CN102653755A

CN102653755A - 一种大丽轮枝菌基因敲除的方法

Info

Publication number: CN102653755A
Application number: CN2011100493058A
Authority: CN
Inventors: 戴小枫; 田李; 陈捷胤; 汪佳妮
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-03-01
Filing date: 2011-03-01
Publication date: 2012-09-05

Abstract

本发明提供一种大丽轮枝菌基因敲除的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：构建用于同源重组的重组质粒，该重组质粒由载体和同源重组DNA片段组成，所述同源重组DNA片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于该外源抗性基因两侧的满足同源重组要求的侧翼序列，所述载体含有外源条件致死基因；通过农杆菌介导的方法，将所述重组质粒转化至大丽轮枝菌中进行同源重组，得到转化子，并筛选出阳性转化子。通过上述方法分别对大丽轮枝菌的ADE4和ChsV基因进行敲除，基因敲除转化子在总的转化子中所占比例分别为87％和44％，由此可见，本发明的方法相对现有技术的大丽轮枝菌的基因敲除方法的效率大大提高了。

Description

一种大丽轮枝菌基因敲除的方法

技术领域

本发明涉及一种大丽轮枝菌基因敲除的方法。

背景技术

我国是农业大国，作为仅次于粮食的第二大农作物的棉花是关系国计民生的战略物资，也是涉及农业和纺织工业两大产业的商品，是全国1亿多棉农收入的主要来源，是纺织工业的主要原料，也是广大人民的生活必需品，棉纱及棉布还是出口创汇的重要商品。因此，棉花的生产、流通、加工和消费，与人民群众的生活和广大棉农的利益息息相关，对国民经济的发展也有着重要影响。

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的黄萎病是棉花的主要病害，严重影响棉花的生产，因此黄萎病的防治对于棉花生产的重要性不言而喻，其中，研究大丽轮枝菌中各个基因的功能，尤其是寻找致病相关基因是重要研究课题，而基因敲除技术是研究基因功能最有效的手段。

现有技术中大丽轮枝菌基因敲除的方法主要包括载体构建，农杆菌介导的转化和转化子筛选三个关键步骤，其中转化子筛选是一个难点，人们往往要筛选大量的转化子，以期得到需要的基因敲除的阳性转化子。这是因为将同源重组DNA片段克隆进T-DNA(transfer DNA)后，借助农杆菌介导的转化方法虽然极大地提高了同源重组片段的转化效率，但是由于T-DNA自身的性质，它会随机整合到该菌基因组的某一区段，造成了T-DNA的随机***转化子和同源双交换产生的基因敲除的阳性转化子都带有同样的抗生素选择标签而难于区分，而同源重组的效率相对随机***的效率要低很多，因此，基因敲除的转化子数量要远远少于随机***的转化子，从而使得阳性转化子的筛选方法繁琐、费时，同时浪费大量的人力、物力和财力。因此，是一种效率低下的基因敲除体系。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有技术中的缺陷，提供一种简便、高效的筛选阳性转化子的大丽轮枝菌基因敲除的方法。

本发明提供了一种大丽轮枝菌基因敲除的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：构建用于同源重组的重组质粒，该重组质粒由载体和同源重组DNA片段组成，所述同源重组DNA片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于该外源抗性基因两侧的满足同源重组要求的侧翼序列，所述载体含有外源条件致死基因；通过农杆菌介导的方法，将所述重组质粒转化至大丽轮枝菌中进行同源重组，得到转化子，并筛选出阳性转化子。

通过上述方法分别对大丽轮枝菌的ADE4基因和ChsV基因进行敲除，在随机挑选的15个ADE4基因敲除的候选转化子中有13个是阳性转化子，基因敲除转化子在总的转化子中所占比例高达87％；在随机挑选的16个ChsV基因敲除的候选转化子中有7个是阳性转化子，基因敲除转化子在总的转化子中所占比例为44％；而林春花(林春花、郑服丛，2008)使用传统的转化子筛选方法构建了稻瘟病MgORP1基因敲除突变株，基因敲除转化子在总的转化子中所占比例仅为1.8％。由此可见，本发明的方法相对现有技术的大丽轮枝菌的基因敲除方法的效率大大提高了。

