CN102643359A - 一种猴头菌多糖及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猴头菌多糖及其制备方法。该猴头菌多糖是采用先水提醇沉,然后用大孔树脂进行脱色的方法制备得到。本发明得到的猴头菌多糖保留率达到75%以上,并且该猴头菌多糖的免疫活性高。
Description
技术领域
本发明涉及食用菌提取及深加工领域,具体地说涉及一种猴头菌多糖及其制备方法。
背景技术
猴头菌(Hericium erinaceus)隶属于真菌门、担子菌亚门、猴头菌科、猴菇菌属,是著名的药食两用菌,早在1200年前我国人民就将其列为“山珍”,与熊掌、海参、鱼翅并架齐驱,有“山珍猴头,美味燕窝”之说。猴头菌多糖是猴头菌中最重要的活性成份之一,具有多种生物活性和药理作用,能增强巨噬细胞的吞噬功能,促进溶血素的形成,抗白细胞下降,降血糖,抗凝血,抗血栓、抗突变和抗衰老等。猴头多糖具有很强的免疫调节作用,它对由ConA诱导的T-淋巴细胞有增殖作用,促进脾脏淋巴细胞的增殖,对脂多糖(LPS)刺激的B淋巴细胞也有协同作用;此外,猴头菌多糖对胃肠粘膜具有保护及损伤修复作用。
目前常用的提取猴头菌中多糖的方法主要是常规的水提醇沉,但是这样得到的猴头菌多糖中含有大量的色素,色素的存在不仅影响多糖色泽,且使粗多糖易吸潮;同时影响多糖的纯度及其生物活性,对产品开发带来不利影响。
发明内容
本发明首先提供了一种猴头菌多糖,其是用如下方法制备得到的:
①水提醇沉的方法提取猴头菌,干燥后得到粗多糖;
②将猴头菌粗多糖水溶液加入大孔树脂D315,进行脱色,干燥后得到猴头菌多糖。
其中所述的脱色为静态脱色,或为动态脱色。
其中静态脱色是将粗多糖水溶液中直接加入大孔树脂D315,室温下,粗多糖浓度为13.9 mg/ml ,pH为4,摇床120rpm,脱色6h,即可;
其中动态脱色是采用湿法装柱的方式装柱,层析柱规格为3.5×60cm,浓度为13.9 mg/ml的粗多糖水溶液4000rpm离心30分钟,上清用盐酸调pH至4.00,流速为0.6BV/h,上样量为3.7 g多糖/100 ml树脂。
该树脂动态脱色完成后,用1L 1mol/L的NaCl冲洗柱子,可连续上样八次以上。
本发明使用的大孔弱碱性阴离子交换树脂为:丙烯酸-二乙烯苯共聚体骨架,功能基团为≡N,具体是购自上海华震科技有限公司的D315树脂。
所述的大孔弱碱性阴离子交换树脂D315在进行脱色前,最好先进行下述步骤的预处理:先用蒸馏水清洗至无泡沫,无浑浊,再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小时,然后倒出碱液,用蒸馏水漂洗至中性。接着将树脂用3-5%的HCl溶液浸泡4小时,然后倒出酸液,用蒸馏水漂洗至中性;再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小时,然后倒出碱液,用蒸馏水漂洗至弱碱性备用。
脱色后的猴头菌粗多糖水溶液,使用冷冻干燥机进行冷冻干燥处理,最终得到颜色较浅的猴头菌多糖产品。
本发明还提供了制备上述猴头菌多糖的方法,该方法包括如下步骤:
①水提醇沉的方法提取猴头菌,干燥后得到粗多糖;
②将猴头菌粗多糖水溶液加入大孔树脂D315,进行脱色,干燥后得到猴头菌多糖。
本发明提供的经过脱色的猴头菌多糖,制备方法简便、适用于大规模生产。脱色率可达到70%以上,多糖保留率达到75%以上,并且该猴头菌多糖的免疫活性显著提高,优于未脱色的猴头菌多糖和其他方法脱色的猴头菌多糖。
具体实施方式
实施例1 水提醇沉法制备猴头菌粗多糖
