酸指数在赋予蛋白质交互生物学功能方面的重要性在本领域中是公知的(Kyte & Doolittle，1982和Hopp，美国专利号4,554,101，每篇均通过引用加入至本文中)。
在本文中使用的氨基酸亲疏水性指数值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)(Kyte& Doolittle，1982)。
氨基酸亲水性值为：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)(U.S.4,554,101)。
除了本文所述的肽基化合物以外，可以构想立体化学上类似的化合物以模拟肽结构的关键部分并且此类化合物也可以以与本发明的肽相同的方式使用。这可以通过本领域技术人员已知的建模和化学设计技术来实现。例如，可以采用酯化和其他烷基化作用来修饰氨基末端，例如，二-精氨酸肽主链的氨基末端，以模拟四肽结构。要理解的是所有这些立体化学上类似的构建体都落入了本发明的范围内。
具有N-末端烷基化和C-末端酯化的肽也涵盖在本发明的范围内。功能等效物也包括糖基化的和与相同或其他的TH或GCH-1片段和/或TH或GCH-1分子形成的共价或聚集结合物(covalent or aggregative conjugates)，包括二聚体或不相关的化学部分。这种功能等效物通过将官能团与在片段中包括在N-和C-末端中任一端或两端发现的基团以本领域已知的方式连接来制备。
功能等效物因此可以包含与羧基末端的脂族酯或酰基酯或酰胺，烷基胺或包含羧基侧链的残基结合的片段，例如，与天冬氨酸残基处的烷基胺的结合物；含羟基残基的O-酰基衍生物和氨基末端氨基酸或含氨基残基的N-酰基衍生物，例如，与fMet-Leu-Phe或免疫原性蛋白的结合物。酰基的衍生物选自烷基-部分的基团(包括C3至C10正烷基)，由此形成烷酰基种类，以及选自碳环或杂环化合物，由此形成芳酰基种类。反应性基团优选是本身已知用于通过反应性侧基将蛋白交联成不溶性基质的双官能化合物。
共价或集合性功能等效物及其衍生物可用作免疫检测中的试剂或用于亲和性纯化程序。例如，根据本发明的TH或GCH-1的片段可以通过本身已知的方法与溴化氰活化的琼脂糖共价连接而使其不可溶，或者吸附至聚烯烃表面，进行或不进行戊二醛交联，以在抗TH或抗GCH-1抗体或细胞表面受体的检测或纯化中使用。片段还可以用可检测到的基团标记，例如，通过氯胺T程序放射性碘化，共价连接至稀土螯合物或偶合至另一荧光部分以用于，例如，诊断性检测中。
TH或GCH-1的优选的预定片段的诱变可以通过进行氨基酸***来进行，通常以约1至10个氨基酸残基的数量级，优选约1至5氨基酸残基来进行，或进行约1至10个残基，诸如约2至5个残基的缺失。
在一个实施方案中，TH或GCH-1的片段通过自动化合成来合成。可以采用任一种商业可得的固相技术，诸如Merrifield固相合成法，其中氨基酸相继地添加到正在生长的氨基酸链。(参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2146，1963)。
用于自动化合成多肽的设备商购自供应商诸如加利福尼亚州福斯特市的Applied Biosystems公司，并且通常可以根据制造商的说明书来操作。固相合成将能够将所需的氨基酸置换掺入至根据本发明的TH或GCH-1的任一片段中。要理解的是置换、缺失、***或其任意亚组合可以组合以获得最终的功能等效物序列。***应当理解为包括氨基-末端和/或羧基-末端融合，例如与疏水或免疫原性蛋白或载体诸如能够充当载体的任何多肽或骨架结构融合。
还提供了寡聚体，所述寡聚体包括二聚体，所述二聚体包括根据本发明的TH和/或GCH-1的片段的同型二聚体和异二聚体，并且这些均落在本发明的范围内。TH或GCH-1功能等效物和变异体可以作为与其他氨基酸序列或与天然TH或GCH-1序列的同型二聚体或异二聚体制备。异二聚体包括包含免疫反应性TH片段以及不需要具有或发挥任何生物学活性的GCH-1片段的二聚体。
假手术(Sham surgery)：也被称为安慰剂手术，是一种省略了被认为是治疗上必需的步骤的手术干预。在有对照的研究中，在对照群体中进行假手术以通过中和安慰剂效应和减少偏差来评估正在研究的干预的效果。然而与安慰剂(其典型的例子是惰性的“糖丸”)相反，假手术涉及真实的手术干预以抵消麻醉、切口创伤以及术前和术后护理的影响并保持常规手术的假象。在本申请中，在称作“Les Sham组”的对照组动物中已经进行了假手术。
具体实施方式
对于最适DOPA递送，TH和GCH1表达水平之间的化学计量关系在脑中还没有被充分研究。到目前为止利用TH和GCH1递送的大多数研究已经采用了不关心控制它们的相对表达水平的设计。TH酶需要辅因子BH4用于DOPA合成。BH4由GTP在三步酶促反应中合成，其中GCH1是第一个限速酶。后面的两种酶是广泛表达的。存在许多原因来仔细地看待此过程。首先，TH酶活性是被复杂调控的，并且TH蛋白的稳定性也被调控。影响活性的一个因素是BH4的围绕量。BH4太少，酶不能有效地工作，而BH4太多可抑制功能。
其次，尽管每次酪氨酸转化为DOPA消耗一个BH4分子，而GCH1酶从不被消耗。由于底物GTP在细胞中很丰富，对于GCH1表达的需求可以大大小于TH表达。连续DOPA递送取决于数种因素，这些因素促成建立用于最适TH酶功能性的环境。
本发明人获得的结果提示TH酶的激活与GCH1的表达量遵循三相动力学关系。在GCH1∶TH比率达到1∶7的初始相中，TH功能和BH4合成两者均随着GCH1的增加而线性地增加。在当GCH1进一步增加，达到5.5E9GCH1基因组拷贝数(对应于1∶3GCH1∶TH比率的水平)的第二相中，BH4水平继续线性增加，而TH功能开始显示饱和的迹象。在第三相中，当增加rAAV5-GCH1滴度超过5.5E9基因组拷贝数时，在TH功能和BH4合成两方面均明显地出现饱和。综合来说，这些数据显示1∶3至1∶7GCH1∶TH比率的工作范围可以导致有效的DOPA合成，在此范围内TH功能得到优化。
因此，在某些实施方案中，TH基因的表达水平比GCH1表达水平高约3-7倍。此外，使用本文所述的载体和方法和载体，稳定的良好限定的比率的转基因表达水平可得以维持，以提供可预测的和优化的体内表达水平。
较早的策略已经利用了双-载体设计或单载体多-顺反子载体。使用各自编码一种基因的单独的病毒载体具有许多限制。首先，“产品”实际上变成两种药物，每种具有其自身的产量变化。由于这难以在体外评估，因此临床级别的生产可能是非常成问题的。其次，尽管在整体范围上，两个基因的表达谱可能看上去相似，但两个载体的拷贝数在个体细胞中可能变化极大，因此导致不同水平的DOPA合成。另外，影响可能会因为许多细胞接受不到或仅接受一种基因而加重，因此即使有的话，也显示非常有限的DOPA合成。
一种更具吸引力的方法是将基因合并到单个载体中，因为两个基因将总是在相同的细胞中表达，将仅有一个“产品”。然而，基因序列太大不能装入特定的载体构建体例如重组AAV载体中阻碍了这种方法。AAV的包装容量被优化到野生型AAV基因组的大小左右(4.7kb)。如果重组基因组显著地超过这个大小，则产量滴度和体内功效都严重地受损。
在基因治疗中，优选类型的病毒载体是AAV。AAV由于许多特性而有利于基因治疗。特别重要的是野生型病毒缺少病原性。其还可以感染未***细胞，并且可以提供长期、稳定的基因表达。所需的基因以及驱动基因转录的启动子一起可以***到反向末端重复序列(ITR)之间，该反向末端重复序列在单链载体DNA被宿主细胞DNA聚合酶复合体转变成双链DNA后协助细胞核中多串联体的形成。基于AAV的基因治疗载体在宿主细胞核中形成游离型多串联体。AAV还表现出非常低的免疫原性，似乎限于生成中和抗体，而它们不诱导明确定义的细胞毒性反应。这些特性使得AAV成为基因治疗的有吸引力的候选物，尤其是在中枢神经***(CNS)的基因治疗中。
尽管多巴胺合成途径通常被认为包括两个主要的酶，TH和AADC，本发明人在本文中已经显示使用表达TH和GCH1而不表达AADC的一种或多种载体的基因治疗，可以提供症状的和/或治疗性缓解。这是最重要的，因为某些病毒载体诸如AAV载体的有限包装容量阻止或限制包含所有三种基因，TH、GCH1和AADC。此外，采用传统的双-顺反子载体基因组构建体，两种基因TH和GCH1的组合是不可能的。尽管有可能在N-末端截短TH酶以减小基因的大小，但这样带来的代价是去除了反馈抑制和磷酸化的固有安全性机制。这种截短的酶在甚至当胞浆DA浓度达到毒性水平时，将继续有效。这并不是如本发明中所利用的全长TH cDNA的那种情况。
本文所述的某些实施方案包括截然不同的质粒设计。例如，某些实施方案利用具有两个启动子的双表达盒，而不是通过使用内部核糖体进入位点实现双重基因表达。采用基因治疗中传统使用的合成的融合启动子诸如合成的含有兔γ-球蛋白内含子的鸡b-肌动蛋白启动子，其前面是来自巨细胞病毒启动子的增强子元件(称为鸡b-肌动蛋白，CBA，启动子)，这种质粒设计将是不可能。小的内源性强启动子的使用已经允许这种不同的质粒设计方式。
单载体表达***
在某些实施方案中，本发明涉及一种单载体表达***，其包含编码被设计进行差异性表达的两种多肽的两种多核苷酸(图2中所述)。这两种编码的多肽，酪氨酸羟化酶(TH)和GTP-环化水解酶1(GCH1)，可以以3∶1至7∶1的比率优先表达。
与其他多肽一起，TH和GCH1是产生多巴胺中的重要酶，因为它们调节来自酪氨酸的L-多巴产生。其他因子参与多巴胺合成，但TH和GCH1之间的化学计量关系可以是此过程中的限制性因素。
因此本发明的主要目的是提供一种载体构建体，其递送优化比例的TH和GCH1。此外，本发明提供了一种局部递送该载体构建体的方法以便将增加的多巴胺的产生限制于需要其的细胞。
病毒载体
从广义上说，基因治疗寻求将新的遗传物质转移至患者的细胞，为患者带来治疗性益处。这种益处包括治疗或预防广范围的疾病、功能障碍和其他病症。
基因治疗可以分为两种不同的类型：生殖系基因治疗，其中遗传物质被转移至生殖细胞中，并且因此将是可遗传的；和体细胞基因治疗，其中遗传物质被转移至体细胞并且因此将是不可遗传的。
离体基因治疗方法涉及修饰分离的细胞诸如干细胞，其可以被输注、移植或以其他的方式移植到患者中。参见，例如，专利号为4,868,116、5,399,346和5,460,959的美国专利。相反，体内基因治疗寻求在体内直接靶向宿主患者组织。
病毒载体是将遗传物质递送至宿主生物体中的有用工具。可用作基因转移载体的病毒包括乳多空病毒、腺病毒、痘苗病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒和逆转录病毒，诸如HIV、SIV、FIV、EIAV、MoMLV。
用于治疗中枢神经***功能障碍的优选病毒是慢病毒和腺相关病毒。两种类型病毒均可以整合入基因组而不需要细胞***，并且两种类型已经在临床前动物研究中针对在神经***、尤其是中枢神经***中的适应征进行了测试。
优选类型的病毒载体是AAV。AAV由于许多特性而在基因治疗中受到关注。其中主要的特性是野生型病毒明显缺少病原性，并且其还可以感染非***的细胞。野生型AAV基因组最经常整合至人第9号染色体的特定位点(指定的AAVS1)中，而以可以忽略不计的频率发生在基因组中的随机整合。该特性使其与逆转录病毒相比是稍微更加可预测的，逆转录病毒存在随机***和诱变的危险。然而，采用AAV作为基因治疗载体，这种整合能力可以通过从载体的DNA去除rep和cap而消除。由于rep和cap基因在复制缺陷型病毒载体中没有功能上的价值，因此它们可以从载体基因组中去除。在这些野生型AAV基因的位置，期望的一个或多个基因与驱动该基因转录的启动子一起可以***在反向末端重复序列(ITR)之间。ITR对于载体DNA的病毒载体包装来说是重要的，其在单链载体DNA被宿主细胞DNA聚合酶复合体转变成双链DNA之后，协助细胞核中多串联体的形成。
基于AAV的基因治疗载体可以在宿主细胞核中形成游离型多串联体。在非***细胞中，这些串联体可以在宿主细胞的生命中保持完整。在***细胞中，AAV DNA可以通过细胞***丢失，因为游离型DNA不与宿主细胞DNA一起复制。AAV DNA至宿主基因组中的随机整合很少但可以被检测到。AAV表现出低的免疫原性，似乎限于生成中和抗体，而它们不诱导明确定义的细胞毒性反应。这些特性，连同感染休眠细胞的能力一起，使得作为人类基因治疗的载体它们的一些优势超过了腺病毒。这些特性使得AAV成为有吸引力的候选物，用于建立用于在中枢神经***(CNS)中的基因治疗的病毒载体。
病毒载体，包括AAV载体，具有某些克隆能力，即，它们能够携带一定量的多核苷酸。因此，在某些实施方案中，本发明涉及包装容量在1至40kb，诸如1至30kb，例如1至20kb，诸如1至15kb，例如1至10kb，诸如1至8kb，例如2至7kb，诸如3至6kb，例如4至5kb范围内的病毒载体。在优选的实施方案中的，本发明涉及包装容量为4.8kb的AAV载体。
目前存在至少11种血清型的AAV。血清型2已经被最广泛地研究，并且AAV2针对例如，骨骼肌、血管平滑肌细胞、肝细胞和特别是神经元表现出天然向性。然而，其他血清型已经证明作为基因治疗的工具是有效的；例如AAV6似乎特别地可用于感染气道上皮细胞，AAV7表现出对鼠骨骼肌细胞的高转导率(类似于AAV1和AAV5)，AAV8特别地可用于转导肝细胞，以及AAV1和5在至血管内皮细胞的基因递送中是高效的。
通过用野生型AAV感染激发的体液免疫被认为是非常普遍的事件。相关的中和活性限制了最普遍使用的血清型AAV2在某些应用中的有效性。因此，目前正在进行的至脑的大多数临床试验涉及递送AAV2，脑是一个相对免疫豁免的器官。
除了使用不同血清型的AAV以外，有可能将不同的血清型组合在一起，诸如使用一种血清型的质粒，其包装在另一种血清型的衣壳中。
在一个实施方案中，本发明的腺相关病毒(AAV)载体是AAV2载体。
在进一步的实施方案中，AAV2载体包装在包装在不同于AAV2衣壳的AAV衣壳中。
还在进一步的实施方案中，AAV2载体包装在AAV5衣壳中。
AAV载体可以使用两种主要的原理制备，转染人细胞系单层培养物或自由漂浮的昆虫细胞。单层细胞培养物通过磷酸钙沉淀、脂转染或其他方式，采用两种或三种质粒制剂的混合物转染，所述混合物含有具有载体基因组的转移质粒和一种或两种包含载体衣壳合成所必需的基因的辅助质粒。对于昆虫细胞培养物，此过程一般代替为使用包含相同功能的杆状病毒构建体转染细胞。然后收集细胞、上清液或两者用于载体的纯化和浓缩。这可以通过氯化铯或碘克沙醇梯度纯化、离子交换色谱、凝胶过滤和亲和色谱和超离心的任意组合来实现。在本领域中记载了制备AAV的方法，例如，US 5,677,158、US 6,309,634和US 6,451,306记述了AAV递送至中枢神经***的实施例。
因此，在主要的方面，本发明涉及一种单载体表达***，其包含
a)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，条件是所述载体不包含编码芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或
b)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述载体是腺相关病毒载体(AAV)，或
