CN102613079A - 一种马蹄种苗培植的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及作物育种技术领域，提供了一种马蹄脱毒种苗培植的方法。所述方法包括以下步骤：对优质马蹄种果进行无菌处理得到无菌培养物，并对无菌培养物进行小芽诱导；对小芽进行分化与增殖培养，得到丛生芽；对丛生芽进行生根培养，得到无菌种苗；对无菌种苗进行炼苗培育和驯化栽培，得到用于种植的脱毒种苗。利用本发明所记载的马蹄种苗培植的方法，能够对马蹄种苗复壮，用于培植能得到大果率高，产量高，且抗病能力强的脱毒种苗，同时能提高马蹄种苗的繁殖系数，减少种果的使用量，降低成本。

Description

一种马蹄种苗培植的方法

技术领域

本发明涉及作物育种技术领域，更具体地说，涉及一种马蹄种苗培植的方法。

背景技术

马蹄，学名荸荠(Eleocharis tuberos)，属单子叶莎草科，为多年生宿根性草本植物，食用部分为地下球茎，质脆甜多汁，营养丰富，可作水果也可作蔬菜。因其口感爽脆，其清热解火的功效，深受消费者的喜爱，是国内外畅销的食品，市场潜力巨大。

现有技术中，国内栽培种植马蹄种苗多采用以种果进行无性繁殖，以小果留种，育苗前不进行种果消毒，忽视了马蹄的提纯复壮，使品种退化严重，主要表现为种苗种植后大果率低、产量低、抗病能力差。

而且，在日益增加的需求量面前，传统的以种果进行无性繁殖时繁殖系数低，获得大量种苗时需要耗费大量种果进行培植，生产成本高。

因此需要一种新的马蹄种苗培植的方法，能够对马蹄种苗复壮，用于培植能得到大果率高，产量高，且抗病能力强的脱毒种苗，同时能提高繁殖系数，减少种果使用量，降低成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种马蹄种苗培植的方法，旨在解决现有技术马蹄种苗大果率低、产量低、抗病能力差，以及繁殖系数低、成本高的问题。

为了实现发明目的，一种马蹄种苗培植的方法包括以下步骤：

A.对优质马蹄种果进行无菌处理得到无菌培养物，并对无菌培养物进行小芽诱导

将优质马蹄种果以水洗净，以0.2％～0.4％的高锰酸钾溶液浸泡15min；放进恒温箱中以20℃～25℃进行培养，直到芽体尖端露白；切取马蹄芽体，剥去芽体外包叶鞘直至芽体中的节清晰可见；用洗衣粉浸泡芽体15min，以清水洗净；超净无菌条件下以75％的酒精浸泡芽体30s，然后以0.1％的氯化汞溶液(内含0.01％Tween80)浸泡10～15min，以无菌水冲洗数次，吸干芽体所含水分；横切芽体节处，取芽体的上部分接种于小芽诱导培养基上，室温无菌条件下避光培养24h，然后以1500～2000lx的光照强度每天光照10～14h，得到小芽；

B.对小芽进行分化与增殖培养，得到丛生芽

将得到的小芽接种于分化与增殖培养基中，室温无菌条件下以1500～2000lx的光照强度，每天光照10～14h培养40～60天，得到丛生芽；

C.对丛生芽进行生根培养，得到无菌种苗

将得到的丛生芽接种到生根培养基中，室温下以1500～2000lx的光照强度条件，每天光照10～14h培养7～21天，得到长出根系的无菌种苗；

D.对无菌种苗进行炼苗培育和驯化栽培，得到用于种植的脱毒种苗

选择根系发达且生长健壮的无菌种苗，保持湿润环境下进行1～3天的炼苗培养，然后转移至试验田进行驯化栽培，避光培养14～40天，得到用于种植的脱毒种苗。

其中，步骤A中所述的小芽诱导培养基成份是基础培养基中加入糖类24～32g/L，琼脂4～8g/L，并加入1～3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，所述小芽诱导培养基灭菌前的酸碱值调节为5.8～6.5。