附图说明

图1为构建用于同源重组的重组质粒的过程图；

图2为构建用于同源重组的重组质粒的各步骤反应的产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图3显示了ADE4基因敲除的候选转化子的筛选结果；

图4显示了ChsV基因敲除的候选转化子的筛选结果。

具体实施方式

术语“基因敲除”为将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。包括去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。广义的基因敲除包括某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以及成段基因组序列的敲除。本发明中所述基因敲除指广义的基因敲除。

所述外源条件致死基因指非大丽轮枝菌内源性的条件致死基因，术语“条件致死基因”指在特定条件下导致个体或细胞死亡的基因。根据本发明，所述外源条件致死基因优选为HSVtk基因，即单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，其作用原理，是因为酶蛋白基因HSV-TK编码的酶蛋白，可以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质，所述外源条件致死基因优选为含有SEQ ID NO：1所示序列的DNA片段，进一步优选为具有SEQ ID NO：1所示序列的DNA片段，并且与其相对应的，所述筛选出阳性转化子的方法包括，向体系中加入与外源抗性基因相对应的抗生素和条件致死基因所对应的5’-氟脱氧尿苷(F2dU)，一般地，所述体系通常指筛选阳性转化子的固体和/或液体培养基，且发明人在研究中发现，5’-氟脱氧尿苷对表达了HSV-TK编码的酶蛋白的大丽轮枝菌的最佳致死浓度为40-60μM，优选为45-55μM，最优选为50μM，此时，基因敲除转化子在总的转化子中所占比例(即基因敲除效率)非常高。所述与外源抗性基因相对应的抗生素也可以为多种，当所述外源抗性基因为潮霉素抗性基因时，所述抗生素为潮霉素，所述潮霉素加入的浓度可以为常规的浓度值，如20-40μg/mL，优选为30μg/mL。

根据本发明的宗旨，所述外源条件致死基因的作用是用于去除至少部分假阳性的转化子，因此，在利用农杆菌进行同源重组的基因敲除体系中，优选地，所述外源条件致死基因位于用于转化的重组质粒的T-DNA内，所述T-DNA，即转移DNA(transferred DNA)，为农杆菌Ti(tumor inducing)或Ri(root inducing)质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中。

根据本发明，所述载体为各种能够用于农杆菌转化的载体，优选地，所述载体的T-DNA序列中含有条件致死基因，并且适用于Gateway连接反应，所述载体可以通过商购得到，也可以通过基因工程制备得到；所述载体可含有如SEQ ID NO：2所示序列的DNA片段，进一步优选为具有SEQ ID NO：2所示序列的DNA片段，本文中，该载体命名为pGKO2-Gateway载体。

根据本发明，所述外源抗性基因指非大丽轮枝菌内源性的抗性基因，术语“抗性基因”指一类能阻止抗生素或除草剂等药物作用的基因或营养补偿性基因，如某些氨基酸合成酶的基因等。这些基因的表达能赋予生物抵抗药物等毒害或营养缺陷的环境，常用做选择性遗传标志。根据本发明，所述外源抗性基因可以为任何适用于大丽轮枝菌的抗性基因，但是考虑到基因操作的优势，本发明中所述抗性基因优选为潮霉素抗性基因(Hyg)，实际应用中，引入所述潮霉素抗性基因具体指引入包含上游启动子和终止子的Hyg抗性基因盒，本发明中所述潮霉素抗性基因也指包括上游启动子和终止子的Hyg抗性基因盒，其基因序列为SEQ ID NO：25中的429-2537位所示的序列。