c)表达盒，所述表达盒包含启动子、第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述启动子与所述第一核苷酸序列可操作地连接，并且其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，或d)表达盒，所述表达盒包含第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列连接至所述翻译起始核苷酸序列，所述翻译起始核苷酸序列连接至所述第二核苷酸序列——的序列的侧翼是5’和3’末端重复序列，并且其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述末端重复序列包含能够指导可操作地连接的多肽表达的序列。
在前文所述的载体的一个实施方案中，由所述第一表达盒表达的所述GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中由所述第二表达盒表达的所述酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同。
在前文所定义的载体的另一个实施方案中，被表达的所述GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中由所述第二表达盒表达的所述酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同。
在前文所定义的载体的另一个实施方案中，被编码的GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中被编码的酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同。
在前文所定义的载体的另一个实施方案中，所述GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中被编码的酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同。
在某些实施方案中，AADC基因包含在载体中可以由于许多原因中的任一种原因是不利的。首先，其生成新的***，该***可以不受调节地将酪氨酸转化为多巴胺。由于纹状体中的转导细胞缺少将多巴胺隔离至囊泡中的机制，因此多巴胺可以迅速地在胞浆中积累。如果TH酶留有N-末端调节结构域，则产生的多巴胺可以通过负反馈直接抑制DOPA合成，所述负反馈会严重地限制治疗的功效。另一方面，如果TH酶被截短，则胞浆多巴胺水平会迅速增加，因为转导的细胞也缺少释放多巴胺的机制。胞浆多巴胺的这种增加已经显示导致纹状体神经元的变性，这不仅消除了症状缓解，而且可能将帕金森氏病转变成多***萎缩(MSA)，一种对L-DOPA无反应的功能障碍，其几乎没有治疗方案。其次，包含AADC基因也可以影响患者对口服L-DOPA药物治疗的反应。已知L-DOPA药物治疗的主要不良事件之一是运动障碍。其被认为至少部分由于脉动式给药途径所引起的纹状体中多巴胺水平的波动导致的。如果在纹状体中在病症处从L-DOPA至多巴胺的转化率被提高，则这会加重该波动，并且也加重运动障碍。这实际上已在用AADC基因转导的动物模型中观察到。
另一方面，缺少AADC基因可以提供DOPA通过可利用的大氨基酸转运蛋白至纹状体神经元外的穿梭运动，并且由此提供安全性机制，因为可利用的AADC酶可以调节转化速度。具有内源性AADC酶活性的神经元还可以具有储存和释放多巴胺的能力，因此降低多巴胺毒性的危险。因此，在某些实施方案中，该载体不包含编码芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列。因此，在另一个主要的方面，本发明提供了一种单载体表达***，其包含a)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的组的多肽至少70％相同，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同，条件是所述载体不包含编码芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或
b)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同，其中所述载体是腺相关病毒载体(AAV)，或
c)表达盒，所述表达盒包含启动子、第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述启动子与所述第一核苷酸序列可操作地连接，并且其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同，或
d)表达盒，所述表达盒包含第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列连接至所述翻译起始核苷酸序列，所述翻译起始核苷酸序列连接至所述第二核苷酸序列——的序列的侧翼是5’和3’末端重复序列，并且其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同，其中所述末端重复序列包含能够指导可操作地连接的多肽表达的序列。
在另一个方面，本发明涉及一种单载体表达***，其包含
a)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少75％相同，诸如至少80％相同，例如至少90％相同，诸如至少92％相同，例如至少95％相同，诸如至少97％相同，例如至少98％相同，诸如至少99％相同，例如至少99.5％相同，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少75％相同，诸如至少80％相同，例如至少90％相同，诸如至少92％相同，例如至少95％相同，诸如至少97％相同，例如至少98％相同，诸如至少99％相同，例如至少99.5％相同，条件是所述载体不包含编码芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或
b)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少75％相同，诸如至少80％相同，例如至少90％相同，诸如至少92％相同，例如至少95％相同，诸如至少97％相同，例如至少98％相同，诸如至少99％相同，例如至少99.5％相同，其中所述载体是腺相关病毒载体(AAV)，或
c)表达盒，所述表达盒包含启动子、第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述启动子与所述第一核苷酸序列可操作地连接，并且其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少75％相同，诸如至少80％相同，例如至少90％相同，诸如至少92％相同，例如至少95％相同，诸如至少97％相同，例如至少98％相同，诸如至少99％相同，例如至少99.5％相同，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同，或
d)表达盒，所述表达盒包含第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列连接至所述翻译起始核苷酸序列，所述翻译起始核苷酸序列连接至所述第二核苷酸序列——的序列的侧翼是5’和3’末端重复序列，并且其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少75％相同，诸如至少80％相同，例如至少90％相同，诸如至少92％相同，例如至少95％相同，诸如至少97％相同，例如至少98％相同，诸如至少99％相同，例如至少99.5％相同，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同，其中所述末端重复序列包含能够指导可操作地连接的多肽表达的序列。在一个实施方案中，本发明的载体是最小整合型载体(minimally integratingvector)。
在一个实施方案中，本发明的载体是图6中所示的载体。
在一个实施方案中，如前文所定义的载体1至40kb，例如1至30kb，诸如1至20kb，例如1至15kb，诸如1至10，例如1至8kb，诸如2至7kb，例如3至6kb，诸如4至5kb的包装容量。
在优选的实施方案中，如前文所定义的载体具有4.5至4.8kb的包装容量。
在一个实施方案中，本发明的载体是病毒载体，其中所述载体选自由下列各项组成的组：腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体。
在优选的实施方案中，载体是腺相关病毒载体(AAV)。
即使优选AAV载体，其他载体也可以用于本发明。因此，在另一个实施方案中，本发明的载体是质粒载体。
还在另一个实施方案中，本发明的载体是合成的载体。
在一个实施方案中，载体在哺乳动物细胞中起作用。在一个实施方案中，该载体仅在哺乳动物细胞中起作用。
在一个实施方案中，本发明涉及一种基于在人、非人灵长类动物、其他哺乳动物物种或其嵌合体形式中鉴定的任何AAV血清型的载体。
在优选的实施方案中，本发明涉及一种基于被修饰以表达改变的或新型衣壳蛋白的任何血清型的AAV载体的载体。在更优选的实施方案中，本发明涉及AAV载体，更优选血清型2AAV载体，更优选包装在血清型5AAV衣壳中的血清型2AAV载体。对于衣壳选择，两个因素可以有助于选择优选的血清型。第一个是存在野生型等效物的中和抗体。已经显示在各个人群中最普遍的血清型是血清型2。因此，使用与血清型2和其他血清型具有最小的衣壳同源性的血清型是有价值的。血清型5引人注目，因为其与其他AAV血清型1至9仅具有53-57％的衣壳序列同源性(Daya和Berns.Gene therapy usingadeno-associated virus vectors.ClinMicrobiol Rev(2008)vol.21(4)pp.583-93)。可能有助于转导在人脑中传播的第二个因素是载体衣壳对其展示亲和性的细胞表面残基。AAV血清型2与硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)具有强的亲和性，而AAV5血清型则无。由于HSPG在脑中十分丰富，因此这可能有助于传播。
基因的表达在转录、翻译或翻译后水平受到控制。转录起始是基因表达中早期和关键性的事件。这取决于启动子和增强子序列并且受到与这些序列相互作用的特定细胞因子的影响。AAV可以被设计成包含不同来源的一个或多个多核苷酸。载体构建体可以包含一个或多个启动子。在本发明的一个实施方案中，所述一个或多个启动子对哺乳动物细胞特异，所述哺乳动物细胞选自但不限于由下列各项组成的组：人神经细胞包括人神经元、中国仓鼠卵巢细胞、CHO-K1、幼仓鼠肾细胞、小鼠成纤维细胞-3T3细胞、非洲绿猴细胞系、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞、AT3细胞、大鼠神经胶质瘤细胞、大鼠神经元细胞和大鼠海马细胞。
在优选的实施方案中，本发明涉及包含基因组序列的载体，其中酶的表达受到一个或多个启动子的控制，所述启动子允许在神经元，诸如例如纹状体神经元中的高表达。在更优选的实施方案中，所述一个或多个启动子是神经元特异性的。在最优选的实施方案中，所述一个或多个启动子是人突触蛋白启动子。
在一个实施方案中，本发明的表达构建体的第一和/或第二启动子，如前文所定义的，是对哺乳动物细胞特异的启动子。
在进一步的实施方案中，所述哺乳动物细胞是神经细胞。还在进一步的实施方案中，所述神经细胞是神经元。
在一个实施方案中，所述第一和所述第二启动子两者都是突触蛋白1启动子。
在另一个实施方案中，所述第一或所述第二启动子中的任一个是突触蛋白1启动子。
在一个实施方案中，本发明中使用的启动子是组成型启动子，其中所述组成性活性启动子选自由下列各项组成的组：CAG、CMV、人UbiC、RSV、EF-1α、SV40、Mt1。
在另一个实施方案中，所述启动子是诱导型启动子，其中所述诱导型启动子选自由下列各项组成的组：Tet-On、Tet-Off、Mo-MLV-LTR、Mx1、孕酮、RU486和雷帕霉素-诱导型启动子。
本发明的启动子可以是组成型启动子，包括但不限于由下列各项组成的组：CAG启动子、CMV启动子、人UbiC启动子、RSV启动子、EF-1α启动子、SV40启动子和Mt1启动子。
除了启动子以外，表达载体还可以包含一个或多个多聚腺苷酸化序列。多聚腺苷酸化序列是产生成熟mRNA以将转录产物翻译成多肽所必需的。在本发明的一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列与本发明的编码TH或GCH-1的序列可操作地连接。在更优选的实施方案中，多聚腺苷酸化序列的5’端与本发明的编码TH或GCH-1的序列的3’端可操作地连接。在更优选的实施方案中，所述多聚腺苷酸化序列是SV40多聚腺苷酸化序列。
在本发明的一个实施方案中，所述第一表达盒或所述第二表达盒包含多聚腺苷酸化序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述第一表达盒和所述第二表达盒两者均包含多聚腺苷酸化序列。
在一个实施方案中，所述多聚腺苷酸化序列是SV40多聚腺苷酸化序列其中所述多聚腺苷酸化序列的5’端与前文所定义的所述第一和/或所述第二核苷酸序列的3’可操作地连接。
在本发明的一个实施方案中，所述编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体的第一核苷酸序列包含SEQ ID NO.18的序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体的第二核苷酸序列包含SEQ ID NO.21的序列。
IRES是内部核糖体进入位点的缩写并且是允许在mRNA序列中间的翻译起始作为更大的蛋白合成过程的一部分的核苷酸序列。在一个实施方案中，内部核糖体进入位点(IRES)也可以包含在本发明的表达载体构建体中。
为了将遗传序列***至宿主DNA中，病毒经常使用重复达上千次的DNA序列，称为重复序列，或末端重复序列包括长末端重复序列(LTR)和反向末端重复序列(ITR)，其中所述重复序列可以是5’和3’末端重复序列两者。ITR在单链载体DNA被宿主细胞DNA聚合酶复合体转变成双链DNA之后，协助细胞核中多串联体的形成。ITR序列可以来源于病毒载体，优选AAV，更优选AAV2。
在一个实施方案中，根据本发明的载体的表达盒包含5’末端重复序列和3’末端重复序列。
在一个实施方案中，所述5’和3’末端重复序列选自反向末端重复序列[ITR]和长末端重复序列[LTR]。
在一个实施方案中，所述5’和3’末端重复序列是AAV反向末端重复序列[ITR]。
在一个进一步的实施方案中，所述反向末端重复序列包含SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的序列。
表达载体还可以包含一个或多个增强子或调控元件，诸如转录后调控元件，以增加或调控转基因表达的水平。这意味着包含在病毒载体中的一种或多种多核苷酸序列的表达与没有增强子和/或调节子的载体中的表达效率相比可以增加或降低。通过使用所述增强子和/或调节子，还有可能差异性地表达包含在载体中的两种以上的基因。因此有可能将增强子或调控子指引至具有两种以上的多核苷酸序列的载体内的独特多核苷酸序列。增强子和调节子包括，但不限于，SP163、大鼠胰岛素II-内含子或其他内含子、CMV增强子和鸡[β]-球蛋白隔离子或其他隔离子。