其中，步骤B中所述的分化与增殖培养基的成份是基础培养基中加入糖类24～32g/L，琼脂4～8g/L，并加入1～3.0mg/L的6-BA及0.1mg/L的萘乙酸(NAA)或者是加入1.5～2.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA及0.05mg/L的玉米素(ZT)，所述分化与增殖培养基灭菌前的酸碱值调节为5.8～6.5。

其中，步骤C中所述的生根培养基的成份是基础培养基中加入糖类24～32g/L，琼脂4～8g/L，并加入0.1～0.3mg/L的NAA，1～2g/L的活性炭，所述生根培养基灭菌前的酸碱值调节为5.8～6.5。

进一步的，上述不同培养基中所述糖类包括蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖和白糖中的至少一种。

其中，上述不同培养基中所述基础培养基包括MS、B5培养基中的至少一种。

其中，在步骤A之前还可以包括步骤：

A0.选取优质的马蹄种果

选取果体***饱满、表面无虫眼、底部圆整、芽体挺拔的马蹄作为种果。

其中，在步骤D之后还可以包括步骤：

E.将得到的脱毒种苗移植栽种到大田，进行生长管理，采收马蹄。

由上可知，本发明通过对优质马蹄种果的芽体进行无菌处理，依次接种于优化的小芽诱导培养基、小芽分化与增殖培养基和丛生芽生根培养基中进行培养，从中选取根系发达且生长健壮的无菌种苗进行炼苗培植，从而达到了培植能得到大果率高，产量高且抗病能力强的优选马蹄脱毒种苗的目的；同时，通过对小芽的分化与增殖，提高了脱毒种苗的繁殖系数，从而可以减少种果的使用量，降低了成本。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下将结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。

本发明所记载马蹄种苗培植的方法，对优质马蹄种果的芽体进行无菌处理，用以减少芽体所带的病毒或病菌；然后再利用小芽诱导培养基对芽体进行诱导出小芽，将小芽接种于分化与增殖培养基中进行小芽的分化与增殖，得到丛生芽，用以提高其繁殖系数；对得到的丛生芽再接入到生根培养基中，进行根系催生，得到带有根系的无菌种苗；选取根系发达且生长健壮的无菌种苗进行炼苗培养以及大田驯化栽培，然后得到可以用于种植的脱毒种苗。通过上述一系列的优化培植，克服了传统方法中品种不断退化的缺陷，对马蹄种苗进行复壮，培植能得到大果率高、产量高且抗病能力强的脱毒种苗，同时通过对小芽进行分化与增殖，得到不同代数的丛生芽，从而提高了种苗的繁殖系数，可以减少种果的使用量，降低成本。

利用本发明所记载的马蹄种苗培植的方法进行马蹄良种育种，得到至少90％的脱毒种苗出苗率，移植大田的成活率可达到95％以上，大果率可达到65％以上；在使用相同种果量的前提下，产量可较传统方法培植的马蹄种苗得到的产量高24％；进行小芽分化与增殖时，繁殖系数可达25～50，得到大量的脱毒种苗。

本发明所记载了一种马蹄种苗培植的方法，所述方法包括以下具体步骤：

S1.对优质马蹄种果进行无菌处理得到无菌培养物，并对无菌培养物进行小芽诱导

将优质马蹄种果以水洗净，以0.2％～0.4％的高锰酸钾溶液浸泡15min；放进恒温箱中以20℃～25℃进行培养，直到芽体尖端露白；切取马蹄芽体，剥去芽体外包叶鞘直至芽体中的节清晰可见；用洗衣粉浸泡芽体15min，以清水洗净；超净无菌条件下以75％的酒精浸泡芽体30s，然后以0.1％的氯化汞溶液(内含0.01％Tween80)浸泡10～15min，以无菌水冲洗数次，吸干芽体所含水分；横切芽体节处，取芽体的上部分接种于小芽诱导培养基上，室温无菌条件下避光培养24h，然后以1500～2000lx的光照强度每天光照10～14h，得到小芽；

