CN102676683A - 一种鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法，通过该方法对罗非鱼无乳链球菌病流行菌株分离与保种、流行菌株鉴定与病原库建立、流行菌株PFGE基因型分析、各PFGE基因型代表菌株毒力测定、各PFGE基因型代表菌株免疫原性和保护范围测定，筛选获得了可用于我国罗非鱼无乳链球菌病免疫预防的疫苗候选菌株和菌株组合。该技术具有针对性强、筛选效率高，效果明显等特点，筛选获得的我国罗非无乳链球菌病疫苗候选菌株组合可保护病原库90％的基因型和96.47％流行菌株。该技术为鱼类链球菌病疫苗候选菌株筛选提供了一种新的方法，适宜在鱼类链球菌病疫苗候选菌株的筛选，对鱼类链球菌病的免疫防控具有重要意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法，具体涉及脉冲场凝胶电泳技术在鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选中的应用。
背景技术
链球菌病是目前对鱼类养殖危害最为严重的病害之一，每年给世界鱼类养殖业造成巨额经济损失。我国是水产养殖大国，每年因链球菌病给水产养殖造成的直接经济损失约在10亿美元。我国是罗非鱼养殖第一大国，年产量占世界总产量50％以上。2001年开始，中国罗非鱼养殖陆续出现了链球菌病的感染，并在个别养殖场造成了30％～50％的高死亡率。2009～2011连续3年，链球菌病在中国罗非鱼养殖大面积暴发流行，发病区域逐年扩大、发病率和死亡率逐年递增，易感罗非鱼规格范围逐年扩大(陈明等，2012；卢迈新等，2010；祝璟琳等，2010；周素明，2008)。按2010年我国罗非鱼产量计算，估计链球菌病给我国罗非鱼产业造成的直接经济损失就高达4亿美元。病害的暴发与随之带来的产品安全问题已成为制约罗非鱼产业发展的瓶颈。目前缺乏一套行之有效的方案预防和治疗该病，药物只能在早期起到控制病情的辅助性作用，但随着耐药和抗药性的产生和积累，该病的现状几乎是“无药可治可防”。
疫苗免疫是预防和控制罗非鱼等鱼类链球菌病最具前景、安全和环保的方法之一。自1995年以色列学者Eldar A报道通过免疫接种预防罗非鱼链球菌病(S.difficile)开始，美国(Klesius等，1999；Pridgeon等，2011)、中国(Sun等，2010)、日本(Dumrongphol等，2009)和韩国(Shin等，2007)等国家多个实验室先后开展了罗非鱼链球菌疫苗的研究，并在试验室均取得很好的免疫效果。由于疫苗的临床应用效果不理想，研制的疫苗至今未能实现在罗非鱼主要要养殖国家或地区使用。生产应用免疫失败的主要原因是对目前广泛存在的罗非鱼链球菌流行菌株的免疫原性不清楚，并且研究已证实罗非鱼链球菌病流行菌株的种间和型间不存在交叉免疫保护(Evans等，2004；Bachrach等，2001)。因此，对流行菌株的鉴定与分型研究，并通过对各型菌株免疫原性进行分析筛选疫苗候选菌株或菌株组合，成为罗非鱼等鱼类链球菌疫苗研发与生产应用的重要前提。
目前常用的生化指标、血清型分析、16S rRNA(核糖体核糖核酸)序列分析和MLST(多位点序列分析)等技术方法均不能很好的对罗非鱼等鱼类链球菌流行菌株进行分型。血清型方法只能将罗非鱼无乳链球菌病流行菌株分为两个血清型(Ia和III)或两个分子血清型(Eldar等，1994；Suanyuk等，2008；Ye等，2011)。同样，用ISR-SSCP(间隔区-单链构象多态性)方法对科威特所有分离菌株分型只获得一个基因型，而利用APLP(随机扩增长度多态性)方法对科威特所有分离菌株分型也只获得两个基因型(Olivares-Fuster等，2008)。使用MLST对中国分离获得无乳链球菌菌株进行分型，只获得ST-7(序列型-7)一个基因型(Ye等，2011)。脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，简称PFGE)基于菌株的DNA指纹原理对病原菌进行分型，具有分型能力强、结果易判断和重复性好等优点，在分子流行病学研究中被广泛应用。同时，研究证明PFGE分型方法对人源无乳链球菌分型比传统血清型分型方法更细，相同PFGE基因型为同一血清型，但同一血清型菌株可分为多个PFGE基因型(Skjaervold等，2004；Pillai等，2009)。但利用PFGE技术对罗非鱼等鱼类链球菌病流行菌株进行分型，并探索流行菌株PFGE基因型与其免疫原性的关系，进而筛选罗非鱼等鱼类无乳链球菌病疫苗候选菌株或菌株组合，目前尚未见报道。