根据同源重组的原理，所述位于该外源抗性基因两侧的满足同源重组要求的侧翼序列指的是与待敲除基因两侧的侧翼序列相同的基因序列，所述侧翼序列的选择为本领域的常规方法，为了达到较高的同源重组的效率，所述侧翼序列的长度优选为1000-1500个核苷酸。

根据本发明的原理，所述方法可以用于任何大丽轮枝菌，如中国常见的导致棉花黄萎病的大丽轮枝菌VD991，以及美国Broad研究所的大丽轮枝菌VDLs.17，也包括其他类型的大丽轮枝菌，如从ATCC商购的大丽轮枝菌，大丽轮枝菌的菌株类型并不影响本发明的实施。

根据本发明的原理，所述大丽轮枝菌中的任何基因及其它们的组合都可以成为待敲除基因，示例地，所述待敲除基因为大丽轮枝菌的ADE4基因和/或ChsV基因。

根据本发明，构建所述同源重组DNA片段的方法可以为本领域各种方法，本发明中优选为融合PCR法，构建所述重组质粒的方法可以为各种常规的外源片段与载体连接的克隆方法，如酶切-连接的克隆方法，本发明中构建所述重组质粒的方法优选为Gateway克隆法。

所述融合PCR法为本领域公知的采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来的方法，此技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的体外连接，为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。根据本发明，用于融合PCR的DNA片段有三段，包括待敲除基因上游侧翼序列的DNA片段，待敲除基因下游侧翼序列的DNA片段和外源抗性基因盒的DNA片段，三者之间的摩尔比例可以为1∶0.8-1.2∶2-4，最优选地，三者之间的摩尔比例为1∶1∶3，其中待敲除基因上游侧翼序列的DNA片段的3’端部分序列与外源抗性基因盒的DNA片段的5’端部分序列互补，外源抗性基因盒的DNA片段的3’端部分序列与待敲除基因下游侧翼序列的DNA片段的5’端部分序列互补，如图1所示，互补部分的序列来自于PCR的引物，本文中，称其为融合PCR的接头序列。

所述Gateway克隆法是本领域公知的克隆技术，它是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的位点特异性的重组整合(integrativerecombination reaction)与切出(excisive recombination reaction)反应。整合反应是由整合酶Int(integrase)和整合宿主因子IHF(Integration Host Factor)催化的。attB和attP之间的重组整合的噬菌体基因组DNA的5’和3’端含有attL和attR位点。切出的重组反应需要IHF、Int和Xis蛋白的参与。在***E.coli基因组DNA的噬菌体基因组DNA的5’和3’端的attL和attR位点发生位点特异性的重组，重新在形成λDNA的attP位点和E.coli基因组DNA的attB位点。通过BP和LR反应就可实现把PCR产物定向转入克隆质粒和表达质粒，实现PCR产物在各种质粒间的转移。Gateway克隆法相对酶切构建载体来说，具有需时短、操作简单的特点，因此缩短了载体构建的时间。

根据本发明，构建所述重组质粒的方法包括在融合PCR步骤之前，通过常规PCR的方法分别获得用于融合PCR的各段DNA片段，即，待敲除基因上游侧翼序列的DNA片段、外源抗性基因序列的DNA片段和待敲除基因下游侧翼序列的DNA片段，根据本发明，优选地，得到所述外源抗性基因的DNA片段的方法可以包括，以带有外源抗性基因的质粒(pUCHyg)为模板，以Hyg-F和Hyg-R为上下游引物的PCR(其中，引物中的F表示上游引物，R表示下游引物，本说明书中均如此表示)；得到所述待敲除基因上游侧翼序列的DNA片段的方法可以包括，以大丽轮枝菌的基因组DNA或cDNA为模板，以5F和5R为引物进行的PCR；得到所述待敲除基因下游侧翼序列的DNA片段的方法可以包括，以大丽轮枝菌的基因组DNA或cDNA为模板，以3F和3R为引物进行的PCR，其中，5R的5’端与Hyg-F完全互补配对，3F的5’端与Hyg-R完全互补配对，以满足融合PCR的要求。根据本发明，对所述用于扩增三段DNA片段的引物序列没有特别的限定，优选地，用于获得待敲除基因上游侧翼序列的DNA片段的下游引物的核酸序列如SEQ ID NO：3所示，用于获得待敲除基因下游侧翼序列的DNA片段的上游引物的核酸序列如SEQ ID NO：4所示，或者如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示序列的引物。本发明的发明人在研究中发现，与其他引物序列相比，使用上述序列的引物能够大大提高融合PCR的成功率。

