CN102596247B - 新蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供四种命名为PRT5、PRT6、PRT7和PRT8的多肽、编码所述多肽的核酸、包含所述蛋白的组合物以及它们在治疗方法和诊断方法中的应用。本发明同样提供特异识别所述多肽的抗体以及它们的应用。每一种蛋白的表征显示，PRT5和PRT8涉及葡萄糖代谢，PRT6涉及雄激素调节，而PRT7与癌症相关。

Description

新蛋白
技术领域
本发明涉及新蛋白、编码这些蛋白的核酸以及包含它们的组合物、特异识别所述蛋白的抗体、以及它们在治疗和诊断方法中的应用。
背景技术
本部分中的讨论不限于描述为针对本发明的“现有技术”的主题。因此，在该讨论中，不允许由于具体主题的包括而包含或推断这样的现有技术情形，也不允许由于这样的包括而包含针对本发明目的的声明。
本申请中提及的所有出版物、包括它们所引用的参考文件通过引用的方式全文并入本文中。
组织特异蛋白和它们的表达水平是生物体健康状态极好的指示物以及在患病状态下用于治疗的潜在目标。
可以根据引起疾病的机制对影响人类的疾病进行分类。例如，具有免疫成分或病因的疾病包括传染病、急性和慢性炎性疾病、癌症、移植病和自体免疫性疾病。
术语炎性肠道疾病(IBD)涵盖了一组疾病，其中肠子发炎(变红并肿胀)，可能是身体抵抗其自身的肠组织的免疫反应的结果，并因此被认为是自体免疫性疾病。
炎性疾病包括：败血病、内毒素血症、胰腺炎、葡萄膜炎、肝炎、腹膜炎、角膜炎、SIRS和受伤诱导炎症。
与生育相关的疾病包括男性不育和女性不育。男性不育可以由多种问题引起。一些更通常的疾病列出如下：
-缺乏***生成：90％的男性不育是由不能产生足够的***而引起。当无***产生时发生无精症(Azzospermia)，当产生很少量的***时被诊断为***减少；
-***；
-其它疾病：包括睾丸的发育异常或损伤(由内分泌紊乱或炎症引起)、附腺疾病、性能力问题、暴露于乙烯雌酚(DES)(一种在20世纪50和60年代使用的合成***，能够引起男性生殖管囊肿)、睾丸未降和如染色体异常的罕见情况中的遗传疾病。
改善睾酮不足的起作用因素包括：
-药物治疗，特别是用于治疗萎靡不振或精神疾病的那些；
-酒精中毒；
-靶定或伤害睾丸的用于癌症的化学疗法或放射疗法；
-慢性疾病；
-脑下垂体(脑中产生从脑到睾丸的调节激素产生的物质的腺体)的功能障碍；
-血色沉着病(血中太多铁)；
-性腺机能减退(此时睾丸不能产生大量的睾酮(亦称雄激素缺乏)或***(亦称***发生))；
-炎性疾病，如肉状瘤病(一种能够引起***或感染的情况)；
-危及免疫***的疾病，如AIDS；
-使肾上腺***负重的过度压力。
女性不育同样可以由多种问题引起。一些更通常的疾病是多囊卵巢病、***、***功能障碍、子宫纤维瘤、子宫内膜异位和免疫性不育。
碳水化合物代谢紊乱以多种形式出现。最常见的紊乱是后天的。碳水化合物代谢中后天性或次生紊乱(secondary derangement)，如糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷和低血糖症均影响中枢神经***。在糖尿病中同样可以看到许多形式和变异的周围神经疾病。碳水化合物代谢的剩余疾病是罕见的代谢的先天性障碍(如，遗传缺陷)。
碳水化合物代谢的后天性紊乱在美国和全世界都是常见的。在酗酒者和采用胰岛素进行治疗的患有糖尿病的病患中，低血糖症是引起神经性疾病，特别是急性精神衰退、记忆力下降、迷失方向、意识不清和昏迷的常见原因。源自其它原因的血胰岛素过多是罕见的，但是胰腺癌可能是原因。糖尿病及其多种神经学并发症是在成年病患中治疗的最常见疾病之一。
糖尿病是最常见的内分泌疾病，它的特征是葡萄糖代谢的异常。与该疾病相关的异常葡萄糖代谢导致了高血糖症(高血糖水平)并最终引起多器官***，包括眼、肾、神经和血管的并发症。尽管最通常地，病患起初表现出过多排尿(多尿症)以及由于极度口渴而频繁喝水(烦渴)，患有持续高血糖症或具有异常葡萄糖耐受性的病患通常被诊断患有该疾病。这些典型的最初症状由高血糖症的渗透作用产生。
糖尿病的发病机理代表性地与胰腺，特别是胰腺胰岛的β细胞的功能障碍有关。该功能障碍可能导致损坏产生胰岛素的胰岛β细胞，所述胰岛素是调节葡萄糖的肽激素。糖尿病通常被分为胰岛素依赖型(或Ⅰ型)和非胰岛素依赖型(或Ⅱ型)。
主要的三种形式或糖尿病是：
-Ⅰ型：由身体不能产生胰岛素而产生。治疗通常涉及施用胰岛素。
-Ⅱ型：由身体不能适当地使用胰岛素并结合相对胰岛素缺乏的情形产生。许多预定发展成Ⅱ型糖尿病的人在糖尿病前期状态度过很多年，这种情况是因为人的血糖水平高于正常水平，但不足以诊断为Ⅱ型糖尿病。
-妊娠糖尿病：怀孕之前从来没有得过糖尿病但在怀孕期间具有高的血糖(葡萄糖)水平的孕妇被认为是患有妊娠糖尿病。妊娠糖尿病在大约4％的孕妇中发作。它可以继续发展成Ⅱ型(或罕见地发展成Ⅰ型)。
-许多其它形式的糖尿病与这些分开分类。例子包括：由于胰岛素分泌的遗传缺陷导致的先天糖尿病、囊肿性纤维化相关的糖尿病、由高剂量的糖皮质激素诱导的类固醇糖尿病和几种形式的单基因糖尿病。
但是，随着该疾病已经得到更好的理解，该术语已得到发展。例如，已经发现，在一些患有非胰岛素依赖型糖尿病的患者中，所述疾病发展成胰岛素依赖型形式，而在其它病患中，胰岛素依赖不发展。
因此，经常按照胰岛损坏的发病机理的基质对病患分类，现在名称Ⅰ型用于表示自体免疫的胰岛发病机理，即，表示由胰岛特异的自体免疫疾病发作引起的糖尿病，且在本文中也如此使用。术语胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)指已经发展至出现很多胰腺β细胞的自体免疫损坏并产生明显症状的阶段的Ⅰ型糖尿病。术语前IDDM指可以通过活组织检查或通过自体免疫反应分析而检测的自体免疫状况，其中胰腺胰岛β细胞受到特异的自体免疫侵袭，以至于一些细胞受到损坏。但是，在前IDDM中，所述损坏(如有)并没有发展到足以需要施用胰岛素的程度。既然在Ⅰ型糖尿病的早期阶段存在一个点，此时可以观察到明显的症状，但是一些胰岛功能仍然保留(被认为是“蜜月期”)，并不是所有Ⅰ型糖尿病都被分类为IDDM，且不是所有前IDDM都不表现明显症状。
与由胰岛素缺乏引起的异常代谢相关的代谢并发症能够影响多种器官***。最常见的急性代谢并发症是糖尿病酮症酸中毒，它的特征是严重的高血糖症(并导致由渗透性利尿引起的血容量减少)以及由过量的游离脂肪酸释放和酮体的产生所诱导的代谢性酸中毒。
除了酮酸中毒的急性代谢并发症外，糖尿病病患容易感染一系列的后期并发症，这些并发症引起了相当大的发病率和过早的死亡率。由于葡萄糖和脂质代谢均异常，糖尿病人比普通人更广泛和更早地发生动脉硬化。该血管病理学可以导致，尤其是冠心病、中风和伴有坏疽的周围血管病。视网膜病是糖尿病的另一个血管并发症。糖尿病视网膜病是导致失明的主要原因，它由增加的视网膜毛细血管渗透性引起，可以发展成梗塞、出血、动脉瘤形成和新血管生成，被认为是增殖性视网膜病。
如上所述，血糖的精细控制与I型糖尿病的后期并发症的改善相关，说明β细胞功能的保护和恢复可以减少或去除该疾病大多数的病理并发症。
碳水化合物代谢的遗传性疾病是罕见的。在非常少的(2-6个)病患中报导有丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物和被称为戊糖尿的良性化合物异常的严重缺陷。
低血糖症、糖尿病酮酸中毒和高渗性昏迷都是潜在致命的但潜在可治愈的情况。
本研究中，发明人发现了新的分泌蛋白，命名为PRT5、PRT6、PRT7和PRT8，它们是本发明的目的。本发明同样提供包含所述蛋白的组合物，以及它们在治疗中的应用。能够特异识别本文描述的新蛋白的抗体以及它们在诊断和治疗中的应用同样是本发明的一个目的。
这些和其它应用以及本发明的目的将随着描述的进行逐渐清晰。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种包含由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4中任意一项表示的氨基酸序列的分离多肽和其任何片段、衍生物或类似物。所述多肽是趋化因子样分泌蛋白，在本文中分别被指定为PRT5、PRT6、PRT7或PRT8。
相似地，本发明的一个目的是提供一种包含PRT5、PRT6、PRT7或PRT8中任意一种分离多肽的分离蛋白，和其任何片段、衍生物或类似物。
本发明的另一个目的是提供一种分离核酸分子，所述分离核酸分子包含编码PRT5、PRT6、PRT7或PRT8中任意一种分离多肽和其任何片段、衍生物和类似物的序列。
本发明的另一个目的是提供一种包含编码PRT5、PRT6、PRT7或PRT8中任意一种分离多肽的分离核酸分子的载体，其中所述核酸分子可操作地与启动子连接且所述载体是表达载体。此外，本发明同样提供包含所述载体的细胞。
