CN107418921B

CN107418921B - 一种海洋微生物菌剂及其制备方法

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Publication number: CN107418921B
Application number: CN201710801240.5A
Authority: CN
Inventors: 王聪; 凌娟; 周卫国; 林丽云; 张燕英; 曾思泉; 尹浩; 董俊德
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2017-09-07
Filing date: 2017-09-07
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2037-09-07
Also published as: AU2018314720B2; CN107418921A; AU2018314720A1; WO2019029394A1

Abstract

本发明公开了一种海洋微生物菌剂及其制备方法。它包括星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43504菌剂和芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO 43505菌剂。按照本发明的方法制成的海洋微生物菌剂，其活菌数量高，杂菌数量少及粪大肠杆菌的数量少，均达到农用微生物菌剂国家标准(GB 20287‑2006)。本发明的海洋微生物菌剂在海水中能够沉淀在海草周围，从而利于菌株定植于海草根部，发挥促进海草生长的作用。

Description

一种海洋微生物菌剂及其制备方法

技术领域：

本发明属于微生物菌剂领域，具体涉及一种海洋微生物菌剂及其制备方法。

背景技术：

在热带和温带海域，由于海草床生态***存在大量的有机碳固定和输出、营养物质循环、稳定的沉积物以及丰富的生物多样性，海草拥有关键的生态地位。海草床生态***不仅生长着大量的动植物，也附寄生许多微生物种群。海洋固氮原核生物能够转化大气中的N元素为铵化合物，进入海洋生态***；解磷细菌能溶解难降解磷化合物，促进P元素的循环。但是，2006年的一项调查研究显示，过去20年内，由于自然因素和人为因素的威胁，世界上有记录的海草床中，大约18％(33000km²)已消失。微生物肥料是指将特殊效能的微生物(如根瘤菌、解磷菌等)经过扩大培养与草炭或其他载体混合，且使用少量接种剂、拌种剂；经过加工制成，用于底肥、追肥的混合肥料。因此可以利用功能微生物制成微生物菌肥及功能缓释剂利用于海草床的修复。

目前国内外对利用PGPB发酵生产微生物菌剂，并运用于陆地农作物的研究趋于成熟。德国研究者Egamberdiyeva在玉米上接种产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)，在钙质土壤中以未接种作对照，发现能够显著提高玉米芽和根的N、P含量16％-85％。在1998年，杨权奎等研究固氮菌肥肥力高对大麦水稻的影响，就发现固氮菌肥能增加大麦和水稻的产量。研究PGPB的影响最多的是水稻。Torre-Ruiz等利用既有固氮解磷作用，又能产生IAA的菌株对龙舌兰施肥，发现能显著(P<0.005)促进龙舌兰的生长。截至2012年，我国微生物肥料企业850多家，年产量超过900万t，农业部登记的产品种类有11个，目前使用的菌种150多种并不断扩大。

Kathiresan.等比较了芽孢杆菌(Bacillus)和固氮菌(Azotobacter)施用于红树林幼苗，根的增长率分别为171.6％和123.9％。然而，国内外应用微生物菌剂促进海草的生长及海草床生态***的修复很少有研究和报道。其存在的困难有：(1)海草生长环境的特殊性，导致菌剂易随海水流动，影响实际促生效果；(2)海水密度大，不利于海草根际沉积物中益生菌的定植。

发明内容：

本发明的目的是提供一种海洋微生物菌剂，该海洋微生物菌剂活菌数量高，杂菌率低，对环境安全无毒，能够在海水中沉淀，从而有利于菌株定植在海草根部，促进海草的生长。

本发明的海洋微生物菌剂，其包括星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43504菌剂和芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO 43505菌剂；

所述的星箭头菌SCSIO 43504菌剂是通过以下方法制备的：将星箭头菌SCSIO43504的菌液浓缩后，将浓缩后的菌体液与麦麸、滑石粉混合均匀后，干燥后获得星箭头菌SCSIO 43504菌剂；