S2.对小芽进行分化与增殖培养，得到丛生芽

将得到的小芽接种于分化与增殖培养基中，室温无菌条件下以1500～2000lx的光照强度，每天光照10～14h培养40～60天，得到丛生芽；

S3.对丛生芽进行生根培养，得到无菌种苗

将得到的丛生芽接种到生根培养基中，室温下以1500～2000lx的光照强度条件，每天光照10～14h培养7～21天，得到长出根系的无菌种苗；

S4.对无菌种苗进行炼苗培育和驯化栽培，得到用于种植的脱毒种苗

选择根系发达且生长健壮的无菌种苗，保持湿润环境下进行1～3天的炼苗培养，然后转移至试验田进行驯化栽培，避光培养14～40天，得到用于种植的脱毒种苗。

上述技术方案的优势在于，利用优质马蹄种果芽体的无菌处理，然后依次接种于小芽诱导培养基、分化与增殖培养基和生根培养基，通过一系列优化的培植进行种苗复壮，从而得到大果率高、产量高且抗病能力强的脱毒种苗；然后在分化与增殖阶段，对小芽进行不同代数的分化与增殖，得到不同代数的丛生芽，提高种苗的繁殖系数，减少种果的使用量，降低了成本。

需要说明的是：

从基因遗传育种的角度出发，为使得到的种苗更多地继承种果优良的基因，因此在步骤S1之前可以先进行步骤S1’：选取那些果体***饱满、表面光滑无虫眼、底部圆整且芽体挺拔的马蹄作为优质马蹄种果，其中所述芽体指的是马蹄果体上端能够长出新芽的尖端部分。

步骤S1中，以高锰酸钾溶液对马蹄种果进行浸泡，其中高锰酸钾溶液的浓度范围为0.2％～0.4％，优选为0.3％，在本步骤的一个具体实施方案中，取高锰酸钾溶液的浓度为0.2％；在本步骤的另一个具体实施方案中，取高锰酸钾溶液的浓度为0.4％；在本步骤的一个优选实施方案中，取高锰酸钾溶液的浓度为0.3％。

恒温箱中的培育温度控制在20℃～25℃，过低或过高都容易使芽体发芽受到抑制，降低种苗培育的速度，影响种苗培育的质量。

步骤S1中的小芽诱导培养基，是一种用于诱导马蹄种果的芽体生长发出小芽的专属营养培养基，其成份以基础培养基为主，并在其中加入营养成份而形成。其中，所述的基础培养基包括但不限于MS、B5培养基中的至少一种，本发明优选MS培养基。在本发明的一个优选实施方案中，采用MS培养基作为小芽诱导培养基的基础培养基；在本发明的一个具体实施方案中，采用B5培养基小芽诱导培养基的作为基础培养基。应当说明的是，上述具体实施方案只是本发明小芽诱导培养基中选用的基础培养基的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

小芽诱导培养基中所述营养成份包括糖类、琼脂和激素6-BA。其中，糖类包括但不限于蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖和白糖中的至少一种，本发明优选蔗糖。进一步的，加入的糖类浓度为24～35g/L，优选为28～30g/L。在本发明的一个优选实施方案中，在基础培养基中加入30g/L的蔗糖；在本发明的一个具体实施方案中，在基础培养基中加入32g/L的麦芽糖；在本发明的另一个具体实施方案中，在基础培养基中加入28g/L的葡萄糖；在本发明的另一个具体实施方案中，在基础培养基中加入混合浓度为30g/L的葡萄糖与麦芽糖。应当说明的是，上述具体实施方案只是本发明小芽诱导培养基中糖类的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

小芽诱导培养基中所含的琼脂浓度范围为4～8g/L，优选为6g/L。在本发明的一个优选实施方案中，加入基础培养基中的琼脂为6g/L；在本发明的一个具体实施方案中，加入基础培养基中的琼脂为4g/L；在本发明的另一个具体实施方案中，加入基础培养基中的琼脂为8g/L。应当说明的是，上述具体实施方案仅是本发明中加入基础培养基的琼脂的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

