CN102613384A

CN102613384A - 一种用活体螺旋藻制备螺旋藻多肽粉的方法

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Publication number: CN102613384A
Application number: CN2012101139667A
Authority: CN
Inventors: 刘锦胜
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Current assignee: Individual
Priority date: 2012-04-18
Filing date: 2012-04-18
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2032-04-18
Also published as: CN102613384B

Abstract

一种用活体螺旋藻制备螺旋藻多肽粉的方法。现有制备螺旋藻多肽通常是使用螺旋藻干粉加水配制成悬浊液，再用生物酶工程技术水解螺旋藻蛋白制备螺旋藻多肽，但螺旋藻干粉活性成份已大量损失，使最终产品活性不足，提取率低，不能消除螺旋藻的腥味。本发明采用活体螺旋藻为原料，通过碱性蛋白酶、风味蛋白酶、红曲霉三步酶解法制备螺旋藻多肽粉，本发明具有提取率高，能有效的保持螺旋藻多肽产品的活性成分，制备的螺旋藻多肽无腥味，口味较好的优点。

Description

一种用活体螺旋藻制备螺旋藻多肽粉的方法

技术领域

本发明涉及一种用活体螺旋藻制备螺旋藻多肽粉的方法。

背景技术

螺旋藻体内优质高蛋白含量高达60～70％，是鱼类的3倍，是肉类的4倍，是鸡蛋的5倍多，而叶绿素含量是蔬菜的10倍多。此外，维生素B3的含量大约是大豆的6.4倍；β-胡萝卜素大约是普通胡萝卜中含量的4倍；螺旋藻中大约含有11种脂肪酸，其中的亚油酸和亚麻酸都是人体必需脂肪酸；螺旋藻含有人和动物必需的常量和微量元素，不但含有大量的铁，而且可以与蛋白质和藻蓝素螯合形成有机铁，因而有利于被吸收利用；同时螺旋藻具有富集硒、锌、碘的能力。螺旋藻是一种理想的营养保健品，市场前景美好。

目前螺旋藻的应用存在如下问题：其一，螺旋藻有较浓的腥味，口味较差。其二，为增强吸收，螺旋藻通常要制备成螺旋藻多肽，目前制备螺旋藻多肽通常是使用螺旋藻干粉加水配制成悬浊液，再用生物酶工程技术水解螺旋藻蛋白制备螺旋藻多肽，但螺旋藻干粉活性成份已大量损失，使最终产品活性不足。其三，现有的一般生物酶工程技术水解螺旋藻蛋白制备螺旋藻多肽的方法酶解程度较低，有效酶解时间较短，提取率较低，原料浪费严重。

现有技术中，CN101095458A所公开的螺旋藻多肽的制备方法，其包括了干粉配制溶液、中性蛋白酶脱腥、细胞破壁、酶法水解(纤维素酶和果胶酶、木瓜蛋白酶)、离心过滤、浓缩干燥等步骤，采用酶解(中性蛋白酶)和物理处理(β-环糊精包裹)相结合的办法进行脱腥。另外，CN1204651A公开了螺旋藻多肽的制备方法及含有这些多肽的药剂和应用，所述方法使用螺旋藻干粉，在酸性、碱性或中性环镜中借助镁、钙、磷、硒等离子水解催化，并结合多种水解蛋白酶以得到螺旋藻多肽。上述方法中均采用螺旋藻干粉为原料，选择细胞破碎提取蛋白质。

发明内容

本发明的目的是提供一种用活体螺旋藻制备螺旋藻多肽粉的方法，已解决现有的螺旋藻干粉提取螺旋藻多肽方法提取率低，成品多肽含量少，口味差的缺点。此方法提取率高，能有效的保持螺旋藻多肽产品的活性成分，同时此方法制备的螺旋藻多肽无腥味，口味较好。

本方法相对于现有技术中螺旋藻多肽的制备方法的优点在于：(1)采用活体螺旋藻为原料制备螺旋藻多肽，比起现有技术采用螺旋藻干粉为原料，能增加最终产品的活性，并且在制备工艺上能减少前处理的步骤，提高生产效率；(2)在脱腥处理上，出乎意料的发现，采用风味蛋白酶能很好的解决螺旋藻多肽腥味大及口味差的问题，比现有技术中采用酶解后再用β-环糊精包裹的技术更为简便，更利于生产扩大化；(3)选择红曲霉用于酶解螺旋藻，显著延长酶解时间，使藻泥酶解充分，提高提取率。(4)选择最优的酶解方案，即通过碱性蛋白酶、风味蛋白酶、红曲霉组合以提高螺旋藻多肽的水解度，并且通过试验确定了最优的酶解试验的参数。

