CN110241236B - 用于鉴定荚膜红细菌的特异性pcr引物、试剂盒和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于鉴定荚膜红细菌的特异性PCR引物、试剂盒和用途，包括如下引物对：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对；及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对。本发明提供的特异性PCR引物对荚膜红细菌特异性强，解决了传统方法中对荚膜特异性差的问题。在利用该引物建立了鉴定荚膜红细菌的方法，该方法具有特异性好、稳定性强和灵敏度高的优点，在检测过程中可以很好地控制假阳性的出现，同时提高了荚膜红细菌的检测精确度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种用于鉴定荚膜红细菌的特异性PCR引物、包含该引物的试剂盒和用途。
背景技术
自然环境的污染以及动物养殖过程中的抗生素耐药问题日益严重，如何采用新的技术和方法促进健康和保障安全生产成为人类可持续发展与否的关键，同时也成为国内外研究热点，实际上这也是生物产业进一步发展的瓶颈问题。在这一背景下，荚膜红细菌的生理、生化特性在人类的生活和生产中起着重要的作用，在水质净化、水产养殖、农作物以及园艺等方面均有广泛的研究和应用。中国专利申请号为201610367225.X的一种含有荚膜红细菌菌株的对虾饲料及其应用中报道了将一株荚膜红细菌作为饲料添加剂应用于对虾养殖，大大提高了对虾的生长速度，增强了对虾的免疫力。中国专利申请号为2012100922031.5的一株荚膜红细菌及其应用中报道了一株荚膜红细菌能产生一些有机小分子，进而刺激植物生长，提高植物的抗病免疫力。中国专利申请号为2013105011364.3的一种荚膜红细菌及其应用中报道了一株荚膜红细菌在池塘中能分泌生物酶类，使大型藻类逐渐分解，从而控制藻类的泛滥生长，从而改善海参的养殖环境，达到提高水生生物池塘养殖产量的目的。
鉴于荚膜红细菌的多功能性，荚膜红细菌将会被广泛应用于微生物肥料及饲料添加剂。为确保含荚膜红细菌产品的使用效果，需要对这些产品中的荚膜红细菌进行鉴定和计数。由于含有光合细菌的产品，尤其是液态产品，其颜色大多为棕红色，很难从产品的颜色和标签来对荚膜红细菌进行判断。传统的光合细菌鉴定需要进行形态特征和生理生化试验，操作步骤繁琐，检测时间较长。传统的16S rDNA检测有时不能将进化关系较近的物种进行有效区分，尤其在光合细菌中红细菌属中，传统的16S rDNA鉴定在进行荚膜红细菌、球形红细菌鉴定时准确性低。因此，急需一种特异性更强的PCR方法来对荚膜红细菌进行鉴定。截至目前，还没有出现关于特异性PCR检测荚膜红细菌的报道。
发明内容
基于此，针对上述现有技术中鉴定荚膜红细菌的方法操作步骤繁检测时间长且特异性差的技术问题，本发明提供了一种引物，该引物对于荚膜红细菌的特异性强，在鉴定过程中，操作简单，检测时间短且灵敏度高、稳定性强。
一种用于鉴定荚膜红细菌的特异性PCR引物，包括如下引物对：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对；
及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对。
本发明还提供了一种试剂盒，包括上述的特异性PCR引物、Taq DNA聚合酶、dNTP和DNA模板
本发明还提供了上述的特异性PCR引物或上述的试剂盒在鉴定荚膜红细菌中的应用。
在一些实施方式中，所述应用的方法包括如下步骤：
S1、提取待测样品的总DNA；
S2、采用权利要求1所述的特异性PCR引物对所述总DNA进行PCR扩增；
S3、对S2扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
在一些实施方式中，所述待测样品选自光合细菌单菌落或光合细菌菌剂产品。
在一些实施方式中，所述PCR的扩增体系中包括：Taq DNA聚合酶0.5μl，dNTP 0.5μl，上、下游引物各0.5μl，DNA模板100ng。
在一些实施方式中，所述PCR的扩增过程中包含退火过程，所述退火过程的条件为：52～56℃下退火1min。
在一些实施方式中，在步骤S3所得到的琼脂糖凝胶电泳图中，若泳道上出现1条条带，则判断所述待测样品来自荚膜红细菌；若泳道上未出现条带，则判断所述待测样品不是来自荚膜红细菌。
在一些实施方式中，若泳道上出现1条条带，PCR扩增的DNA片段的长度为300bp。
本发明提供的特异性PCR引物对荚膜红细菌特异性强，解决了传统方法中对荚膜特异性差的问题。在利用该引物建立了鉴定荚膜红细菌的方法，该方法具有特异性好、稳定性强和灵敏度高的优点，在检测过程中可以很好地控制假阳性的出现，同时提高了荚膜红细菌的检测精确度；此外，该方法除了检测单菌落以外，还可以检测微生物菌剂等生物样品中荚膜红细菌的存在情况，只需要获得样品中的基因组DNA，就能通过特异性PCR扩增，了解样品中是否存在荚膜红细菌，有效地解决了检测靶标单一、检测引物特异性不强的问题。
附图说明
图1为本发明公开的一些实施例的流程示意图；
图2为实施例1的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
参见图1，鉴定荚膜红细菌的方法，包括如下步骤：
1、待测菌落DNA的提取
称取1.0g样品洗涤处理，然后将菌体置于1.5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后置于65℃水浴中慢慢融化，以此反复冻融3次，再加入0.1mL 10％SDS和10.0μl10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下10000g离心10min，收集上清液并转移至另一离心管中。加入与上清液等体积的氯仿，10000g离心10min，吸取上层上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，最后将上清转移至另一离心管中，加入2倍上清体积的异丙醇沉淀DNA，离心去上清，DNA沉淀用70％乙醇洗涤2次，再加入双蒸水溶解DNA，-20℃储存。
2、荚膜红细菌的特异性引物扩增
反应体系10μl，上下游引物各0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，dNTP 0.5μl，DNA模板100ng，双蒸水补至10μl。PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min，PCR结束后的产物置于4℃保存。
引物序列：
Seq1:正向引物：5’-GGGAAATTGGAATGGGCGAAGAT-3’
Seq1:反向引物：5’-GGTCGATCAGCGTGCTGAA-3’
Seq2:正向引物：5’-GGAAGCGCGTCTGTTCAAATAC-3’