在优选的实施方案中，本发明的多核苷酸序列受嵌入在载体内的转录后调控元件的调控。在更优选的实施方案中，所述调控元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。在更优选的实施方案(WPRE)中，所述WPRE调控本发明的两种多核苷酸之间的表达比率，优选通过增加TH的表达。
在本发明的一个实施方案中，所述第二核苷酸序列与转录后调控元件可操作地连接，其中所述转录后调控元件可以是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，其中所述土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件可以包含SEQ ID NO.22的序列。
在一个具体的实施方案中，本发明的两种多肽的表达以一定的比率发生，其中TH表达高于GCH 1表达。在优选的实施方案中，TH∶GCH 1比率在1∶1至50∶1之间，诸如1∶1至45∶1之间，例如1∶1至40∶1之间，诸如1∶1至35∶1之间，例如1∶1至30∶1之间，诸如1∶1至29∶1之间，例如1∶1至28∶1之间，诸如1∶1至27∶1之间，例如1∶1至26∶1之间，诸如1∶1至25∶1之间，例如1∶1至24∶1之间，诸如1∶1至23∶1之间，例如1∶1至22∶1之间，诸如1∶1至21∶1之间，例如1∶1至20∶1之间，诸如1∶1至19∶1之间，例如1∶1至18∶1之间，诸如1∶1至17∶1之间，例如1∶1至16∶1之间，诸如1∶1至15∶1之间，例如1∶1至14∶1之间，诸如1∶1至13∶1之间，例如1∶1至12∶1之间，诸如1∶1至11∶1之间，例如1∶1至10∶1之间，诸如1∶1至9∶1之间，诸如1∶1至8∶1之间，例如1∶1至7∶1之间，诸如7∶1，例如6∶1之间，诸如5∶1，例如4∶1，诸如3∶1，例如2∶1至8∶1之间，诸如3∶1至7∶1。
为了将表达比率控制在所需的范围，存在几种可能性。样品中存在的mRNA的水平可以通过RT PCR测量。RT-PCR利用一对引物，所述引物与cDNA的两条链中每一条上的定义序列互补。然后这些引物由DNA聚合酶延伸，并且在每个循环后形成链的一个拷贝，导致对数扩增。RT-PCR包括三个主要步骤。第一个步骤是逆转录，其中使用逆转录酶和引物将RNA逆转录成cDNA。
下一步骤涉及dsDNA的变性，以使两条链分开，并且引物可以在较低的温度下再次结合并且开始新的链反应。
PCR扩增的最后步骤是从引物的DNA延伸，其由热稳定的Taq DNA聚合酶来完成。当扩增进行时使用荧光报告分子可以将扩增子可视化。
蛋白的量可以以几种方式测量。
多核苷酸水平可以通过放射免疫测定(RIA)来检测。RIA是一种用来测量抗原浓度的非常敏感的技术，其不需要使用生物测定。为了进行放射免疫测定，经常通过用与酪氨酸连接的碘的γ-放射性同位素标记抗原从而将已知量的抗原制成为有放射性的。此放射性标记的抗原然后与已知量的针对该抗原的抗体混合，结果，两者彼此化学结合。然后，加入来自患者的含有未知量的该相同抗原的血清样品。这导致来自血清的未标记(或“冷”)抗原与放射性标记抗原竞争抗体结合位点。随着“冷”抗原的浓度增加，越来越多的抗原与抗体结合，替代了放射性标记变异体，并且减小了抗体结合的放射性标记抗原与游离的放射性标记抗原的比率。然后结合的抗原与未结合的抗原分开，并测量上清液中剩余的游离抗原的放射性。使用已知的标准品，然后可以生成结合曲线，该结合曲线能够得出患者血清中抗原的量。
也可以采用酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA是一种用来检测样品中存在蛋白或任何其他抗原的定量技术。在ELISA中，未知量的抗原固定至表面，然后在该表面上冲洗特异性抗体，使得其可以与抗原结合。此抗体与酶连接，并且在最终步骤中，加入一种物质，所述酶可以将该物质转化成一些可检测到的信号。
存在几种类型的ELISA，包括间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA和反向ELISA。也可以使用其他基于免疫的测定，诸如化学发光免疫测定和解离增强镧系元素免疫测定(Dissociation-Enhanced Lanthinide Immunoassays)。散射测浊法和比浊法也适用于蛋白测定。
确定蛋白含量的另一方式是通过基于色谱法的方法，更具体地是液相色谱法。亲和色谱法基于分析物和特定分子之间的选择性非共价相互作用。
离子交换色谱法使用离子交换机制来分离分析物。离子交换色谱法使用带电荷的固定相来分离带电荷的化合物。在常规方法中，固定相是离子交换树脂，其携带带电荷的官能团，所述官能团与要保留的化合物的带相反电荷的基团相互作用。尺寸排阻色谱法(SEC)也被称为凝胶渗透色谱(GPC)或凝胶过滤色谱。SEC用来根据其尺寸分离分子(或更准确地根据其流体力学直径或流体力学体积)。较小的分子能够进入介质的孔隙，因此，需要更长的时间洗脱，而较大的分子从孔隙中被排出，且洗脱速度更快。
反相色谱法是一种洗脱程序，其中流动相的极性大大超过固定相。因此，极性化合物先被洗脱而非极性化合物被保留。
备选方法包括电泳。电泳利用在电场的影响下分散的粒子相对于流体的运动。粒子然后以依照它们的相对电荷的速度移动。更具体地说，以下的电泳方法可用于检测CD163：
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、火箭免疫电泳、亲和免疫电泳和等电聚焦。
流式细胞仪也可用于确定蛋白含量。在流式细胞仪中，单一波长的光束定向到流体力学聚焦的流体流。许多探测器(一些为荧光探测器)瞄准流体流通过光束的点：一个与在光束一致，几个探测器与其垂直。通过光束的每个0.2至150微米的悬浮粒子以某种方式散射光，粒子中存在的或附着于粒子的荧光化学物质可被激发从而以比光源更长的波长发光。这种散射光和荧光的组合被探测器接收到，通过分析每个探测器处亮度的波动，有可能得出关于各个单个粒子的物理和化学结构的多种信息。
Luminex技术，是基于用特异性地俘获来自样品的特异性抗原的试剂包被微球的技术。
MS是一种用于测定样品或分子的元素组成的分析技术。它也用于阐明分子诸如蛋白质和其他化学化合物的化学结构。MS的原理包括将化学化合物电离以产生带电荷的分子或分子片段，并测量其质量电荷比。
酶活性可通过多种方法测量。所有酶测定测量随着时间推移底物的消耗或产物的产生。通常，主要使用四种类型的实验：初始速率实验，进展曲线实验，瞬变动力学实验或松弛实验(re1axation experiments)。这些测定包括分光光度测定、荧光测定、量热法测定、化学发光测定、光散射测定、放射测定、色谱和比色测定，诸如MTT测定。
因此，在一个实施方案中，表达比率通过测量存在的编码TH的多核苷酸的量相对于编码GCH 1的多核苷酸的量，更优选TH mRNA的量相对于GCH 1mRNA的量来确定。在另一个实施方案中，TH和GCH 1多肽的表达通过表达的蛋白质的量来测量。还在另一个优选的实施方案中，表达比率通过测量TH和CGH 1多肽的酶活性来确定。
在本发明的一个实施方案中，TH∶GCH1比率为至少3∶1，诸如至少4∶1，例如至少5∶1，诸如至少6∶1，例如至少7∶1，诸如至少10∶1，例如15∶1，诸如20∶1，例如25∶1，诸如30∶1，例如35∶1，诸如40∶1，例如45∶1，诸如50∶1。
在本发明的优选实施方案中，TH∶GCH1比率为7∶1。
在一个实施方案中，本发明的TH和GCH1的表达水平之间的比率通过测量表达的TH和GCH1酶的活性来确定。
在另一个实施方案中，本发明的TH和GCH1的表达水平之间的比率通过测量四氢生物蝶呤(BH4)的量来确定，四氢生物蝶呤是儿茶酚胺/多巴胺生物合成中的一种中间产物。
在另一个实施方案中，本发明的TH和GCH1的表达水平之间的比率通过测量转录的mRNA的量来确定。
在另一个实施方案中，本发明的TH和GCH1的表达水平之间的比率通过测量表达的蛋白质的量来确定。
酪氨酸羟化酶
酪氨酸羟化酶，缩写TH，是一种催化酪氨酸转化为3，4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)(一种多巴胺的前体)的单加氧酶。TH活性受响应于环境变化以及神经元和激素刺激的转录和翻译后机制的调控。对TH活性的最快速调节通过经由磷酸化的蛋白翻译后修饰而发生。
如前所述，酪氨酸羟化酶的主要功能是将酪氨酸转化为多巴胺。TH主要见于多巴胺能神经元中，但不仅限于这些。TH基因是在胚胎发育是必不可少的，因为TH敲除基因型在小鼠胚胎期14天内是致命的，而TH突变的杂合子小鼠正常发育，只有儿茶酚胺水平的略微下降。
TH酶是高度特异的，不接受吲哚衍生物，这与参与儿茶酚胺产生的许多其他酶的行为不同。作为合成儿茶酚胺的限速酶，TH在肾上腺素能神经元的生理学中起关键作用。儿茶酚胺，诸如多巴胺，在所述肾上腺素能神经元的信号传导中是主要参与者。肾上腺素能神经元的功能障碍通常导致几种神经退行性疾病，诸如周围神经病变、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、缺血性中风、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经***肿瘤、多发性硬化、周围神经创伤或损伤、暴露于神经毒素、代谢性疾病诸如糖尿病或肾功能不全和由传染原引起的损害，或引起情绪障碍诸如抑郁症。
在治疗帕金森氏病中可以使用采用本发明的构建体和方法施用的TH。
在本发明中编码TH的多核苷酸序列列于SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。在优选的实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12以及编码TH多肽的多核苷酸的序列变异体，所述序列变异体包含与所述SEQ ID NO.至少70％的序列同一性，更优选与SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.1275％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，诸如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，诸如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，诸如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，诸如至少99％的序列同一性。
包含在本发明的载体构建体中的编码TH的多核苷酸还可以编码TH多肽的生物学活性片段或变异体。
在优选的实施方案中，由本发明编码的TH多核苷酸的这些片段或变异体包含至少50个连续氨基酸，诸如75个连续氨基酸，例如100个连续氨基酸，诸如150个连续氨基酸，例如200个连续氨基酸，诸如250个连续氨基酸，例如300个连续氨基酸，诸如350个连续氨基酸，例如400个连续氨基酸，诸如450个连续氨基酸，其中所讨论的序列中指定的任何氨基酸被改变成不同的氨基酸，以所述片段或变异体中不超过15个氨基酸被如此改变为条件。
还包括SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14以及本发明的编码的TH多肽的突变和置换形式。在一个实施方案中，氨基酸序列中的置换是保守的，其中氨基酸被具有相似的化学和/或物理特性的另一氨基酸置换。突变可以在SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14和或在编码的TH多肽内的一个或多个位点中发生。在优选的实施方案中，本发明涉及赋予TH生物学活性的任何突变，诸如例如中性突变或沉默突变。在更优选的实施方案中，本发明涉及突变，其中丝氨酸残基S8、S19、S31、S40或S404的一个或多个被改变。
在一个实施方案中，由根据本发明的载体构建体表达的生物学活性片段包含至少50个连续氨基酸，其中在所选择的序列中指定的任何氨基酸被改变为不同的氨基酸，以序列中不多于15个氨基酸残基被如此改变为条件。
在一个实施方案中，由根据本发明的载体构建体表达的酪氨酸羟化酶(TH)多肽与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14组成的群组的多肽至少75％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少80％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少85％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少90％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQID NO.14组成的群组的多肽至少95％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少96％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少97％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少98％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQID NO.14组成的群组的多肽至少99％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽100％相同。
在一个实施方案中，由根据本发明的载体构建体表达的生物学活性片段是酪氨酸羟化酶的催化结构域。
在一个实施方案中，由根据本发明的载体构建体表达的生物学活性片段是突变的酪氨酸羟化酶多肽，其中残基S19、S31、S40或S404中的一个或多个残基已经改变为另一个氨基酸残基。
GTP-环化水解酶1
GTP-环化水解酶I(GCH 1)是酶的GTP环化水解酶家族成员。GCH 1是叶酸和生物蝶呤生物合成途径的一部分。GCH 1是四氢生物蝶呤(BH4)生物合成中的第一个和限速酶，催化GTP转化成7，8-DHNP-3′-TP。BH4是在单胺神经递质血清素(5-羟色胺(5-HT)、褪黑激素、多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素的生物合成中芳族氨基酸羟化酶(AAAH)所需要的重要辅因子。此基因的突变与恶性苯丙酮尿症和高苯丙氨酸血症，以及L-DOPA-反应性肌张力障碍有关。已经记载了编码不同同工型的数种可变剪接的转录变异体；然而，不是所有变异体都产生功能酶。
GCH 1具有许多临床意义，涉及几种功能障碍。GCH1缺陷是GTP环化水解酶1缺乏(GCH1D；也称为由于GTP环化水解酶I缺乏引起的非典型性严重苯丙酮尿症)的原因。GCH1D是由于四氢生物蝶呤缺乏引起的恶性高苯丙氨酸血症的原因之一。其也是由于神经递质多巴胺和血清素耗竭引起的缺陷性神经传递的原因，导致诸如帕金森氏病的疾病。主要症状包括：精神运动性阻滞、紧张性障碍(tonicity disorders)、惊厥、嗜睡、易怒、异常活动、体温过高、多涎和吞咽困难。一些患者可能表现严重高苯丙氨酸血症和轻度5型肌张力障碍之间的中间严重性表现型(伴有昼间波动的肌张力障碍-帕金森综合征)。在此中间表现型中，存在明显的运动迟缓，但没有智力障碍和，如果有的话，仅最轻的高苯丙氨酸血症。GCH1缺陷是5型肌张力障碍(DYT5)的原因；还称为伴有昼间波动的进行性肌张力障碍、常染色体显性Segawa综合征或伴有昼间波动的肌张力障碍-帕金森综合征。DYT5是一种DOPA-反应性肌张力障碍。肌张力障碍是根据存在持续的不随意肌收缩而定义的，经常导致异常姿势。DYT5典型地出现在童年期，其中由于下肢肌张力障碍而具有行走困难，并且晚间肌张力障碍加重。其特征是姿势和运动障碍，显示明显的昼间波动。躯干转动罕见。睡眠后症状缓解，疲劳和运动则加重。对L-DOPA有良好的反应而没有副作用。