本发明的技术方案如下：

(1)活体螺旋藻过滤清洗、沥水处理；

将活体螺旋藻过滤清洗，调节pH后将藻泥进行沥水处理，使藻泥的含水量达到小于90％。

(2)第一步酶解：碱性蛋白酶；

将处理好的藻泥装入反应罐内，加入碱性蛋白酶，完成第一步酶解反应。

(3)第二步酶解：风味蛋白酶；

在第一步酶解完成后加入风味蛋白酶，完成第二步酶解反应。

(4)第三步酶解：红曲霉；

在第二步酶解完成后加入红曲霉，完成第三步酶解反应。

(5)喷雾干燥。

使用喷雾干燥塔喷雾干燥，所得即为活体螺旋藻多肽粉。

现有技术中评价螺旋藻多肽制备方法常采用的指标是螺旋藻蛋白的水解度，本发明相对于现有技术中螺旋藻多肽的制备方法的优点除了提取率高，水解度高之外，由于采用活体螺旋藻为原料制备螺旋藻多肽，比起现有技术采用螺旋藻干粉为原料，能增加最终产品的活性。因此，本发明还引入螺旋藻多肽的活性的测定。

(一)实验方法

1、螺旋藻蛋白水解度的测定：

蛋白质水解度的测定采用pH-stat法(Adler-Nissen，1986)，

螺旋藻蛋白水解度(DH)以水解断裂的肽键数目(h)占总键数目(h_tot)的百分数来确定，即：

DH＝h/h_tot×100％

2、螺旋藻多肽的活性的测定

螺旋藻中藻蓝蛋白是一种具有生物活性功能的天然藻蓝素蛋白，是螺旋藻中重要的活性物质。因此，测定螺旋藻多肽中藻蓝蛋白的含量能较好的反映螺旋藻多肽的活性。

藻蓝蛋白浓度的测定，参考[曲文娟等，钝顶螺旋藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138]中的方法，藻蓝蛋白的特征吸收在620nm，异藻蓝蛋白的特征吸收在650nm。提取液中藻蓝蛋白浓度(C)按公式(I)计算：

C＝(A_620nm-0.474A_650nm)/5.34，(mg/ml)

3、不同酶解配方对螺旋藻蛋白水解度的影响

酶法水解蛋白质是目前获得多肽的主要途径，该方法优点是节约成本、产品安全性高、无副作用。水解用酶的选择是生产螺旋藻多肽的关键。

本实验选用了常见的商业化的蛋白酶及红曲霉处理螺旋藻，均采用在35℃，水解60、90、120、180分钟。本发明所用蛋白酶及红曲霉均由市面上购得，蛋白酶包括碱性蛋白酶(酶活力为40万U/g)、风味蛋白酶(酶活力为1.5万U/g)、木瓜蛋白酶。结果见表1。

表1不同酶解配方对螺旋藻蛋白水解度(DH(％))的影响

由表1可见，其中以碱性蛋白酶对螺旋藻蛋白的水解效果最好。因此，本发明首先选用碱性蛋白酶水解螺旋藻；并进一步选择风味蛋白酶除去螺旋藻的特有腥味，显著改善螺旋藻多肽的口味；此外，考虑红曲霉能显著延长酶解时间，使藻泥酶解充分，提高提取率。基于以上考虑，本发明最终确定以碱性蛋白酶、风味蛋白酶、红曲霉组合的三步酶解法来酶解活体螺旋藻。

4、三步酶解法工艺参数优化

(1)单因素试验对水解度影响

pH值是酶促反应的主要条件之一，适宜的pH值是酶促反应的重要参数。实验设在pH值为6、6.5、7、7.5、8、8.5的条件下进行水解，水解时间为3小时。结果见表2：

表2不同pH值对螺旋藻蛋白水解度(DH(％))的影响

由表2可见，基本上水解度随着pH值增加而升高。综合考虑后，确定选择pH值为8.5作为酶解反应的pH值。

在酶最适温度范围内，选取酶解温度35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃等6个水平，考察酶解反应之后蛋白质水解度。结果见表3：

表3不同温度对螺旋藻蛋白水解度(DH(％))的影响

由表3可见，基本上酶与大多数化学反应有相同之处，在较低温下，温度升高时水解度不断上升，但当温度继续升高，酶蛋白分变性而失活，引起酶反应速率下降。因此，最终确定酶反应的温度为45-50℃。