根据本发明，优选地，构建所述重组质粒的方法包括在融合PCR步骤之后，以融合PCR得到的产物为模板，以5’端分别带有Gateway BP反应的接头的引物为引物，进行PCR(巢式PCR)，得到带有接头的同源重组DNA片段，用于下一步与载体的连接，所述Gateway BP反应的接头可以根据不同的载体进行选择，如本发明中所用载体为商购的pGKO2-Gateway载体时，所述接头也相应的采用与上述载体相匹配的DNA序列，如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

根据本发明，所述农杆菌介导的转化方法可以为本领域公知的方法，包括将重组质粒转化至农杆菌感受态细胞中，并将转化后的农杆菌感受态细胞与大丽轮枝菌共培养，本发明的发明人在研究中发现，所述共培养在微孔滤膜上进行时，重组质粒的转化效率较高，且成本较低，并且，当所述大丽轮枝菌的孢子浓度为4×10⁶-6×10⁶个/毫升，最优选为5×10⁶个/毫升时，能够进一步的提高重组质粒的转化效率。

根据本发明，所述方法还包括对筛选得到的阳性转化子的验证，一般地，对于筛选得到的转化子首先通过PCR的方法进行验证，所述PCR的引物根据待敲除基因进行设计，如果不能扩增出目的条带，则可能为阳性转化子，如果能够扩增出目的条带，则为阴性转化子，但是即使不能扩增出目的条带，也不保证一定为阳性转化子，因此这样的PCR验证方法会得到一些假阳性的结果，本发明的发明人在研究中发现，如果将引物设计在与侧翼序列相对应的位置，则可以更精确的判断转化子是否为阳性转化子，能够进一步提高筛选的效率。例如，用于验证的引物为test-1和test-2，二者分别于待敲除基因上下游侧翼序列完全相同或完全互补配对。当然，为了精确的验证，仍需要进行测序。

下面，通过以下实施例对本发明做更详细的说明。

DNA序列委托上海生工公司合成，测序委托中国农业科学院作物科学研究所公司进行；带有外源抗性基因的质粒pUCHyg是将Hyg基因通过SalI/XbaI酶切位点连入pUC19质粒中得到的重组质粒，其序列如SEQ IDNO：25所示；5’-氟脱氧尿苷购自sigma公司；遗传转化所用农杆菌菌株为AGL-1(购自Biovector中国质粒载体菌株基因库)；落叶型棉花黄萎病菌株大丽轮枝菌购自ATCC(商品号为26289^TM)；PCR仪型号为Biometra PCR；测定孢子浓度使用血球计数板计数；Gateway连接中使用的试剂(如酶等)均购自Invitrogen公司，Gateway连接步骤按照Invitrogen公司试剂手册的方法进行，所用微孔滤膜为上海新亚净化材料厂生产，孔径为0.45μm，所述三轮PCR反应中所用的DNA聚合酶、dNTP，提取基因组的试剂盒和PCR产物纯化的试剂盒等分子生物学常规试剂均购自上海生工公司，相应的分子生物学操作按照商品试剂说明书和《分子克隆》(第三版)进行。