采用本发明的构建体和方法施用的GCH 1可以用于治疗帕金森氏病。
本发明中的编码GCH 1的多核苷酸序列列于SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。在优选的实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4以及编码GCH 1多肽的多核苷酸的序列变异体，所述序列变异体包含与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4至少70％的序列同一性，更优选与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.475％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，诸如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，诸如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，诸如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，诸如至少99％的序列同一性。
包含在本发明的载体构建体中的编码GCH 1的多核苷酸还可以编码GCH 1多肽的生物学活性片段或变异体。
在优选的实施方案中，由本发明编码的GCH 1多核苷酸的这些片段或变异体包含至少50个连续氨基酸，诸如75个连续氨基酸，例如100个连续氨基酸，诸如150个连续氨基酸，例如200个连续氨基酸，诸如250个连续氨基酸，其中所讨论的序列中指定的任何氨基酸被改变为不同的氨基酸，以所述片段或变异体中不多于15个氨基酸被如此改变为条件。
还包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6以及本发明的编码的GCH 1多肽的突变和置换形式。在一个实施方案中，氨基酸序列中的置换是保守的，其中氨基酸被具有相似的化学和/或物理特性的另一氨基酸置换。突变可以在SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6和或在编码的GCH 1多肽内的一个或多个位点中发生。在优选的实施方案中，本发明涉及赋予TH生物学活性的任何突变，诸如例如中性突变或沉默突变。
在一个实施方案中，由根据本发明的载体构建体表达的生物学活性片段包含至少50个连续氨基酸，其中所选择的序列中指定的任何氨基酸被改变为不同的氨基酸，以序列中不多于15个氨基酸残基被如此改变为条件。
在一个实施方案中，由根据本发明的载体构建体表达的GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少75％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少80％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少85％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少90％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少95％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少96％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少97％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少98％相同，更优选与选自由SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少99％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽100％相同。
治疗神经退行性疾病的靶组织
治疗神经退行性疾病的一个挑战是局部施用药剂以避免过多的副作用。目前治疗大脑功能障碍的大多数药物以使得它们到达整个大脑的方式给药，最常通过口服给药。而且，当口服递送时，药物会以脉冲的方式到达靶区域，在这种脉冲的方式中波动的水平可给患者带来问题。体内基因治疗的一个重要参数是选择合适的靶组织。对于治疗帕金森氏病，壳核和尾状核是特别令人感兴趣的。更具体地，治疗应当集中在黑质中致密区的多巴胺能神经元。
在帕金森氏病中，据信经常伴随采用目前选用药L-多巴长期治疗的运动障碍是药物在脑中的波动水平的结果。
已经在帕金森氏病的临床前动物模型中进行测试的一种方式是通过使用基因治疗方式来改进多巴胺替代策略，在该方式中在多巴胺缺乏最多的壳核和尾状核中可以进行局部多巴胺替代。该方式称为“酶替代策略”。此治疗的基本原理来源于对PD患者的临床观察，其提示由口服L-DOPA用药治疗诱发的严重运动障碍可以通过经由静脉内或十二指肠途径输注的L-DOPA来缓解。因此，目前的假说是运动障碍的发展至少部分由于口服L-DOPA递送模式所产生的DA的间断性脉冲式供应。
基因治疗能够调节产生多巴胺的酶，而不是供应多巴胺或L-多巴。
因此，在本发明的具体实施方案中，编码TH和GCH 1酶的多核苷酸被递送至要治疗帕金森氏病的个体的大脑中。在优选的实施方案中，所述多核苷酸在单AAV载体中递送。在更优选的实施方案中，包含所述多核苷酸的所述载体被递送至所述个体的大脑中，优选在尾状核和/或壳核中。还在更优选的实施方案中，递送所述载体使得其在黑质致密区的多巴胺能神经元中起效。
给药和递送方案
一个重要的参数是要被递送到靶组织中的TH和GCH1的剂量。就此而言，″单位剂量″通常是指每ml TH和GCH 1组合物的TH和HCH1的浓度。对于病毒载体，TH和GCH 1的浓度可以由每ml神经营养组合物的病毒粒子数定义。最适地，对于使用病毒表达载体递送TH和GCH 1，TH和GCH 1的每个单位剂量将包含2.5至25μL的TH和GCH 1组合物，其中所述组合物包括药学上可接受流体中的病毒表达载体，并且提供每ml TH和GCH 1组合物从1010直至1015个表达TH和GCH 1的病毒粒子(图7中例证)。这样高的滴度可特别用于腺相关病毒，诸如本发明中所述的AAV载体。实施例2描述了本发明的载体的剂量方案。
在一个实施方案中，施用于有需要的患者的载体的剂量为1.5E+10至2.2E+12之间个载体基因组拷贝数每毫升壳核灰质。
在另一个实施方案中，用于制备治疗儿茶酚胺失调的药剂的载体的剂量为1.5E+10至2.2E+12个载体基因组拷贝数每毫升所述载体意欲给药的个体的壳核灰质。
在优选的实施方案中，给药部位是大脑的纹状体，尤其是尾状核和/或壳核。注射至壳核中可以标记位于大脑的各个远端区域中的靶部位，例如，苍白球、杏仁核、丘脑底核或黑质。在优选的实施方案中，靶部位(或之一)是黑质，更优选黑质中的致密区。注射还可以进入纹状体和黑质两者中。
在给定的靶部位内，载体***可以转导靶细胞。靶细胞可以是存在于神经组织中的细胞，诸如神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞，小胶质细胞或室管膜细胞。在优选的实施方案中，靶细胞是神经元，尤其是黑质中致密区的多巴胺能神经元。
载体***优选通过直接注射给药。注射至大脑(尤其是纹状体)中的方法是本领域中公知的(Bilang-Bleuel等人(1997)Proc.Acad.Nati.Sci.USA94：8818-8823；Choi-Lundberg等人(1998)Exp.Neurol.154：261-275；Choi-Lundberg等人(1997)Science 275：838-841；和Mandel等人(1997)Proc.Acad.Natl.Sci.USA 94：14083-14088)。可以给予立体定向注射。
本领域技术人员将理解本发明采用的直接递送法避免了与体内基因治疗相关的限制性危险因素。在本发明中，递送是直接的，并且选择递送部位使得分泌的Th和GCH1的扩散在大脑的受控和预定区域内发生，从而优化了与靶向神经元的接触，同时尽量减少了与非靶向细胞的接触。
载体衣壳性质的改良能够使得在鞘内(IT)注射或注射至脑室(ICV)之后，载体靶向至纹状体区域。这可以通过改良衣壳的特定结构域来实现。例如，位置587处的氨基酸突变可以去除AAV血清型2的HSPG结合亲和性，并且开放与可能是细胞类型特异性的其他细胞表面残基的结合。另一种备选方式是生成嵌合的AAV血清型，其遗传来自混合的两种血清型的不同结合性质。
药物制剂
为了形成用于本发明中的TH和GCH 1组合物，可以将编码TH和GCH 1的表达病毒载体置于药学上可接受的悬浮液、溶液或乳液中。合适的介质包括盐水和脂质体制剂。
更具体地，药学上可接受的载体可以包括非水性溶液、混悬液和乳液的无菌水溶液。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油，和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖，右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。
静脉内载体包括流体和营养物补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些)，等等。
还可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如，例如，抗菌剂，抗氧化剂，螯合剂，和惰性气体等等。此外，TH和GCH 1转基因的组合物可以使用本领域公知的手段冻干，用于后续的重构和根据本发明的用途。
胶体分散体系还可以用于靶向基因递送。
胶体分散体系包括高分子复合体、微球、珠子，和基于脂质的体系包括水包油型乳液、胶束、混合胶束和脂质体。脂质体是人工膜囊泡，其可用作体外和体内的递送载体。已经显示，尺寸范围为0.2-4.0μm的大单层囊泡(LUV)可以封装相当大百分比的包含大的高分子的缓冲水溶液。RNA、DNA和完整的病毒粒子可以封装在水性内部并且以生物学活性形式递送至细胞(Fraley，等人，Trends Biochem.Sci.，6：77，1981)。除了哺乳动物细胞以外，脂质体已被用于在植物、酵母和细菌细胞中递送可操作编码的转基因。为了使脂质体成为高效的基因转移载体，应该具有以下特性：(1)以高效率封装编码TH和GCH1的基因，同时不影响其生物学活性；(2)与非靶细胞相比，优先和实质上与靶细胞结合；(3)以高效率将囊泡的水性内容物递送至靶细胞的细胞质；和(4)遗传信息的准确和有效的表达(Mannino，等人，Biotechniques，6：682，1988)。
可用于脂质体生产的脂质的例子包括磷脂酰化合物，诸如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、脑苷脂和神经节苷脂。特别有用的是二酰基磷脂酰甘油，其中脂质部分包含14-18个碳原子，特别是16-18个碳原子，并且是饱和的。示例性的磷脂包括蛋磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。
可基于解剖学和机械因素对脂质体的靶向进行分类。解剖分类基于选择性的水平，例如，器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性。基于其是被动或主动可以区分机械性靶向。被动靶向利用脂质体分布至细胞的天然倾向，所述细胞属于含有窦状毛细血管的器官中的网状内皮***(RES)。
另一方面，主动靶向涉及脂质体的改变，所述改变通过将脂质体偶联到特异性配体诸如单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白质，或通过改变脂质体的组成或大小，以实现至除了天然发生的定位部位之外的器官和细胞类型的靶向。
靶向基因递送***的表面可以以多种方式改性。在脂质体靶向递送***的情况下，可以将脂质基团结合至脂质体的脂质双分子层中，以保持靶向配体与脂质体双分子层的稳定缔合。可以使用多种连接基团来连接脂质链与靶向配体。
因此，在一个方面，本发明涉及在治疗帕金森氏病的方法中使用的药物组合物，所述组合物包含单载体表达***和用于将所述载体递送到基底神经节的制剂，其中所述单载体表达***包含
a)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变体，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变体，条件是所述载体不包含编码芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或
b)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变体，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变体，其中所述载体是腺相关病毒载体(AAV)，或
c)表达盒，所述表达盒包含启动子、第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述启动子与所述第一核苷酸序列可操作地连接，并且其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变体，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变体，或
d)表达盒，所述表达盒包含第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列连接至所述翻译起始核苷酸序列，所述翻译起始核苷酸序列连接至所述第二核苷酸序列——的序列的侧翼是5’和3’末端重复序列，并且其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变体，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变体，其中所述末端重复序列包含能够指导可操作地连接的多肽表达的序列。
在本发明的一个实施方案中，由所述第一表达盒表达的GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中由所述第二表达盒表达的酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同。
在本发明的一个实施方案中，被表达的GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中由所述第二表达盒表达的所述酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同。
在本发明的一个实施方案中，GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ IDNO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中被编码的酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同。