小芽诱导培养基中的6-BA浓度范围为1～3.0mg/L，其中优选为2.0～2.5mg/L，更优选为2.5mg/L。在本发明的一个优选实施方案中，加入基础培养基中的6-BA浓度为2.5mg/L；在本发明的一个具体实施方案中，加入基础培养基中的6-BA浓度为3.0mg/L；在本发明的另一个具体实施方案中，加入基础培养基中的6-BA浓度为1.0mg/L；在本发明的另一个具体实施方案中，加入基础培养基中的6-BA浓度为2.0mg/L。应当说明的是，上述具体实施方案只是本发明小芽诱导培养基中所含的6-BA浓度的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

在基础培养基中加入糖类、琼脂与6-BA之后搅拌混匀，调节酸碱值(pH值)的范围为5.8～6.5，优选为pH6.0，然后将调好pH值的小芽诱导培养基以0.06MPa的条件下灭菌30分钟即可得到无菌的小芽诱导培养基。

步骤S2中，丛生芽是指小芽经过分化与增殖之后得到的簇状小芽，可用于分离进行进一步的培植。而所述分化与增殖培养基是指用于对小芽进行分化与增殖作用的营养培养基。所述分化与增殖培养基，以基础培养基为主，加入糖类、琼脂，以及6-BA和NAA，或者是加入6-BA、NAA及ZT混合灭菌之后而形成。

分化与增殖培养基中的基础培养基包括但不限于MS、B5培养基中的至少一种，本发明优选MS培养基。分化与增殖培养基中加入的糖类包括但不限于蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖和白糖中的至少一种，本发明优选蔗糖。进一步的，加入的糖类浓度为24～35g/L，优选为28～30g/L。在本发明的一个优选实施方案中，在基础培养基中加入30g/L的蔗糖；在本发明的一个具体实施方案中，在基础培养基中加入32g/L的麦芽糖；在本发明的另一个具体实施方案中，在基础培养基中加入28g/L的葡萄糖；在本发明的另一个具体实施方案中，在基础培养基中加入混合浓度为30g/L的葡萄糖与麦芽糖。应当说明的是，上述具体实施方案只是本发明分化与增殖培养基中糖类的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

分化与增殖培养基中所含的琼脂浓度范围为4～8g/L，优选为6g/L。在本发明的一个优选实施方案中，加入基础培养基中的琼脂为6g/L；在本发明的一个具体实施方案中，加入基础培养基中的琼脂为4g/L；在本发明的另一个具体实施方案中，加入基础培养基中的琼脂为8g/L。应当说明的是，上述具体实施方案仅是本发明分化与增殖培养基中加入基础培养基的琼脂浓度的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

配制分化与增殖培养基时加入的激素组合为6-BA+NAA，或者是6-BA+NAA+ZT组合。在组合6-BA+NAA中，6-BA浓度范围为1～3.0mg/L，其中优选为2.0～2.5mg/L，更优选为2.5mg/L。在本发明的一个优选实施方案中，加入基础培养基中的6-BA浓度为2.5mg/L；在本发明的一个具体实施方案中，加入基础培养基中的6-BA浓度为3.0mg/L；在本发明的另一个具体实施方案中，加入基础培养基中的6-BA浓度为1.0mg/L；在本发明的另一个具体实施方案中，加入基础培养基中的6-BA浓度为2.0mg/L。而NAA的浓度为0.1mg/L。

在组合6-BA+NAA+ZT中，6-BA浓度范围为1.5～2.5mg/L，NAA的浓度为0.1mg/L，ZT浓度为0.05mg/L。

步骤S3中所述的生根培养基是一种用于培养芽体催使其长出根系的营养培养基，由基础培养基中加入糖类、琼脂、NAA及活性炭形成。其中，所述的基础培养基包括但不限于MS、B5培养基中的至少一种，本发明优选MS培养基。在本发明的一个优选实施方案中，采用MS培养基作为生根培养基的基础培养基；在本发明的一个具体实施方案中，采用B5培养基生根培养基的作为基础培养基。应当说明的是，上述具体实施方案只是本发明生根培养基中选用的基础培养基的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