本发明的另一个目的是提供包含PRT5、PRT6、PRT7或PRT8中任意一种分离多肽和其任何片段、衍生物或类似物或含有所述分离多肽和其任何片段、衍生物或类似物的蛋白的组合物。所述组合物可以进一步包含制药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
当包含PRT5或PRT8或其生物学活性片段或衍生物时，本发明提供的所述组合物可以具有特殊的治疗应用，如增强葡萄糖代谢、诱导胰岛素受体表达、诱导Glut-4转运蛋白移位至质膜、诱导葡萄糖流入和/或糖原合成、以及诱导糖酵解和脂肪酸合成，或所述组合物可以用于治疗以下疾病：葡萄糖代谢相关疾病、糖尿病、代谢综合征、肥胖、内分泌疾病和肌肉疾病。
当包含PRT6或其生物学活性片段或衍生物时，本发明提供的所述组合物可以具有特殊的治疗应用，如提高睾酮生成，或可以用于治疗睾酮缺乏或低睾酮相关疾病。
可选择地，当包含PRT7或其生物学活性片段或衍生物时，本发明提供的所述组合物可以具有特殊的效果，如诱导p53表达、细胞凋亡或细胞死亡，或它在癌症治疗中具有治疗用途。
本发明的另一个目的是提供本发明中描述的PRT5、PRT6、PRT7或PRT8中任意一种分离多肽在制备治疗疾病或紊乱的药物中的应用，所述疾病或紊乱选自：具有免疫学因素或病因的疾病、传染病、急性和慢性炎性疾病、癌症、移植病和自体免疫性疾病、与生育相关的疾病和碳水化合物代谢紊乱、糖尿病、代谢综合征、肥胖、内分泌疾病和肌肉疾病。
本发明的另一个目的是提供一种在需要的个体中治疗疾病或紊乱的方法，包括对所述个体施用治疗有效量的分离多肽PRT5、PRT6、PRT7或PRT8、或包含所述分离多肽的蛋白、或包含其的组合物，所述疾病或紊乱选自：具有免疫学因素或病因的疾病、传染病、急性和慢性炎性疾病、癌症、移植病和自体免疫性疾病、与生育相关的疾病、碳水化合物代谢紊乱、糖尿病、代谢综合征、肥胖、内分泌疾病和肌肉疾病。
本发明的另一个目的是提供一种抗体或其任何片段或衍生物，所述抗体能够特异识别分离多肽PRT5、PRT6、PRT7或PRT8之一或其片段或衍生物、或包含其的蛋白。本发明同样提供包含抗PRT5抗体、抗PRT6抗体、抗PRT7抗体或抗PRT8抗体的组合物，以及它们的治疗和诊断应用。
最后，本发明提供一种用于诊断和/或监测疾病或紊乱的治疗功效和/或用于评估疾病或紊乱的预后的诊断试剂盒，所述疾病或紊乱选自：具有免疫学因素或病因的疾病、传染病、急性和慢性炎性疾病、癌症、移植病和自体免疫性疾病、与生育相关的疾病和碳水化合物代谢紊乱；所述试剂盒包括至少一种抗PRT5抗体、抗PRT6抗体、抗PRT7抗体或抗PRT8抗体或包含其的组合物，以及用于实现检测样品中的抗原存在的说明书，其中所述抗原能够被所述抗体特异识别。所述试剂盒可以进一步包括至少一种以下成分：至少一种用于收集被测样品的工具、至少一种用于检测所述抗原被所述抗体识别的必需试剂和至少一种对照样品。
附图说明
图1A-1D：PRT5对葡萄糖水平的作用
图1A：该图显示了注射2mg/kg葡萄糖的C57Bl小鼠，在注射PRT5后1天、在时间点0.5、1.5、2、2.5和4小时测量的血液中的葡萄糖浓度(mg/dL)。
图1B：该图显示了注射2mg/kg葡萄糖的C57Bl小鼠，在注射PRT5后2天、在时间点0.5、1和2小时测量的血液中的葡萄糖浓度(mg/dL)。
图1C：该图显示了注射2mg/kg葡萄糖的C57Bl小鼠，在注射PRT5后3天、在时间点0.5、1和2小时测量的血液中的葡萄糖浓度(mg/dL)。
图1D：该图显示了注射2mg/kg葡萄糖的C57Bl小鼠，在注射PRT5后4天、在时间点0.5、1和2小时测量的血液中的葡萄糖浓度(mg/dL)。
图例：-◇-盐水；-■-1μg/kg PRT5；-▲-5μg/kg PRT5；Sal.＝盐水；Gluc.＝葡萄糖；T.inj.＝注射葡萄糖后的时间。
图2A-2B：健康个体和糖尿病病患的人血清中的PRT5水平
图2A：该柱状图显示了8位健康个体和9位II型糖尿病病患的PRT5水平(pg/ml)。以1∶3稀释样品并以1∶250稀释抗PRT5抗体。
图2B：该柱状图显示了健康个体对II型糖尿病病患(每一种平均10个样品)的PRT5水平(pg/ml)。以1∶3稀释样品并以1∶250稀释抗PRT5抗体。
图例：H.＝健康个体；T.II Diab.＝II型糖尿病病患。
图3A-3B：PRT6对睾酮水平的作用
图3A：睾酮校准曲线。
图3B：该柱状图显示了用4％DMSO水溶液、0.5μg/kg的PRT6或5μg/kg的PRT6(每组6只小鼠)处理4天的小鼠血清(以1∶10稀释血液)中睾酮的水平(ng/ml)。
图例：Test.conc.＝睾酮浓度；Test.＝睾酮；Treat.＝处理；w.o.＝周龄。
图4A-4F：胰腺癌和肺癌病患中的PRT7水平
图4A：该柱状图显示了胰腺癌病患(10位病患，癌症阶段显示在每个柱的下方)与健康个体(9个样品)相比较的PRT7的水平(pg/ml)。
图4B：该柱状图显示了分别在男性和女性的胰腺癌病患与健康个体中的PRT7平均水平(pg/ml)。
图4C：该柱状图显示了仅来自男性的样品中，胰腺癌病患(5位病患，癌症阶段显示在每个柱的下方)与健康个体(5个样品)相比较的PRT7的水平(pg/ml)。
图4D：该柱状图显示了仅在男性中，胰腺癌病患与健康个体中的PRT7平均水平(pg/ml)。
图4E：该柱状图显示了肺癌病患(9个样品)和健康个体(9个样品)相比较的PRT7的水平(pg/ml)。
图4F：该柱状图显示了分别在男性和女性中，肺癌病患与健康个体中的PRT7平均水平(pg/ml)。
图例：H.＝健康个体；PC＝胰腺癌病患；C.st.＝癌症阶段；LC＝肺癌；m.＝男性；f.＝女性。
图5A-5B：PRT8对葡萄糖水平的作用
图5A：该图显示了注射2mg/kg葡萄糖的C57Bl小鼠，在注射PRT8后2天、在时间点30、60和120分钟测量的葡萄糖水平。
图5B：该图显示了注射2mg/kg葡萄糖的C57Bl小鼠，在注射PRT8后3天、在时间点30、60和120分钟测量的葡萄糖水平。
图例：-◇-盐水；-■-1μg/kg PRT8；-▲-10μg/kg PRT8；Sal.＝盐水；Gluc.＝葡萄糖；T.＝注射葡萄糖后的时间。
具体实施方式
本发明人已经分离了新的蛋白，它们全都包含至少一个信号肽域，表示它们是分泌蛋白或趋化因子样蛋白。
多肽序列分析显示新的分离蛋白具有类似于趋化因子的结构特性，表示它们是配体类蛋白或趋化因子类蛋白。
这些被命名为PRT5、PRT6、PRT7和PRT8的新的分离蛋白是本发明的目的。本文涉及的所有多肽具有由免费的domain软件(来自CBS的SignalP，生物序列分析中心，丹麦科技大学)和内部开发的软件检测的突出的信号肽序列(数据未显示)。
不同蛋白的表达模式在下文的实施例中描述。简要地，PRT5显著发现于胰腺和睾丸中，同样也发现于脾、卵巢和小肠中(实施例1)。PRT6显著发现于睾丸中(实施例4)。PRT7显著发现于胎儿脑中，同样发现于肝脏、骨骼肌和成人脑中(实施例6)。最后，PRT8显著发现于胰腺和睾丸中，也发现于肝脏中(实施例8)。
序列比较显示新鉴定的蛋白和到此为止记述的任何其它蛋白没有同源性。
因此，在第一个方面，本发明提供一种表现为趋化因子样分泌蛋白的分离多肽及其任何片段、类似物和衍生物，所述多肽包含由SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4任意一项表示的氨基酸序列。
本文中使用的术语“多肽”表示一种多肽或一种蛋白。所述多肽可以通过基因工程方法(在宿主细胞中表达)或通过任何其它合适方式合成获得。
在本文中，术语“蛋白”通常用于表示处于稳定构象的完整的生物学分子以及它的变异体。多肽可以表示任何线性单链氨基酸，通常不考虑长度，但是通常意味着没有规定的构象。
因此，本发明既涉及多肽，也涉及包含由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4表示的氨基酸序列的蛋白，以及它们的片段、类似物和衍生物。
除非另有说明，多肽通常由天然存在的L-氨基酸组成。
关于多肽分子，术语“生物学特性”指多肽发挥至少一种体外或体内作用的能力，所述能力可以由全长PRT5、PRT6、PRT7或PRT8多肽发挥，包括但不限于说明书中记载的生物学活性。例如，生物学特性包括治疗癌症、免疫***相关疾病、病毒病和炎性疾病的能力。
术语“与未修饰的分子相比，没有明显影响修饰的分子的生物学特性”表示修饰的分子保持了与未修饰的分子的生物学活性性质上相似的生物学活性。
关于与本发明相关的修饰的多肽，应当理解为它保持了具有选自SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的氨基酸序列的蛋白的至少一种生物学特性。为了检测一种多肽是否保持了与未修饰的分子的生物学活性性质上相似的生物学活性，可以使用一种或多种检测，如体外、体内或临床试验，其中修饰的多肽与对应的未修饰的多肽(即PRT5、PRT6、PRT7或PRT8多肽，或其片段)进行比较，所述未修饰的多肽平行检测或在分开操作的实验中检测。