发明内容
针对鱼类无乳链球菌疫苗研发和生产应用存在的困难，本发明主要解决的问题是提供一种鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法，用于指导疫苗的研发与生产应用。
本发明采取的技术方案是：
鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株的筛选方法，包括：(1)鱼类链球菌病流行菌株分离与保种；(2)鱼类无乳链球菌病流行菌株鉴定与病原库建立；(3)鱼类无乳链球菌病流行菌株PFGE基因型分析；(4)各PFGE基因型代表菌株毒力测定；(5)各PFGE基因型代表菌株免疫原性和保护范围测定。
应用PFGE技术对鱼类无乳链球菌流行菌株进行基因型分析，根据分型结果比较不同PFGE基因型流行菌株免疫原性和保护范围获得鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株或菌株组合。
采用PFGE技术对鱼类无乳链球菌流行菌株进行基因型分析，通过比较菌株PFGE基因型与其免疫原性对应关系，证实PFGE分型技术可用于指导鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株的筛选及疫苗生产应用。
(一)鱼类链球菌病流行菌株分离与保种
采用现场分离和实验室分离获得病鱼链球菌病流行菌株。
现场分离：直接在发病养殖场对疑似链球菌病鱼或病死鱼进行细菌分离。
实验室分离：通过氧气袋充氧运输疑似链球菌病鱼或冷冻运输疑似链球菌病死鱼至实验室，在洁净操作台进行细菌分离。
接种部位或组织：脑、肝、肾、脾、心脏、血液、鳍部等。
鱼体规格：满足接种条件的鱼体均可进行接种(大于10克)。
接种与保存方法：对病鱼或者病死鱼进行解剖，按常规方法划线接种于血平板上，28℃培养24h；细菌生长至一定程度挑取单菌落于TSB(胰胨大豆蛋白胨)液体培养基中扩大培养24h，菌液革兰氏染色显微观察确定无污染；取0.8ml菌液，加入0.2ml甘油后充分混匀，于-80℃冷冻保存。
(二)鱼类无乳链球菌病流行菌株鉴定与病原库建立
1、鱼类无乳链球菌病流行菌株鉴定
采用肉眼及显微观察、生化鉴定、二重PCR(聚合酶链式反应)等方法对分离的临床菌株进行鉴定。肉眼及显微观察：肉眼观察细菌在血平板上的溶血特征、轮廓形状；菌液状态及颜色变化；染色后通过油镜观察细菌形状、排列特点、染色特征等；进而对临床菌株进行初步鉴定。生化鉴定：利用法国生物梅里埃公司API鉴定***进行细菌鉴定。二重PCR：PCR引物参考黎炯(2010)和Zlotkin等(1998)公开发表论文。无乳链球菌(S.agalactiae)特异性引物为H1 5’-AAGCGTGTATTCCAGATTTCCT-3’和H2 5’-CAGTAATCAAGCCCAGCAA-3’，特异性扩增片段大小为474bp；海豚链球菌(S.iniae)特异性引物为P15′-CTAGAGTACACATGTACTTAAG-3′和P2 5’-GGATTTTCCACTCCCATTAC-3′，特异性扩增片段大小为474bp。DNA抽提试剂盒和PCR反应试验盒均为中国大连TaKaRa公司产品，按试剂盒说明书进行PCR特性性扩增。PCR体系如下：10×Ex Taq Buffer(Mg2+)5.0μL，dNTP 2.0μL，H1，H2，P1 and P2引物各2.0μL，2.0μl DNA模板(大约50ng)，1.0μL Takara ExTaq(5U/μL)，32.0μL ddH2O，总体积50μL；PCR反应在在美国ABI公司的GeneAmp PCR system9700进行；PCR反应程序：第一步，94℃，5min；第二步，94℃，30sec，58℃，30sec，72℃，45sec，35个循环；第三步，72℃，10min；1.2％琼脂糖凝胶电泳，GeneGreen(核酸染料)染色，凝胶成像***拍照。每次PCR设阳性和空白对照。