生根培养基中的糖类包括但不限于蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖和白糖中的至少一种，本发明优选蔗糖。进一步的，加入的糖类浓度为24～35g/L，优选为28～30g/L。在本发明的一个优选实施方案中，在基础培养基中加入30g/L的蔗糖；在本发明的一个具体实施方案中，在基础培养基中加入32g/L的麦芽糖；在本发明的另一个具体实施方案中，在基础培养基中加入28g/L的葡萄糖；在本发明的另一个具体实施方案中，在基础培养基中加入混合浓度为30g/L的葡萄糖与麦芽糖。应当说明的是，上述具体实施方案只是本发明生根培养基中糖类的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

生根培养基中所含的琼脂浓度范围为4～8g/L，优选为6g/L。在本发明的一个优选实施方案中，加入基础培养基中的琼脂为6g/L；在本发明的一个具体实施方案中，加入基础培养基中的琼脂为4g/L；在本发明的另一个具体实施方案中，加入基础培养基中的琼脂为8g/L。应当说明的是，上述具体实施方案仅是本发明生根培养基中加入基础培养基的琼脂浓度的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

其中，生根培养基中所含的NAA浓度范围为0.1～0.3mg/L，优选为0.2mg/L；生根培养基中加入的活性炭浓度范围为1～2g/L。

为进一步观察和培植符合要求的脱毒种苗，在步骤S4之后还可以进行步骤S5：将得到的脱毒种苗移植栽种到大田，进行生长管理，采收马蹄。步骤S5中，需要对移植栽种的脱毒种苗进行抗病能力、长势、产量和大果率进行进一步的观察以及数据统计，然后根据统计的数据结果确定本发明所记载马蹄种苗培植技术的可行性及优越性。

为证明本发明所记载的马蹄种苗培植方法的优势所在，本发明提供了一个具体实施例加以比较说明。

本实施例以广西壮族自治区贺州市的优质马蹄作为种果，利用本发明所记载的马蹄种苗培植方法培植得到脱毒种苗，然后将脱毒种苗移植栽种到大田，对其生长以及产果状况进行跟踪记录，具体实施如下：

一、选取优质马蹄作为种果

选取果体***饱满、表面光滑无虫眼、底部圆整、芽体挺拔的优质马蹄作为种果。

二、对优质马蹄种果进行无菌处理得到无菌培养物，并对无菌培养物进行小芽诱导

1、无菌处理得到无菌培养物

将优质马蹄种果以水洗净，以0.3％的高锰酸钾溶液浸泡15min；放进恒温箱中以25℃进行培养，直到芽体尖端露白；切取马蹄芽体，剥去芽体外包叶鞘直至芽体中的节清晰可见；用洗衣粉浸泡芽体15min，以清水清洗5次；在超净台中以75％的酒精浸泡芽体30s，然后以0.1％的氯化汞溶液(内含0.01％Tween80)浸泡15min，以无菌水冲洗5次，吸干芽体所含水分；顺着分节处横切芽体，取芽体上部分作为无菌培养物。

2、小芽诱导

1)配制小芽诱导培养基：以MS作为基础培养基，加入蔗糖至浓度为30g/L、加入琼脂至浓度为6g/L，加入6-BA至浓度为2.5mg/L，配制小芽诱导培养基，混匀之后调节pH至6.0，以0.06MPa，30min的条件，利用高压灭菌锅对小芽诱导培养基进行灭菌。

2)小芽诱导培养：将灭菌的小芽诱导培养基分装至锥形瓶中，每瓶20mL，得到小芽诱导培养瓶；将无菌培养物接种到培养瓶中，每瓶5颗无菌培养物；接种好的培养瓶避光培养24h，然后以2000lx的光照强度，每天光照12h，控制培养温度为25℃。

经培养4天后，可见无菌培养物中小芽由白变绿；10天后小芽开始长大变长，原芽体切口处逐渐长出愈伤组织；2～3周后切口处就可看到有诱导分化的小芽，且分化的小芽芽体周围出现褐色外包表皮。