在本发明的一个实施方案中，GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，并且其中被编码的酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同。
在本发明的一个实施方案中，如前文所定义的药物组合物包含甘露醇、肝素或基于钆的MRI对比剂(contrast agents)。
在另一个实施方案中，如前文所定义的药物组合物包含营养因子或可逆蛋白酶体抑制剂。
医疗用途和治疗方法
在一个方面，本发明的载体用作药剂。
在一个方面，本发明涉及如前文所定义的载体用于制备治疗与儿茶酚胺功能失调相关的疾病的药剂的用途。
在一个方面，本发明涉及如前文所定义的载体，用于治疗与儿茶酚胺功能失调相关的疾病的方法中。
在一个方面，本发明涉及一种在有需要的患者中，治疗与儿茶酚胺功能失调相关的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用如前文所定义的载体。
在本发明的一个实施方案中，儿茶酚胺功能失调是儿茶酚胺缺乏。
在本发明进一步的实施方案中，儿茶酚胺功能失调是儿茶酚胺过多。
在一个优选的实施方案中，儿茶酚胺缺乏是多巴胺缺乏。
在另一个实施方案中，儿茶酚胺过多是多巴胺过多。
在一个实施方案中，所述与儿茶酚胺功能失调相关的疾病是中枢和/或周围神经***的疾病、功能障碍或损害。
在进一步的实施方案中，所述中枢和/或周围神经***的疾病、功能障碍或损害是神经退行性疾病。
在另一个实施方案中，所述与儿茶酚胺功能失调相关的疾病是基底神经节的疾病。
在一个实施方案中，通过使用本发明的载体可治疗的疾病选自由下列各项组成的组：帕金森氏病(PD)、DOPA反应性肌张力障碍、ADHD、精神***症、抑郁症，血管性帕金森综合征、特发性震颤、慢性应激、遗传性多巴胺受体异常、阿片、***、酒精或***的长期使用、肾上腺功能不全、高血压、去甲肾上腺素缺乏症、创伤后应激障碍、病态性赌博症、痴呆、路易体痴呆。
在优选的实施方案中，通过使用本发明的载体可治疗的神经退行性疾病是帕金森氏病(PD)。
在一个方面，本发明涉及根据本发明的载体用于制备治疗神经***疾病的药剂的用途。所述神经***疾病可以是周围神经***或中枢神经***的疾病。
治疗不仅是预期的治愈性治疗，而且是预防性(preventive)(非绝对的预防)或预防(prophylactic)治疗。治疗还可以是改善性(非绝对的改善)或对症性的。
优选CNS功能障碍是神经退行性疾病或神经疾病，在本发明的一个优选实施方案中，所述神经退行性疾病是帕金森氏病。
神经***疾病可以通过向有需要的个体施用治疗有效量的本发明的病毒载体；或治疗有效量的本发明的药物组合物来治疗。
药物组合物
因此，在一个方面，本发明涉及包含如前文所定义的载体和药学上可接受载体或稀释剂的药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，如前文所定义的药物组合物的pH为pH 4至pH 9之间。
在另一个实施方案中，药物组合物的注射是颅内、脑内、静脉内、玻璃体内、鼻内、肌内、脊柱内、腹膜内、皮下、推注或连续给药。
在一个实施方案中，所述药物组合物被配制用于通过注射给药、舌下片剂或喷雾剂、皮肤给药或吸入。
在一个实施方案中，如前文所定义的药物组合物被配制用于通过注射给药、栓剂、口服给药、舌下片剂或喷雾剂、皮肤给药、吸入或用于使用可植入的生物相容性胶囊局部给药。
在进一步的实施方案中，所述注射是静脉内、肌内、脊柱内、腹膜内、皮下、推注或连续给药。
在一个实施方案中，药物组合物以30分钟至24小时的间隔进行给药。
在另一个实施方案中，药物组合物以1至6小时的间隔进行给药。
在本发明的一个实施方案中，其中所述治疗的持续时间为6至72小时。
在本发明的一个重要方面，所述治疗的持续时间为终生。
在进一步的实施方案中，如前文所定义的药物组合物被配制用于通过注射给药、栓剂、口服给药、舌下片剂或喷雾剂、皮肤给药、吸入或用于使用可植入的生物相容性胶囊局部给药。
在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物中的活性成分，即载体的剂量为每kg体重10μg至500mg之间，诸如20μg至400mg之间，例如30μg至300mg之间，诸如40μg至200mg之间，例如50μg至100mg之间，诸如60μg至90μg之间，例如70μg至80μg。
在进一步的实施方案中，根据本发明的药物组合物以72小时至至少7天的间隔给药，诸如80小时，例如96h，诸如5天，例如6天，诸如一周一次。
在进一步的实施方案中，根据本发明的药物组合物以7天至1个月的间隔给药，诸如每两周一次，例如每三周一次。
可植入的宿主细胞
在一个方面，本发明涉及包含如前文所定义的载体的分离的宿主细胞。
在一个方面，本发明涉及用根据本发明的载体转导的分离的宿主细胞。这些细胞优选是哺乳动物宿主细胞因为这些细胞能够分泌和正确地加工编码的TH和GCH1。
优选的物种包括由啮齿类动物(小鼠、大鼠)、兔、犬、猫、猪、猴、人组成的组。
对于由本发明载体转导的良好候选物的原代培养物和细胞系的例子包括由下列各项组成的组：CHO、HEK293、COS、PCI2、HiB5、RN33b、神经元细胞、胚胎细胞、ARPE-19、MDX12、C2C12、HeLa、HepG2、纹状体细胞、神经元、星形胶质细胞、中间神经元。
在一个实施方案中，本发明的宿主细胞选自由下列各项组成的组：真核细胞，优选哺乳动物细胞，更优选灵长类动物细胞，更优选人细胞。
在另一个实施方案中，本发明的宿主细胞选自由下列各项组成的组：中国仓鼠卵巢细胞、CHO-K1、幼仓鼠肾细胞、小鼠成纤维细胞-3T3细胞、非洲绿猴细胞系、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞、AT3细胞、大鼠神经胶质瘤细胞、大鼠神经元细胞和大鼠海马细胞。
实施例
实施例1：单rAAV载体在帕金森氏病的动物模型中对于连续DOPA递送的效果
材料和方法
实验设计
在下面实验中的所有大鼠(除了未处理对照组中的动物以外)接受单侧6-OHDA注射，6-OHDA注射至内侧前脑束(MFB)以达到黑质纹状体途径的全部损害。在损害后4至5小时，所有发生损害的动物在安非他明诱导的旋转实验后在旋转实验中进行筛选[Ungerstedt和Arbuthnott：Quantitative recording ofrotational behavior in rats after 6-hydroxy-dopamine lesions of the nigrostriataldopamine system；Brain Res 1970 24 485-93]。仅将表现出朝向DA耗竭侧＞6.0次转体/min的动物纳入研究中(n＝54)。
20只确认有6-OHDA损害的大鼠基于它们在圆筒实验和在安非他明-和阿朴***-诱导的旋转中的表现平均分配至两组中(Les-Sham和TH-GCH1)(图3)。损害后6周时，TH-GCH1组中的动物接受立体定向注射3.5E10 gcrAAV5-TH:GCH1载体，对照组接受假手术，手术包括打开头皮，在正确的部位钻孔，但不穿透硬脑膜。在rAAV注射后第5周和第10周，使用相同的药物诱导的旋转实验对动物进行再次测试。在rAAV后第5、第9和第13周，在相同的旋转流量计设备中在不存在先前药理学激发的情况下对动物评分(自主旋转)。在注射后第5、第12和第14周还重复了圆筒实验。为了研究对运动学习、感觉运动整合以及运动功能的治疗效果，一旦充分表现出治疗的疗效就开始进行踏步、爬梯和走廊实验的训练。在rAAV注射后第5、第10和第12周时进行踏步实验。在转导后第22-24周之间，在21天内以单实验阶段进行爬梯实验。然后将动物进行走廊实验并在第28周时处死。
40只确认有6-OHDA损害的大鼠基于它们在圆筒实验、踏步实验和走廊实验中的表现平均分配至4组中。在损害后第6周，动物立体定向注射以等体积的rAAV5-TH:GCH1载体[5μl]。接受递增浓度的载体制剂的四组形成下面的四个剂量组：0.7％[9.1E8gc]GCH1-TH(n＝10)，3.4％[4.6E9gc]GCH1-TH(n＝10)，9.8％[1.3E10gc]GCH1-TH(n＝10)，100％[1.3E11gc]GCH1-TH(n＝10)。包括相同大小的、未处理的、年龄匹配的对照组作为参照(n＝10)。在6-OHDA损害后第5周(在AAV注射前)和AAV后第12周在走廊实验中对动物进行评分。
8只确认有6-OHDA损害的动物基于它们在走廊实验和在安非他明-诱导的旋转中的表现平均分配至2组中(Les-Sham和TH-GCH1)。TH-GCH1组中的动物接受如下所述的全滴度AAV5-TH:GCH1载体的立体定向注射，并且在AAV注射后最少第6个月时使用在线微量透析进行评估。将所有动物断头并迅速地去除大脑，切除纹状体组织并快速冷冻用于生物化学分析。中脑被后固定在4％多聚甲醛(PFA)中用于确认6-OHDA损害。
载体构建
本研究中利用的病毒载体是假型rAAV2/5载体，其中目的转基因的侧翼为包装在AAV5衣壳中的AAV2(本文称为简单rAAV)的反向末端重复序列。在本发明中，构建了表达转基因TH和GCH1两者的新型质粒。在此，两个表达盒融合至单个AAV2质粒中。TH和GCH1在人突触蛋白1(Syn-1)启动子的控制下表达。GCH1基因之后紧接着晚期SV40poly-A序列，所述序列在控制TH基因表达的第二Syn-1启动子之前。为了获得超过GCH1的TH基因表达，通过添加土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)来改善TH mRNA的运输。完整的序列的末端是早期SV40poly-A序列(图1)。rAAV载体使用双转染法采用适宜的转移质粒和含有必要的腺病毒包装基因的辅助质粒来制备，如以前所述[Grimm等人：Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virusvectors；Hum Gene Ther 1998182745-60；Hauswirth等人：Production andpurification of recombinant adeno-associated virus；Meth Enzymol  2000 316743-61]。之后通过碘克沙醇不连续梯度和琼脂糖Q柱色谱将它们纯化，如在别处所详述的那样[Ulusoy等人：Dose Optimization for Long-term rAAV-mediatedRNA Interference in the Nigrostriatal Projection Neurons；Mol Ther 2009171574-84]。纯化的病毒载体悬浮液使用TaqMan定量PCR进行滴定，如在别处所述的那样[Ulusoy等人：Dose Optimization for Long-term rAAV-mediated RNAInterference in the Nigrostriatal Projection Neurons；Mol Ther 2009171574-84])，但采用靶向WPRE序列的引物和探针。注射的载体悬浮液的最终效价为1.0E13gc/m。
手术操作
在以约6ml/kg的总体积经腹膜内注射的芬太尼和Dormitor(美托咪定)(Apoteksbolaget，Sweden)的20∶1混合物诱导的麻醉下进行所有手术操作。使用10μl汉密尔顿氏注射器(Hamilton syringe)对装在立体定向框架(Stoelting，WoodDale，IL)中的动物进行注射。从前囟计算前后位(AP)和中间外侧(ML)坐标，以及从硬脑膜表面计算背腹(DV)坐标[Watson和Paxinos：The rat brain in stereotaxiccoordinates；Academic Press San Diego 1986]。
6-OHDA损害。动物接受6-OHDA(Sigma-Aldrich AB，Sweden)注射，6-OHDA注射至右侧MFB(以3.5μg/μl的浓度注射的14μg在抗坏血酸盐-盐水中的游离碱(0.02％))以便达到黑质纹状体的完全损害[Ungerstedt和Arbuthnott：Quantitative recording of rotational behavior in rats  after 6-hydroxy-dopaminelesions of the nigrostriatal dopamine system；Brain Res 1970 24 485-93]。在下面的坐标处进行注射：AP：-4.4mm；ML：-1.2mm和DV：-7.8mm，门牙固定杆(tooth bar)设为-2.4mm[Carlsson等人：Serotonin neuron transplants exacerbateL-DOPA-induced dyskinesias in a rat model of Parkinson′s disease；J Neurosci 200727 8011-22]。使用与汉密尔顿氏注射器连接的26号针头以1μl/min的注射速度进行注射，并使针头保持在合适的位置额外3min之后将其缓慢撤出。
rAAV载体注射。载体治疗组中的动物接受在林格氏乳酸盐悬浮液中的5μlrAAV5载体的立体定向注射。在下列的坐标处以一个1.5μl和一个1μl沉淀物沿两个针道中的每一个进行注射：(1)AP：+1.0mm；ML：-2.6mm和DV：-4.5，-3.5mm以及(2)AP：0mm；ML：-3.2mm和DV：-5.0，-4.0mm，门牙固定杆设为-2.4mm。使用安装在与汉密尔顿氏注射器连接的22s号针头上的拉长玻璃毛细管(外径60-80μm直径)进行注射。注射速率为0.4μl/min，并且在递送第一沉淀物后使针头保持在合适的位置1min，以及在递送第二沉淀物后保持3min，然后在从脑实质缓慢撤出针头。
行为测试