修饰的多肽可以是包括至少8、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或至少65个氨基酸残基、与PRT5、PRT6、PRT7或PRT8多肽中包括的至少8、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或至少65个氨基酸残基的对应序列具有一定程度的一致性的连续序列的多肽，所述一定程度的一致性是至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％以及特别地至少95％。
本发明同样提供源自PRT5、PRT6、PRT7或PRT8的多肽，如其中一个或多个氨基酸被另一个氨基酸保守取代的修饰的多肽。如在本文中所使用的，“保守取代”指一类中的某一氨基酸由同一类的另一氨基酸取代，其中一类是通过共同的物理化学氨基酸侧链性质和在天然发现的同源蛋白中的高取代频率定义。已经分类了6种一般种类的氨基酸侧链，包括：类I(Cys)；类II(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；类III(Asn、Asp、Gln、Glu)；类IV(His、Arg、Lys)；类V(Ile、Leu、Val、Met)；和类VI(Phe、Tyr、Trp)。例如，Asp取代为类III的另一种残基，如Asn、Gln或Glu的取代是保守取代。
在一个实施方式中，所述氨基酸序列中仅有一个取代。
在另一个实施方式中，有两个取代。在另一个实施方式中，有三个取代。取代的最大数量应当不超过在未取代的序列中保留至少70％、期望地至少80％、优选地至少90％、最优选地至少95％的氨基酸的氨基酸数量。在一个具体的实施方式中，包括高达3个、有时高达6个被其它氨基酸取代的氨基酸残基的取代是保守取代。
在另一种实施方式中，一个或多个氨基酸可以是由D-氨基酸、优选地对应的D-氨基酸替换。在一种具体的实施方式中，所有的氨基酸都是D-氨基酸。
因此，应当理解为本发明涉及包含与本文公开的序列同源的序列并具有基本相等或更高活性的蛋白或多肽。同源序列指缺失、添加或取代不超过总氨基酸数量的25％、优选地不超过10％的序列。
优选的取代是期望不改变所述蛋白或多肽的二级结构的变化，即保守变化。下表显示了可以与原始氨基酸(左侧)替换的氨基酸(右侧)。
同样可以根据它们的基本特征，如电荷、侧链大小等等对氨基酸进行分组。下表显示了相似氨基酸的组。优选的取代是一个组中的氨基酸与相同组中的氨基酸替换，如下：
1、小的脂肪族，非极性：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
2、极性的负电荷残基和它们的氨基化合物：Asp、Asn、Glu、Gln；
3、极性的正电荷残基：His、Arg、Lys；
4、大的脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val、Cys；
5、大的芳香族残基：Phe、Tyr、Trp。
更多关于氨基酸取代和蛋白质结构的内容可以在Schulz等，Principles ofProtein Structure，Springer-Verlag，New York，NY，1979和Creighton，T.E.，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，CA 1983中找到。
如在下文详细描述的，上文详述的优选的保守氨基酸取代期望基本上保留或增加本发明蛋白的功能或活性。当然，任何氨基酸取代、添加或缺失被认为是在本发明的范围内，其中得到的蛋白或多肽保持了原始功能。例如，保守取代是本发明的多肽仍然可以被识别野生型多肽的抗体所识别的取代。
本发明的蛋白或多肽可以通过常规化学方法，如固相合成(使用如FMOC和BOC技术)和溶液相合成而产生。如在下文提到的Current Protocols inMolecular Biology第16章中详细描述的，这些蛋白或多肽同样可以在细菌或昆虫细胞或其它体内真核转录***中产生。产生之后，从产生它们的细胞纯化所述蛋白或多肽。多肽的纯化和分离方法是本领域技术人员已知的并在如Ausubel等(eds.)Current Protocols in Molecular Biology，第16章，John Wiley和Sons，2006和Coligan等(eds.).Current Protocols in Protein Science，第5和第6章，John Wiley和Sons，2006中详细描述。有利地，所述蛋白或多肽可以作为与第二种蛋白(如谷胱甘肽S转移酶(GST))等、或序列标签(如组氨酸标签(His标签)序列)的融合物产生。如在上文提及的Current Protocols inMolecular Biology第16章和在His标签蛋白表达和纯化试剂盒(购自如QiagenGmbH，德国)的说明书中所详细描述的，融合物或标签蛋白的应用简化了纯化程序。
本发明的蛋白或多肽同样可以在无细胞***中使用如细胞提取物或核糖体合成。
可以进一步修饰本发明的多肽或蛋白以提高它们的功能、亲和力或稳定性。例如，可以使用环化作用以赋予多肽更高的稳定性和/或全面提高的性能。已经开发了许多不同的环化方法，包括侧链环化和骨架环化。这些方法在现有技术中充分记载[如，Yu等，Bioorg.Med.Chem.7，161-75，1999，Patel等，J.Pept.Res.53，68-74，1999，Valero等，J.Pept.Res.53，56-67，1999，Romanovskis等，J.Pept.Res.52，356-74，1998，Crozet等.Mol.Divers.3，261-76，1998，Rivier等，J.Med.Chem.41，5012-9，1998，Panzone等，J.Antibiot.(Tokyo)，51，872-9，1998，Giblin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，12814-8，1998，Limal等，J.Pept.Res.52：121-9，1998，和US 5,444,150]。
一种具体的环化方法涉及通过使用苯环的对位取代的氨基酸衍生物的两性分子的α-螺旋的稳定作用[Yu等(1999)id ibid]。另一种具体环化方法是骨架环化，如在Reissmann等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids 1：51-6，1994-95和其参考文献中所公开的。同样可以使用另一种涉及骨架与侧链连接的环化方法[Reissmann等(1994-95)id ibid]。
但是，根据本发明，本发明的蛋白或多肽可以在其N末端和/或C末端用多种相同或不同的有机基团扩展，所述有机基团不是天然存在的或合成的氨基酸。作为这样扩展的一个例子，所述蛋白或多肽可以用N-乙酰基在N末端和/或C末端扩展。
为了改进多肽的结构，本发明的蛋白或多肽可以通过它们的N末端与十二烷基半胱氨酸(LC)残基连接和/或通过它们的C末端与半胱氨酸(C)残基连接，或与适于将多肽与用于免疫的佐剂连接的其它残基连接。
在另一方面，本发明提供一种分离核酸分子，所述分离核酸分子包含编码由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4任意一项表示的多肽和其任何片段、衍生物和类似物的序列或其全长互补序列。
此外，本发明提供一种分离核酸分子，所述分离核酸分子仅由于遗传密码简并性而在密码子序列上与包含编码由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4任意一项表示的多肽的序列的核酸分子不同。
如在本文中所使用的，术语“核酸分子”意思是包括DNA分子(如cDNA)和RNA分子(如mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。所述核酸分子可以是单链或双链，但优选地，它是双链DNA。
术语“分离核酸分子”意思是包括分离自其它核酸分子的核酸分子，并且当通过重组技术产生时，基本没有其它细胞物质或培养基，或当化学合成时，基本没有化学前体或其它化学品。
本发明范围内的衍生物同样包括多核苷酸衍生物。多核苷酸衍生物或核酸衍生物不同于在核苷酸序列中记载的或已知的序列。例如，一种多核苷酸衍生物的特征可以是一个或多个核苷酸的取代、***或缺失。
本发明的一个方面涉及足以用作杂交探针以鉴定编码PRT5、PRT6、PRT7或PRT8蛋白的核酸分子(如，编码PRT5、PRT6、PRT7或PRT8的mRNA)的核酸片段以及用于扩增或突变PRT5、PRT6、PRT7或PRT8的编码核酸分子的用作PCR引物的片段。
