CN102703435A - 云南番茄曲叶病毒基因组的分离鉴定及其农杆菌介导的侵染性克隆构建 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种云南番茄曲叶病毒基因组的分离鉴定及其农杆菌介导的侵染性克隆构建方法。提取感病番茄的基因组总DNA，PCR克隆病毒全基因组DNA，序列测定获得云南番茄曲叶病毒的全基因组序列。通过PCR和酶切的方法获得1.4个正向重复的基因组，并***到具有高度复制能力的植物表达载体pBinPLUS，重组载体通过电击法导入具有强感染力的农杆菌菌株EHA105，从而获得以农杆菌介导的对寄主植物具有高效感染能力的侵染性克隆。本发明为云南番茄曲叶病毒田间检测、基因组结构与功能研究、寄主植物、传毒介体与病毒三者之间的互作研究提供了成熟的方法和体系。

Description

云南番茄曲叶病毒基因组的分离鉴定及其农杆菌介导的侵染性克隆构建

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及云南番茄曲叶病毒基因组的分离鉴定及其侵染性克隆构建方法。

背景技术

双生病毒（Geminivirus）是世界范围内广泛发生的一类植物单链DNA病毒，病毒粒子为典型的双联体颗粒形态，大小约18～20 nm×30 nm，基因组为单链环状DNA。一般发生在热带、亚热带地区，温带地区偶有发生，由昆虫介体以持久性方式传播，大多侵染寄主植物的韧皮部组织。依据基因组结构、昆虫介体、寄主范围的不同，国际病毒分类委员会将双生病毒科（Geminiviridae）划分为四个属：玉米线条病毒属（Mastrevirus）、甜菜曲顶病毒属（Curtovirus）、番茄伪曲顶病毒属（Topocuvirus）和菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）。大多具有经济危害性的双生病毒属于菜豆金色花叶病毒属。大部分该属病毒的基因组结构是双组份，含有DNA-A和DNA-B，DNA-A和DNA-B基因组大小为2.5-3.0kb，DNA-A和DNA-B序列之间有一非常保守的共同区。还有一些病毒是单组份结构，类似于双组份的DNA-A，并且单组份足以引发病毒的成功侵染和致病症状，如番茄黄花叶病毒（Tomato yellow mosaic virus，ToYMV），番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)。近年来，在单组份双生病毒上发现一种新型的卫星DNAβ分子，该分子大小约为辅助病毒DNA-A的一半，卫星DNAβ依赖辅助病毒进行复制、移动和包裹，但辅助病毒必须与卫星DNAβ分子共同侵染才能在寄主上引发典型的症状，如中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）及其卫星DNAβ分子（Tomato yellow leaf curl China betasatellite，TYLCCNB）。

2004至2011年，在云南的元谋地区多次采集到黄脉、曲叶、叶脉突起症状的番茄样品，经基因组抽提、PCR扩增、序列测定发现，该病毒全长2749个核苷酸，具有典型的单组份双生病毒的基因组结构特征，病毒链编码外壳蛋白（AV1）和AV2蛋白，互补链编码复制相关蛋白（AC1）、转录激活蛋白（AC2）、复制增强蛋白（AC3）及症状相关蛋白（AC4），中间被一个277个核苷酸的非编码区（IR）分隔。IR区含有茎环结构和保守九核苷酸序列TAATATT↓AC（↓是病毒滚环复制剪切位点）、TATA盒及重复序列。根据国际病毒分类委员会关于双生病毒的分类标准，双生病毒全基因组序列的同源性低于89%，则认为是一个病毒新种。云南番茄曲叶病毒的全基因组序列与GenBank上所有已知双生病毒的同源性最高为87%，因此，我们认为这是一个病毒新种，命名为云南番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Yunnan virus，ToLCYnV）。