实施例1

(1)构建用于同源重组的重组质粒，过程图如图1所示，包括三轮PCR过程：

第一轮PCR：以大丽轮枝菌的基因组DNA(完整的基因序列参见数据库网站http://www.broadinstitute.org/)为模板，以5F-ADE4和5R-ADE4为引物，通过PCR得到基因ADE4(基因序列编号为VDAG_00128，Broad研究所)上游侧翼序列的DNA片段，约1000bp，并以3F-ADE4和3R-ADE4为引物，通过PCR得到基因ADE4下游侧翼序列的DNA片段，约1000bp；以pUCHyg为模板，以Hyg-F和Hyg-R为引物，进行PCR反应，扩增得到长度为1.8kb的潮霉素抗性基因盒的DNA片段；所述引物序列如表1所示，所述PCR的条件如表2所示；对得到的三个片段的PCR产物进行纯化并进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图2所示，其中，第一泳道为ADE4基因下游侧翼序列的DNA片段，第二泳道为潮霉素抗性基因盒的DNA片段，第三泳道为ADE4基因上游侧翼序列的DNA片段，最后一个泳道M为Marker，其中，1kb，2kb和4kb的位置已经标识出来，图1中ADE4ORF表示ADE4基因的开放阅读框；

第二轮PCR：利用融合PCR方法，以纯化后的潮霉素抗性基因盒的DNA片段，ADE4基因上、下游侧翼序列的DNA片段为模板进行扩增，融合PCR的条件如表2所示；从而将上述三片段首尾相接，得到潮霉素抗性基因盒两侧各与ADE4基因上下游1kb片段相连接的3.8kb的同源重组DNA片段；对融合PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图2第四泳道所示；由图2可以看出，融合PCR的产物中同源重组DNA片段的比例很低；

第三轮PCR：以第二轮PCR的产物为模板，以Nest-F-ADE4和Nest-R-ADE4为“巢式”引物，通过PCR获得3.8kb融合片段的特异性扩增产物，即两侧带有Gateway BP反应接头的同源重组DNA片段，如图1所示，Nest-F-ADE4和Nest-R-ADE4中黑色并标识为attB的部分，引物序列如表1所示，各PCR反应的条件如表2所示，对第三轮PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图2第五泳道所示，可以看出，第三轮PCR的产物绝大多数为同源重组DNA片段。

表1

其中，下划线“_”表示与HygF和HygR互补的序列(融合PCR的接头序列)；波浪线

表示用于Gateway BP反应的接头序列。

将构建好的同源重组DNA片段与pGKO2-Gateway载体进行GatewayBP反应，得到重组质粒pKO-ADE4。其具体步骤如下：

(1)PEG纯化：向第三轮PCR的产物中加入等体积的TE缓冲溶液(PH8.0)和等体积的PEG(30％的PEG8000/30mM的MgCl₂)溶液进行稀释，涡旋混匀，在12000rpm离心15min，弃去上清液，向沉淀中加入一定体积的TE缓冲溶液(PH 8.0)将其溶解，使产物的终浓度大于＞10ng/μl；

(2)Gateway连接反应：将1-7μl的PEG纯化后的第三轮PCR的产物(15-150ng，带有接头序列的PCR产物)、1μl(150μg/μl)的pGKO2-Gateway载体与TE缓冲溶液(PH 8.0)混合，使总体积达到8μl。然后加入2μl的BPClonase^TMII酶，在25℃反应1h，加入1μl蛋白酶K涡旋混匀，在37℃反应10min后终止反应；

(3)转化：将1μl的Gateway连接反应的产物加入到50μl的One

OmniMAX^TM 2T1噬菌体抗性细胞(Invitrogen商品号C8540-03)中，在冰上孵育30分钟，将热击的细胞在40℃孵育30s，然后加入250μl的SOC培养基，并在37℃震荡孵育1小时，取100μl的转化物涂布于选择性平板上，并注意，任何感受态细胞的转化效率都要大于1.0×10⁸转化子/微克；