(2)多因素试验对水解度影响

通过上述实验确定了，三步酶解法中对应的碱性蛋白酶、风味蛋白酶和红曲霉的最佳酶解反应的pH值为8.5，温度为45-50℃。

接下来，在限定pH值和温度的条件下，确定加酶量及酶解反应时间。

分别以J、F、D指代碱性蛋白酶、风味蛋白酶和红曲霉。结果见表4

表4多因素试验对水解度影响

由表4可见，三步酶解法中最佳的加酶量及酶解时间分别为：以藻泥的重量计，碱性蛋白酶(0.05％)、风味蛋白酶(0.03％)和红曲霉(0.15％)；碱性蛋白酶(70min)、风味蛋白酶(60min)和红曲霉(180min)。

通过以上试验，最终确定本发明的最佳的三步酶解法的实验方法，即为本发明最优选的技术方案为：

(1)将活体螺旋藻过滤清洗，pH达到8.5时将藻泥进行沥水处理，使藻泥的含水量达到小于90％。处理后得到藻泥。

(2)第一步酶解：

将处理好的藻泥装入反应罐内，加入碱性蛋白酶，酶活力为40万U/g，按照质量百分百计算，碱性蛋白酶为藻泥的0.05％，酶解温度为45-50℃，作用时间为70分钟，第一步酶解完成。

(3)第二步酶解：

在第一步酶解完成后加入风味蛋白酶，酶活力为1.5万U/g，按照质量百分百计算，风味蛋白酶为藻泥的0.03％，酶解温度为45-50℃，作用时间为60分钟，第二步酶解完成。

(4)第三步酶解：

在第二步酶解完成后加入红曲霉，按照质量百分百计算，红曲霉为藻泥的0.15％，作用温度为45-50℃，作用时间为180分钟。

(5)喷雾干燥：使用喷雾干燥塔喷雾干燥，所得即为活体螺旋藻多肽粉。

(二)具体实施例

将活体螺旋藻过滤清洗，pH达到8.5时将藻泥进行沥水处理，使藻泥的含水量小于90％。将处理好的藻泥装入反应罐内，每罐1000千克，加入酶活力为40万U/g碱性蛋白酶0.5千克，进行加温、搅拌，酶解温度为45℃，作用时间为70分钟。加入酶活力为1.5万U/g的风味蛋白酶0.3千克，进行加温、搅拌，酶解温度为45℃，作用时间为60分钟。添加1.5千克红曲霉，进行加温、搅拌，在45℃条件下反应180分钟使用喷雾干燥塔喷雾干燥，所得即为活体螺旋藻多肽粉。

螺旋藻多肽的活性及蛋白质水解度的测定。

参照“(一)实验方法中”，螺旋藻多肽的活性的测定方法，测定实施例中所制得的螺旋藻多肽粉的螺旋藻多肽的活性。

结果，藻蓝蛋白含量为16％，可见本发明制得的螺旋藻多肽的活性显著高于常规方法制得的螺旋藻多肽的活性(约5-9％)。

依照上述的蛋白质水解度测定方法，测得本发明的螺旋藻多肽的蛋白质水解度38(％)，可见本发明制得的螺旋藻多肽的水解度显著高于常规方法获得的蛋白质水解度(约10-20％)。

Claims

1.一种用活体螺旋藻制备螺旋藻活性多肽粉的方法，其特征在于选取活体螺旋藻，进行以下各项操作步骤：

(1)活体螺旋藻过滤清洗、沥水处理：

将活体螺旋藻过滤清洗，调节pH后将藻泥进行沥水处理，使藻泥的含水量达到小于90％，

(2)第一步酶解：

将处理好的藻泥装入反应罐内，加入碱性蛋白酶，完成第一步酶解反应，

(3)第二步酶解：

在第一步酶解完成后加入风味蛋白酶，完成第二步酶解反应，

(4)第三步酶解：

在第二步酶解完成后加入红曲霉，完成第三步酶解反应，

(5)喷雾干燥：

使用喷雾干燥塔喷雾干燥。

2.权利要求1所述的螺旋藻活性多肽粉的制备方法，其特征在于所述各项操作步骤为：

(1)将活体螺旋藻过滤清洗，PH达到8.5时将藻泥进行沥水处理，使藻泥的含水量小于90％，

(2)将处理好的藻泥装入反应罐内，加入碱性蛋白酶，酶活力为40万U/g，按照质量百分百计算，碱性蛋白酶为藻泥的0.05％，进行加温、搅拌，酶解温度为45-50℃，作用时间为70分钟，

(3)加入风味蛋白酶，酶活力为1.5万U/g，按照质量百分百计算，风味蛋白酶为藻泥的0.03％，进行加温、搅拌，酶解温度为45-50℃，作用时间为60分钟，

(4)加入红曲霉，按照质量百分百计算，红曲霉为藻泥的0.15％，温度为45-50℃，作用时间为180分钟，

(5)使用喷雾干燥塔喷雾干燥。