植物病毒侵染性克隆是研究病毒功能基因组的至关重要的平台。在分子生物学水平研究病毒基因组结构与功能、以及寄主与传毒介体、病毒三者之间的互作，必须首先获得病毒的侵染性克隆。在此基础上才能获得病毒野生型分子或者突变型分子的均一群体，进而利用DNA重组技术进行突变、***、置换、缺失以及互补实验对病毒基因组进行功能区域的定位，才有可能在寄主植物表型水平上反映和评价基因功能的表达。根据双生病毒科不同属病毒的特征，双生病毒侵染性载体构建主要方法为磨擦接种法、基因枪法、农杆菌注射法。磨擦接种法操作简单，但只适用于能够机械传播的病毒，而大部分双生病毒都不能经过磨擦接种侵染寄主植物，因此这一方法适用的病毒很少。基因枪法只需提纯病毒的DNA或简单的TA克隆，对病毒克隆的要求不高，但高度依赖于精密的基因枪等实验设备，且每次基因枪轰击所消耗金粉的费用昂贵，不同植物甚至同一植株不同部分的试验条件难以统一，这种成本高、仪器依赖性强、操作繁琐、可控性差的基因枪法在实际应用中难以推广。农杆菌注射法首先在双链DNA病毒花椰菜花叶病毒中成功应用，并逐渐被应用于双生病毒。这种方法的关键步骤是通过分子生物学方法将1-2个重复的双生病毒全基因组构建到高效植物表达载体中，再转化到农杆菌，注射植物进行侵染接种。农杆菌注射法是目前操作相对简单、应用最广和最有效的方法。但农杆菌注射方法由于需要用接种缓冲液对菌液进行后期处理，操作步骤繁琐，降低了实验效率，并且注射接种法对于茎杆粗硬的植物可操作性差，影响了双生病毒接种效率。本发明利用农杆菌注射法的优点，并对接种方法进行了改造。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种双生病毒新种云南番茄曲叶病毒基因组的分离鉴定及其农杆菌介导的侵染性克隆的构建方法。

双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组的分离鉴定方法包括如下步骤：

1）从云南采集叶片卷曲、黄化、叶脉外突症状的番茄病叶，用CTAB方法提取番茄基因组总DNA；

2）以番茄基因组总DNA为模板，根据双生病毒的保守序列设计简并引物1：5’-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3’和简并引物2：5’-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3’，PCR扩增病毒的部分序列，PCR扩增产物克隆至T-Vector，对克隆产物进行阳性克隆的筛选及序列测定；

3）根据测得的部分序列设计特异全长引物Y194F：5’- AATCATGGCCGCTCCTCAAAGC-3’和Y194R：5’- GACATACGCGAATGCGGGAAC -3’，以番茄基因组总DNA为模板PCR扩增病毒的全基因组DNA，病毒全长PCR扩增产物克隆至T-Vector，筛选阳性克隆并进行全序列测定；

4）序列测定结果通过DNAStar分析软件进行组合、拼接，获得双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组DNA序列。

农杆菌介导的新种云南番茄曲叶病毒侵染性克隆的构建方法包括如下步骤：

1）根据双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组DNA序列，利用PCR、限制性酶切、连接的方法把1.4个正向重复的基因组DNA构建到植物表达载体pBinPLUS上，获得带有1.4个正向重复基因组DNA的重组植物表达载体；