(4)挑取阳性菌落，培养并提取重组质粒pKO-ADE4。

表2

表2显示了三轮PCR的引物、模板和反应条件，以及反应产物。

(2)农杆菌介导的转化：

(i)制备感受态细胞

从新鲜的YEP平板上挑取农杆菌AGL-1的单菌落，接种于液体YEP培养基(含利福平Rif50mg/ml)中，28℃，200rpm振荡培养过夜；取1ml菌液接种于50ml液体YEP液体培养基(含Rif 50mg/ml)中扩大培养，28℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀值为0.5；冰浴30min后，在4℃，5000rpm条件下离心收集菌体，重悬于冰冻的10ml的0.15mol/L的NaCl溶液中；在4℃，5000rpm条件下再次离心收集菌体，重悬于1ml的20mmol/L的CaCl₂溶液中，按200μl/管分装；制备好的感受态细胞置液氮中速冻1min后，放于-70℃冰箱保存，半年内使用；

(ii)重组质粒的转化

向每管感受态细胞中加入大约1μg的重组质粒pKO-ADE4，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃融化3min；加入800μl的YEP液体培养基，于28℃、150rpm恢复培养3h后，在5000rpm离心1min收集菌体；将收集到的农杆菌菌体涂布于YEP平板上，在28℃培养2-3天，挑取长出的单菌落；

(iii)大丽轮枝菌的准备

取100ml三角瓶一个，加入CM液体培养基20ml，接种平板或离心管保存的大丽轮枝菌；在25℃，150rpm摇床中培养2-3天，取少量菌液，用无菌水稀释10倍后镜检，计算孢子数量；根据检测结果，用无菌水稀释至孢子浓度为5×10⁶cfu/ml；

(iv)共培养

制备IM(诱导培养基)平板数块，其中每块平板(25ml)含50μL，20mM的AS(乙酰丁香酮)，小心将灭菌的微孔滤膜放在平板上，尽量不产生气泡；分别吸取准备好的农杆菌和大丽轮枝菌孢子悬浮液各100μL混匀；将200μL农杆菌和大丽轮枝菌混合液均匀涂布于微孔滤膜上，在超净台内吹干，并置于25℃恒温培养箱中培养48h。

(3)阳性转化子的筛选和验证

将共培养后的农杆菌和大丽轮枝菌混合液均匀的涂布在同时添加有潮霉素(浓度30μg/mL)和50μM的F2dU的平板上，在25℃培养5天后，平板上出现菌斑，挑选15个ADE4基因敲除的候选转化子后，对其进行分子生物学验证，即以候选转化子的基因组DNA为模板，以Test-1和Test-2为引物进行PCR扩增，PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。以野生型菌株基因组作为模板，以test-1和test-2作为引物，扩增出了预期的1.2kb的DNA片段；同样条件下以15个候选转化子的基因组DNA做模板，其中13个(1，2，3，4，5，7，8，9，10，12，13，14，15，16号)扩增出了单一的1.8kb的DNA片段。说明这13个转化子中ADE4基因成功地被1.8kb的潮霉素抗性基因同源重组所替代，使引物test-1和test-2之间的距离增大到1.8kb。而其余2个转化子(6，11号)被鉴定为T-DNA随机***的假阳性转化子，显示了1.2kb(ADE4基因的PCR条带)和1.8kb(随机***的T-DNA中同源重组片段的PCR条带)的双电泳条带；然后对这15个候选转化子进行了测序验证，与PCR验证的结果相同。这两方面都说明ΔADE4突变体(即缺失ADE4基因的转化子)的构建是成功的，基因敲除转化子在总的转化子中所占比例为13/15＝87％。

实施例2

(1)构建用于同源重组的重组质粒，过程与实施例1相同，包括三轮PCR过程：

第一轮PCR：以大丽轮枝菌的基因组DNA为模板，以5F-ChsV和5R-ChsV为引物，通过PCR得到ChsV基因(VDAG 00420，Broad研究所)上游侧翼序列的DNA片段，约为1000bp，以3F-ChsV和3R-ChsV为引物，通过PCR得到ChsV基因下游侧翼序列的DNA片段，约为1000bp；以pUCHyg为模板，以Hyg-F和Hyg-R为引物，进行PCR反应，扩增得到长度为1.8kb的潮霉素抗性基因盒的DNA片段；所述引物序列如表3所示，所述PCR的条件与实施例1相同，如表4所示；