所述的芽孢杆菌SCSIO 43505菌剂是通过以下方法制备的：将芽孢杆菌SCSIO43505菌液浓缩后，将浓缩后的菌体液与草炭、滑石粉混合均匀后，干燥后获得芽孢杆菌SCSIO 43505菌剂。

优选，所述的星箭头菌SCSIO 43504菌剂用PVA水溶袋包装密封，所述的芽孢杆菌SCSIO 43505菌剂用PVA水溶袋包装密封。

水溶性的PVA包装材料，对环境安全无毒，易于储存和运输，且使用方便。在静止的海水中，PVA水溶袋包装的菌剂溶解时间约为20min。溶解后，菌剂暴露于海水中，沉淀在海草周围。

所述的星箭头菌SCSIO 43504的菌液是通过以下方法制备的：将星箭头菌SCSIO43504的活化菌液以体积分数5％的接种量接种到发酵培养基中，温度33℃、无菌风量60m³/h、发酵时间60h，由此获得星箭头菌SCSIO 43504的菌液，所述的发酵培养基每升含有：玉米粉10g，黄豆粉5g，NaCl 25g，其余为水，pH7.5。

所述的芽孢杆菌SCSIO 43505菌液是通过以下方法制备的：将芽孢杆菌SCSIO43505的活化菌液以体积分数5％的接种量接种到发酵培养基中，温度28℃、无菌风量60m³/h、发酵时间48h，由此获得芽孢杆菌SCSIO 43505的菌液，所述的发酵培养基每升含有：玉米粉10g，黄豆粉5g，NaCl 25g，CaCO₃ 2g，其余为水，pH6.7。

优选，所述的星箭头菌SCSIO 43504菌剂是通过以下方法制备的：将星箭头菌SCSIO 43504的菌液浓缩后，将每30ml浓缩后的菌体液与25g麦麸、25g滑石粉混合均匀后，干燥后获得星箭头菌SCSIO 43504菌剂；

所述的芽孢杆菌SCSIO 43505菌剂是通过以下方法制备的：将芽孢杆菌SCSIO43505菌液浓缩后，将每30ml浓缩后的菌体液与25g草炭、25g滑石粉混合后，干燥后获得芽孢杆菌SCSIO 43505菌剂。

本发明利用从海草根际沉积物中分离得到的两株功能菌株，以它们作为菌剂的功能菌株，然后针对不同的菌株，选取合适的载体、干燥温度和时间、包覆材料、储存条件等。合适的载体不仅能够吸附菌体达到干燥的效果，而且不对菌体本身产生危害，影响活菌数量。干燥的温度和时间也会影响活菌数量和染杂菌的数量。干燥时间短，样品被染杂菌机率就越大。

按照本发明的方法制成的海洋微生物菌剂，其活菌数量高，杂菌数量少及粪大肠杆菌的数量少，均达到农用微生物菌剂国家标准(GB 20287-2006)。本发明的海洋微生物菌剂在海水中能够沉淀在海草周围，从而利于菌株定植于海草根部，发挥促进海草生长的作用。

星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43504于2016年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016691。

芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO 43505于2016年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016692。

附图说明：

图1是菌株16S rDNA***发育进化树，其中AZ16表示星箭头菌(Sagittulastellata)SCSIO43504，XT37表示芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO 43505。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

LB培养基：用于菌种活化和保藏。蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 25g，去离子水1L，固体加入16g琼脂，然后灭菌。

选择性海草固氮培养基：用于固氮菌的初筛。FeSO₄·7H₂O 0.001g，KCl 0.56g，MgCl₂·6H₂O 4.0g，NaCl 25g，MgSO₄·7H₂O 4.8g，K₂HPO₄ 0.01g，Tris 0.48g，蛋白胨4.0g，酵母提取物2.0g，甘油2.0mL，去离子水1L，pH 8.1，固体加入16g琼脂，然后灭菌。

无氮培养基(Ashby)：用于固氮菌株的复筛。CaCO₃ 5g，甘露醇5g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 5g，CaSO₄ 0.1g，陈海水0.5L，去离子0.5L，pH 7.0，然后灭菌。