2、鱼无乳类链球菌病原库建立
通过对各地疑似链球菌病发病鱼进行细菌分离鉴定，并对鉴定为无乳链球菌的菌株进行整理归档，记录每株细菌的相关信息(时间、地点、采样组织及鉴定结果等)，建立鱼类无乳链球菌病病原库。
(三)鱼类无乳链球菌病流行菌株PFGE基因型分析
胶块制备：将实验菌株在5％血平板上培养24h后，刮取培养基上新鲜培养物，制备细胞悬浮液；加入30μL溶菌酶(10mg/mL)37℃水浴10min，再加入15μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀，然后加入150μL已经溶化的56℃1％SeaKem Gold(低熔点琼脂糖)(含1％SDS十二烷基硫酸钠)，制成胶块。
细胞裂解：将胶块放入5mL细胞裂解液中(含25μL蛋白酶K)，在54℃水浴摇床中孵育2h，转速约160rpm。
胶块洗涤：15mL的50℃纯水洗涤15min，重复洗2次；之后加入50℃TE，洗涤15min，重复洗3次，加入5mL TE，继续酶切或置4℃保存备用。
胶块内DNA酶切：用刀片切下2mm宽的胶块放入150μL酶切缓冲液(116μL纯水+15μL T Buffer+15μL BSA(牛血清白蛋白)+4μL SmaI)，在37℃水浴中孵育4h以上。
电泳：电泳时间为21h，电压为6V，角度为120°，始末脉冲时间为4.0s～40s。
染胶和图像的获取：电泳结束后，凝胶用0.1μg/mL的Gel-red(核酸染料)染色30min，纯水脱色60min，在凝胶成像仪中读取图像。
聚类分析：应用BioNumerics数据库软件进行处理，识别图像条带；选择UPGMA(分析方法)方法进行聚类分析；按照PulseNet(实验室分子分型监测网络)的命名原则，对每一种不同的带型进行命名。
(四)、各PFGE基因型代表菌株毒力测定
各PFGE基因型菌株经TSB扩大培养24h，测定菌液浓度为菌株半数致死量的50-100倍(1×108CFU(菌落形成单位)/尾)；攻毒组每尾鱼腹腔注射0.2mL菌液，对照组腹腔注射0.2mL灭菌TSB，每个试验组设2个平行组，每组20尾；正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天；统计每个试验组的死亡率，测定各PFGE基因型代表菌株毒力。
(五)、各PFGE基因型代表菌株免疫原性和保护范围测定
1、无乳链球菌水剂灭活疫苗制备：
从-80℃冰箱取出保存的无乳链球菌菌种接种于血平板，28℃培养24h，挑取单菌落于10mL TSB培养基28℃，120rpm振荡培养24h；革兰氏染色镜检无污染后加入到100mL TSB培养基28℃，120rpm振荡培养24h，铺板计数方法对培养菌液进行细菌计数；革兰氏染色镜检无污染后加入甲醛进行灭活，使其最终浓度为0.25％，120rpm，28℃振荡24h灭活；菌液10000g离心10min，分别收集菌体和上清；上清使用10kDa(千道尔顿)超滤膜5倍体积超滤浓缩；按菌体∶上清浓缩液体积比为16mL∶1L的比例混合制备疫苗，结合平板计数和OD600测定结果，调整疫苗浓度为2.5×109cells(细胞)/mL；铺血平板检测疫苗是否完全灭活。
2、各PFGE基因型代表菌株型内免疫保护试验：
按上述疫苗制备方法分别将各PFGE基因型代表菌株制备成灭活疫苗并通过腹腔注射免疫鱼；免疫15天后，每个试验组选择1-4株相同PFGE基因型菌株(其中1株为同源菌株，即疫苗菌株本身；其它均为异源菌株)进行腹腔注射感染，每个菌株感染试验组设2个平行组，每组15尾；感染后正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天；计算各组的免疫相对保护率，比较疫苗对同PFGE型内同源或异源菌株免疫原性差异。
3、疫苗候选菌株第1轮筛选：
根据各PFGE基因型代表菌株型内免疫保护试验结果证实，各代表菌株制备的疫苗对基因型内同源或异源菌株具有相同免疫保护率，因此设计该试验进行疫苗候选菌株第1轮筛选；利用各PFGE型代表菌株制备的疫苗分别通过腹腔注射免疫鱼；免疫15天后，利用所有PFGE型代表菌株的混合菌液对免疫鱼进行腹腔注射感染；每个试验组设2个平行组，每组15尾；感染后正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天，计算各PFGE型代表菌株制备的疫苗对所有基因型代表菌株混合菌液感染的免疫保护率，筛选获得免疫效果较好的疫苗候选菌株。