2）通过电击方法将上述重组植物表达载体导入农杆菌菌株EHA105；

3）带有重组植物表达载体的农杆菌接种YEP平板培养基，28℃培养24-48小时至形成菌落；

4）选用4-6叶充分展开的云南番茄苗龄期植株，用牙签挑取固体菌落对植株进行伤口感染，接种的具体方法和部位：在距离根部1-2 cm茎干处取三点进行扎刺接种；

5）接种植株置于25℃隔离温室培养，一周后观察接种植株的症状；

6）对有症状表型和没有症状表型的云南番茄苗龄期植株分别进行ELISA、PCR和Southern blot检测以确定新种云南番茄曲叶病毒的侵染和积累量。

双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组DNA序列用于田间云南番茄曲叶病毒的快速检测。

所述的农杆菌介导的新种云南番茄曲叶病毒侵染性克隆用于云南番茄曲叶病毒的致病性测定、病毒基因功能研究及寄主植物、传毒介体与病毒三者之间的互作研究。

本发明与现有技术相比具有的有益效果是：1）分离鉴定了一个双生病毒新种云南番茄曲叶病毒的基因组DNA；2）提供了云南番茄曲叶病毒的农杆菌介导的侵染性克隆的构建方法，该方法操作简易、侵染效率高；3）利用本发明构建的农杆菌介导的侵染性克隆接种植株，避免了常规农杆菌菌液接种方法上的缺陷，无需繁琐的操作，对仪器的依赖性低，且重复性好、快速高效、简单易学、利于大规模推广；4）利用本发明可以用于田间云南番茄曲叶病毒的快速检测；5）利用本发明可以通过突变、缺失、***、置换以及互补进行病毒基因组结构和功能及病毒、寄主、传毒介体互作机制研究。

附图说明

图1转云南番茄曲叶病毒AC4基因的本氏烟症状；

图2 云南番茄曲叶病毒田间检测的PCR结果。

具体实施方式

本发明通过PCR扩增、基因克隆、序列测定等实验分离鉴定了双生病毒新种云南番茄曲叶病毒。以云南番茄曲叶病毒Y194分离物为例进行侵染性克隆的构建，在序列测定的基础上，设计引物把1.4个正向重复的全长基因组DNA克隆到高复制量的植物表达载体上，重组载体转化农杆菌，通过农杆菌接种的方法使病毒基因组进入植物细胞并开始自行复制，从而实现病毒对植物的高效感染，该方法快速高效、重复性好、适用性广。

双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组的分离鉴定方法包括如下步骤：

1）从云南采集叶片卷曲、黄化、叶脉外突症状的番茄病叶，用CTAB方法提取番茄基因组总DNA；

2）以番茄基因组总DNA为模板，根据双生病毒的保守序列设计简并引物1：5’-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3’和简并引物2：5’-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3’，PCR扩增病毒的部分序列，PCR扩增产物克隆至T-Vector，对克隆产物进行阳性克隆的筛选及序列测定；

3）根据测得的部分序列设计特异全长引物Y194F：5’- AATCATGGCCGCTCCTCAAAGC-3’和Y194R：5’- GACATACGCGAATGCGGGAAC -3’，以番茄基因组总DNA为模板PCR扩增病毒的全基因组DNA，病毒全长PCR扩增产物克隆至T-Vector，筛选阳性克隆并进行全序列测定；

4）序列测定结果通过DNAStar分析软件进行组合、拼接，获得双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组DNA序列。

农杆菌介导的新种云南番茄曲叶病毒侵染性克隆的构建方法包括如下步骤：

1）根据双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组DNA序列，利用PCR、限制性酶切、连接的方法把1.4个正向重复的基因组DNA构建到植物表达载体pBinPLUS上，获得带有1.4个正向重复基因组DNA的重组植物表达载体；

2）通过电击方法将上述重组植物表达载体导入农杆菌菌株EHA105；

3）带有重组植物表达载体的农杆菌接种YEP平板培养基，28℃培养24-48小时至形成菌落；

4）选用4-6叶充分展开的云南番茄苗龄期植株，用牙签挑取固体菌落对植株进行伤口感染，接种的具体方法和部位：在距离根部1-2 cm茎干处取三点进行扎刺接种；

5）接种植株置于25℃隔离温室培养，一周后观察接种植株的症状；

6）对有症状表型和没有症状表型的云南番茄苗龄期植株分别进行ELISA、PCR和Southern blot检测以确定新种云南番茄曲叶病毒的侵染和积累量。

双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组DNA序列用于田间云南番茄曲叶病毒的快速检测。

所述的农杆菌介导的新种云南番茄曲叶病毒侵染性克隆用于云南番茄曲叶病毒的致病性测定、病毒基因功能研究及寄主植物、传毒介体与病毒三者之间的互作研究。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1 云南番茄曲叶病毒Y194 基因组 DNA的克隆和测定

