CN1026898C - 溶菌酶生产方法 - Google Patents

Abstract

一种以柞蚕蛹为原料生产溶菌酶的生产方法。柞蚕蛹含有丰富的溶菌酶，经人工诱导后提高酶活力10倍以上，收集蛹血、加热、直接用DEAE——纤维素及甲壳质包裹纤维素柱层析，洗脱后真空浓缩，透析，真空干燥而得到产品，酶的回收率高。有关纤维素可再生使用，本方法的工艺可与蚕蛹综合利用的其他工艺(如提取蛹蛋白等)相衔接。

Description

本发明是涉及溶菌酶的生产方法，对现有技术的改进，溶菌酶是专门溶解细菌的酶类。目前，溶菌酶的制备采用鸡蛋清为原料，在生产过程中采用盐析法或酒精沉淀除去蛋白，或用树脂层析纯化技术。因此，增加了脱盐工序及在洗脱过程中将蛋清大量稀释，使干燥时耗费能源。

本发明以柞蚕蛹为原料，蚕蛹经人工诱导提高溶菌酶的活力;加热除蛋白，DEAE-纤维素层析分离，甲壳质包裹的纤维素层析纯化，真空干燥而成。溶菌酶得率高，工艺简单，成本低廉，纤维素层析可半自动化调控，纤维素可再生使用。柞蚕蛹除提取溶菌酶外，还可生产大量有经济价值的产品，如蛹油、蛹蛋白等，其工艺互相衔接。

生产流程如框图1。

一.柞蚕蛹的收集：用活蛹缫丝后的蚕蛹，剔除死、破蛹体后供用;削茧蛹应保持蛹体完好，受伤或损破者弃去。

二、人工诱导：诱导方法有三种。

1.注射大肠杆菌：菌种分别为E·coli K₁₂D₃₁或HB₁₀₁，剂量为10⁸菌/ml，每蛹注射50μl，注射后在25℃放置72小时以上供用。

2.热空气诱导：将活蛹置50℃～55℃热空气箱中处理30～60分钟，处理后在25℃放置48～72小时供用。

3.超声波诱导：将活蛹浸入流水中，用超声波发生器处理，频率20仟赫兹，功率150瓦，时间5-10分钟。处理后在25℃转/分离心，收集蛹血，残余蛹体供综合利用。

四.蛹血除蛋白：加入苯基硫脲0.02%～0.05%，水浴中快速拌搅加热至60℃，并速冷至室温，离心除去蛋白沉淀，收集清液即溶菌酶组分。剩余的蛹血残渣供综合利用。

五.调整pH：溶菌酶组分加入等体积0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后进行柱层析。

六.DEAE-纤维素柱层析：DEAE-纤维素离子交换层析，按常规活化，装柱。柱直径与高比例为1∶10～12，柱内先用碱性缓冲液使柱内充分饱和，可选用0.1M，pH8.0磷酸盐，将上述 溶菌酶组分注入柱内作离子交换，控制流速2ml/cm²·分钟，用0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液洗脱溶菌酶组分。DEAE-纤维素柱回收蛹血蛋白后再生供用。

七.甲壳质包裹纤维素柱层析：甲壳质包裹纤维素活化后装柱，先用0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液将柱内充分饱和后，再用无离子水洗至微碱性，将DEAE-纤维素柱层析后洗脱的溶菌酶组分注入甲壳质包裹纤维素柱内作亲和层析，控制流速2ml/cm²·分钟，待充分亲和吸附后，用0.1M，pH2～2.5乙酸缓冲液洗脱溶菌酶组分，甲壳质包裹纤维素再生供用。

八.真空浓缩、透析及干燥：收集溶菌酶组分，在60℃，600mmHg下用真空薄膜浓缩器浓缩到粘稠状，移入透析袋中，在4℃下流水透析除去盐分，内容物在60℃，600mmHg下真空干燥，即为溶菌酶制品。

活柞蚕蛹1kg作原料，将大肠杆菌K₁₂D₃₁接种于液体LB培养基（蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g，加水至1升，pH7.2）中，37℃振荡培养过液，达到10⁸菌/ml的水平，每蛹注射50μl，放置于25℃，72小时。

蚕蛹穿刺后离心取蛹血，篮式离心机3000转/分钟，离心10分钟，收集蛹血约150ml。加入0.02%苯基硫脲，在水浴中搅拌加热至60℃，速冷至室温，离心3000转/分钟。10分钟以除去蛋白，清液为溶菌酶组分。