第二轮PCR：利用融合PCR方法，将潮霉素抗性基因盒的DNA片段，ChsV基因上、下游侧翼序列的DNA片段为模板进行扩增，所述融合PCR的条件如表4所示；从而将上述三片段首尾相接，得到潮霉素抗性基因盒两侧各与ChsV基因上下游1kb片段相连接的3.8kb的同源重组DNA片段，所述PCR的条件如表4所示；

第三轮PCR：以第二轮PCR的产物为模板，以Nest-F-ChsV和Nest-R-ChsV为“巢式”引物，通过PCR获得3.8kb融合片段的特异性扩增产物，同时使该融合体两侧带有Gateway BP反应的接头，引物序列如表3所示，各PCR反应的条件如表4所示。

将构建好的同源重组DNA片段与pGKO2-Gateway载体进行GatewayBP反应，得到重组质粒pKO-ChsV。具体步骤与实施例1相同。

表3

其中，下划线“_”表示与HygF和HygR互补的序列；波浪线表示用于Gateway BP反应的接头序列。

表4

表4显示了三轮PCR的引物、模板和反应条件，以及每轮PCR的反应产物。

(2)农杆菌介导的转化：

按照实施例1的方法(i)制备感受态细胞；(ii)重组质粒转化；(iii)大丽轮枝菌的准备；(iv)共培养。

(3)阳性转化子的筛选和验证

将共培养后的农杆菌和大丽轮枝菌混合液均匀的涂布在同时添加有潮霉素(终浓度为30μg/mL)和55μM的F2dU的平板上，在25℃培养2天后，平板上出现挑选16个ChsV基因敲除的候选转化子后，对其进行了分子生物学验证，即以候选转化子的基因组DNA为模板，以Test-3和Test-4为引物进行PCR扩增，PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。以野生型菌株的基因组作为模板，以test-3和test-4作为引物，扩增出了预期的1.2kb的DNA片段；同样条件下以16个候选转化子的基因组DNA做模板，其中7个(3，4，6，8，9，13，16号)扩增出了单一的1.8kb的DNA片段。说明这16个转化子中ChsV基因成功地被1.8kb的潮霉素抗性基因的同源重组所替代，使引物test-3和test-4之间的距离增大到1.8kb。然后对这16个候选转化子进行了测序验证，与PCR验证的结果相同。这两方面都说明ChsV缺失的突变体的构建是成功的，基因敲除转化子在总的转化子中所占比例为7/16＝44％。

实施例3

按照实施例1的方法进行大丽轮枝菌ADE4基因的敲除。

不同的是，用于筛选的F2dU的终浓度为0.5μM，从平板上挑选53个ADE4基因敲除的候选转化子进行验证，只有2个为阳性转化子，基因敲除转化子在总的转化子中所占比例仅为3.8％。

实施例4

按照实施例1的方法进行大丽轮枝菌ADE4基因的敲除，不同的是，引物5R-ADE4分别换为5R-2和5R-3，同时引物3F-ADE4相应的换为3F-2和3F-3，引物序列如下所示，

5R-2：5’-TGG ACG ACT AAA CCA AAA TAG TTG ACG CTC ATC GACAGA-3’(SEQ ID NO：21)；

3F-2：5’-GAC TAT GAA AAT TCC GTC ACT AGG TTT CCG ACT CCGATG C-3’(SEQ ID NO：22)；

5R-3：5’-AAC GAC ACA AAT TTT GTG ATG TTG ACG CTC ATC GACAGA-3’(SEQ ID NO：23)；

3F-3：5’-CTT CAG GCT CCG GCG AAG AGT AGG TTT CCG ACT CCGATG C-3’(SEQ ID NO：24)；

按照实施例1的方法，用上述两组引物(5R-2和3F-2，5R-3和3F-3)进行PCR，然后将得到的三段PCR产物进行融合PCR，用琼脂糖凝胶电泳进行检测融合PCR的产物，几乎观察不到明显的同源重组DNA片段的条带，而从图2中第5泳道可以观察到非常明显的同源重组DNA片段的条带。说明使用实施例1的引物中的融合PCR的接头序列与待敲除基因片段之间的连接效率很高。