1）植物总DNA的抽提

称取0.5-1.0 g田间云南番茄曲叶病毒发病叶片，加液氮研磨至粉末状，将研磨好的粉末迅速转入50 ml加有4-8 ml CTAB抽提液 [含2％(v/v) 2-巯基乙醇(2-Me)] 的离心管中。65℃水浴加热，每20-30分钟颠倒混匀，1 h后加入等体积的 24：1的氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀后4℃ 10,000 rpm 离心5 min。取上清转入另一新的50 ml离心管中，加入1/10上清体积的CTAB/NaCl以及等体积的24：1的氯仿/异戊醇混匀，再4℃ 10, 000 rpm 离心5 min。取上清转入另一新的50 ml离心管中，加入1/10上清体积的3 M NaAc (pH 5.2)和等体积的-20℃预冷的异丙醇，-20℃放置1 h。4℃ 12, 000 rpm 离心5 min；弃上清。沉淀用70％酒精洗一次，即加入2 ml 70％酒精，4℃ 10, 000 rpm 离心5 min。将块状DNA沉淀用干净的枪头转移至1.5 ml离心管中，适度干燥后用200-500 μL ddH₂O溶解即得植物总DNA。

2）PCR扩增、克隆以及全基因组序列测定和分析

以上述提取的植物总DNA为模板，用简并引物1(5’-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3’)和简并引物2(5’-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3’)对DNA进行PCR扩增，反应参数为：94℃ 3 min；94℃变性45 sec，52℃退火30 sec，72℃延伸45 sec，30个循环后，72℃延伸10 min，PCR获得约500 bp长的条带。PCR产物经QiaGen胶纯化Kit回收后克隆至pGEM-T Vector，阳性克隆经PCR或酶切鉴定进行序列测定和分析。在序列测定和分析的基础上设计另一对背靠背的全长引物Y194F（5’- AATCATGGCCGCTCCTCAAAGC-3’）和Y194R（5’- GACATACGCGAATGCGGGAAC -3’）进行扩增，PCR产物为约2.7kb的条带。经QiaGen胶纯化Kit回收后克隆至pGEM-T Easy Vector，获得阳性克隆pGEM-T-DNA。测序公司进行序列测定，并用DNAstar的Seqman进行序列拼接得到Y194 DNA的全长基因组序列如SEQ ID NO:1，共2749 bp。

实施例2 云南番茄曲叶病毒Y194侵染性克隆的构建

农杆菌介导的双生病毒的侵染性克隆需要1.3－2.0个重复以上的全长基因组，并且必须包括2个基因间隔区（IR区）。以病毒基因组DNA为模板，以含有EcoR I单酶切位点的Y194EF（5’- GCGGAATTCCTTAAAGTGCTTTAG -3’）与Y194ER (5’- TAGGAATTCATGGGAGCCCAAAG -3’)为引物，PCR扩增并克隆至pGEM-T Vector，获得pGEM-T-Y194，用BamH I和EcoR I对pGEM-T-Y194进行酶切，得到0.4个全长DNA，***用BamH I和EcoR I双酶切的双元载体pBinPLUS获得 pBinPLUS-Y194-0.4A；用EcoR I从pGEM-T-Y194切出一个完整的全长DNA后***pBinPLUS-Y194-0.4A的相应位点，得到pBinPLUS-Y194-1.4A的侵染性克隆。

实施例3 重组载体电击转化农杆菌

通过电击的方法将重组植物表达载体导入农杆菌宿主细胞EHA105。首先，需要制备EHA105的感受态细胞。挑取农杆菌EHA105的单菌落接种于5mL含40 μg/mL利福平(Rif)的YEP液体培养基中，28℃ 200 rpm，培养至OD600≈0.6，用1.5 mL离心管收集足够的菌，4℃ 8,000 rpm离心1 min，弃尽上清；菌体用200 μL ddH₂O充分重悬，4℃ 8,000 rpm离心1 min，弃尽上清，重复三次后，弃尽上清；最后菌体再用200 μL ddH₂O 充分重悬，即为农杆菌感受态细胞。取10 μL重组质粒pBinPLUS-Y194-1.4A加入到200 μL 根癌农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，转入电击杯中，置于冰上10 min 。调节电击装置(BIO-RAD)至电压2400 V，按仪器指示进行电击。电击完后，室温静置2 min后加入800 μL YEP 恢复培养基，28℃静置1 h，然后在 28℃，200 rpm 振荡培养2 h。最后取200 μL 涂布于含50 μg/mL卡那霉素(Kan) 和40 μg/mL利福平(Rif) 的YEP固体培养基上，在培养箱中28℃倒置培养48 h 。