将猴头菌子实体用粉碎机粉碎成颗粒,按照液料比15:1(体积升比重量公斤)加入相应体积的蒸馏水,加热煮沸持续2h,之后用滤布(100目)过滤,滤渣重复上述步骤再提取一次后过滤,合并两次提取的滤液。滤液按浓缩比1:1浓缩后,70%乙醇沉淀,弃上清,沉淀溶于水,喷雾干燥最终得到猴头菌粗多糖干品。
实施例2体外刺激巨噬细胞生成NO实验
将实施例1制备得到的猴头菌粗多糖干品配制成10mg/ml的粗多糖水溶液,然后分别进行如下三种方法脱色。
①双氧水脱色:粗多糖溶液浓度为10mg/ml,用氨水调pH至8.0,加入3%的30%的双氧水,60 ℃水浴180分钟,调pH至7.0, 取样。
②D315树脂脱色:粗多糖溶液浓度为10mg/ml,体积为100ml,加入20ml的大孔树脂,摇床中120rpm, 25 ℃, 9小时,取样。
双氧水脱色、D315树脂脱色及未脱色粗多糖溶液于分子截流量为3500的透析袋透析除去小分子。
将脱色后的猴头菌多糖水溶液用旋转蒸发仪浓缩后先放置于-20℃冷冻12h,然后置于-80摄氏度冷冻12h,之后转到冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理,最后得到脱色的猴头菌多糖。
供试样品的配制
精确称取以上得到的猴头菌多糖样品于灭过菌的eppendorf管中,用PBS缓冲液配置成浓度5mg/mL。充分溶解后以12000 rpm/min离心30分钟,无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中,将样品稀释成25、50、100μg/mL待用。空白对照为PBS缓冲液,阳性对照为10μg/mL LPS溶液。
小鼠RAW264.7巨噬细胞的制备
用DMEM培养基在37℃、5% CO2条件下传代培养后,用0.05%胰蛋白酶消化,混悬液300×g离心3min后收集细胞,用无色RPMI1640培养基将细胞稀释到一定浓度备用。
巨噬细胞释放NO活性的测定
由于NO极不稳定,在体内很快生成亚硝酸基(NO2-)和硝酸基(NO3-),故采用Griess法测定样品中的NO2- /NO3-作为衡量NO水平的指标。
(1)用亚硝酸钠制标准曲线:
配成不同浓度的亚硝酸钠溶液,浓度梯度为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μM共11个;取100μL于96孔板,加入50μL Griess试剂,测定543nm吸光值,标准曲线每个浓度3个重复,绘制标准曲线。
(2)NO产量测定
吸掉巨噬细胞的培养液,加PBS 2 ml,震荡再吸掉。用0.05%胰酶或5% EDTA溶液在培养箱37℃中3-5min消化巨噬细胞。消化完毕,加入1mL DMEM完全培养基+胎牛血清终止反应,离心,吸掉消化液,加入1mL无色RPMI1640(10%胎牛血清+1%抗生素液体),计数。用无色RPMI1640培养基将细胞稀释至5×105/ml,加入96孔板,每孔加入180μL,然后再加入20μL待测样品, 37℃培养48h。取100μL上清于96孔板,加入50μLGriess试剂,显色10min后,于波长543nm处测定吸光度,根据标准曲线计算相应的NO量。
实验结果
双氧水脱色猴头多糖与未脱色猴头多糖测定的巨噬细胞中NO的含量(单位:μmoL/5.0×108cells)分别为: 17.30 、7.95 (样品浓度25μg/mL);23.61 、12.60(样品浓度50μg/mL);13.49 、15.71(样品浓度100μg/mL)。可以看出,实施例2中的双氧水脱色猴头菌多糖与实施例1中的相比,刺激巨噬细胞产生NO的活性降低。树脂D315脱色猴头菌多糖与未脱色猴头菌多糖测定的巨噬细胞中NO的含量(单位:μmoL/5.0×108cells)分别为: 26.29 、8.64(样品浓度10μg/mL);34.92、24.70(样品浓度25μg/mL);42.42 、31.89(样品浓度50μg/mL),可以看出,实施例2中的树脂D315脱色猴头多糖与实施例1中的相比,刺激巨噬细胞产生NO的活性显著增强。