三、对小芽进行分化与增殖培养，得到丛生芽

1、配制分化与增殖培养基：MS为基础培养基，加入蔗糖至浓度为30g/L、加入琼脂至浓度为6g/L，加入6-BA至浓度为2.5mg/L，加入NAA至浓度为0.1mg/L，混匀之后调至pH6.0，然后将混合物放入高压灭菌锅中，0.06MPa，30min进行灭菌处理，灭菌结束后将分化与增殖培养基分装至锥形培养瓶中，每瓶20mL，得到无菌的分化与增殖培养瓶。

2、接种小芽，得到丛生芽：在超净台中，将诱导分化的小芽外包表皮去除，然后将分化的小芽接种至制备好的分化与增殖培养基中，25℃，1500lx光照强度下每天光照培养12h。

分化与增殖培养2周时间，明显可见小芽分化5～10颗小芽；此时可将小芽继续接种到新的分化与增殖培养瓶中，进行传代分化增殖，可连续传代4次得到共5代的丛生芽，其繁殖系数可达到25～50。丛生芽继续在分化与增殖培养基中培养50天，丛生芽可转化成丛生苗，高度在1～3cm，茎状叶直径0.5～2cm。

四、对丛生芽进行生根培养，得到无菌种苗

1、配制生根培养基：以MS作为基础培养基，加入蔗糖至浓度为32g/L、加入琼脂至浓度为6.0g/L，加入NAA至浓度为0.2mg/L，再加入活性炭至浓度为2g/L，混匀之后调节pH值为6.0，高压灭菌锅内以0.06MPa，30min进行灭菌，然后分装至锥形培养瓶中，每瓶20mL，得到生根培养瓶。

2、丛生苗生根培养：选择生长良好的丛生苗接种到生根培养瓶中进行生根培养，每瓶接种8颗；25℃，2000lx光照强度下每天光照12h培养一周，丛生苗基部长出根毛；10天后基部根毛长长至1～3cm，可作为无菌种苗；3周后无菌种苗根长为3～8cm，主根开始分化幼根与根毛，此时丛生苗长高至5cm左右。

五、对无菌种苗进行炼苗培育和驯化栽培，得到用于种植的脱毒种苗

待无菌种苗的根系基本布满培养瓶内培养基时，从培养室中选择根系发达且生长健壮的无菌种苗取出，打开培养瓶的封盖，以喷雾器保持种苗处于湿润环境下，进行3天炼苗；之后将炼苗结束的无菌种苗移植到大棚或者是有遮阴的水田进行驯化栽培，按照常规的方法进行生长管理；移植一周后种苗进入生长期，成活率达到94％；移植五周可进行进一步的苗株分化，得到更多的种苗，此时称为二段育苗；二段育苗之后再过四周得到用于种植的脱毒种

六、脱毒种苗移植栽种到大田，进行生长管理，采收马蹄

将脱毒种苗移植栽种到大田中，一周后观察移植栽种成活率达到96％；移植成活后，每两周施复合肥一次，封行前每次60斤/亩，封行后每次90斤每亩；待到马蹄结果成熟后进行采收，并统计大果率以及亩产量。

为使本发明所记载的技术方案优势更加明显，在利用本发明所记载的马蹄种苗培植方法进行种苗培植的同时，利用传统的以马蹄种果直接进行种苗培植的方法，进行相同面积的种苗种植，按照同样的生产管理，进行马蹄种植，采收果实并统计大果率和亩产量。

对两种培植方法的各项数据进行平均数据统计，包括出苗率、繁殖系数、移植成活率、亩产量和大果率。其中，以果重大于等于30g作为大果的标准进行计算。两种培植方法得到的各项统计结果如表1所示：

表1.两种培植方法各项统计结果

统计项目	平均出苗率	繁殖系数	平均移植成活率	平均亩产量(kg)	平均大果率
						本发明方法	92％	50	95％	3100	65％
传统方法	83％	10	85％	2500	50％

从上表中统计数据可以看出，利用本发明所记载的马蹄种苗培植方法得到的平均种苗出苗率要高于传统方法约9个百分点；本发明所述方法繁殖系数远高于传统培植方法；大田移植时的平均移植成活率也远高于传统方法；3100kg的平均亩产量更是高于传统培植方法的2500kg多达24％；在大果的统计中，不论是绝对数量还是所占的比值都远高于传统培植方法得到的种苗。