4、疫苗候选菌株第2轮筛选：
通过免疫保护试验对第1轮筛选获得的疫苗候选菌株进行免疫保护范围的测定；将筛选获得的疫苗分别通过腹腔注射免疫鱼；免疫15天后，利用所有PFGE基因型代表菌株分别对免疫鱼进行腹腔注射感染；每个试验组设2个平行组，每组15尾；感染后正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天，计算所选疫苗对各PFGE基因型代表菌株的免疫保护率，分析各疫苗的免疫保护范围；根据免疫保护率和免疫保护范围选择疫苗候选菌株。
5、疫苗候选菌株组合免疫：
根据上述两轮筛选试验选择免疫保护率较好，免疫范围较广，并可交叉弥补的疫苗进行组合，通过腹腔注射免疫鱼；免疫15天后，利用所有PFGE基因型代表菌株及其混合菌液分别对免疫鱼进行腹腔注射感染；每个试验组设2个平行组，每组15尾；感染后正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天，计算各组合免疫组对各PFGE基因型代表菌株及其混合菌液的免疫保护率，分析各组合免疫的免疫保护范围；根据免疫保护率和免疫保护范围选择较好的菌株组合。
本发明与现有技术对比其特点在于：
1、本发明采用PFGE技术对鱼类无乳链球菌流行菌株进行基因型分析，通过比较菌株PFGE基因型与其免疫原性对应关系，证实PFGE分型技术可用于指导鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株的筛选及疫苗生产应用。
2、本发明通过利用PFGE技术与动物免疫保护试验对本实验室建立的我国罗非鱼无乳链球菌病原库菌株进行了基因型与免疫原性分析，获得了免疫保护率高、保护范围较广的疫苗候选菌株和菌株组合。
本发明技术具有针对性强、筛选效率高，效果明显等特点，筛选获得的我国罗非无乳链球菌病疫苗候选菌株组合可保护病原库90％(9/10)的基因型和96.47％(82/85)流行菌株。该技术为鱼类链球菌病疫苗候选菌株筛选提供了一种新的方法，适宜在鱼类链球菌病疫苗候选菌株的筛选，对鱼类链球菌病的免疫防控、对鱼类无乳链球菌病疫苗研发和生产应用具有重要的指导意义和应用价值。
附图说明
图1：二重PCR快速检测鱼类无乳链球菌和海豚链球菌。
1-6泳道分别为：海豚链球菌(ATCC29178)和无乳链球菌(ATCC27956)、海豚链球菌(ATCC29178)、无乳链球菌(ATCC27956)、停乳链球菌(NCTC4335S)、副***炎链球菌(MCCCA01039)、格氏乳球菌(MCCCA07812)标准菌株；7-19泳道分别为罗非鱼无乳链球菌病流行菌株各PFGE型代表菌株FJ005，GD009，GD024，GD008，FJ007，GD022，HN016，GX042，GD004，GX032，GX005，GX022，GX009；20泳道为空白对照；M表示DL 2000DNA分子量标准，从上到下分子量分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。
图2：中国罗非鱼链球菌流行菌株分布情况。
图3：罗非鱼无乳链球菌病流行菌株PFGE分型结果(总图)，图中虚线位置分别为图2-1与图2-2、图2-2与图2-3分割位置；
图3-1：罗非鱼无乳链球菌病流行菌株PFGE分型结果，PFGE基因型C、D；
图3-2：罗非鱼无乳链球菌病流行菌株PFGE分型结果，PFGE基因型B、H、E、F；
图3-3：罗非鱼无乳链球菌病流行菌株PFGE分型结果，PFGE基因型A、G、I、J。
图4：疫苗VG、VB、VD的免疫保护范围。
具体实施方式
下面以我国罗非鱼无乳链球菌疫苗候选菌株筛选为例，结合附图，对本发明的技术应用进行详细叙述：
一、我国罗非鱼链球菌病流行菌株分离与保种
采用野外现场分离和实验室分离获得我国罗非鱼链球菌病流行菌株。