Seq2:反向引物：5’-TCGATGACCTTCCAGTTGATGAATTC-3’
Seq3:正向引物：5’-ATGCGGGAACGCGCAGATA-3’
Seq3:反向引物：5’-ATGGTCGGAGCGAGAGGAT-3’
3、PCR产物的检测
反应结束后取5μl PCR产物，加入1μl 6×溴酚蓝上样缓冲液，在2％琼脂糖凝胶上110V电泳35min。紫外拍照，以含有目的扩增片段的荚膜红细菌CGMCC1.3366的DNA作为阳性对照，以无菌水作为阴性对照，根据是否在300bp处出现预期特征条带，确定样品中是否含有荚膜红细菌。
扩增效果见2，泳道1～3为无菌水阴性对照，泳道4～6为含有目的扩增片段的荚膜红细菌CGMCC1.3366阳性对照，泳道7～9为未知样品1，泳道10～12为球形红细菌CGMCC1.3368，泳道13～15为沼泽红假单胞菌CGMCC 1.2180。
以上实施例可以得出，采用本发明提供的引物对荚膜红细菌具有特异性。
实施例2
鉴定荚膜红细菌的方法，包括如下步骤：
1、光合细菌产品中的DNA提取
称取1.0g光合细菌固态样品(如是液态样品，则先将菌液进行离心，取1.0g沉淀)，然后将菌体置于1.5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后置于65℃水浴中慢慢融化，以此反复冻融3次，再加入0.1mL 10％SDS和10.0μl 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下10000g离心10min，收集上清液并转移至另一离心管中。加入与上清液等体积的氯仿，充分混合，10000g离心10min，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，最后将上清转移至另一离心管中，加入2倍上清体积的异丙醇沉淀DNA，离心去上清，DNA沉淀用70％乙醇洗涤2次，再加入双蒸水溶解DNA，-20℃储存。
2、荚膜红细菌的特异性引物扩增
反应体系10μl，上下游引物各0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，dNTP 0.5μl，DNA模板100ng，双蒸水补至10μl。PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min，PCR结束后的产物置于4℃保存。
引物序列：
Seq1:正向引物：5’-GGGAAATTGGAATGGGCGAAGAT-3’
Seq1:反向引物：5’-GGTCGATCAGCGTGCTGAA-3’
Seq2:正向引物：5’-GGAAGCGCGTCTGTTCAAATAC-3’
Seq2:反向引物：5’-TCGATGACCTTCCAGTTGATGAATTC-3’
Seq3:正向引物：5’-ATGCGGGAACGCGCAGATA-3’
Seq3:反向引物：5’-ATGGTCGGAGCGAGAGGAT-3’
3、PCR产物的检测
反应结束后取5μl PCR产物，加入1μl 6×溴酚蓝上样缓冲液，在2％琼脂糖凝胶上110V电泳35min。紫外拍照，以含有目的扩增片段的荚膜红细菌CGMCC1.3366的DNA作为阳性对照，以无菌水作为阴性对照，根据是否在300bp处出现预期特征条带，确定样品中是否含有荚膜红细菌。若在300bp处出现特征条带，则样品中含有荚膜红细菌；若300bp处未出现特征条带，则样品中不含有荚膜红细菌。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 用于鉴定荚膜红细菌的特异性 PCR 引物、试剂盒和用途
<141> 2019-06-12
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gggaaattggaatgggcgaagat 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggtcgatcagcgtgctgaa 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggaagcgcgtctgttcaaatac 22
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tcgatgaccttccagttgatgaattc 26
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atgcgggaacgcgcagata 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atggtcggagcgagaggat 19
Claims (9)
1.一种用于鉴定荚膜红细菌的特异性PCR引物，其特征在于，包括如下引物对：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对；
及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对；
所述特异性PCR引物对荚膜红细菌特异性强。
2.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的特异性PCR引物、Taq DNA聚合酶、dNTP和DNA模板。
3.如权利要求1所述的特异性PCR引物或权利要求2所述的试剂盒在鉴定荚膜红细菌中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括如下步骤：
S1、提取待测样品的总DNA；
S2、采用权利要求1所述的三对特异性PCR引物分别对所述总DNA进行PCR扩增；
S3、对步骤S2扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述待测样品选自光合细菌单菌落或光合细菌菌剂产品。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR的扩增体系中包括：Taq DNA聚合酶0.5μL，dNTP 0.5μL，上、下游引物各0.5μL，DNA模板100ng。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR的扩增过程中包含退火过程，所述退火过程的条件为：52～56℃下退火1min。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在步骤S3所得到的琼脂糖凝胶电泳图中，若泳道上出现1条条带，则判断所述待测样品来自荚膜红细菌；若泳道上未出现条带，则判断所述待测样品不是来自荚膜红细菌。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，若泳道上出现1条条带，PCR扩增的DNA片段的长度为300bp。
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