改良选择性解磷培养基(PSM)：用于解磷菌株的筛选。D-葡萄糖15g，NH₄NO₃ 5g，CaCl₂ 2g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，MnSO₄·7H₂O 0.01g，植酸钠4g(单独灭菌)，NaCl 25g，pH 8.15，去离子水1L，固体培养基加入16g琼脂，然后灭菌。

1、菌株的分离

本发明利用选择性海草固氮培养基从西沙喜盐草根际沉积物中初筛，然后用无氮培养基复筛，纯化获得一株固氮菌SCSIO 43504，然后将其保存在LB培养基中。

本发明利用改良选择性解磷培养基从西沙喜盐草根际沉积物中筛选，纯化得到一株解有机磷菌SCSIO 43505，然后将其保存在LB培养基中。

2、菌种的分类、鉴定、安全性评价

2.1、形态特征：

固氮菌SCSIO 43504：球状菌、乳白色、菌落圆形且小、表面光滑、选择性固氮培养基中菌落呈黄圆形黏稠状、革兰氏阴性菌，固氮酶活性达34.63nmoLC₂H₂/(mL·h)。

解有机磷菌SCSIO 43505：杆状菌、灰白色、菌落圆形且大、选择性固氮培养基中菌落呈深黄色圆形褶皱、干燥、革兰氏阳性菌，植酸酶活性达239.49μg/L。

2.2、生理生化鉴定

根据《常见细菌鉴定手册》革兰氏阳性好养和兼性厌氧球菌及产芽孢杆菌鉴定方法，选取一些特征性生理生化指标鉴定结果如表1所示：

表1菌株的生理生化特征

注:"+"表示阳性；"-"表示阴性,"*"表示未做，不清楚。

固氮菌SCSIO 43504能够利用D-葡萄糖、麦芽糖、半乳糖，不能利用蔗糖、D-甘露醇、无淀粉酶。能利用乙酰胺和尿素，氧化酶活性高，V-P反应为阳性。

解有机磷菌SCSIO 43505能利用D-葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、淀粉，对糖类无选择特异性。

两株菌均能产生赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶，且不能产生吲哚及利用硝酸盐产气。

1.3、菌株16S rDNA***发育分析

分别提取固氮菌SCSIO 43504和解有机磷菌SCSIO 43505的DNA，然后对其16SrDNA进行扩增和测序，固氮菌SCSIO 43504的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，解有机磷菌SCSIO 43505的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。然后将上述16S rDNA进行BLAST在线比对，固氮菌SCSIO 43504属于箭头菌属(Sagittula)，与一株珊瑚礁来源的Sagittula stellataE-37^T相似度达99.04％，解有机磷菌SCSIO 43505属于芽孢杆菌属(Bacillus)，与Bacillusaryabhattai B8W22相似度达100％，选取与固氮菌SCSIO 43504和解有机磷菌SCSIO 43505同源性相近菌株的16S rDNA序列构建***发育进化树，如图1所示。

通过形态上、生理生化、基因水平对细菌鉴定，确定其种属。

本发明从海洋喜盐草的根际沉积物中，筛选、分离得到一株具有高效固氮能力的固氮菌SCSIO 43504，生理生化特征及16S rDNA初步鉴定为星箭头菌(Sagittulastellate)，命名为星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43504，其与陆地生态***PGPR菌种类不一致。其生理生化检测结果与从珊瑚礁分离得到的Sagittula stellate E-37^T也存在一些差异，具体见表1，星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43504能在厌氧的条件下生长，利用乙酰胺和尿素但不能利用甘露醇。陆地生态***中，产植酸酶细菌研究的最多的是芽孢杆菌属(Bacillus)。因此星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43504与现有技术中的星箭头菌存在许多区别，是一个新株，于2016年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016691。

将解有机磷菌SCSIO 43505命名为：芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO 43505，于2016年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016692。

1.4菌株生长曲线的测定

将活化后的星箭头菌SCSIO 43504，芽孢杆菌SCSIO 43505菌液分别按体积分数1％接种量接种于分别装有100mL选择性海草固氮培养基和LB培养基的250mL三角瓶中，隔4h取200μL菌液测量OD₆₀₀。重复三次。