野外分离：2006～2011年，本实验室人员分别到广东省的湛江、茂名、化州、高州、阳江、珠海、阳春、高要、广州、清远、惠州、汕头12市，广西省的南宁、北海、玉林、钦州、百色、柳州6市，海南省海口、琼海、澄迈、临高、文昌5市，福建漳州市及云南罗平县的罗非鱼发病养殖场进行链球菌现场分离。发病罗非鱼均出现链球菌病的典型症状，如鳃和鳍条出血、游姿失衡、体色发黑、肠道出血等。通过细菌接种环对病鱼脑、肝、肾、脾或鳍部进行细菌血平板划接种分离，28℃培养24h。挑取单菌落于TSB液体培养基扩大培养24h，镜检无污染后，取0.8ml菌液，加入0.2ml甘油后充分混匀，于-80℃冷冻保存。
实验室分离：2006～2011年，养殖户使用氧气袋充氧运输发病罗非鱼或冷冻运输病死鱼至实验室对病鱼或病死鱼进行细菌分离，方法同上。
二、我国罗非鱼链球菌病流行菌株鉴定与病原库建立
1、罗非鱼链球菌鉴定：采用肉眼及显微镜观察、生化和PCR方法对分离的流行菌先生进行鉴定。
肉眼及显微观察：肉眼观察罗非鱼无乳链球菌病在血平板上生长为白色、β溶血菌落，菌落呈圆形且轮廓平滑。接种于TSB液体培养基28℃培养12h后，原清澈透明的培养基逐渐变浑浊至不透明。革兰氏染色后显微镜油镜观察革兰氏染色呈阳性，菌体为球形、多呈链状排列。通过肉眼及显微观察可初步鉴定为罗非鱼链球菌。
生化鉴定：使用接种环挑取纯化后在固体培养基上生长的单菌落，然后接种于10mL的TSB液态培养基28℃，120rpm振荡培养24h。利用法国生物梅里埃公司API鉴定***进行细菌鉴定，绝大部分流行菌株可鉴定到种。
二重PCR快速检测：PCR引物参考黎炯(2010)和Zlotkin等(1998)公开发表论文。无乳链球菌(S.agalactiae)特异性引物为H1 5’-AAGCGTGTATTCCAGATTTCCT-3’和H25’-CAGTAATCAAGCCCAGCAA-3’，特异性扩增片段大小为474bp；海豚链球菌(S.iniae)特异性引物为P15′-CTAGAGTACACATGTACTTAAG-3′和P2 5’-GGATTTTCCACTCCCATTAC-3′，特异性扩增片段大小为474bp。PCR反应产品为中国大连TaKaRa公司PCR试剂盒，PCR体系如下：10×Ex Taq Buffer(Mg2+)5.0μL，dNTP 2.0μL，H1，H2，P1 and P2引物各2.0μL，2.0μl DNA模板(大约50ng)，1.0μL Takara Ex Taq(5U/μL)，32.0μL ddH2O，总体积50μL；PCR反应在在美国ABI公司的GeneAmp PCR system 9700进行；PCR反应程序：第一步，94℃，5min；第二步，94℃，30sec，58℃，30sec，72℃，45sec，35个循环；第三步，72℃，10min；1.2％琼脂糖凝胶电泳，GeneGreen染色，凝胶成像***拍照。每次PCR设阳性和空白对照。
2、罗非鱼链球菌病原库建立
通过对我国罗非鱼主要养殖区链球菌发病罗非鱼的细菌分离与鉴定，共从广东、海南、广西、福建和云南5省的26个市，98个罗非鱼养殖场分离获得142株罗非鱼链球菌病流行菌株(菌株分布见附图2)，实验室有针对性的选择了105株进行了PCR鉴定和PFGE基因型分析(见表1)。通过电脑对鉴定鉴定的链球菌菌株进行整理归档，记录每株细菌的相关信息(时间、地点、采样组织及鉴定结果等)，建立罗非鱼无乳链球菌病病原库。该病原库菌株来源年份为2006-2011年，菌株分布区域的罗非鱼养殖量和产量约占中国罗非鱼总量的90％以上。因此，该病原库菌株可以代表中国近6年罗非鱼链球菌流行菌株特点。
表1 我国罗非鱼链球菌病原库部分菌株信息表
三、我国罗非鱼无乳链球菌流行菌株PFGE基因型分析
1、胶块制作：将-80℃保存的85株罗非鱼无乳链球菌株在5％血平板上培养24h后，挑取单个菌落再在5％血平板上重新划线培养18～24h。用比浊仪调节菌液浓度至4.5个麦氏单位。取150μL菌液放至Eppendorf管中，加入30μL溶菌酶(10mg/mL)，37℃水浴10min，再加入15μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀，然后再加入150μl已经溶化的56℃1％SeaKemGold(含1％SDS)，用枪头轻轻吸吹几次，同时避免气泡产生，取混合液加至plug模具中，室温下静置30min，待其凝固。