溶菌酶组分中加入等体积0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液，用DEAE-纤维素柱层析，收集流出的溶菌酶组分，约250ml，用甲壳质包裹纤维素作亲和层析，柱内用0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液饱和。吸附层析后，用0.1M，pH2.0～2.5乙酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱的溶菌酶组分，约150ml。

将溶菌酶组分在60℃，600mmHg真空浓缩至粘稠状，用半透膜透析去盐，内容物在60℃，600mmHg下抽干，即为成品，约100mg，酶活力达到20000单位/mg蛋白水平。

实例二

活柞蚕蛹1kg作原料，将蚕蛹置52℃烘箱内处理30分钟，置25℃，48小时。

蚕蛹穿刺后离心取蛹血，收集蛹血约150ml，加入0.02%苯基硫脲，在水溶中搅拌加热至60℃，速冷至室温，离心3000转/分，10分钟以除去蛋白，清液为溶菌酶组分。

溶菌酶组分中加入等体积0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液，用DEAE-纤维素离子交换柱层析，收集流出的溶菌酶组分，约250ml。

市售甲壳质50g，用40%NaOH液充分浸泡，捣碎，37℃浸渍3小时，用水冲洗，抽滤以除去余碱，使转化为去乙酰甲壳质。在碱性（pH10）条件下，加入100g纤维素，充分拌搅，然后用冰乙酸调至酸性，使甲壳质沉淀，水洗去余酸，用0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液浸泡，装柱后将DEAE-纤维素洗脱的溶菌酶组分注入其中进行亲和层析，最后用0.1MpH2～2.5乙酸盐缓冲液洗脱溶菌酶组分，约收集150ml。

将溶菌酶组分在60℃，600mmHg真空浓缩至粘稠状，用半透膜透析去盐，内容物在60℃，600mmHg下抽干，即为成品，约得85mg，酶活力达到18000单位/mg·蛋白水平。

参考文献

1.Emel′yanenko，P.A.，Stayukova，L.G.，1983，Extraction    of    lysozyme    from    colostrum.USSRpatent，SU    1041937Al，CA，99（25）208831y.

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Claims (9)

1、溶菌酶生产方法，其特征在于：

(1)以柞蚕蛹为原料；

(2)蚕蛹经人工诱导提高蛹血中酶的活力；

(3)收集蛹血，蛹血加热除蛋白得溶菌酶组分；

(4)溶菌酶组分在碱性条件下，经DEAE-纤维素离子交换柱得粗酶制剂；

(5)粗酶制剂经甲壳质包裹纤维素亲和层析柱纯化，纯化后酶制剂真空浓缩干燥得到产品。

2、根据权利要求1所说的溶菌酶生产方法，其特征在于所说的人工诱导蚕蛹选自下列三种方法：

（1）注射大肠杆菌诱导：菌种分别为E·coliK₁₂D₃₁或HB₁₀₁，剂量为10⁸个菌/ml，每蛹注射50ml，注射后在25℃，放置72小时以上;

（2）热空气诱导;将活蛹置50℃-55℃热空气箱中处理30-60分钟，处理后在25℃，放置48-72小时;

（3）超声波诱导：将活蛹浸入流动的水中，用频率为20仟赫兹，功率150瓦超声波发生器处理5-10分钟，处理后在25℃，放置72-96小时。

3、根据权利要求1所说的溶菌酶生产方法，其特征在于蛹血中加入苯基硫脲0.02%-0.05%，并在水浴中加热至60℃，使蛋白沉淀，离心后得溶菌酶组分。

4、根据权利要求3所说的溶菌酶生产方法，其特征在于经离心除蛋白后的溶菌酶组分中加入等体积的0.1M，pH8.0的磷酸盐。

5、根据权利要求1、4所说的溶菌酶生产方法，其特征在于溶菌酶组分经DEAE-纤维素离子交换柱作离子交换。

6、根据权利要求5所说的溶菌酶生产方法，其特征在于DETE-纤维素柱用0.1M，pH8.0磷酸盐所饱和。

7、根据权利要求1所说的溶菌酶生产方法，其特征在于粗酶制剂经甲壳质包裹纤维素柱纯化。

8、根据权利要求7所说的溶菌酶生产方法，其特征在于甲壳质包裹纤维素柱用0.1M，pH8.0磷酸盐所饱和。

9、根据权利要求1所说的溶菌酶生产方法，其特征在于经甲壳质包裹纤维素柱纯化后的溶菌酶组分，在60℃，600mmHg下真空干燥得产品。