实验结果表明：

芽孢杆菌SCSIO 43505在接种至选择性海草固氮培养基后8h开始进入生长对数期，接种24h后达到稳定，菌种浓度缓慢的下降最终趋于稳定。星箭头菌SCSIO 43504在接种至选择性海草固氮培养基10h之后进入生长对数期，同样在24h之后达到稳定。在LB培养基中，芽孢杆菌SCSIO 43505在8h之后进入生长对数期，26h后进入稳定期，与在选择性海草固氮培养基中差异不大。星箭头菌SCSIO 43504在LB培养基中，接种20h之后进入对数期，28h之后达到稳定期，开始进入衰亡期。

1.5、菌株发酵培养基的优化

A、单因素实验优化初始pH、发酵温度、接种量、培养基盐度、无机盐种类

B、利用Design-Expert8.0.6软件中Box-Behnken Design方法对pH、温度、接种量进行优化，共设计17组实验，重复三次，确定发酵的最终条件。

方差分析结果表明，星箭头菌SCSIO 43504模型有效(P＝0.0052<0.05)：

OD600＝-15.04013+0.2*T+3.05637*pH+0.44356*IS-4.12654E-003*T*pH-1.04861E-003*T*IS-6.72588E-004*pH*IS-2.60413E-003*T2-0.19747*pH²-0.041269*IS²

根据模型推测，当初始pH7.49、温度(T)32.65℃、接种量4.90％时，星箭头菌SCSIO43504菌液的OD₆₀₀可达到0.6876。以此培养条件，接入活化24h后的SCSIO 43504菌液，培养48h后测得菌液的OD₆₀₀为0.724，略高于预测值。

方差分析结果表明，芽孢杆菌SCSIO 43505模型显著(P＝0.0193<0.05)：

OD₆₀₀＝-16.13695+0.94565*T+0.97933*pH+0.16923*IS+0.020242*T*pH-3.34954E-003*T*IS-7.40000E-003*pH*IS-0.018620*T²-0.11158*pH²+4.22840E-003*IS²

根据模型推测，当初始pH6.82、温度(T)28.65℃、接种量5％时，芽孢杆菌SCSIO43505菌液的OD₆₀₀可达到1.33615，实际OD₆₀₀为1.2876，略小于预测值。

确定最终发酵条件如表2所示：

表2菌株发酵条件

1.6发酵条件优化

根据微生物肥料生物安全通用技术准则(NY 1109-2006)规定的微生物肥料使用菌种安全性评价本发明的星箭头菌SCSIO 43504，芽孢杆菌SCSIO 43505。急性毒性实验16d后，实验小鼠未见明显中毒体征，无动物死亡。因此根据急性毒性剂量分级标准判定，星箭头菌SCSIO 43504，芽孢杆菌SCSIO 43505属实际无毒级别。

实施例2：海洋微生物菌剂的制备

1、菌液发酵

将星箭头菌SCSIO 43504接种LB液体培养基中活化48小时，然后将活化的星箭头菌SCSIO 43504菌液以体积分数5％的接种量接种至6L发酵培养基1[10L发酵罐(BioFlo115)]中，温度33℃、无菌风量60m³/h、发酵时间60h，获得星箭头菌SCSIO 43504发酵菌液。所述的发酵培养基1，每升含有玉米粉10g，黄豆粉5g，NaCl 25g，pH 7.5，其配制方法是将玉米粉10g，黄豆粉5g，NaCl 25g加入1L水中，调pH值至7.5，灭菌而得。

将芽孢杆菌SCSIO 43505接种LB液体培养基中活化，然后将活化的芽孢杆菌SCSIO43505菌液以体积分数5％的接种量接种至6L发酵培养基2[10L发酵罐(BioFlo 115)]中，温度28℃、无菌风量60m³/h、发酵时间48h，获得芽孢杆菌SCSIO 43505发酵菌液。所述的发酵培养基2，每升含有玉米粉10g，黄豆粉5g，NaCl 25g、CaCO₃ 2g，pH 6.7，其配制方法是将玉米粉10g，黄豆粉5g，NaCl 25g、CaCO₃ 2g加入1L水中，调pH值至6.7，灭菌而得。