实施例4 农杆菌扎刺接种植株

pBinPLUS-Y194-1.4A在含50 μg/mL卡那霉素和40 μg/mL利福平的YEP固体平板培养基培养，28℃下培养48小时。接种植株选用4-6叶期充分展开的幼苗为宜。接种本氏烟、番茄、心叶烟、三生烟、普通烟。具体接种方法如下，取一根灭菌牙签，挑取固体菌落，在距离根部1-2cm处取三点进行韧皮部扎刺接种，接种植株置于25℃隔离温室培养。

实施例5 云南番茄曲叶病毒侵染性克隆的侵染性测定

对接种植株进行症状观察，并对所有接种植株进行PCR及ELISA检测。接种4周后症状观察表明，接种后的本氏烟呈现严重叶上卷、叶脉增厚的症状；番茄表现出叶下卷、叶脉增厚的症状；心叶烟有叶脉增厚的表型；三生烟呈现叶下卷症状；矮牵牛具有叶上卷、叶脉增厚及叶表面针状突起的症状。Y194 DNA侵染不同寄主上的侵染效率都非常高，在94%以上（见表1）。

表1.  Y194 DNA对不同寄主的侵染性及侵染效率检测

Y194 DNA	本氏烟	番茄	心叶烟	三生烟	矮牵牛
						发病株数/接种株数	66/66	59/60	31/32	30/32	32/32
侵染效率(%)	100	98	97	94	100
						EILSA检测	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性
PCR检测	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性

实施例6 田间病毒病样品特异性检测

针对云南番茄曲叶病毒的外壳蛋白碱基序列，设计云南番茄曲叶病毒的特异引物ToLCYnVF（5’-GTCCCGCCGATATAGTCATTTCC-3’）和ToLCYnVR (5’-GAGAATCATAAAAATAGATACGG-3’)。采集田间叶片卷曲、黄化、叶脉外突等疑似云南番茄曲叶病毒病症状的番茄、烟草、辣椒、及杂草等48个样品，用CTAB法提取DNA后，用此特异引物对DNA样品进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃ 2 min；94℃变性45 sec，48℃退火30 sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10 min。PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，若有750 bp的目的条带，则表明样品感染了云南番茄曲叶病毒。图2电泳结果表明，部分番茄和烟草样品检测到云南番茄曲叶病毒。

实施例7 云南番茄曲叶病毒AC4基因功能研究

为了明确云南番茄曲叶病毒AC4的功能，设计特异性引物AC4F（5’-ATGGGTCACTGCATCTCCATG-3’）和AC4R（5’-TTAGGGCCTCTGCAGCAGCATC-3’），PCR扩增AC4片段，并将AC4构建到植物表达载体pBin438上。农杆菌介导法转化本氏烟，获得转云南番茄曲叶病毒AC4基因的转基因本氏烟。转AC4基因本氏烟表现出叶片皱缩、上卷等典型云南番茄曲叶病毒病的症状（图1）。转基因结果说明，AC4是云南番茄曲叶病毒的症状决定因子。

 