在另一种实施方式中，所述包含编码由SEQ ID NO.1表示的多肽的序列的分离核酸分子包含由SEQ ID NO.5表示的序列。
在另一种实施方式中，所述包含编码由SEQ ID NO.2表示的多肽的序列的分离核酸分子包含由SEQ ID NO.6表示的序列。
在另一种实施方式中，所述包含编码由SEQ ID NO.3表示的多肽的序列的分离核酸分子包含由SEQ ID NO.7表示的序列。
在另一种实施方式中，所述包含编码由SEQ ID NO.4表示的多肽的序列的分离核酸分子包含由SEQ ID NO.8表示的序列。
可以使用标准的分子生物学技术和本文提供的序列信息产生本发明的核酸分子，如具有SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8中任何一项的核苷酸序列的核酸分子，或其一部分。
在一种具体实施方式中，一种本发明的分离核酸分子包含SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8任何一项所示的核苷酸序列。
在另一种具体实施方式中，一种本发明的分离核酸分子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8任何一项所示的全长核苷酸序列有至少大约80％、85％、90％、95％、98％或更多的同源性。
此外，本发明的核酸分子可以包含SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8任何一项的核酸序列的仅一部分，例如，可以用作引物(如由SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16中任何一项所表示的序列)的片段，或编码PRT5、PRT6、PRT7或PRT8蛋白中任何一种的一部分(如PRT5、PRT6、PRT7或PRT8蛋白中任何一种的生物学活性部分)的片段。在一种优选的实施方式中，核酸分子包含含有SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8中任何一项的核酸的至少100个连续的核苷酸。
基于PRT5、PRT6、PRT7或PRT8核苷酸序列中任意一种的探针可以用于检测编码相同或同源蛋白的转录本。这样的探针可以用作诊断检测试剂盒的一部分，所述诊断检测试剂盒用于鉴定表达本发明的PRT5、PRT6、PRT7或PRT8蛋白中任意一种的细胞或组织，例如通过测量个体细胞样品中PRT5、PRT6、PRT7或PRT8的编码核酸的水平，如检测PRT5、PRT6、PRT7或PRT8的mRNA水平。
可以通过分离SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中任意一项的核苷酸序列的一部分分别制备编码PRT5、PRT6、PRT7或PRT8蛋白中任意一种的“生物学活性部分”的核酸片段，所述核酸片段编码具有PRT5、PRT6、PRT7或PRT8蛋白的生物学活性、表达所述蛋白的编码部分(如通过体外重组表达)和评估所述蛋白的编码部分的活性的多肽。在一种具体实施方式中，本发明的多核苷酸编码包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4中任意一项的氨基酸序列的至少30个连续氨基酸残基的片段。
本发明进一步包括核酸分子，基于遗传密码简并性，所述核酸分子与SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中任意一项所示的核苷酸序列不同，但编码分别与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中任意一项所示的核苷酸序列编码的那些蛋白相同的PRT5、PRT6、PRT7或PRT8蛋白。
在一种实施方式中，本发明的分离核酸分子具有编码具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中任意一项所示的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列或其片段。在另一种实施方式中，本发明的分离核酸分子具有编码与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中任意一项有至少大约80％、85％、90％、95％、98％或更多一致性的蛋白的核苷酸序列或其片段。
除了分别在SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中所示的PRT5、PRT6、PRT7或PRT8核苷酸序列之外，本领域技术人员应当意识到，导致PRT5、PRT6、PRT7或PRT8蛋白的多肽组成的氨基酸序列变化的DNA序列多态性可以在种群中存在。基于天然的等位基因变异，PRT5、PRT6、PRT7或PRT8基因的多肽中的这样的遗传多态性可以在种群中存在。
功能性等位基因变异将典型地包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4中任意一项的一个或多个氨基酸的保守取代，或在所述蛋白的非关键区中非关键残基的取代、缺失或***。
非功能性等位基因变异将典型地包含非保守取代、缺失或***、或SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中任意一项的氨基酸序列的未成熟截短(premature truncation)，或在所述蛋白的关键残基或关键区的取代、***或缺失。
可以通过分别向SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8的核苷酸序列引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，从而向编码的蛋白中引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失而产生编码与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中任意一种蛋白分别同源的PRT5、PRT6、PRT7或PRT8蛋白的分离核酸分子。可以通过标准技术，如定点突变和PCR介导的突变引入突变。优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸取代。
因此，在PRT5、PRT6、PRT7或PRT8蛋白的任意一种中的预测的非必需氨基酸残基优先地由来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基替换。可选地，在另一种实施方式中，随机地沿着PRT5、PRT6、PRT7或PRT8任意一种的全长或部分DNA编码序列引入突变，例如通过饱和诱变，且可以筛选得到的突变体的PRT5、PRT6、PRT7或PRT8蛋白的生物学活性以鉴定保持PRT5、PRT6、PRT7或PRT8活性的突变体。在SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中任意一项发生突变之后，可以重组表达所述编码蛋白并检测所述蛋白的活性。
为检测两条氨基酸序列或两条核酸序列之间的百分比一致性，出于最佳比较目的(如，可以在两条氨基酸序列或之一或在两条核酸序列或之一中引入缺口用于最佳比对，且出于比较目的可以忽视非同源序列)将序列进行比对。在一种优选的实施方式中，出于比较目的的比对的参考序列的长度是所述参考序列长度的至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、更优选地至少60％、以及更优选地至少70％、80％、90％或95％。然后比较相应氨基酸位置的氨基酸残基或相应核苷酸位置的核苷酸。当第一条序列的某一位置的氨基酸残基或核苷酸与第二条序列的相应位置的氨基酸残基或核苷酸相同时，这两个分子在这个位置处是一致的(如在本文中所使用的，氨基酸或核酸“一致性”与氨基酸或核酸“同源性”是相等的)。考虑到缺口(其需要被引入以用于两条序列的最佳比对)的数量以及每一个缺口的长度，两条序列之间的百分比一致性是由两条序列共享的一致位置的数量函数。