2、细菌裂解：每5ml细胞裂解液中加入25μL蛋白酶K(20mg/mL)，使其终浓度为0.1mg/mL，颠倒混匀。在每个50ml离心管加入5mL蛋白酶K/CLB(次氯酸钠漂白液)混合液，将凝固成型的胶块放入蛋白酶K/CLB混合液中。将离心管放置在54℃水浴摇床中孵育2h，转速约160rpm，同时将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。
3、胶块洗涤：2h后从水浴摇床中拿出离心管，换上绿色的Screened-cap。轻轻倒掉CLB。每管中加入15mL预热的纯水，轻摇离心管，确保胶块在液面下，放回50℃水浴摇床中，摇15min。倒掉水，用纯水再重复洗1次。倒掉水，加入15mL预热TE，在50℃的水浴摇床中摇15min。倒掉TE，用TE重复洗3次，每次15min。倒掉TE，再加入10mL TE，放4℃冰箱保存待用。
4、胶块内DNA酶切：在每个1.5mL Eppendorf管中加入150μL缓冲液(120μL纯水+15μL T Buffer+15μLBSA)。小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上，用刀片切下2mm宽的胶块放入上述已加好缓冲液Eppendorf管中，将管子放在37℃水浴中孵育10min。用枪头吸出缓冲液，避免损伤胶块。每管再加入150μL酶切缓冲液(116μL纯水+15μL T Buffer+15μL BSA+4μLSma Ⅰ酶/样本胶块)，在37℃水浴中孵育4h以上。从37℃水浴中取出Eppendorf管，用枪头吸出酶切混合液，避免损伤胶块。每管加入150μL 0.5×TBE，平衡10min，吸出TBE缓冲液，把胶块梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干3min，把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100mL熔化的在55℃～60℃平衡的1％SKG。在室温下凝固30min左右。
5、电泳、电泳图像分析和结果聚类分析：加入2.2L 0.5×TBE，关上盖子。设置电泳参数，电泳时间为21h，电压为6V，角度为120，始末脉冲时间为4.0s～40s。电泳结束后，0.1μg/mL的Gel-red染色30min，纯水脱色60min，在凝胶成像仪中读取图像。图像应用BioNumerics数据库软件进行处理，识别图像条带。选择UPGMA方法进行聚类分析。按照PulseNet的命名原则，对每一种不同的带型进行命名。如附图3所示，85株罗非鱼无乳链球菌菌株共分为10个PFGE型，分别为A、B、C、D、E、F、G、H、I和J。
四、我国罗非鱼无乳链球菌流行菌株各PFGE基因型代表菌株毒力测定
每个罗非鱼无乳链球菌PFGE型挑选一株为代表菌株，通过攻毒试验比较各PFGE型代表菌株毒力，具体操作如下：
A、B、C、D、E、F、G、H、I和J共10个PFGE型，每个PFGE型挑选1株为代表菌株，代表菌株分别为FJ005、GD009、GD024、GD008、FJ007、GD022、HN016、GX042、GD004和GX032。具体实施中根据代表菌株对应的PFGE型分别编码为S.aA～S.aJ。按上述罗非鱼无乳链球菌培养方法分别制备S.aA～S.aJ菌液。每个试验组设2个平行组，每组20尾；攻毒组每尾鱼腹腔注射0.2mL菌液，对照组腹腔注射0.2mL灭菌TSB(各菌株感染剂量见表2)。正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天。使用S.aA～S.aJ攻毒死亡率分别为85.00％、95.00％、100％、95.00％、95.00％、85.00％、100％、95.00％、90.00％和100％，具体结果见表2。
表2各PFGE基因型代表菌株毒力测定结果
与平均死亡率相比差异显著(P＜0.05)。
五、我国罗非鱼无乳链球菌流行菌株各PFGE基因型代表菌株免疫原性和保护范围测定
1、无乳链球菌水剂灭活疫苗制备