实施例3
将实施例1得到的猴头菌粗多糖配制成10mg/ml的水溶液。
取HZ202,JK206,335,D315,D303(购自上海华震科技有限公司),脱色一号(购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司)六种大孔树脂各20ml,和100ml 10mg/ml离心后的猴头多糖(4000rpm,30min)溶液混和,迅速摇匀后取样,为初样,将三角瓶放到摇床中,温度设为25℃,120rpm。
吸附9小时,用滤布过滤,100ml蒸馏水清洗,过滤,再用50ml蒸馏水清洗,过滤,合并滤液,旋蒸仪浓缩,定容至100ml,取50ml冻干,另50ml透析。测多糖含量,算出得率。
体外刺激巨噬细胞生成NO实验的操作方法同实施例2。
体外刺激淋巴细胞增殖实验的操作步骤如下:
供试样品的配制
精确称取多糖样品(实施例1、实施例2中得到的猴头多糖)于灭过菌的eppendorf管中,用PBS缓冲液配置成浓度10 mg/mL。充分溶解后以12000 rpm/min离心30分钟,无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中,将样品稀释成200、500、1000μg/mL待用。空白对照为PBS缓冲液,阳性对照为60μg/mL PHA溶液。
小鼠脾淋巴细胞的制备
小鼠颈椎脱臼处死,取脾脏,用PBS冲洗3~4次。用100目筛在培养皿中将脾脏磨碎,磨碎后的混悬液以400×g离心6 min,吸去上清液,加入浓度为0.83%氯化氨溶液裂解红细胞,反复冲打,静置10 min后400×g离心6 min,收集的细胞用PBS缓冲液冲洗数遍后,台朌蓝检查活力在95%以上。用RPMI1640将细胞稀释成2×106个/mL,加入96孔细胞培养板中,在37℃、5%的CO2下培养。
淋巴细胞增殖率的测定
将180 μL每mL含2×106个淋巴细胞的悬浮液加至96孔板中,同时加入20 μL样品,于37℃、含5%的CO2条件下培养3 d,用酶标仪测定其570 nm和600 nm处的吸光度,然后加入20 μL Alamar Blue试剂,再培养,变色后再测定570 nm和600 nm处的吸光度,然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对细胞增殖的影响。
计算公式:
淋巴细胞增殖率(%)=[117216×Al570(sample)-80586×Al600(sample)]
/[117216×Al570(control)-80586×Al600(control)]×100%
实验结果
六种大孔树脂HZ202、JK206、335、D315、D303、脱色一号脱色后猴头菌多糖测定的巨噬细胞中NO的含量(单位:μmoL/5.0×108cells)分别为:18.46、12.77 、22.77、26.59、27.24、23.18(样品浓度25μg/mL);24.32、18.71 、27.00、31.63、26.59、26.67(50μg/mL);30.01、22.53 、34.15、37.89、35.86、33.83(100μg/mL)。可以看出,各树脂脱色猴头多糖相比,D315刺激巨噬细胞产生NO的活性最高。