可以使用数学运算法则完成两条序列之间的序列比较和百分比一致性的测定。在一种实施方式中，使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))运算法则测定两条氨基酸序列之间的百分比一致性，所述运算法则已经合并至GCG软件包的GAP程序(通过Accelrys Inc.站点(原来的GeneticsComputer Group)在线使用，圣地亚哥，加利福尼亚)中，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，且缺口加权是16、14、12、10、8、6或4，长度加权是1、2、3、4、5或6。在另一种实施方式中，使用GCG软件包的GAP程序(通过Accelrys Inc.站点(原来的Genetics Computer Group)在线使用，圣地亚哥，加利福尼亚)测定两条核苷酸序列之间的百分比一致性，使用NWSgapdna.CMP矩阵，且缺口加权是40、50、60、70或80，长度加权是1、2、3、4、5或6。在另一种实施方式中，使用E.Meyers和W.Miller的运算法则(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))测定两条氨基酸序列或核苷酸序列之间的百分比一致性，所述法则已经合并至ALIGN程序(2.0版本)中，使用加权剩余表，缺口长度罚值是12，缺口罚值是4。
核酸和蛋白序列可以进一步用作“询问序列”以针对公开数据库进行检索，从而例如鉴定家族其它成员或相关序列。可以使用NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)进行这样的检索。可以使用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，其中分值(score)＝100，词长(wordlength)＝12，以获得同源核苷酸序列。可以使用XBLAST程序进行BLAST蛋白检索，其中分值＝50，词长＝3，以获得同源氨基酸序列。为获得出于比较目的的缺口比对，可以使用如在Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序默认(如XBLAST和NBLAST)参数。(见，如美国国家生物技术信息中心的在线数据库)。
此外，可以使用“Clustal”方法(Higgins和Sharp，Gene，73：237-44，1988)和“Megalign”程序(Clewley和Arnold，Methods Mol.Biol，70：119-29，1997)比对序列并测定相似性、一致性或同源性。
在另一方面，本发明提供一种载体，所述载体包含编码如由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4任意一项表示的多肽的分离核酸分子和其任何片段、衍生物或类似物。因此，所述载体包含分别由SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8表示的分离核酸序列，或仅由于遗传密码简并性而与其不同的任何变异体。
在所述载体的一种实施方式中，所述核酸分子与启动子可操作地连接。
在另一种实施方式中，所述载体是一种表达载体。
如本文中所使用的，术语“载体”意思是包括一种核酸分子，所述核酸分子能够将另一种核酸转运至该核酸分子已经连接的位置。载体可以由一个或少量多个限制性核酸内切酶位点表征，在位点处的这些DNA序列可以以预定的方式切开而不丧失所述载体的主要生物学功能，且在此处可以连接入DNA片段使其得以复制和克隆。载体可以进一步包含适于用于鉴定转化有所述载体的细胞的标记物。一种类型的载体是“质粒”，它是指额外的DNA片段可以连接至其中的圆形双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可以连接至病毒基因组中。一些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(如，非游离型哺乳动物载体)通过引入至宿主细胞而结合至宿主细胞的基因组，并因此随着宿主基因组而复制。此外，一些载体能够引导与它们有效连接的基因的表达。在本文中指定这样的载体为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中使用的表达载体通常是以质粒的形式。在本申请说明书中，由于质粒是最通常使用的载体形式，“质粒”和“载体”可以交互替换使用。但是，本发明计划包括提供相等功能的其它形式的表达载体，如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“有效连接”或“可操作地连接”意思是指分子之间彼此功能性连结，因为一种分子的活性或状态可以影响另一种分子的活性或状态的变化。当调节序列与编码目标多肽或蛋白的DNA序列功能性相关联时，核苷酸序列是“可操作地连接”。例如，如果启动子核苷酸序列控制编码目标蛋白的DNA序列转录，所述启动子核苷酸序列与所述编码目标蛋白或多肽的DNA序列可操作地连接。典型地，两条有效连接的多肽通过肽键共价连接。
在另一方面，本发明提供一种包含上述载体的细胞，所述载体包含编码如由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4任意一项表示的多肽分离核酸分子和其任何片段、衍生物或类似物，所述载体包含分别由SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8表示的分离核酸序列，或仅由于遗传密码简并性而与其不同的任何变异体。
在一个实施方式中，所述细胞是选自植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、细菌细胞或哺乳动物细胞的宿主细胞。
在本文中，术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”可以交互替换使用。“宿主细胞”包括能够通过引入外源DNA而修饰的任何可培养的细胞。优选地，宿主细胞是，在其中，转录调节蛋白可以稳定表达、转录后修饰、定位至合适的亚细胞室并参与合适的转录***的细胞。检测信号的选择同样可以影响合适的宿主细胞的选择。例如，如上所述，报告子构建体能够基于应答转录调节蛋白的基因转录的激活或抑制而提供可选择的或可筛选的特性；为了达到最佳的选择或筛选，将考虑宿主细胞的表现型。应该理解，这样的术语并不仅仅指具体的个体细胞，也包括这样细胞的后代或可能的后代。因为由于突变或环境影响，在随后的后代中可能发生一些变化，这样的后代可能事实上与亲本细胞并不相同，但是它们仍然包括在本文使用的术语的范围内。
本发明的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，大肠杆菌(E.coli)或杆菌(Bacilli)。适于用于转化的原核宿主细胞包括，例如大肠杆菌、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门杆菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的多个其它种。真核细胞包括但不限于，酵母细胞、植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞(如杆状病毒)、哺乳动物细胞和寄生物(如锥体虫)的细胞。
如在本文中所使用的，术语“酵母”不仅包括严格分类意义上的酵母，即单细胞生物，也包括酵母样多细胞真菌或丝状真菌。示例性的种包括乳酸克鲁维酵母(Kluyverei lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和Ustilaqo maydis，其中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是优选的。在本发明实践中可以使用的其它酵母是粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)。
哺乳动物宿主细胞培养***包括已建立的细胞系，如HeLa细胞、COS细胞、L细胞、3T3细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、胚胎干细胞等。
在另一方面，本发明提供一种包含如上所定义的一种选自PRT5、PRT6、PRT7和PRT8的分离多肽或蛋白或其任何片段、类似物或衍生物的组合物，其中所述蛋白或多肽分别包含选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的序列。
本发明人在下面的实施例2和实施例8(分别是图1A-1D和5A-5B)中已经令人惊讶地显示出多肽PRT5和PRT8对葡萄糖水平和葡萄糖转变有显著作用。在饥饿、注射葡萄糖之后测量中，PRT5和PRT8均诱导了葡萄糖水平的降低。在注射PRT5后2、3和4天以及在注射PRT8后2和3天，这些结果最显著。
这些结果表示PRT5和PRT8是葡萄糖的调节物，并且可能是糖尿病治疗或葡萄糖代谢相关疾病治疗中的重要治疗剂。
在实施例3中显示的结果(图2A-2B)进一步支持了PRT5作为葡萄糖代谢的调节物和作为糖尿病状况中的影响因素的作用。糖尿病病患中降低的PRT5水平强烈地指向了PRT5在糖尿病中的重要作用。因此可以推断，PRT5以及PRT8可以用作调节葡萄糖代谢、葡萄糖转变甚至诱导胰岛素表达的治疗剂。
本发明人进一步令人惊讶地发现PRT5能够增加用PRT5处理的小鼠的骨骼肌中胰岛素受体的水平(数据未显示)。