2、菌液浓缩

选择大容量离心机对发酵后得到的星箭头菌SCSIO 43504发酵菌液以及芽孢杆菌SCSIO 43505发酵菌液进行浓缩，去除上清液，得到菌体液(液体状)。此步骤用超滤膜进行浓缩可达到同等效果。

3、载体选择和干燥条件确定

将浓缩后的菌体液与干燥载体进行混合，烘干，PVA袋进行分装保存。

具体为：

A、将30ml星箭头菌SCSIO 43504菌体液与25g麦麸、25g滑石粉混合均匀后，再在38℃烘箱中干燥12h，得到星箭头菌SCSIO 43504菌剂，取样计算活菌数和杂菌率，其余用PVA袋进行分装保存，每小袋10g，在常温或4℃下保存。

B、将30ml星箭头菌SCSIO 43504菌体液与50g麦麸混合均匀后，再在38℃烘箱中干燥12h，取样计算活菌数和杂菌率，其余用PVA袋进行分装保存，每小袋10g，在常温或4℃下保存。

C、将30ml星箭头菌SCSIO 43504菌体液与50g滑石粉混合均匀后，再在38℃烘箱中干燥12h，取样计算活菌数和杂菌率，其余用PVA袋进行分装保存，每小袋10g，在常温或4℃下保存。

D、将30ml星箭头菌SCSIO 43504菌体液与50g草炭混合均匀后，再在38℃烘箱中干燥12h，取样计算活菌数和杂菌率，其余用PVA袋进行分装保存，每小袋10g，在常温或4℃下保存。

E、将30ml星箭头菌SCSIO 43504菌体液与25g滑石粉、25g草炭混合均匀后，再在38℃烘箱中干燥12h，取样计算活菌数和杂菌率，其余用PVA袋进行分装保存，每小袋10g，在常温或4℃下保存。

F、将30ml芽孢杆菌SCSIO 43505菌体液与25g滑石粉、25g草炭混合均匀后，再在38℃烘箱中干燥12h，得到芽孢杆菌SCSIO 43505菌剂，取样计算活菌数和杂菌率，其余用PVA袋进行分装保存，每小袋10g，在常温或4℃下保存。

具体结果如表3所示：

表3：不同载体对固体菌剂的影响

4、星箭头菌SCSIO 43504菌剂和芽孢杆菌SCSIO 43505菌剂混合后的菌剂特征如表4所示

表4混合菌剂的主要特征

实施例3：固体菌剂对泰来藻生长的生态效应

1、实验材料和方法

1.1、泰来藻的培养：每盆中培养在原位海水中适应5d的20株泰来草(根长10cm，叶嫩绿，长度随机)，进行编号固定。在饱和光照强度((250μmol photons m^-2s^-1)，室温(30℃)下培养。处理组3个缸(长宽高为65cm*45cm*35cm)加入混合菌剂[1g星箭头菌SCSIO 43504菌剂(实施例2中步骤3中的A组，未用PVA袋包装)+1g芽孢杆菌SCSIO 43505菌剂(实施例2中步骤3中的F组，未用PVA袋包装)]，混合菌剂沉淀在泰来藻根部周围；对照组3个缸不做处理，隔7d换水，并重新加入混合菌剂，持续培养7周。

2、植株测量指标

2.1、叶片的生长速率：培养适应的第20d时，随机选取6株泰来藻，用铜线圈距离海草根部1cm处固定，测量植株的长度。1周后，测量植株增长的的长度，及叶片枯萎和新增的数量。

新增叶片的长度：GL＝(Gnm+Gm)/t；Gnm为标记增长的长度；Gm为新增叶片和小叶片的长度。

2.2、新叶数和枯叶数：标记一周后，记录标记植株叶片的生长情况。

2.3、叶绿素含量和光合作用强度：对随机标记的植株叶片测量最大荧光产量。光合作用强度由最大光量子产率，Fv/Fm＝(Fm－F0)/Fm，Fm为在暗适应下打开饱和脉冲时得到的最大荧光产量。