药物诱导的旋转通过使用自动旋转流量计碗(rotometer bowl)(AccuScanInstruments Inc.，Columbus，Ohio)在注射硫酸D-安非他明(2.5mg/kg，ip；Apoteksbolaget，Sweden)或阿朴***-HCl(0.05mg/kg，sc；Sigma-Aldrich AB，Sweden)后测量左侧和右侧转体，并分别监测90和40min来评估。旋转不对称评分表示为完全360°转体次数/min，同侧转动(即，朝向注射侧)被赋为正值。圆筒实验评估前肢利用不对称性，其基本上如[Kirik等：Growth and functionalefficacy of intrastriatal nigral transplants depend on the extent of nigrostriataldegeneration；J Neurosci 2001212889-96]所述的那样进行，根据[Schallert和Tillerson：Innovative models of cns disease：from molecule to therapy.Interventionstrategies for degeneration of dopamine neurons in parkinsonism：optimisingbehavioral assessment of outcome；1999 131-51]进行微小的改动。大鼠个别地放置在20cm玻璃杯中并允许其自由移动，同时用数码视频照相机记录。两个垂直的镜子置于玻璃杯后，使杯子的全部表面均可以清晰地在屏幕上看到。将动物留置在杯中直至观察到触碰杯壁至少20次。然后由对动物的分组身份不了解的观察者使用逐帧分析离线对在此探查阶段期间在杯壁上前肢的放置和使用进行评分。对在饲养期间在与杯壁20次接触期间使用的爪进行评分，并且当左前爪触碰时表示为总触碰次数的百分比。在此实验中，正常动物按平均50％记分。踏步(前肢运动不能)实验。前肢运动不能由对个体大鼠的分组身份不了解的研究者使用踏步实验来评估，所述踏步实验最初由[Schallert等人：Excessivebracing reactions and their control by atropine and L-DOPA in an animal analog ofParkinsonism；Exp Neurol 19796433-43]描述，改良为根据[Olsson等人：Forelimbakinesia in the rat Parkinson model：differential effects of dopamine agonists andnigral transnlants as assessed by a new stepping test；J Neurosci 1995 15 3863-75]的侧-踏步实验，并且如以前所述[Winkler等人：L-DOPA-induced dyskinesia in theintrastriatal 6-hydroxydopamine model of parkinson′s disease：relation to motor andcellular parameters of nigrostriatal function；Neurobiol Dis 2002 10 165-86]被采纳。简言之，研究者使用两手仅仅抓住大鼠举起大鼠的后爪和一只前爪离开桌子但使未受限制的爪子接触桌子表面。然后动物在规定的90cm距离内跨越桌子表面以缓慢恒定的步幅在5s的时间内移动。研究者对正手和反手两个方向上调整侧步的次数评分两次，并计算平均值。在6-OHDA-损害后第三周内对动物训练4天。当动物已经达到稳定的基线能力的第5-7天的平均评分形成最终的因变量。来自此时间点的数据构成治疗前基线评分。因此，最后三天的平均值用作治疗前的能力评分。在随后的三个实验阶段，rAAV注射后第6-、9-和12-周，首先驯化动物熟悉实验1天或两天，然后连续评估三天。
爬梯实验用来评估熟练的前肢伸出和抓握能力，所述实验采用对由[Montoya等人：The″staircase test″：a measure of independent forelimb reaching and graspingabilities in rats；J Neurosci Methods 1991 36 219-28]所述的最初实验设计的改良形式来进行，其如以前记载为[Winkler等人：Intranigral transplants of GABA-richstriatal tissue induce behavioral recovery in the rat Parkinson model and promote theeffects obtained by intrastriatal dopaminergic transrlants；Exp Neurol 1999 155165-86]。糖丸(TestDiet，Richmond，VA)放置在由一个宽的中央平台(35mm)隔开的双层楼梯的台阶上，所有都包封在一个小的树脂玻璃盒子(285x60x90mm)中。在第一个实验日前动物禁食48小时，并在整个实验期期间保持受限的食物摄入(6-8g/天)，仅在每天实验阶段后给予食物。以rAAV注射后21周为单个阶段进行爬梯实验。在爬梯实验中动物训练连续21天(15min/天)，在两侧台阶2-5的每个上面放置10个糖丸(总计40个糖丸/侧)，其中第1天规定为大鼠开始查找糖丸的第一日。来自第11-15天的数据用作稳定能力的评分。在第16-18天和第19-21天时，糖丸仅分别放置在左侧和右侧搁板上，给予大鼠强迫选择的挑战。熟练的前肢能力表示为帕金森(左)侧上的食入的糖丸数目(获取的-掉落的)。失误率定义为掉落的百分比((获取的-食入的/获取的)×100)。
走廊实验在6-OHDA MFB损害后第5周、AAV注射前(规定的损害基线)第12周或AAV注射后第25周时进行，如以前所述[Dowd等人：The Corridor Task：asimple test of lateralised response selection sensitive to unilateral dopaminedeafferentation and graft-derived dopamine replacement in the striatum；Brain Res Bull 20056824-30]，以研究单侧感觉运动反应选择。简言之，将大鼠放置在走廊的一端(150cm×7cm×23cm)，走廊有10对相邻的盖子，均匀地沿地板分布。每个盖子装有5-10个糖丸。查找(Retrieval)定义为每次大鼠将其鼻子伸到唯一的杯子中，无论是否它吃到任何糖丸。不与其他查找交叉的再访不计分。测试每只大鼠直至做出20次查找或经过了5分钟的最大时间。在测试前和整个测试期间限制大鼠食物，如以上在爬梯实验中所述，并且在糖丸沿地板散落的走廊中驯化10分钟，持续两天。为了减少探查行为，在评分之前将大鼠放置在空走廊中。然后将大鼠评分4天，结果表示为最后两天的平均值。数据表示为作为总查找次数的百分比的对侧查找的次数。
生化分析
12只大鼠通过断头处死，之后取出大脑并使用大脑模具沿冠状轴切成两部分。然后将来自前部的每个半球的纹状体组织迅速切下并分别在干冰上冷冻，并保存在-80℃直至进一步分析。包含中脑-后脑区的尾部在4％多聚甲醛(PFA)中在4℃后固定24小时，然后在25％蔗糖中保持至少24小时。使用前述实验方案的改良形式将切开的脑组织匀浆和制备，所述改良实验方案使得能够从同一样品通过高效液相色谱(HPLC)检测单胺和BH4，以及体外TH活性和western印迹分析[Romero-Ramos等人：Low selenium diet induces tyrosine hydroxylase enzymein nigrostriatal system of the rat；Brain Res Mol Brain Res 2000847-16]。简言之，使用超声波粉碎器在在冰上在Tris-乙酸盐缓冲液(5μl/mg，20mM，pH 6.1)中匀浆。然后将100μl匀浆液吸入至等体积的冰冷的0.8mM高氯酸中用于HPLC测量。剩余的匀浆液以17,000×g在4℃离心10min。40μl上清液进一步在10μl包含0.6％Triton X-100的Tris-乙酸盐缓冲液(20mM，pH 6.1)中进一步稀释并在-20℃保存用于体外TH活性测定。
微量透析
在异氟醚麻醉下进行微量透析实验(图8)。具有3mm长半透膜(35kD截止PES膜，Microbiotech AB)的微量透析探针在下述的坐标处***至右侧(损害和切开的(transdiced))纹状体中：AP：+0.5mm；ML：-2.9mm和DV：-4.25，-3.5mm和(2)AP：0mm；ML：-3.2mm和DV：-5.5，门牙固定杆设为-2.4mm。使用CSF以0.67μl/min的流速冲洗探针，填充直连式HPLC-EC设备的注射环使得能够用15分钟的时间分辨率进行分析。如以前所述检测和定量DA和代谢物(Ulusoy等人.Presynaptic dopaminergic compartment determines the susceptibility toL-DOPA-induced dyskinesia in rats.ProcNatlAcadSci USA(2010)vol.107(29)pp.13159-64)。数据表示为在探针植入后平衡最少1小时后采集的三次连续测量的平均值。
单胺和BH4的HPLC分析
高氯酸中的组织匀浆液在离心(15min，9,000×g，4℃)前在冰上孵育至少20min。通过Whatman滤板式过滤器以9,000×g过滤上清液另外2min。之后，样品在Mili-Q过滤的去离子水中以1∶4稀释，并在-80℃中保存直至进行分析。组织提取物然后在三个独立的测量中通过HPLC-EC分析(1)DA和血清素(5-HT)；(2)DOPA；和(3)BH4。对于每次测量，25μl每种样品通过冷却的自动进样器(Spark Holland Midas)注射至与防护池(guard cell)(ESA 5020)和玻璃-碳电极分析池(ESA 5011)连接的电化学检测器(ESA Coulochem III)。对于DA/5-HT和DOPA检测，反相C18柱(3μm ReproSil-pur，4.6mm
Figure BDA00001867481500671
150mm长，Chrompack)用于化合物分离，而对于BH4检测，其更换为另一反相C18柱(5μm ReproSil-pur，4.6mm
Figure BDA00001867481500681
250mm长，Chrompack)，其前面是C8柱(5μm ReproSil 80，4.6mm33mm长，Chrompack)。
用于DA/5-HT检测的流动相包含60mM醋酸钠、90μM Na2-EDTA、9％甲醇中的460μM 1-辛烷磺酸，其中pH调整为4.2。对于DOPA检测，其包含用H3P04调整至pH 3.0的100mM NaH2P04、90μM Na2-EDTA、10％甲醇中的1mM辛基硫酸钠。另一方面，用于BH4检测的流动相由以前描述的EC BH4检测方案进行改良[Howells和Hyland：Direct analysis of tetrahydrobiopterin in cerebrospinal fluidby high-performance liquid chromatography with redox electrochemistry：preventionof autoxidation during storage and analysis；Clin Chim Acta 1987 167 23-30]并由50mM醋酸钠、5mM柠檬酸、48μM EDTA、5％甲醇中的160μM DTE组成，pH 5.2。对于儿茶酚胺，流动相以500μl/min的流速递送，对于BH4以1ml/min的流速递送。使用清晰色谱软件包(DataApex，Prague，Czech Republic)进行峰鉴定和定量。
组织学分析
8只动物通过过量使用戊巴比妥钠(Apoteksbolaget，Sweden)进行深麻醉，并用50ml生理盐水溶液，然后用250ml新鲜制备的冰冷的在调整至pH＝7.4的0.1M磷酸盐缓冲液中的4％PFA心脏灌流。取出大脑并在相同的溶液中后固定2小时，然后在25％蔗糖中低温保护24-48小时，然后切片。固定的大脑和后固定的中脑区在半自动冷冻切片机(Microm HM 450)上切成40μm冠状切片，并收集成6个系列并在-20℃保存在抗冻液(0.5M磷酸钠缓冲液，30％甘油和30％乙二醇)中直至进一步处理。使用针对TH的抗体(兔IgG 1∶10,000Pel-Freez，Rogers，AR)，和针对GCH1的抗体(定制的兔IgG，1∶5,000)进行免疫组织化学。使用生物素化二抗(羊抗兔BA1000，Vector Laboratories，Burlingame，CA)，然后与抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶溶液(ABC Elite，Vector Laboratories)孵育1小时，通过3，3’-二氨基联苯胺在0.01％H202中的显色反应显色而将染色可视化。
实施例2：剂量计算
在完全多巴胺去神经的大鼠模型中利用单载体AAV介导的DOPA递送在啮齿动物研究中的发现已经使我们能够精确地确定功能恢复所需要的剂量范围。通过仔细的评价，我们已经发现9.1E8gc GCH1-TH(确定为0.7％，表1A)的剂量在走廊实验中导致10只动物中的2只出现明显的康复。下一个剂量4.6E9gc GCH1-TH(3.4％)导致10只动物中8只康复，而测试的两个最高剂量1.3E10gc GCH1-TH(9.8％)和1.3E11gc GCH1-TH(100％)在此实验中能够使10只动物中的10只全部康复。然而100％的剂量导致更快速的康复，在手术后第3周时就已经完全康复。
为了计算在非人灵长类动物和人中的等效剂量，基于关于MR和组织学评价的文献数据计算壳核区的换算系数(表1B)。这些数据提供了啮齿动物和人之间的换算系数为1∶60。这些数字使得能够计算物种之间的等效总剂量(表1C)，并且还确认基于目前可达到的病毒生产滴度，这样的剂量是可行的。基于假设生产滴度3E13gc/ml，注射剂量/人壳核将落在1.82μl至260μl之间(表1D)。
对于适应在壳核体积和体重方面的个体患者差异的精确度，剂量被重新定义为gc/cm3壳核灰质或kg体重(表1E)。另外，基于载体基因组的分子量(1.4g/μmol)生成了对于载体制剂的μg单链DNA(ssDNA)的等效量。
表1，治疗性剂量范围的定义
表1A，剂量定义
Figure BDA00001867481500691
表1B，物种间壳核体积的换算系数
Figure BDA00001867481500701
表1C，总剂量计算
Figure BDA00001867481500702
表1D，所需体积的计算
Figure BDA00001867481500703
*根据假定生产滴度3E13gc/ml计算
表1E，对于人治疗的特异性剂量计算的计算
Figure BDA00001867481500711
根据参考文献(3，4，5)计算的患者平均体重74kg
病毒载体基因组分子量计算为1.4g/μmol
当确定本发明的剂量时使用了下面的参考文献。
(1)Chakos等人，Striatal enlargement in rats chronically treated with neuroleptic.Biol Psychiatry(1998)vol.44(8)pp.675-84
(2)Yin等人.Striatal volume differences between non-human and humanprimates.J Neurosci Methods(2009)vol.176(2)pp.200-5
(3)Beyer等人.Weight change and body composition in patients with Parkinson′sdisease.J Am Diet Assoc(1995)vol.95(9)pp.979-83
(4)Uc等人.Predictors of weight loss in Parkinson′s disease.MovDisord(2006)vol.21(7)pp.930-6
(5)Delikanaki-Skaribas等人.Daily energy expenditure，physical activity，andweight loss in Parkinson′s disease patients.MovDisord(2009)vol.24(5)pp.667-71
本文进行和给出的所有试验程序已经得到了Lund-
Figure BDA00001867481500712
地区试验动物使用伦理委员会的批准。伦理许可号：M59-06和M267-08.