胰岛素与它的受体结合并依次启动很多蛋白激活级联。所述胰岛素受体(CD220)是一种跨膜受体，由胰岛素激活并属于酪氨酸激酶受体大类。它由两个α亚单位和两个β亚单位组成，构成所述胰岛素受体。所述β亚单位穿过细胞膜并通过二硫键连接。所述α亚单位和β亚单位由单一基因(INSR)编码。
基于胰岛素和它的受体结合，启动了复杂的级联事件，包括：Glut-4转运子转移至质膜及葡萄糖的流入、糖原合成、糖酵解和脂肪酸合成。这些过程主要发生在胰岛素反应性组织(包括肌肉细胞和脂肪组织)的外部膜上，并导致葡萄糖从血液到这些组织的吸收的增加。
因此，可以推断的是，通过诱导胰岛素受体的表达，PRT5也诱导所述级联事件。因此，PRT5直接或间接地诱导了Glut-4转运子转移至脂膜及葡萄糖流入、糖原合成、糖酵解和脂肪酸合成。
糖原合成同样由胰岛素受体通过IRS-1刺激。在这种情况下，PI-3激酶(PI-3K)的SH2域与IRS-1的P-Tyr结合。在激活时，PI-3K可以将膜脂质磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)转变为磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PIP3)。这通过磷酸化作用间接激活了蛋白激酶PKB(Akt)。PKB然后磷酸化几种靶蛋白，包括糖原合酶激酶3(GSK-3)。GSK-3磷酸化糖原合酶(并因此使糖原合酶失活)。当GSK-3被磷酸化时，它是失活的，并被阻止失活糖原合酶。以这样迂回的方式，胰岛素增加了糖原合成。
因此，在一种具体方面，本发明提供一种包含分离多肽PRT5或PRT8中任何一种、特别是PRT5的组合物，或包含含有所述分离多肽的蛋白或编码所述多肽的核酸的组合物，用于诱导胰岛素受体的表达、诱导Glut-4转运子转移至质膜及葡萄糖的流入、诱导糖原合成和/或诱导糖酵解和脂肪酸合成。
在另一具体方面，本发明提供一种包含分离多肽PRT5或PRT8中任何一种或含有所述分离多肽的蛋白或编码所述分离多肽的核酸的组合物，用于治疗葡萄糖代谢相关疾病。
胰岛素抵抗是一种常见且广泛流行的代谢疾病，它与糖尿病、代谢综合征和肥胖的病理生理学密切相关。它也是多种内分泌疾病，包括***(PCOS)、甲状腺和肾上腺疾病以及它们的并发症的表现形式。
本发明人的意想不到的结果表示PRT5可以用作征服这些疾病的旁路机制。因此，PRT5可以用作治疗与胰岛素抵抗相关的任何病理状况，如糖尿病、代谢综合征、肥胖和内分泌疾病以及肌肉疾病的治疗剂。
肌肉***的一些最常见的疾病和紊乱包括肌病、慢性疲劳综合征、纤维肌痛、肌肉萎缩症和间隔综合征。涉及缺陷型骨骼肌葡萄糖和/或糖原代谢的具体疾病是肌磷酸化酶和磷酸果糖激酶缺乏，更简单的描述是在锻炼之后疼痛的肌肉抽筋。
在另一具体方面，本发明提供一种包含分离多肽PRT5或PRT8中任何一种或含有所述分离多肽的蛋白或编码所述分离多肽的核酸的组合物，用于治疗选自糖尿病、代谢综合征、肥胖、内分泌疾病以及肌肉疾病的疾病。
在另一具体方面，本发明提供一种包含分离多肽PRT5或PRT8中任何一种或含有所述分离多肽的蛋白或编码所述分离多肽的核酸的组合物，用于增加葡萄糖代谢。
此外，在下面的实施例5(以及图3A-3B)中，本发明人令人惊奇地显示了多肽PRT6具有显著的增加睾酮水平的作用。这些结果强烈地显示了PRT6是一种用于诱导和/或增加睾酮产生的有效试剂，并因此可以用于治疗睾酮缺乏相关的疾病，或甚至在健康状况下用于诱导睾酮产生。
睾酮是在5亿个***细胞中通过酶顺序步骤从胆固醇合成，所述***细胞位于生精小管之间的睾丸的组织间隙室中，它构成了大约5％的成熟睾丸体积。此外，已经描述了在特定组织中从循环的功能差的肾上腺雄激素前体DHEA性腺外生物合成睾酮和二氢睾酮，尽管肾上腺雄激素对循环的睾酮的纯粹贡献很小。睾丸的睾酮分泌主要由促黄体激素(LH)通过它对***细胞线粒体中的胆固醇转化成孕烯醇酮的速率限制的调节而控制，所述胆固醇转化成孕烯醇酮通过定位在线粒体膜内部的细胞色素P-450胆固醇侧链***酶复合物完成。
临床上，睾酮以生理剂量使用以用于雄激素替代治疗，以及代表性地更高剂量的睾酮或基于它的结构的合成雄激素同样用于药理性雄激素治疗。雄激素替代治疗的主要目标是恢复生理性模式的雄激素暴露于所有的身体组织。这种治疗的目标是复制生理学循环的睾酮水平和全部范围(包括前受体雄激素活化作用)的天然雄激素对组织的作用。药理性雄激素治疗开发了睾酮或合成雄激素作为激素药物对肌肉、骨骼和其它组织的合成代谢或其它作用，如同其它治疗剂一样判断了它们的功效、安全性和相关的成本效率。
可以将睾酮的生理作用分类成前***(pre-peripubertal)作用、***作用和成年作用。所述前***作用是最先观察到的作用，表现出在孩童期的末期出现上升的雄激素水平，这在男孩和女孩中均发生，并通常辨别为：成年类型的体臭；皮肤和头发油质增加；痤疮；出现***；腋毛；突发生长，加速的骨骼成熟；以及上嘴唇和鬓脚的毛发。当雄激素已经比正常成年女性水平高数月或数年时开始发生***作用。在男性中，这通常是晚期的***作用，而在女性中，在血液中提高水平的游离睾酮的延长周期之后发生。这些作用可以被观察为：
-皮脂腺放大，这可能引起痤疮；
-***增大或***增大；
-***和***或***充血频率增加；
-***扩展至大腿和向上至脐；
-面部毛发(鬓脚、胡须、小胡子)；
-头发的减少(雄激素性脱发)；
-胸毛、乳晕(periareolar)毛、肛周毛；
-腿毛；
-腋毛；
-脸上的皮下脂肪减少；
-肌肉强度和质量增加；
-声音加深；
-喉结发育；
-睾丸中***发生组织的发育，雄性生殖；
-颚、额、下巴、鼻子的发育以及面部骨轮廓的改变；
-肩变得更宽，胸腔扩张；
-骨成熟完成及生长终止。这间接地通过***代谢发生并因此在男性中比在女性中更逐渐发生。
成年睾酮作用在男性中比在女性中更明显可论证，但是可能对男性和女性都很重要。由于睾酮水平在成人生命的后几十年会降低，这些作用中的一些可能下降。这些作用通常被认为是：
-***和***充血/******频率；
-在重要挑战中调节快速HPA(下丘脑-垂体-肾上腺轴)反应；
-精神和身体能量；
-肌肉营养性的保持。
在老年男性中维持正常的睾酮水平已经显示出改善许多因素，这些因素被认为是减少心血管疾病、如增加的瘦体重、减少内脏脂肪量、减少总胆固醇以及甘油调节风险。在重要挑战下，睾酮可能在战-或-逃反应的调节中起作用。此外，睾酮调节了巨核细胞和血小板上凝血噁烷A2受体的数量并因此调节在人中血小板的聚合。
低睾酮水平的征兆，特别是在衰老的男性中，的列表包括：
-***功能障碍(***问题)；
-***降低(低的性冲动)；
-情绪骚乱，包括消沉、易怒和感觉疲劳；
-肌肉尺寸和力量降低；
-骨质疏松症(骨密度变稀)；
-体脂肪增加；
-难以集中精神和记忆力下降；以及
-睡眠困难。
因此，在另一具体方面，本发明提供一种包含分离多肽PRT6或含有所述分离多肽的蛋白或编码所述分离多肽的核酸的组合物，用于提高睾酮产生。
在另一具体方面，一种包含分离多肽PRT6或含有所述分离多肽的蛋白或编码所述分离多肽的核酸的组合物，用于治疗睾酮缺乏或低睾酮相关的疾病。
本发明人已经进一步令人惊奇地显示在癌症中PRT7增加。该现象的一种非限定性例子在本文的实施例7中显示，其中在患有肺癌或胰腺癌的病患的样品中发现高水平的PRT7。此外，本发明人观察到PRT7能够诱导p53(数据未显示)。
所述癌症抑制子蛋白p53已知是稳定的并由不同的细胞胁迫如热休克、组织缺氧、渗压休克和DNA损害所激活，导致细胞生长的抑制和细胞凋亡(Ko和Prives，Genes Dev.10：1054-1072，1996；Levine，Cell 88：323-331，1997；Oren，Cancer Biol.5：221-227，1994)。同样已知的是细胞凋亡和细胞周期停滞是p53的主要的肿瘤抑制作用(Levine，Cell 88：323-331，1997)。除癌症外，细胞凋亡相关疾病的例子包括动脉硬化、阿耳茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化、移植物抗宿主病、自体免疫淋巴球增多综合征和病毒传染。
PRT7可以诱导p53的这个发现强烈表明PRT7可以用于癌症治疗。
因此，在另一具体方面，本发明提供一种包含分离多肽PRT7或含有所述分离多肽的蛋白或编码所述多肽的核酸的组合物，用于治疗癌症和/或诱导p53表达和/或诱导细胞凋亡。
在一种实施方式中，本发明提供的任何组合物可以进一步包含制药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
所述组合物的制备是本领域公知的并且已经在许多文献和教科书中有描述，见如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Gennaro A.R.ed.，MackPublishing Co.，Easton，PA，1990，特别是其中的1521-1712页。