序列表

(1)一般资料

(i)申请人：谢艳，周雪平，矫晓阳，吴建祥

(ii)发明主题：云南番茄曲叶病毒基因组的分离鉴定及其农杆菌介导的侵染性克隆构建

(ⅲ)序列数：1

(2) SEQ ID NO:1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：2749碱基对   

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)几何结构：线性

(ⅱ)分子类型：云南番茄曲叶病毒Y194 基因组 DNA

(ⅲ)推测：非

(ⅳ)反义：非

(ⅴ)序列描述：SEQ ID NO:1

accggatggccgcgcgattttttttaaagtggttcccgcattcgcgtatgtccaatcatggccgctcctcaaagcttaattattaaatggtcccctatataacttaggccccaagtatttacgttaaacatgtgggatcctttactcaacgagttcccggataccgtacatgggttcaggtgtatgcttgcaataaaatacctgcagcttgtagaaaatacgtattctcccgatacgttgggatacgatctaatacgcgatctcatacttgttatacgggtgagggattatgtcgaagcgtcccgccgatatagtcatttccactcccgcctccaaggtgcgtcgccgtctgaacttcgacagcccttacacacgtcgtgctgctgtccccactgtccgcgtcaccagaagacaaatatggaacaacaggcccatgtatcgaaagcccatgatgtaccggatgtacagaagccctgatgttccgaagggttgtgaaggcccatgtaaggtgcagtcatatgaggcccgtcatgatgtatctcatactggtaaggtgatatgtgtcacggatgttacacgtggtaatggtattacgcatcgagttggtaagaggttttgtgtgaaatctatttacgtcattgggaagatatggatggatgaaaatattaaattgaagaatcacaccaatacagttatgtttttccttgttagagatcggcgtccgagtggtactccgatggattttcaacaggtgtttaattgttatgacaatgagccaagcaccggtactgtgaagaatgatcttagagataggtttcaagtgattcgcaagttcaattatatggttactggtgggcaatatgcgtccaaagaacaagcagtggtgaagaagttcttgcgggttaatacccatgttgtgtataatcatcaagaacaggcgaagtatgaaaatcatactgagaatgcgttgttgttgtatatggtgtgtactcatgctagtaatcctgtatatgcgactttgaaagtccgtatctatttttatgattctcaaatgaattaataaatatttagttttatatcatgatcttcaattacatcaatcgtgccttctaggacattgtataatacatgagatattgctctaattacattgttgatgctaatcactcccaatctatctaaatatttaatacattgatacttaaatactcttaagaaacgcaatgtctgaggatgtaaacgagtccagattttgcaggttagaaaacatttgtgtatccccaacgctttcctcaggttgtagttgaattggacttgtaatgtgattatgtcgtggttcctcagaaatggtcgctctaggtgtttggttatcttgaaataaaggggatttttgaccgtccaaatataaacgccattctctgcttgagctgcagtgagtagttcccctgtgcgtgaatccattatcgtgacagccaatggcgagaaagtatgaacagccacagggtagatcaactctccgtcgtctggttgtcttcttggcgattcggtgttgcaccttgataggaacctgagtagagtgggccttggagggtgacgaagatcgcattttttagcgcccaatttcgaagtgcggtgttcttttcctcttccagatactctttatagctggaattgggtcctggattgcagaggaagatagtgggtattccgcctttaatttgaactggtttcccgtatttggtgttactttgccagtccctttgggctcccatgaattccttaaagtgctttaggtagtgcggatctacgtcatcaatgacgttgaaccaagcatcattattgtacacctttggactcagatccaaatgaccacacaaataattatgtggtcctaatgacctggcccacatcgtcttccccgttctactatcaccctctatgactatacttatcggtcttaaaggccgcgcagcggcactgacaacattatccaccgcccaatcttcaagttcttctggaacttgatcaaaagaagaagaagcaaatggagaaatatatacctccaacggaggtgcaaaaatcctatctaaattagattttaaattatgatattgaaaaatataatctttcggcagtttctcccgaataacagccatagcggcttcagcggaacctgtgtttagggcctctgcagcagcatcattagctgtctgttgacctcctcgtgcagatcttccatcgatctgaaaactaccccagtcgatgtaatcaccgtccttcttgatgtaggacttgacgtccgagctggacttagctccctggaagtttgggtggtattgggtggaggtattagggtgtgtgatgtcgaaatgtctgggattacggaactgggctttacctttgaattggatgagcacatggagatgcagtgacccattacgatgtttttcttgtgctactcgtatgaataatttatcggatgggcatggtatttgttgaatgatttctagggcttgttcttttggaatggggcatttgggataagtgagaaatatgtttttggctttcacttggaatgaattaagacgaggcattttgacttagtcaattgggtgctctctaaagtcctatggaatggggggctttgggtgcccatttataccgagcacccaaatggcaatatcgtaattccccaaataaggtcaaaattcaaaagtcgaaattcaaaagcggccatccgtataatatt