实施例3：本发明中包含的序列
SEQ ID NO 1：GTP环化水解酶1(人)
SEQ ID NO 2：GTP环化水解酶1同工型GCH-2(人)
SEQ ID NO 3：GTP环化水解酶1同工型GCH-3(人)
SEQ ID NO 4：GTP环化水解酶1同工型GCH-4(人)
SEQ ID NO 5：GTP环化水解酶1(大鼠)
SEQ ID NO 6：GTP环化水解酶1(小鼠)
SEQ ID NO 7：酪氨酸3-羟化酶(人)
SEQ ID NO 8：酪氨酸3-单加氧酶(人)
SEQ ID NO 9：酪氨酸羟化酶(人)
SEQ ID NO 10：酪氨酸羟化酶(人)
SEQ ID NO 11：酪氨酸3-单加氧酶(人)
SEQ ID NO 12：酪氨酸3-单加氧酶(人)
SEQ ID NO 13：酪氨酸3-羟化酶(大鼠)
SEQ ID NO 14：酪氨酸3-羟化酶(小鼠)
SEQ ID NO 15：腺相关病毒2左侧末端序列
SEQ ID NO 16：腺相关病毒2右侧末端序列
SEQ ID NO 17：智人(Homo sapiens)突触蛋白1(SYN1)启动子序列
SEQ ID NO 18：智人GTP环化水解酶1(GCH1)，转录变异体1
SEQ ID NO 19：猿猴病毒40早期多聚腺苷酸化序列
SEQ ID NO 20：猿猴病毒40晚期多聚腺苷酸化序列
SEQ ID NO 21：智人酪氨酸羟化酶(TH)，转录变异体2
SEQ ID NO 22：土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV8)转录后调控元件序列
SEQ ID NO 1：GTP环化水解酶1(人)
＞sp|P30793|GCH1_人GTP环化水解酶1OS＝智人(Homo sapiens)GN＝GCH1 PE＝1SV＝1EC＝3.5.4.16
替代名称：
GTP环化水解酶I
缩写名称＝GTP-CH-I或GCH-1或GCH1或GCH 1
生物体：智人(人)
http://www.uniprot.org/uniprot/P30793
MEKGPVRAPAEKPRGARCSNGFPERDPPRPGPSRPAEKPPRPEAKSAQPADGWKGERPRSEEDNELNLPNLAAAYSSILSSLGENPQRQGLLKTPWRAASAMQFFTKGYQETISDVLNDAIFDEDHDEMVIVKDIDMFSMCEHHLVPFVGKVHIGYLPNKQVLGLSKLARIVEIYSRRLQVQERLTKQIAVAITEALRPAGVGVVVEATHMCMVMRGVQKMNSKTVTSTMLGVFREDPKTREEFLTLIRS
SEQ ID NO 2：GTP环化水解酶1同工型GCH-2(人)
＞sp|P30793-2|GCH1_人GTP环化水解酶1的同工型GCH-2OS＝智人GN＝GCH1
MEKGPVRAPAEKPRGARCSNGFPERDPPRPGPSRPAEKPPRPEAKSAQPADGWKGERPRSEEDNELNLPNLAAAYSSILSSLGENPQRQGLLKTPWRAASAMQFFTKGYQETISDVLNDAIFDEDHDEMVIVKDIDMFSMCEHHLVPFVGKVHIGYLPNKQVLGLSKLARIVEIYSRRLQVQERLTKQIAVAITEALRPAGVGVVVEATSAEP
SEQ ID NO 3：GTP环化水解酶1同工型GCH-3(人)
＞sp|P30793-3|GCH1_人GTP环化水解酶1的同工型GCH-3OS＝智人GN＝GCH1
MEKGPVRAPAEKPRGARCSNGFPERDPPRPGPSRPAEKPPRPEAKSAQPADGWKGERPRSEEDNELNLPNLAAAYSSILSSLGENPQRQGLLKTPWRAASAMQFFTKGYQETISDVLNDAIFDEDHDEMVIVKDIDMFSMCEHHLVPFVGKVHIGYLPNKQVLGLSKLARIVEIYSRRLQVQERLTKQIAVAITEALRPAGVGVVVEAT
SEQ ID NO 4：GTP环化水解酶1同工型GCH-4(人)
＞sp|P30793-4|GCH1_人GTP环化水解酶1的同工型GCH-4OS＝智人GN＝GCH1MEKGPVRAPAEKPRGARCSNGFPERDPPRPGPSRPAEKPPRPEAKSAQPADGWKGERPRSEEDNELNLPNLAAAYSSILSSLGENPQRQGLLKTPWRAASAMQFFTKGYQETISDVLNDAIFDEDHDEMVIVKDIDMFSMCEHHLVPFVGKVHIGYLPNKQVLGLSKLARIVEIYSRRLQVQERLTKQIAVAITEALRPAGVGVVVEATKSNKYNKGLSPLLSSCHLFVAILK
SEQ ID NO 5：GTP环化水解酶1(大鼠)
＞sp|P22288|GCH1_大鼠GTP环化水解酶1OS＝大鼠(Rattus norvegicus)GN＝Gch1 PE＝1SV＝1MEKPRGVRCTNGFPERELPRPGASRPAEKSRPPEAKGAQPADAWKAGRPRSEEDNELNLPNLAAAYSSILRSLGEDPQRQGLLKTPWRAATAMQFFTKGYQETISDVLNDAIFDEDHDEMVIVKDIDMFSMCEHHLVPFVGRVHIGYLPNKQVLGLSKLARIVEIYSRRLQVQERLTKQIAVAITEALQPAGVGVVIEATHMCMVMRGVQKMNSKTVTSTMLGVFREDPKTREEFLTLIRS
SEQ ID NO 6：GTP环化水解酶1(小鼠)
＞sp|Q05915|GCH1_小鼠GTP环化水解酶1OS＝小家鼠(Mus musculus)GN＝Gch1PE＝2SV＝1
MEKPRGVRCTNGFSERELPRPGASPPAEKSRPPEAKGAQPADAWKAGRHRSEEENQVNLPKLAAAYSSILLSLGEDPQRQGLLKTPWRAATAMQYFTKGYQETISDVLNDAIFDEDHDEMVIVKDIDMFSMCEHHLVPFVGRVHIGYLPNKQVLGLSKLARIVEIYSRRLQVQERLTKQIAVAITEALQPAGVGVVIEATHMCMVMRGVQKMNSKTVTSTMLGVFREDPKTREEFLTLIRS
SEQ ID NO 7：酪氨酸3-羟化酶(人)
EC＝1.14.16.2
替代名称：酪氨酸3-单加氧酶或酪氨酸3-羟化酶或酪氨酸羟化酶
缩写名称＝TH
生物体：智人(人)
MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAVLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAI
SEQ ID NO 8：酪氨酸3-单加氧酶(人)
＞sp|P07101|TY3H_人酪氨酸3-单加氧酶OS＝智人GN＝TH PE＝1SV＝5MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMVRGQGAPGPSLTGSPWPGTAAPAASYTPTPRSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAVLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
SEQ ID NO 9：酪氨酸羟化酶(人)
＞tr|Q2M3B4|Q2M3B4_人酪氨酸羟化酶OS＝智人GN＝TH PE＝2SV＝1
MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAMLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
SEQ ID NO 10：酪氨酸羟化酶(人)
＞tr|B7ZL73|B7ZL73_人TH蛋白OS＝智人GN＝TH PE＝2SV＝1
MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMVRGQSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAMLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADHTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
SEQ ID NO 11：酪氨酸3-单加氧酶(人)
＞sp|P07101|TY3H_人酪氨酸3-单加氧酶OS＝智人GN＝TH PE＝1SV＝5
MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMVRGQGAPGPSLTGSPWPGTAAPAASYTPTPRSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAVLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
SEQ ID NO 12：酪氨酸3-单加氧酶(人)
＞sp|P07101|TY3H_人酪氨酸3-单加氧酶OS＝智人GN＝TH PE＝1SV＝5MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMVRGQGAPGPSLTGSPWPGTAAPAASYTPTPRSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAVLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
SEQ ID NO 13：酪氨酸3-羟化酶(大鼠)
＞sp|P04177|TY3H_大鼠酪氨酸3-单加氧酶OS＝大鼠GN＝Th PE＝1SV＝3MPTPSAPSPQPKGFRRAVSEQDAKQAEAVTSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAAAAAAAAVASSEPGNPLEAVVFEERDGNAVLNLLFSLRGTKPSSLSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPLAGSPHLEYFVRFEVPSGDLAALLSSVRRVSDDVRSAREDKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYKHGEPIPHVEYTAEEIATWKEVYVTLKGLYATHACREHLEGFQLLERYCGYREDSIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTVYWFTVEFGLCKQNGELKAYGAGLLSSYGELLHSLSEEPEVRAFDPDTAAVQPYQDQTYQPVYFVSESFNDAKDKLRNYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPHTIQRSLEGVQDELHTLAHALSAIS
SEQ ID NO 14：酪氨酸3-羟化酶(小鼠)
＞sp|P24529|TY3H_小鼠酪氨酸3-单加氧酶OS＝小鼠GN＝Th PE＝1sV＝3MPTPSASSPQPKGFRRAVSEQDTKQAEAVTSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAAAAAAAAVASAEPGNPLEAVVFEERDGNAVLNLLFSLRGTKPSSLSRALKVFETFEAKIHHLETRPAQRPLAGSPHLEYFVRFEVPSGDLAALLSSVRRVSDDVRSAREDKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQAYRQRRKLIAEIAFQYKQGEPIPHVEYTKEEIATWKEVYATLKGLYATHACREHLEAFQLLERYCGYREDSIPQLEDVSHFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTVYWFTVEFGLCKQNGELKAYGAGLLSSYGELLHSLSEEPEVRAFDPDTAAVQPYQDQTYQPVYFVSESFSDAKDKLRNYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPHTIRRSLEGVQDELHTLTQALSAIS
SEQ ID NO 15：腺相关病毒2左侧末端序列
ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct
SEQ ID NO 16：腺相关病毒2右侧末端序列
aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa
SEQ ID NO 17：智人突触蛋白1(SYN1)启动子序列
CTAGACTCTAGCTGCAGAGGGACCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGTCGA
SEQ ID NO 18：智人GTP环化水解酶1(GCH1)，转录变异体1
ATGGAGAAGGGCCCTGTGCGGGCACCGGCGGAGAAGCCGCGGGGCGCCAGGTGCAGCAATGGGTTCCCCGAGCGGGATCCGCCGCGGCCCGGGCCCAGCAGGCCGGCGGAGAAGCCCCCGCGGCCCGAGGCCAAGAGCGCGCAGCCCGCGGACGGCTGGAAGGGCGAGCGGCCCCGCAGCGAGGAGGATAACGAGCTGAACCTCCCTAACCTGGCAGCCGCCTACTCGTCCATCCTGAGCTCGCTGGGCGAGAACCCCCAGCGGCAAGGGCTGCTCAAGACGCCCTGGAGGGCGGCCTCGGCCATGCAGTTCTTCACCAAGGGCTACCAGGAGACCATCTCAGATGTCCTAAACGATGCTATATTTGATGAAGATCATGATGAGATGGTGATTGTGAAGGACATAGACATGTTTTCCATGTGTGAGCATCACTTGGTTCCATTTGTTGGAAAGGTCCATATTGGTTATCTTCCTAACAAGCAAGTCCTTGGCCTCAGCAAACTTGCGAGGATTGTAGAAATCTATAGTAGAAGACTACAAGTTCAGGAGCGCCTTACAAAACAAATTGCTGTAGCAATCACGGAAGCCTTGCGGCCTGCTGGAGTCGGGGTAGTGGTTGAAGCAACACACATGTGTATGGTAATGCGAGGTGTACAGAAAATGAACAGCAAAACTGTGACCAGCACAATGTTGGGTGTGTTCCGGGAGGATCCAAAGACTCGGGAAGAGTTCCTGACTCTCATTAGGA
SEQ ID NO 19：猿猴病毒40早期多聚腺苷酸化序列
TTCGAGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCGTCTAGCATCGAA
SEQ ID NO 20：猿猴病毒40晚期多聚腺苷酸化序列CAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTT
SEQ ID NO 21：智人酪氨酸羟化酶(TH)，转录变异体2
ATGCCCACCCCCGACGCCACCACGCCACAGGCCAAGGGCTTCCGCAGGGCCGTGTCTGAGCTGGACGCCAAGCAGGCAGAGGCCATCATGTCCCCGCGGTTCATTGGGCGCAGGCAGAGCCTCATCGAGGACGCCCGCAAGGAGCGGGAGGCGGCGGTGGCAGCAGCGGCCGCTGCAGTCCCCTCGGAGCCCGGGGACCCCCTGGAGGCTGTGGCCTTTGAGGAGAAGGAGGGGAAGGCCGTGCTAAACCTGCTCTTCTCCCCGAGGGCCACCAAGCCCTCGGCGCTGTCCCGAGCTGTGAAGGTGTTTGAGACGTTTGAAGCCAAAATCCACCATCTAGAGACCCGGCCCGCCCAGAGGCCGCGAGCTGGGGGCCCCCACCTGGAGTACTTCGTGCGCCTCGAGGTGCGCCGAGGGGACCTGGCCGCCCTGCTCAGTGGTGTGCGCCAGGTGTCAGAGGACGTGCGCAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTACTGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGTAAGCAGAACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTACACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGG
SEQ ID NO 22：土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV8)转录后调控元件序列
CGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTCGAGCT
Figure IDA00001867482300011
Figure IDA00001867482300021
Figure IDA00001867482300031
Figure IDA00001867482300051
Figure IDA00001867482300061
Figure IDA00001867482300071
Figure IDA00001867482300081
Figure IDA00001867482300091
Figure IDA00001867482300101
Figure IDA00001867482300111
Figure IDA00001867482300131
Figure IDA00001867482300141
Figure IDA00001867482300161
Figure IDA00001867482300171
Figure IDA00001867482300181
Figure IDA00001867482300191
Figure IDA00001867482300201
Figure IDA00001867482300211
Figure IDA00001867482300231
Figure IDA00001867482300241

Claims (105)

1.一种单载体表达***，包含
a)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，条件是所述载体不包含编码芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或
b)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述载体是腺相关病毒载体(AAV)，或
c)表达盒，所述表达盒包含启动子、第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述启动子与所述第一核苷酸序列可操作地连接，并且其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，或
d)表达盒，所述表达盒包含第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列连接至所述翻译起始核苷酸序列，所述翻译起始核苷酸序列连接至所述第二核苷酸序列——的序列的侧翼是5’和3’末端重复序列，并且其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述末端重复序列中的至少一个包含能够指导可操作地连接的多肽表达的序列。
2.权利要求1a)所述的载体，其中由所述第一表达盒表达的所述GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，并且其中由所述第二表达盒表达的所述酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQID NO.14。
3.权利要求1b)所述的载体，其中被表达的所述GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，并且其中由所述第二表达盒表达的所述酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