从-80℃冰箱取出保存的无乳链球菌菌种接种于血平板，28℃培养24h，挑取单菌落于10mL TSB培养基28℃，120rpm振荡培养24h；革兰氏染色镜检无污染后加入到100mL TSB培养基28℃，120rpm振荡培养24h，铺板计数方法对培养菌液进行细菌计数；革兰氏染色镜检无污染后加入甲醛进行灭活，使其最终浓度为0.25％，120rpm，28℃振荡24h灭活；菌液10000g离心10min，分别收集菌体和上清；上清使用10kDa超滤膜5倍体积超滤浓缩；按菌体∶上清浓缩液体积比为16mL∶1L的比例混合制备疫苗，结合平板计数和OD600测定结果，调整疫苗浓度为2.5×109cells/mL；铺血平板检测疫苗是否完全灭活；
2、各PFGE基因型代表菌株型内免疫保护试验：
按上述疫苗制备方法将各PFGE基因型代表菌株S.aA～S.aJ分别制备成疫苗VA～VJ，通过腹腔注射免疫罗非鱼。免疫组每尾鱼腹腔注射0.2mL水剂疫苗，对照组每尾鱼腹腔注射0.2mL灭菌PBS，具体免疫剂量和试验组设置见表3。免疫15天后，每个试验组选择1-4株相同PFGE基因型菌株(其中1株为同源菌株，即疫苗菌株本身；其它均为异源菌株)进行腹腔注射感染，每个菌株感染试验组设2个平行组，每组15尾。感染后正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天；计算各组的免疫相对保护率，比较疫苗对同PFGE型内同源或异源菌株免疫原性差异。试验结果如表3显示，疫苗VA～VJ对型内同源或异源菌株的相对免疫保护率差异不大，但疫苗VA～VJ对同型菌株免疫保护率之间存在较大差异，VA、VB、VF和VG免疫保护效果最好，相对免疫保护率为85.42～98.81％；其次为VC、VE和VH，相对免疫保护率为66.70～73.81％)；再次为VD、VI和VJ，相对免疫保护率为44.71～62.14％。
表3VA～VJ对同基因型菌株感染的免疫保护试验
a所有免疫组免疫剂量均为0.5×109cells/尾。
△与所有型菌株平均RPS相比差异显著(P＜0.05)。
3、疫苗候选菌株第1轮筛选：
根据各PFGE基因型代表菌株型内免疫保护试验结果证实，各代表菌株制备的疫苗对基因型内同源或异源菌株具有相同免疫保护率，因此设计该试验进行疫苗候选菌株第1轮筛选。按上述疫苗制备方法将各PFGE基因型代表菌株S.aA～S.aJ分别制备成疫苗VA～VJ，通过腹腔注射免疫罗非鱼。免疫组每尾鱼腹腔注射0.2mL水剂疫苗，对照组每尾鱼腹腔注射0.2mL灭菌PBS，具体免疫剂量和试验组设置见表4。免疫15天后，利用所有PFGE型代表菌株(S.aA～S.aJ)的混合菌液对免疫罗非鱼进行腹腔注射感染。感染后正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天，计算各PFGE型代表菌株制备的疫苗对所有基因型代表菌株混合菌液感染的免疫保护率，筛选获得免疫效果较好的疫苗候选菌株。结果见表4，疫苗VA～VJ相对免疫保护率分别为40.00％，60.00％，26.67％，46.67％，20.00％，53.33％，60.00％，33.33％，13.33％和17.86％。
表4VA～VJ对所有基因型代表菌株混合菌液感染的免疫保护试验
a混合菌液中各代表菌株的量相等。
4、疫苗候选菌株第2轮筛选：
通过免疫保护试验对第1轮筛选结果显示VB、VD、VF和VG对型间和混合菌株攻毒免疫保护效果较高，同时结合各基因型菌株数量和优势基因型区域分布，对VB、VD和VG进行免疫保护范围的测定。疫苗VB、VD和VG通过腹腔注射分别免疫罗非鱼，免疫组每尾鱼腹腔注射0.2mL水剂疫苗，对照组每尾鱼腹腔注射0.2mL灭菌PBS，具体免疫剂量和试验组设置见表5。免疫15天后，免疫15天后，利用所有PFGE基因型代表菌株SaA～SaJ分别对免疫罗非鱼进行腹腔注射感染。感染后正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天。结果显示VB对代表菌株SaA～SaJ的相对免疫保护率分别为100％、100％、73.33％、79.31％、3.45％、76.92％、100％、10.34％、44.44％和53.57％。VD对代表菌株SaA～SaJ的相对免疫保护率分别为33.33％、31.03％、36.67％、58.62％、24.14％、19.23％、25.00％、34.48％、14.81％和32.14％。