本发明的组合物可以进一步包含至少一种制药学可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂。
术语“制药学可接受的载体”意思是惰性的、无毒材料的任一种，它们与所述活性组分不反应。有时基于期望形式的制剂选择所述载体。有时载体也可以具有促进将活性组分递送或渗透至目标组织的效果，用于促进药物的稳定性、减缓清除速率、给予慢释放性质、减少不期望的副反应效果等。所述载体也可以是稳定制剂的物质(如，防腐剂)，用于为制剂提供可食用的滋味等。所述载体可以是通常使用的那些的任何一种，并仅由化学-物理因素，如溶解度和缺乏与本发明抗体的反应性，以及给药途径限定。所述载体可以包括添加剂、着色剂、稀释剂、缓冲液、崩解剂、润湿剂、防腐剂、增味剂和药理学相容的载体。此外，所述载体可以是佐剂，佐剂定义为以可预测方式影响所述活性组分作用的物质。载体的典型例子包括：(a)液体溶液，其中有效量的活性物质溶解在稀释液，如水、盐水、原汁、醇、糖浆等中；(b)胶囊(如包含如表面活性剂、滑润剂和惰性装填物的普通硬壳或软壳凝胶类型)、片剂、糖锭(其中活性物质在调味料中，如蔗糖和***树胶或黄芪胶中，或者所述活性物质在惰性基质中，如凝胶和甘油中)和锭剂，每一种都包含预定量的活性试剂作为固体或颗粒；(c)粉末；(d)在合适液体中的悬浮液；(e)合适的乳状液；(f)脂质体制剂；以及其它。
在另一种实施方式中，本发明的组合物同样可选地进一步包括其它活性试剂，例如但不限于：抗生素、细胞因子、淋巴因子、生长因子、激素、抗氧化剂、维生素等。
在另一方面，本发明提供选自如上所定义的PRT5、PRT6、PRT7或PRT8的多肽或蛋白的应用，用于制备治疗疾病或紊乱的药物，所述疾病或紊乱选自具有免疫学因素或病因的疾病、传染病、急性和慢性炎性疾病、癌症、移植病和自体免疫性疾病、与生育相关的疾病和碳水化合物代谢紊乱。
在另一具体方面，本发明提供分离多肽PRT5或PRT8中任何一种或包含所述分离多肽的蛋白或编码所述多肽的核酸在制备治疗葡萄糖代谢相关疾病的药物中的应用。
更具体地，本发明提供分离多肽PRT5或PRT8中任何一种或包含所述分离多肽的蛋白或编码所述多肽的核酸在制备治疗选自以下疾病的药物中的应用：糖尿病、代谢综合征、肥胖、内分泌疾病和肌肉疾病。
在另一具体方面，本发明提供分离多肽PRT6或包含所述分离多肽的蛋白或编码所述多肽的核酸在制备用于治疗睾酮缺乏或睾酮缺乏相关的疾病的药物中的应用。
在另一具体方面，本发明提供分离多肽PRT7或包含所述分离多肽的蛋白或编码所述多肽的核酸在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
在另一方面，本发明提供一种在需要的个体中治疗疾病或紊乱的方法，所述方法包括对所述个体施用治疗有效量的选自如上定义的PRT5、PRT6、PRT7和PRT8的多肽或蛋白或包含所述多肽或蛋白的组合物，所述疾病或紊乱选自：具有免疫学因素或病因的疾病、传染病、急性和慢性炎性疾病、癌症、移植病和自体免疫性疾病、与生育相关的疾病、碳水化合物代谢紊乱、糖尿病、代谢综合征、肥胖、内分泌疾病和肌肉疾病。
在另一具体方面，本发明提供一种用于治疗选自葡萄糖代谢相关疾病、糖尿病、代谢综合征、肥胖、内分泌疾病和肌肉疾病的疾病的方法，所述方法包括对需要的个体施用治疗有效量的分离多肽PRT5或PRT8或包含所述分离多肽的蛋白或编码所述分离多肽的核酸或包含所述分离多肽的组合物。
在另一具体方面，本发明提供一种用于提高葡萄糖代谢的方法，所述方法包括对需要的个体施用治疗有效量的分离多肽PRT5或PRT8或包含所述分离多肽的蛋白或编码所述分离多肽的核酸或包含所述分离多肽的组合物。
在另一具体方面，本发明提供一种用于诱导胰岛素受体表达的方法，所述方法包括对需要的个体施用治疗有效量的分离多肽PRT5或PRT8，特别是PRT5，或包含所述分离多肽的蛋白或编码所述分离多肽的核酸或包含所述分离多肽的组合物。
相似地，本发明提供一种用于诱导细胞中胰岛素受体表达的方法，所述方法包括用有效量的PRT5或其生物学活性片段或衍生物或包含其的组合物接触细胞。所述方法可以是体外或离体方法。所述细胞将通常是肌肉细胞、脂肪细胞、它们的起源细胞或可以期望胰岛素受体在其中表达的任何细胞。
在另一具体方面，本发明提供一种用于治疗睾酮缺乏相关的疾病或用于提高睾酮产生的方法，所述方法包括对需要的个体施用治疗有效量的分离多肽PRT6或包含其的蛋白或编码其的核酸或包含其的组合物。
在另一方面，本发明提供一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括对需要的个体施用治疗有效量的分离多肽PRT7或包含其的蛋白或编码其的核酸或包含其的组合物。
此外，本发明提供一种用于诱导细胞中p53、细胞凋亡或细胞死亡中任意一种的方法，所述方法包括用有效量的PRT7或其生物学活性片段或衍生物或包含其的组合物接触细胞。所述方法可以是体外或离体方法。所述细胞可以是期望诱导p53或诱导细胞凋亡或细胞死亡的任何细胞，如癌细胞。
如在本文中所使用的，术语“有效量”意思是实现所挑选的结果所必需的量，其目前涉及用于治疗疾病所必需的PRT5、PRT6、PRT7或PRT8、或其生物学活性衍生物的量。
所述治疗有效量或剂量依赖于需要治疗的疾病状态的严重程度和反应性，其疗程持续一小时至几个小时，一天至几天，或直到痊愈或疾病状态已经减少。普通技术人员可以容易地确定最适宜的剂量、定量给药方法和重复率。最适宜的剂量可以依据本发明的每一种多肽或蛋白或包含其的组合物的相对潜力变化，并通常基于EC50估计，发现在动物模型的体外以及体内均有效。本领域普通技术人员可以容易地基于使用的多肽或蛋白的标准的残留时间、浓度和修正估计给药重复率。
本文中使用的术语“治疗”或“处理”意思是改善患有疾病或紊乱的病患中的疾病活性的一种或多种临床指示。“处理”指治疗性处理。
“病患”或“需要的个体”意思是期望对其治疗紊乱或疾病以克服所述紊乱或疾病的任何哺乳动物，特别是人个体。
通常，“治疗有效量”同样通过与预防性或治疗性目的相关联的疾病的严重程度、给药途径和病患的综合情形(年龄、性别、体重和主治医生知道的其它考虑因素)确定。
多种给药方法可以用于将本发明描述的多肽PRT5、PRT6、PRT7或PRT8递送至需要的个体。可以通过静脉内(i.v.)、肌肉的(i.m.)、腹膜内(i.p.)或局部注射或通过本领域技术人员发现的其它合适的途径递送所述多肽或包含其的组合物。为了有效治疗，本发明的多肽或蛋白应当以使得它们在施用之后在所述***中能够稳定的方式制备。
如在本文中所使用的，术语“紊乱”指正常功能被扰乱的状况。“疾病”指引起受侵袭的人或与这个人接触的其它人不适、功能障碍或悲痛的身体或精神的任何异常状况。有时该术语被广泛使用，包括伤害、先天性畸形、残疾、综合征、症状、不正常行为和结构和功能的非典型变化、由疾病产生的慢性或永久性健康问题。
术语“疾病”、“紊乱”、“状况”和“病”在本文中相等使用。
在另一方面，本发明提供一种特异识别选自PRT5、PRT6、PRT7和PRT8的多肽或其任何片段或衍生物的抗体。
具体地，所述PRT5、PRT6、PRT7或PRT8多肽分别由SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4表示。被本发明的抗体识别的片段的非限定性例子是用作产生所述抗体的抗原的肽。因此，在一种具体实施例中，所述抗PRT5抗体识别由SEQ ID NO.17表示的肽，所述抗PRT6抗体识别由SEQ ID NO.18表示的肽，所述抗PRT7抗体识别由SEQ ID NO.19表示的肽，以及所述抗PRT8抗体识别由SEQ ID NO.20表示的肽。
如在本文中定义的，本发明的抗体通常天然得到或天然产生。因此，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。可选择地，本发明的抗体可以是合成产生(如通过化学合成)，或通过从各自的抗体产生细胞或细胞系分离特定mRNA而重组产生。所述特定mRNA然后应当经过标准分子生物学操作(获得cDNA、将所述cDNA引入至表达载体中等)以产生重组产生的抗体。所述技术是本领域技术人员公知的。
如在下面实施例中是描述的，使用产生多克隆抗体领域的技术人员已知的标准技术在兔子中产生本发明的抗体。
产生抗蛋白的多克隆抗体是本领域技术人员公知的技术，并在CurrentProtocols in Immunology，John E.Coligan等(eds.)，Wiley和Sons Inc的第2章中有描述。