4.权利要求1c)所述的载体，其中被编码的GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，并且其中被编码的酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
5.权利要求1d)所述的载体，其中被编码的GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，并且其中被编码的酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
6.权利要求1至5中任一项所述的载体，其中所述载体不包含编码芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列。
7.权利要求1所述的载体，其中所述载体具有1至40kb，例如1至30kb，诸如1至20kb，例如1至15kb，诸如1至10，例如1至8kb，诸如2至7kb，例如3至6kb，诸如4至5kb的包装容量。
8.权利要求1所述的载体，其中所述载体具有4.5至4.8kb的包装容量。
9.权利要求1至8中任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
10.权利要求1至8中任一项所述的载体，其中所述载体是质粒载体。
11.权利要求1至8中任一项所述的载体，其中所述载体是合成载体。
12.权利要求9所述的载体，其中所述病毒载体选自由下列各项组成的群组：腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体。
13.权利要求9所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒载体(AAV)。
14.权利要求12所述的载体，其中所述腺相关病毒载体(AAV)是AAV2载体。
15.权利要求14所述的载体，其中所述AAV2载体的衣壳包装在不同于AAV2衣壳的AAV衣壳中。
16.权利要求15所述的载体，其中所述AAV2载体包装在AAV5衣壳中。
17.权利要求1至16中任一项所述的载体，其中所述载体在哺乳动物细胞中起作用。
18.权利要求1至5中任一项所述的载体，其中所述生物学活性片段包含至少50个连续氨基酸，其中所选择序列中指定的任一个氨基酸被改变为不同的氨基酸，以所述序列中不多于15个氨基酸残基被这样改变为条件。
19.权利要求18所述的载体，其中所述生物学活性片段是酪氨酸羟化酶的催化结构域。
20.权利要求1所述的载体，其中所述生物学活性变异体是突变的酪氨酸羟化酶多肽，其中残基S19、S31、S40或S404中的一个或多个已经被改变为另一个氨基酸残基。
21.权利要求1至20中任一项所述的载体，其中所述GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少70％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少75％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少80％相同，更优选与选自由SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少85％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6组成的群组的多肽至少90％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少95％相同，更优选与选自由肽SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少96％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少97％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少98％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽至少99％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的群组的多肽1()()％相同。
22.权利要求1至20中任一项所述的载体，其中所述酪氨酸羟化酶(TH)多肽与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少70％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQID NO.14组成的群组的多肽至少75％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少80％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少85％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少90％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少95％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少96％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少97％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少98％相同，更优选与选自由SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽至少99％相同，更优选与选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14组成的群组的多肽100％相同。
23.权利要求1所述的载体，其中所述第一和/或所述第二启动子是对哺乳动物细胞特异的启动子。
24.权利要求23所述的载体，其中所述哺乳动物细胞是神经细胞。
25.权利要求34所述的载体，其中所述神经细胞是神经元。
26.权利要求1所述的载体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是突触蛋白1启动子。
27.权利要求1所述的载体，其中所述第一启动子或所述第二启动子是突触蛋白1启动子。
28.权利要求1所述的载体，其中所述启动子是组成型启动子。
29.权利要求28所述的载体，其中所述组成型活性启动子选自由下列各项组成的群组：CAG、CMV、人UbiC、RSV、EF-1α、SV40、Mt1。
30.权利要求1所述的载体，其中所述启动子是诱导型启动子。
31.权利要求30所述的载体，其中所述诱导型启动子选自由下列各项组成的群组：Tet-On、Tet-Off、Mo-MLV-LTR、Mx1、孕酮、RU486和雷帕霉素-诱导型启动子。
32.权利要求1所述的载体，其中所述第一表达盒或所述第二表达盒还包含多聚腺苷酸化序列。
33.权利要求1所述的载体，其中所述第一表达盒和所述第二表达盒还包含多聚腺苷酸化序列。
34.权利要求32或33任一项所述的载体，其中所述多聚腺苷酸化序列是SV40多聚腺苷酸化序列。
35.权利要求32至34中任一项所述的载体，其中所述多聚腺苷酸化序列的5’与所述第一核苷酸序列和/或所述第二核苷酸序列的3’可操作地连接。
36.权利要求1所述的载体，其中编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体的所述第一核苷酸序列包含SEQ ID NO.18的序列。
37.权利要求1所述的载体，其中编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体的所述第二核苷酸序列包含SEQ ID NO.21的序列。
38.权利要求1至37中任一项所述的载体，其中所述第二核苷酸序列与转录后调控元件可操作地连接。
39.权利要求38所述的载体，其中所述转录后调控元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
40.权利要求39所述的载体，其中所述土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件包含SEQ ID NO.22的序列。
41.权利要求1至40中任一项所述的载体，其中所述载体的所述表达盒包含5’末端重复序列和3’末端重复序列。
42.权利要求41所述的载体，其中所述5’和3’末端重复序列选自反向末端重复序列[ITR]和长末端重复序列[LTR]。
43.权利要求41所述的载体，其中所述5’和3’末端重复序列是AAV反向末端重复序列[ITR]。
44.权利要求43所述的载体，其中所述反向末端重复序列包含SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16的序列。
45.权利要求1至44中任一项所述的载体，其中TH∶GCH1的比率为至少3∶1，诸如至少4∶1，例如至少5∶1，诸如至少6∶1，例如至少7∶1，诸如至少10∶1，例如15∶1，诸如20∶1，例如25∶1，诸如30∶1，例如35∶1，诸如40∶1，例如45∶1，诸如50∶1。
46.权利要求1至44中任一项所述的载体，其中所述TH∶GCH1的比率为7∶1。
47.权利要求45至46中任一项所述的载体，其中所述比率通过测量表达的TH和GCH1酶的活性来确定。
48.权利要求45至46中任一项所述的载体，其中所述比率通过测量四氢生物蝶呤(BH4)的量来确定。
49.权利要求45至46中任一项所述的载体，其中所述比率通过转录的mRNA的量来确定。
50.权利要求45至46中任一项所述的载体，其中所述比率通过表达的蛋白质的量来确定。
51.前述任一项权利要求所述的载体，其中所述载体是图6中所限定的载体。
52.权利要求1至51中任一项所述的载体，其中所述载体是最小整合型载体。
53.权利要求1至52中任一项所述的载体，用作药剂。
54.一种分离的宿主细胞，包含权利要求1至53中任一项所述的载体。
55.权利要求54所述的宿主细胞，其中所述细胞选自由真核细胞组成的群组，优选哺乳动物细胞，更优选灵长类动物细胞，更优选人细胞。
56.权利要求55所述的宿主细胞，其中所述细胞选自由下列各项组成的群组：中国仓鼠卵巢细胞、CHO-K1、幼仓鼠肾细胞、小鼠成纤维细胞-3T3细胞、非洲绿猴细胞系、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞、AT3细胞、大鼠神经胶质瘤细胞、大鼠神经元细胞和大鼠海马细胞。
57.权利要求1至56中任一项所述的载体在制备用于治疗与儿茶酚胺功能失调相关的疾病的药剂中的用途。
58.权利要求57所述的用途，其中所述儿茶酚胺功能失调是儿茶酚胺缺乏。
59.权利要求57所述的用途，其中所述儿茶酚胺功能失调是儿茶酚胺过多。
60.权利要求58所述的用途，其中所述儿茶酚胺缺乏是多巴胺缺乏。
61.权利要求59所述的用途，其中所述儿茶酚胺过多是多巴胺过多。
62.权利要求57至61中任一项所述的用途，其中所述与儿茶酚胺功能失调相关的疾病是中枢和/或周围神经***的疾病、功能障碍或损害。
63.权利要求62所述的用途，其中所述中枢和/或周围神经***的疾病、功能障碍或损害是神经退行性疾病。
64.权利要求57至63中任一项所述的用途，其中所述与儿茶酚胺功能失调相关的疾病是基底神经节的疾病。
65.权利要求64所述的用途，其中所述疾病选自由下列各项组成的群组：帕金森氏病(PD)、DOPA反应性肌张力障碍、ADHD、精神***症、抑郁症、血管性帕金森综合征、特发性震颤、慢性应激、遗传性多巴胺受体异常、阿片、***、酒精或***的长期使用、肾上腺功能不全、高血压、去甲肾上腺素缺乏症、创伤后应激障碍、病态性赌博、痴呆、路易体痴呆。
66.权利要求65所述的用途，其中所述神经退行性疾病是帕金森氏病(PD)。
67.权利要求1至53中任一项所述的载体，用于治疗与儿茶酚胺功能失调相关的疾病的方法中。
68.权利要求67所述的载体，其中所述儿茶酚胺功能失调是儿茶酚胺缺乏。
69.权利要求67所述的载体，其中所述儿茶酚胺功能失调是儿茶酚胺过多。
70.权利要求68所述的载体，其中所述儿茶酚胺缺乏是多巴胺缺乏。
71.权利要求69所述的载体，其中所述儿茶酚胺过多是多巴胺过多。
72.权利要求67至71中任一项所述的载体，其中所述与儿茶酚胺功能失调相关的疾病是中枢和/或周围神经***的疾病、功能障碍或损害。
73.权利要求72所述的载体，其中所述中枢和/或周围神经***的疾病、功能障碍或损害是神经退行性疾病。
74.权利要求67至73中任一项所述的载体，其中所述与儿茶酚胺功能失调相关的疾病是基底神经节的疾病。
75.权利要求74所述的载体，其中所述疾病选自由下列各项组成的群组：帕金森氏病(PD)、DOPA反应性肌张力障碍、ADHD、精神***症、抑郁症、血管性帕金森综合征、特发性震颤、慢性应激、遗传性多巴胺受体异常、阿片、***、酒精或***的长期使用、肾上腺功能不全、高血压、去甲肾上腺素缺乏症、创伤后应激障碍、病态性赌博、痴呆、路易体痴呆。
76.权利要求75所述的载体，其中所述神经退行性疾病是帕金森氏病(PD)。
77.一种治疗需要所述治疗的患者中的与儿茶酚胺功能失调相关的疾病的方法，所述方法包括向个体施用权利要求1至53中任一项所述的载体。
78.权利要求77所述的方法，其中所述儿茶酚胺功能失调是儿茶酚胺缺乏。
79.权利要求77所述的方法，其中所述儿茶酚胺功能失调是儿茶酚胺过多。
80.权利要求78所述的方法，其中所述儿茶酚胺缺乏是多巴胺缺乏。
81.权利要求79所述的方法，其中所述儿茶酚胺过多是多巴胺过多。
82.权利要求77至81中任一项所述的方法，其中所述与儿茶酚胺功能失调相关的疾病是中枢和/或周围神经***的疾病、功能障碍或损害。
83.权利要求82所述的方法，其中所述中枢和/或周围神经***的疾病、功能障碍或损害是神经退行性疾病。
84.权利要求77至83中任一项所述的方法，其中所述与儿茶酚胺功能失调相关的疾病是基底神经节的疾病。
85.权利要求84所述的方法，其中所述疾病选自由下列各项组成的群组：帕金森氏病(PD)、DOPA反应性肌张力障碍、ADHD、精神***症、抑郁症、血管性帕金森综合征、特发性震颤、慢性应激、遗传性多巴胺受体异常、阿片、***、酒精或***的长期使用、肾上腺功能不全、高血压、去甲肾上腺素缺乏症、创伤后应激障碍、病态性赌博、痴呆、路易体痴呆。
86.权利要求84所述的方法，其中所述神经退行性疾病是帕金森氏病(PD)。
87.一种用于治疗帕金森氏病的方法中的药物组合物，所述组合物包含单载体表达***和用于将所述载体递送至基底神经节的制剂，其中所述单载体表达***包含
a)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，条件是所述载体不包含编码芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或
b)第一和第二表达盒，所述第一表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第一核苷酸序列可操作地连接的第一启动子序列，所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二表达盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与第二核苷酸序列可操作地连接的第二启动子序列，所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述载体是腺相关病毒载体(AAV)，或
c)表达盒，所述表达盒包含启动子、第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述启动子与所述第一核苷酸序列可操作地连接，并且其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，或
d)表达盒，所述表达盒包含第一核苷酸序列、翻译起始核苷酸序列诸如内部核糖体进入位点(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻译起始核苷酸序列连接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第—核苷酸序列连接至所述翻译起始核苷酸序列，所述翻译起始核苷酸序列连接至所述第二核苷酸序列——的序列的侧翼是5’和3’末端重复序列，并且其中所述第一核苷酸序列编码GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，并且其中所述第二核苷酸序列编码酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述末端重复序列包含能够指导可操作地连接的多肽表达的序列。
88.权利要求87a)所述的组合物，其中由所述第一表达盒表达的所述GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，并且其中由所述第二表达盒表达的所述酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
89.权利要求87b)所述的组合物，其中被表达的所述GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体，其中所述多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6，并且其中由所述第二表达盒表达的所述酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
90.权利要求87c)所述的组合物，其中被编码的GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，并且其中所述被编码的酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
91.权利要求87d)所述的组合物，其中被编码的GTP-环化水解酶1(GCH1)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，并且其中被编码的酪氨酸羟化酶(TH)多肽或其生物学活性片段或变异体与选自由下列各项组成的群组的多肽至少70％相同：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
92.权利要求91所述的药物组合物，其中所述制剂包含甘露醇、肝素或基于钆的MRI对比剂。
93.权利要求91至92中任一项所述的药物组合物，进一步包含营养因子或可逆蛋白酶体抑制剂。
94.一种药物组合物，包含权利要求1至53中任一项所述的载体，和药学上可接受的载体或稀释剂。
95.权利要求94所述的药物组合物，被配制用于注射给药、舌下含片或喷雾剂、皮肤给药或吸入。
96.权利要求95所述的药物组合物，其中所述注射是颅内、脑内、静脉内、玻璃体内、鼻内、肌内、脊柱内、腹膜内、皮下、推注或连续给药。
97.根据权利要求91至96中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物的pH在pH 4至pH 10之间。
98.根据权利要求91至97中任一项所述的药物组合物，其中所述载体的剂量为每毫升壳核灰质1.5E+10至2.2E+12之间个载体基因组拷贝。
99.根据权利要求91至98中任一项所述的药物组合物，其中以30分钟至24小时的间隔进行给药。
100.根据权利要求91至98中任一项所述的药物组合物，其中以1至6小时的间隔进行给药。
101.根据权利要求91至98中任一项所述的药物组合物，其中所述治疗的持续时间为6至72小时。
102.根据权利要求91至98中任一项所述的药物组合物，其中所述治疗的持续时间为终生。
103.一种用于分别确定GTP环化水解酶1多肽(SEQ ID NO.1、2、3、4、5和6)与酪氨酸羟化酶多肽(SEQ ID NO.7、8、9、10、11、12、13和14)，或它们的变异体的表达比率的方法，所述多肽由权利要求1至53中任一项所定义的载体编码，所述方法包括测量：
a.所述多肽的酶活性，或
b.产生的BH4的量，或
c.所述多肽的表达量，或
d.分别与GTP环化水解酶1多肽和酪氨酸羟化酶的多肽相对应的转录mRNA的水平。
104.权利要求103所述的方法，其中所述比率通过所述多肽的活性和所述多肽的存在量的组合来确定。
105.一种组件试剂盒，所述试剂盒包含权利要求91至102中任一项所述的药物组合物和用药说明书。
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