2.4、根的生长状况：在培养42d后，记录新根的条数并且测量根的长度。

2.5、叶绿素测量：培养42d后，选取标记的植株测量叶绿素含量，重复三次。

3、实验结果

混合菌剂对泰来藻的根、叶的影响如表5所示，加入混合菌剂的处理组的每盆的新根数量较对照组(不加混合菌剂)增加了27.63％，且新根的平均长度增加了31.57％。叶的生长速率增长的不明显，但是新叶的数量比对照组增加了12.36％，且对照组的枯死数量是处理组的2.84倍。这些结果表明了混合菌剂对泰来藻具有较好的促生作用，有潜力运用于保护和恢复海草生态***。

表5不同处理组的泰来藻根、叶的情况

叶绿素的含量和光合作用速率的结果如表6所示，处理组的叶绿素a和叶绿素b浓度比对照组高，且总叶绿素浓度比对照组高24.64％。对最大光量子产率进行非参数检验(2个相关样本检测)得到秩均值，T 2.00>CK 1.28，两者之间P＝0.000<0.05，存在显著性差异。结果表明，混合菌剂能提高泰来藻的光合作用，提高海草的生产力。

表6不同处理组的泰来藻叶绿素浓度、光合作用情况

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种海洋微生物菌剂及其制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1352

<212> DNA

<213> 星箭头菌(Sagittula stellata SCSIO 43504)

<400> 1

ggccgtgcgg cagctaccat gcaagtcgtg cgcgccttcg ggtgagcggc ggacgggtga 60

gtaacacgtg ggaatgtgcc cttctgttga ggatagcccc gggaaactgg gagtaatact 120

cgatacgccc ttagggggaa ggaaggatca gcccgcgtct gattaggtag ttggtggggt 180

aatggcctac caagcctacg atcagtagct ggttttagag gatgatcagc cacactggga 240

ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtgag gaatcttaga caatgggcgc 300

aagcctgatc tagccatgcc gcgtgagtga tgaaggcctt agggtcgtaa agctctttcg 360

ccagggatga taatgacagt acctggtaaa gaaaccccgg ctaactccgt gccagcagcc 420

gcggtaatac ggagggggtt agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc gcgcgtaggc 480

ggactggaaa gttgggggtg aaatcccagg gctcaaccct ggaactgcct ccaaaactat 540

cagtctagag ttcgagagag gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata 600

ttcggaggaa caccagtggc gaaggcggct cactggctcg atactgacgc tgaggtgcga 660

aagtgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acaccgtaaa cgatgaatgc 720

cagtcgtcgg gttgcatgca attcggtgac acacctaacg gattaagcat tccgcctggg 780

gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 840

catgtggttt aattcgaagc aacgcgcaga accttaccaa cccttgacat cctgtgctaa 900

cccgagagat cgggctttcc cttcggggac gcagtgacag gtgctgcatg gctgtcgtca 960

gctcgtgtcg tgagatgttc ggttaagtcc ggcaacgagc gcaacccaca tccttagttg 1020

ccagcagttc ggctgggcac tctagggaaa ctgcccgtga taagcgggag gaaggtgtgg 1080

atgacgtcaa gtcctcatgg cccttacggg ttgggctaca cacgtgctac aatggcagtg 1140

acaatgggtt aatccccaaa aactgtctca gttcggattg gggtctgcaa ctcgacccca 1200

tgaagtcgga atcgctagta atcgcgtaac agcatgacgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1260

ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag ttggttctac ctgacggccg tgcgctaacc 1320

ttcgggaggc agcgaccacg gagataaatg gg 1352

<210> 2

<211> 1411

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌(Bacillus sp.SCSIO 43505)