比较实施例1和实施例3的结果，可以看出，实施例1中阳性转化子在总的转化子中的比例高达87％，而当使用的F2dU的浓度过低时(即现有技术中所使用的浓度)，基因敲除效率大大降低了，仅为3.8％，但仍高于现有技术1.8％的基因敲除效率。这说明本发明的方法是一种高效的筛选阳性转化子的大丽轮枝菌基因敲除的方法，同时说明使用的F2dU的浓度在40-60μM，进一步优选在45-55μM时能够得到最高的基因敲除效率。

比较实施例1和实施例4的结果可以看出，使用其他融合PCR的接头序列得到同源重组DNA片段的效率非常低，几乎观察不到阳性连接片段，说明实施例1中使用的三轮PCR的引物序列尤其是引物中用于融合PCR的接头序列，能够极大的提高同源重组DNA片段的构建成功率，从而便利了整个基因敲除的过程，提高整体基因敲除方法的成功率。

Claims

1.一种大丽轮枝菌基因敲除的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：构建用于同源重组的重组质粒，该重组质粒由载体和同源重组DNA片段组成，所述同源重组DNA片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于该外源抗性基因两侧的满足同源重组要求的侧翼序列，所述载体含有外源条件致死基因；通过农杆菌介导的方法，将所述重组质粒转化至大丽轮枝菌中进行同源重组，得到转化子，并筛选出阳性转化子。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述外源条件致死基因为HSVtk基因，其含有如SEQ ID NO：1所示序列的DNA片段，所述筛选出阳性转化子的方法包括，向体系中加入与外源抗性基因相对应的抗生素和条件致死基因所对应的5’-氟脱氧尿苷，且5’-氟脱氧尿苷的浓度为40-60μM。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述载体的序列如SEQ IDNO：2所示，所述外源条件致死基因位于载体的T-DNA中。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述外源抗性基因为潮霉素抗性基因。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，位于该外源抗性基因两侧的满足同源重组要求的侧翼序列与待敲除基因两侧的侧翼序列相同，且所述侧翼序列的长度为1000-1500个核苷酸。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述待敲除基因为大丽轮枝菌的ADE4基因和/或ChsV基因。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，构建所述同源重组DNA片段的方法为融合PCR法，构建所述重组质粒的方法为Gateway克隆法。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，构建所述重组质粒的方法包括在融合PCR步骤之前，通过常规PCR的方法分别获得待敲除基因上游侧翼序列的DNA片段、外源抗性基因序列的DNA片段和待敲除基因下游侧翼序列的DNA片段，优选地，用于获得待敲除基因上游侧翼序列的DNA片段的下游引物的核酸序列如SEQ ID NO：3所示，用于获得待敲除基因下游侧翼序列的DNA片段的上游引物的核酸序列如SEQ ID NO：4所示；在融合PCR步骤之后，以融合PCR得到的产物为模板，以5’端分别带有GatewayBP反应的接头的引物为引物，进行PCR，得到带有接头的同源重组DNA片段，用于下一步与载体的连接。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述农杆菌介导的转化方法包括将重组质粒转化至农杆菌感受态细胞中，并将转化后的农杆菌感受态细胞与大丽轮枝菌共培养，其中，所述共培养在微孔滤膜上进行，且所述大丽轮枝菌的孢子浓度为4×10⁶-6×10⁶个/毫升。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法还包括对筛选得到的阳性转化子的验证，所述验证通过PCR的方法进行，所述PCR的引物为与外源抗性基因两侧的侧翼序列配对的引物。