SEQ ID NO:2. 简并引物1：5’-taatattacckgwkgvccsc-3’

SEQ ID NO:3. 简并引物2：5’-tggacyttrcawggbccttcaca-3’

SEQ ID NO:4. Y194F：5’- aatcatggccgctcctcaaagc-3’

SEQ ID NO:5. Y194R：5’- gacatacgcgaatgcgggaac -3’

SEQ ID NO:6. Y194EF  5’- gcggaattccttaaagtgctttag -3’

SEQ ID NO:7. Y194ER  5’- taggaattcatgggagcccaaag -3’

SEQ ID NO:8. ToLCYnVF 5’-gtcccgccgatatagtcatttcc-3’

SEQ ID NO:9. ToLCYnVR  5’-gagaatcataaaaatagatacgg-3’

SEQ ID NO: 10.AC4F  5’-atgggtcactgcatctccatg-3’

SEQ ID NO:11.AC4R（5’-ttagggcctctgcagcagcatc-3’

Claims (4)

1.一种双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组的分离鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：

1）从云南采集叶片卷曲、黄化、叶脉外突症状的番茄病叶，用CTAB方法提取番茄基因组总DNA；

2）以番茄基因组总DNA为模板，根据双生病毒的保守序列设计简并引物1：5’-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3’和简并引物2：5’-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3’，PCR扩增病毒的部分序列，PCR扩增产物克隆至T-Vector，对克隆产物进行阳性克隆的筛选及序列测定；

3）根据测得的部分序列设计特异全长引物Y194F：5’- AATCATGGCCGCTCCTCAAAGC-3’和Y194R：5’- GACATACGCGAATGCGGGAAC -3’，以番茄基因组总DNA为模板PCR扩增病毒的全基因组DNA，病毒全长PCR扩增产物克隆至T-Vector，筛选阳性克隆并进行全序列测定；

4）序列测定结果通过DNAStar分析软件进行组合、拼接，获得双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组DNA序列。

2.一种农杆菌介导的新种云南番茄曲叶病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1）根据双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组DNA序列，利用PCR、限制性酶切、连接的方法把1.4个正向重复的基因组DNA构建到植物表达载体pBinPLUS上，获得带有1.4个正向重复基因组DNA的重组植物表达载体；

2）通过电击方法将上述重组植物表达载体导入农杆菌菌株EHA105；

3）带有重组植物表达载体的农杆菌接种YEP平板培养基，28℃培养24-48小时至形成菌落；

4）选用4-6叶充分展开的云南番茄苗龄期植株，用牙签挑取固体菌落对植株进行伤口感染，接种的具体方法和部位：在距离根部1-2 cm茎干处取三点进行扎刺接种；

5）接种植株置于25℃隔离温室培养，一周后观察接种植株的症状；

6）对有症状表型和没有症状表型的云南番茄苗龄期植株分别进行ELISA、PCR和Southern blot检测以确定新种云南番茄曲叶病毒的侵染和积累量。

3.一种如权利要求1所述的方法获得的双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组DNA序列的应用，其特征在于所述的双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组总DNA序列用于田间云南番茄曲叶病毒的快速检测。

4.一种如权利要求2所述的农杆菌介导的新种云南番茄曲叶病毒侵染性克隆的构建方法的应用，其特征在于所述的农杆菌介导的新种云南番茄曲叶病毒侵染性克隆用于云南番茄曲叶病毒的致病性测定、病毒基因功能研究及寄主植物、传毒介体与病毒三者之间的互作研究。

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