由此可知本发明所记载的马蹄种苗培植方法能对马蹄种苗进行复壮，培植能得到大果率高、产量高且抗病能力强的脱毒种苗，同时通过小芽的分化与增殖，大大提高了种苗的繁殖系数，减少了种果的使用量，可以降低成本。

应当说明的是，本发明典型的应用但不限于马蹄种苗的培植，在其他类似的作物育种中也可以应用本发明所阐述的方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种马蹄种苗培植的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A.对优质马蹄种果进行无菌处理得到无菌培养物，并对无菌培养物进行小芽诱导

将优质马蹄种果以水洗净，以0.2％～0.4％的高锰酸钾溶液浸泡15min；放进恒温箱中以20℃～25℃进行培养，直到芽体尖端露白；切取马蹄芽体，剥去芽体外包叶鞘直至芽体中的节清晰可见；用洗衣粉浸泡芽体15min，以清水洗净；超净无菌条件下以75％的酒精浸泡芽体30s，然后以0.1％的氯化汞溶液(内含0.01％Tween80)浸泡10～15min，以无菌水冲洗数次，吸干芽体所含水分；横切芽体节处，取芽体的上部分接种于小芽诱导培养基上，室温无菌条件下避光培养24h，然后以1500～2000lx的光照强度每天光照10～14h，得到小芽；

B.对小芽进行分化与增殖培养，得到丛生芽

将得到的小芽接种于分化与增殖培养基中，室温无菌条件下以1500～2000lx的光照强度，每天光照10～14h培养40～60天，得到丛生芽；

C.对丛生芽进行生根培养，得到无菌种苗

将得到的丛生芽接种到生根培养基中，室温下以1500～2000lx的光照强度条件，每天光照10～14h培养7～21天，得到长出根系的无菌种苗；

D.对无菌种苗进行炼苗培育和驯化栽培，得到用于种植的脱毒种苗

选择根系发达且生长健壮的无菌种苗，保持湿润环境下进行1～3天的炼苗培养，然后转移至试验田进行驯化栽培，避光培养14～40天，得到用于种植的脱毒种苗。

2.根据权利要求1所述的马蹄种苗培植的方法，其特征在于，步骤A中所述的小芽诱导培养基成份是基础培养基中加入糖类24～32g/L，琼脂4～8g/L，并加入1～3.0mg/L的6-BA，所述小芽诱导培养基灭菌前的酸碱值调节为5.8～6.5。

3.根据权利要求1所述的马蹄种苗培植的方法，其特征在于，步骤B中所述的分化与增殖培养基的成份是基础培养基中加入糖类24～32g/L，琼脂4～8g/L，并加入1～3.0mg/L的6-BA及0.1mg/L的NAA或者是加入1.5～2.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA及0.05mg/L的ZT，所述分化与增殖培养基灭菌前的酸碱值调节为5.8～6.5。

4.根据权利要求1所述的马蹄种苗培植的方法，其特征在于，步骤C中所述的生根培养基的成份是基础培养基中加入糖类24～32g/L，琼脂4～8g/L，并加入0.1～0.3mg/L的NAA，1～2g/L的活性炭，所述生根培养基灭菌前的酸碱值调节为5.8～6.5。

5.根据权利要求2至4中的任一项所述的马蹄种苗培植的方法，其特征在于，所述糖类包括蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖和白糖中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的马蹄种苗培植的方法，其特征在于，所述基础培养基包括MS、B5培养基中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的马蹄种苗培植的方法，其特征在于，在步骤A之前还包括步骤：

A0.选取优质的马蹄种果

选取果体***饱满、表面无虫眼、底部圆整、芽体挺拔的马蹄作为种果。

8.根据权利要求1所述的马蹄种苗培植的方法，其特征在于，在步骤D之后还包括步骤：

E.将得到的脱毒种苗移植栽种到大田，进行生长管理，采收马蹄。