<400> 2

gctagctcct tacggttact ccaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg 60

gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc 120

gattccagct tcatgtaggc gagttgcagc ctacaatccg aactgagaat ggttttatgg 180

gattggcttg acctcgcggt cttgcagccc tttgtaccat ccattgtagc acgtgtgtag 240

cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc 300

ggcagtcacc ttagagtgcc caactaaatg ctggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt 360

tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca 420

ctctgtcccc cgaaggggaa cgctctatct ctagagttgt cagaggatgt caagacctgg 480

taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540

tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt 600

agctgcagca ctaaagggcg gaaaccctct aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg 660

actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcgcctcagc gtcagttaca 720

gaccaaaaag ccgccttcgc cactggtgtt cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac 780

acgtggaatt ccgcttttct cttctgcact caagttcccc agtttccaat gaccctccac 840

ggttgagccg tgggctttca catcagactt aagaaaccgc ctgcgcgcgc tttacgccca 900

ataattccgg ataacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 960

gtggctttct ggttaggtac cgtcaaggta cgagcagtta ctctcgtact tgttcttccc 1020

taacaacaga gttttacgac ccgaaagcct tcatcactca cgcggcgttg ctccgtcaga 1080

ctttcgtcca ttgcggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct 1140

cagtcccagt gtggccgatc accctctcag gtcggctatg catcgttgcc ttggtgagcc 1200

gttacctcac caactagcta atgcaccgcg ggcccatctg taagtgatag ccgaaaccat 1260

ctttcaatca tctcccatga aggagaagat cctatccggt attagcttcg gtttcccgaa 1320

gttatcccag tcttacaggc aggttgccca cgtgttactc acccgtccgc cgctaacgtc 1380

atagaagcaa gcttctaatc agttcgctcg a 1411

Claims

1.一种海洋微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：所述的海洋微生物菌剂包括星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43504菌剂和芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO 43505菌剂；

所述的星箭头菌SCSIO 43504菌剂是通过以下方法制备的：将星箭头菌SCSIO 43504的菌液浓缩后，将浓缩后的菌体液与麦麸、滑石粉混合均匀后，干燥后获得星箭头菌SCSIO43504菌剂；

所述的芽孢杆菌SCSIO 43505菌剂是通过以下方法制备的：将芽孢杆菌SCSIO 43505菌液浓缩后，将浓缩后的菌体液与草炭、滑石粉混合均匀后，干燥后获得芽孢杆菌SCSIO43505菌剂；

所述的星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43504，其保藏号为：CCTCC NO：M2016691；

所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO 43505，其保藏号为：CCTCC NO：M 2016692。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的星箭头菌SCSIO 43504菌剂用PVA水溶袋包装密封，所述的芽孢杆菌SCSIO 43505菌剂用PVA水溶袋包装密封。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的星箭头菌SCSIO 43504的菌液是通过以下方法制备的：将星箭头菌SCSIO 43504的活化菌液以体积分数5％的接种量接种到发酵培养基中，温度33℃、无菌风量60m³/h、发酵时间60h，由此获得星箭头菌SCSIO43504的菌液，所述的发酵培养基每升含有：玉米粉10g，黄豆粉5g，NaCl 25g，其余为水，pH7.5。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的芽孢杆菌SCSIO 43505菌液是通过以下方法制备的：将芽孢杆菌SCSIO 43505的活化菌液以体积分数5％的接种量接种到发酵培养基中，温度28℃、无菌风量60m³/h、发酵时间48h，由此获得芽孢杆菌SCSIO 43505的菌液，所述的发酵培养基每升含有：玉米粉10g，黄豆粉5g，NaCl 25g，CaCO₃ 2g，其余为水，pH6.7。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的星箭头菌SCSIO 43504菌剂是通过以下方法制备的：将星箭头菌SCSIO 43504的菌液浓缩后，将每30ml浓缩后的菌体液与25g麦麸、25g滑石粉混合均匀后，干燥后获得星箭头菌SCSIO 43504菌剂。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的芽孢杆菌SCSIO 43505菌剂是通过以下方法制备的：将芽孢杆菌SCSIO 43505菌液浓缩后，将每30ml浓缩后的菌体液与25g草炭、25g滑石粉混合后，干燥后获得芽孢杆菌SCSIO 43505菌剂。

7.一种按照权利要求1所述的制备方法制备得到的海洋微生物菌剂。