五种大孔树脂HZ202,335,D315,D303,脱色一号脱色后猴头多糖测定的淋巴细胞增值率(%)分别为: 230%,226%,234%,271%,251%(样品浓度50μg/mL);239%,261%,251%,265%,308%(100μg/mL);204%,250%,273%,266%,247%(200μg/mL)。各树脂脱色后的猴头菌多糖相比,D315,D303,脱色一号脱色后猴头多糖都具有较好的刺激淋巴细胞增殖的活性。
实施例4
实施例1的猴头粗多糖干品配成13.8mg/ml的猴头菌粗多糖溶液,离心除去沉淀部分。
大孔弱碱性阴离子交换树脂D315的预处理:
先用蒸馏水清洗至无泡沫,无浑浊,再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小时,然后倒出碱液,用蒸馏水漂洗至中性。接着将树脂用3-5%的HCl溶液浸泡4小时,然后倒出酸液,用蒸馏水漂洗至中性;再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小时,然后倒出碱液,用蒸馏水漂洗至弱碱性备用。
100mL 13.85mg/ml的猴头菌粗多糖水溶液加入37mL已预处理好的大孔弱碱性阴离子交换树脂D315,于250mL三角烧瓶中,置于摇床中震荡,120rpm,25℃、pH4.0条件下脱色6h,然后用滤布(100目)过滤,收集脱色后的猴头菌多糖水溶液,进行脱色的测定以及多糖保留率的测定。
猴头菌多糖水溶液,稀释100倍后用苯酚硫酸法在490nm下测定脱色前后多糖含量,在450nm下测定脱色前后色素含量。
计算公式:
结果:脱色率达到69.35%,多糖保留率达到80.16%。
3. 冷冻干燥
将脱色后的猴头粗多糖水溶液用旋转蒸发仪浓缩后先放置于-20℃冷冻12h,然后置于-80摄氏度冷冻12h,之后转到冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理,最后得到颜色较浅的猴头菌多糖。
实施例5
实施例1的猴头粗多糖干品配成13.9mg/ml的猴头菌粗多糖溶液,离心除去沉淀部分。
阴离子交换树脂D315的预处理(树脂预处理方法同实施例4)
取100ml预处理好的大孔树脂D315,采用湿法装柱的方式装柱,层析柱规格为3.5×60cm,配置浓度为13.9 mg/ml的粗多糖,4000rpm离心30分钟,取上清,用盐酸调PH至4.00,流速为0.6BV/h,上样量为3.7g多糖/100ml树脂,该树脂脱色完成后,用1L 1mol/L的NaCl冲洗柱子,可连续上样八次以上。脱色后的猴头菌多糖水溶液,使用冷冻干燥机进行冷冻干燥处理,最终可得到颜色较浅的猴头菌多糖产品。
测定其多糖含量和色素,与实施例1的相比,计算得到其脱色率为75.7%,多糖保留率为77.8%。
Claims (4)
1.一种猴头菌多糖,其特征在于其是用如下方法制备得到的:
①水提醇沉的方法提取猴头菌,干燥后得到粗多糖;
②将猴头菌粗多糖水溶液加入大孔树脂D315,进行脱色,干燥后得到猴头菌多糖。
2.根据权利要求1所述的猴头菌多糖,其特征在于步骤②中所述的脱色的方法为:
将粗多糖水溶液中加入大孔树脂D315,室温下,pH为4,摇床120rpm,脱色6h,即可。
3.根据权利要求1所述的猴头菌多糖,其特征在于步骤②中所述的脱色的方法为:
采用湿法装柱的方式装柱,层析柱规格为3.5×60cm,浓度为13.9 mg/ml的粗多糖水溶液4000rpm离心30分钟,上清用盐酸调pH至4.00,流速为0.6BV/h,上样量为3.7 g多糖/100 ml树脂。
4.一种制备权利要求1-3任一项所述猴头菌多糖的方法,其特征在于包括如下步骤:
①水提醇沉的方法提取猴头菌,干燥后得到粗多糖;
②将猴头菌粗多糖水溶液加入大孔树脂D315,进行脱色,干燥后得到猴头菌多糖。
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