VG对代表菌株SaA～SaJ的相对免疫保护率分别为0.00％、6.90％、50.00％、89.66％、100％、100％、100％、89.66％、0.00％和57.14％，具体结果见表5。以RPS大于等于50％定为免疫效果较好，小于50％定为免疫效果较差，则疫苗VG、VB和VD免疫保护范围如图4所示，即VB可保护PFGE基因型A、B、C、D、F、G、J流行菌株，不能保护E、H和I流行菌株；VG可保护PFGE基因型C、D、E、F、G、H和J流行菌株，不能保护A、B和I流行菌株；VD只能保护PFGE基因型流行菌株。
表5疫苗VB、VD和VG免疫保护范围测定试验
a所有免疫组的免疫剂量均为0.5×109cells/尾。
5、疫苗候选菌株组合免疫：
根据上述两轮筛选试验发现，VG+VB和VG+VD组合免疫，可交叉弥补扩大组合免疫的保护范围。分别制备VG+VB和VG+VD两种组合疫苗，通过腹腔注射免疫罗非鱼。免疫15天后，利用所有PFGE基因型代表菌株SaA～SaJ及其混合菌液分别对免疫罗非鱼进行腹腔注射感染；每个试验组设2个平行组，每组15尾。免疫组每尾鱼腹腔注射0.2mL水剂疫苗，对照组每尾鱼腹腔注射0.2mL灭菌PBS，具体免疫剂量和试验组设置见表6。感染后正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天，计算各组合免疫组对各PFGE基因型代表菌株及其混合菌液的免疫保护率，分析各组合免疫的免疫保护范围。根据免疫保护率和免疫保护范围选择较好的菌株组合。结果如表6所示，VG+VB对菌株SaA～SaJ的相对免疫保护率分别为38.46％、31.03％、40.74％、86.21％、100％、96.43％、100％、80.00％、26.67％和58.62％。VG+VB对菌株SaA～SaJ的相对免疫保护率分别为100％、96.55％、77.78％、93.10％、100％、100％、100％、80.00％、46.67％和65.52％。VG+VD对S.aA～S.aJ菌株混合菌液攻毒的相对免疫保护率为50.00％，VG+VB对S.aA～S.aJ菌株混合菌液攻毒的相对免疫保护率为75.00％。组合VG+VB无论是免疫保护率还是免疫范围，都明显优于组合VG+VB。
表6VG+VD和VG+VB免疫保护范围测定试验
a所有免疫组的免疫剂量均为0.5×109cells/尾，组合疫苗中VG、VB和VD的量相同。
b混合菌液为菌株S.aA～S.aJ菌液混合，S.aA～S.aJ每个菌株的浓度相同。
通过将本发明技术应用于我国罗非鱼无乳链球菌疫苗候选菌株的筛选，获得的罗非无乳链球菌病疫苗候选菌株组合VG+VB可保护90％(9/10)的基因型和96.47％(82/85)流行菌株，可用于我国罗非鱼无乳链球菌病疫苗的开发。
Claims (2)
1.一种鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法，其特征在于它的技术内容包括：
(1)鱼类链球菌病流行菌株分离与保种；
(2)鱼类无乳链球菌病流行菌株鉴定与病原库建立；
(3)鱼类无乳链球菌病流行菌株PFGE基因型分析；
(4)各PFGE基因型代表菌株毒力测定；
(5)各PFGE基因型代表菌株免疫原性和保护范围测定；
应用PFGE技术对鱼类无乳链球菌流行菌株进行基因型分析，根据分型结果比较不同PFGE基因型流行菌株免疫原性和保护范围获得鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株或菌株组合。
2.根据权利要求1所述的鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法，其特征是：采用PFGE技术对鱼类无乳链球菌流行菌株进行基因型分析，通过比较菌株PFGE基因型与其免疫原性对应关系，证实PFGE分型技术可用于指导鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株的筛选及疫苗生产应用。
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