根据本发明，识别PRT5、PRT6、PRT7或PRT8抗原的任意一种的多克隆抗体指分别对应于PRT5、PRT6、PRT7或PRT8抗原的多克隆抗体的主要识别位点。通常，PRT5、PRT6、PRT7或PRT8或其片段用作用于免疫动物的免疫原以产生本发明描述的一种抗体，所述动物如兔子、豚鼠、山羊、小鼠、大鼠、绵羊、猴子。通过已知的方法从得到的抗PRT5、抗PRT6、抗PRT7或抗PRT8抗血清纯化抗体片段。所述得到的抗体用作多克隆抗体。关于多克隆抗体的特异性，分别识别PRT5、PRT6、PRT7或PRT8。所述多克隆抗体的主要识别位点保留在PRT5、PRT6、PRT7或PRT8蛋白的C-末端区。在C-末端区具有主要识别位点的多克隆抗体是识别例如分别由SEQ ID NO.17表示的肽、或由SEQ ID NO.18表示的肽、或由SEQ ID NO.19表示的肽或由SEQ ID NO.20表示的肽的抗体。
通常，从用免疫原免疫的动物血清纯化的免疫球蛋白制备多克隆抗体。来自不同批次的多克隆抗体同样可以混合在一起以避免来自不同动物的个体差异和抗血清中的批次差异。由于多克隆抗体是抗体的集合，多克隆抗体具有多个识别位点。
可以从免疫的动物(特别是大鼠或小鼠)的脾或***获取B细胞，然后在促进杂交细胞生长的条件下通过与永生化B细胞融合而制备单克隆抗体。产生单克隆抗体的技术在许多文献和教科书中有描述，如上面提到的CurrentProtocols in Immunology的第2章。如在那篇文章的第2章所述，可以以与蛋白免疫的动物的脾或***细胞相同的方式，将这些动物的脾或***细胞用于产生单克隆抗体。用于产生单克隆抗体的技术进一步由Kohler和Milstein[Kohler和Milstein(1975)Nature 256；495-497]，和在US 4,376,110中描述。
术语“抗体”同样意味着包括完整分子及其片段，如能够结合抗原的抗体的scFv、Fv、Fab’、Fab、双特异性抗体、线性抗体、F(ab’)2抗原结合片段[Wahl等(1983)J.Nucl.Med.24，316-325]。
根据本文公开的适用于完整抗体分子的方法，以及适用于本发明公开的抗体的其它应用，抗体的Fab和F(ab’)2和其它片段可用于检测生物样品中的蛋白，所述蛋白作为生产本发明抗体的抗原。这样的片段例如可以通过使用酶如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab’)2片段)经过蛋白裂解而产生。因此，根据计划的应用，用于本发明的抗体的Fab和F(ab’)2和其它片段可以用多种标签标记。这些标签可以是便于检测的可检测标签，或能够杀死肿瘤细胞的毒性标签，或可以诱导其它细胞或物质杀死肿瘤细胞的“诱导”标签。
如果抗体能够与分子(抗原)特异反应，且因此所述抗体与所述分子结合，则所述抗体被称为是“能够结合”或“识别”所述分子。术语“表位”意思是指能够被抗体结合，且同样能够由所述抗体或产生所述抗体的细胞识别的任何分子的部分。表位或“抗原决定簇”通常由分子如氨基酸或糖侧链的化学活性表面基团组成，并具有特异的三维结构特性以及特异的电荷特性。
“抗原”是能够被抗体识别和结合的分子或分子一部分。抗原可以有一个或多于一个的表位。上述的特异反应意思是表示所述抗原将以高度选择性和特异性的方式与它对应的抗体反应，而不与大量由其它抗原引起的其它抗体反应。
在本发明中，由SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20表示的多肽用作抗原以产生本发明的多克隆抗体，并因此被本发明的抗体识别。相似地，本文描述的全长蛋白同样可以作为每一种根据它自身的特异性(即，PRT5与抗PRT5、PRT6与抗PRT6、PRT7与抗PRT7、PRT8与抗PRT8)被本发明抗体识别并能够与本发明抗体结合的抗原。
本发明提供的抗体可以是任何同种型，IgG、IgM、IgE、IgA或IgD。
关于所述抗体，“生物学特性”或“生物学活性”通常指抗体特异识别表位并因此与表位结合的能力。所述表位可以是全长蛋白的一部分或者包含在所述蛋白的片段或多肽中。
在另一方面，本发明提供一种包含本发明描述的抗体作为活性成分的组合物。因此，包含的作为本发明组合物的活性试剂的所述抗体是识别并结合选自PRT5、PRT6、PRT7或PRT8的多肽或其任何片段、类似物或衍生物的抗体或其片段。
所述组合物可以用在诊断和/或治疗方法中。
所述抗体或包含其的组合物可以用于诊断影响PRT5、PRT6、PRT7或PRT8中任意一种的表达和/或功能的疾病或紊乱。可选地，所述抗体或包含其的组合物可以用于治疗影响PRT5、PRT6、PRT7或PRT8中任意一种的表达和/或功能的疾病或紊乱。
在另一种实施方式中，所述包含本发明描述的所述抗体的组合物可以用于癌症治疗。
在下面的实施例7中，本发明人已经令人惊奇地显示了在来自患有胰腺癌或肺癌的男性病患的样品中提高水平的循环的PRT7。PRT7因此可以用作检测癌症(其中，胰腺癌或肺癌是具体非限定的例子)的标记物。因此，抗PRT7特异抗体可以用作癌症的诊断工具。
因此，在一种具体的实施方式中，所述组合物包含识别多肽PRT7或其片段或衍生物的抗体。
在另一种实施方式中，包含本发明描述的抗体的组合物可以用于例如癌症预后。在经历癌症治疗的病患中存在预后的特别需要，其中具有治疗功效的指示物是必要的。因此，包含本发明描述的至少一种抗体的组合物应当能够通过检测或测定PRT5、PRT6、PRT7或PRT8蛋白中任意一种的水平而测定治疗的结果。
本发明同样提供产生抗体的细胞系，所述细胞系产生本发明的抗体。因此，本发明提供产生抗蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述蛋白选自PRT5、PRT6、PRT7和PRT8的蛋白。
在一种实施方式中，所述产生抗体的细胞是克隆分离的并永生的以产生产生抗体的细胞系，这同样是本发明的目的。可以根据本领域技术人员已知的方法和如Lanzavecchia等，2007[Lanzavecchia A，Corti D，Sallusto F.(2007)Humanmonoclonal antibodies by immortalization of B cells.Curr Opin Biotechnology；18(6)：523-8]描述的方法完成细胞永生化。
在另一方面，本发明提供本发明描述的抗体在制备诊断组合物中的应用，所述抗体识别选自PRT5、PRT6、PRT7和PRT8的蛋白。具体地，所述组合物用于诊断疾病或紊乱，所述疾病或紊乱选自具有免疫学因素或病因的疾病、传染病、急性和慢性炎性疾病、癌症、移植病和自体免疫性疾病、与生育相关的疾病和碳水化合物代谢紊乱。
如在本文所涉及的，自体免疫性疾病包括炎性肠道疾病(IBD)、克罗恩病、多发性硬化(MS)、自体免疫性葡萄膜炎、自体免疫性葡萄膜视网膜炎、自体免疫性甲状腺炎、桥本氏病、胰岛炎、干燥综合征、自然流产、实验性自体免疫性心肌炎、风湿性关节炎(RA)、狼疮(SLE)、牛皮癣和糖尿病，特别是I型糖尿病。自体免疫疾病的其它例子包括急性坏死性出血性脑炎、阿狄森氏病、血中丙球蛋白缺乏、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、斑秃、淀粉样变性病、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自体免疫性再生障碍性贫血、自体免疫性家族性自主神经异常、自体免疫性肝炎、自体免疫性高血脂、自体免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自体免疫性心肌炎、自体免疫血小板减少性紫癜(ATP)、轴突和神经元神经病、Bal氏病、Behnet氏病、大疱性类天疱疮、心肌症、巨大***增生症、口炎性腹泻(非热带性)、查加斯病、慢性疲劳综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、许尔-斯特劳斯综合征、瘢痕性类天疱疮/良性黏膜性类天疱疮、科干综合征、冷凝集素病、先天性心传导阻滞、萨科奇病毒性心肌炎、CREST病、原发性混合型冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、皮肌炎、德维克氏病、盘状红斑狼疮、Dressler综合征、子宫内膜异位、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、实验性过敏性脑脊髓炎、Evan综合征、纤维性肌痛、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、古德帕斯丘综合征、格雷夫氏病、格林巴利综合征、溶血性贫血、过敏性紫癜肾炎、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、免疫调节性脂蛋白、包涵体性肌炎、胰岛素依赖型糖尿病(1型)、间质性膀胱炎、青少年关节炎、青年糖尿病、川崎病、朗-伊二氏综合征、白细胞破裂性脉管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木样结膜炎、线性IgA病(LAD)、莱姆病、梅尼艾氏病、显微镜下多动脉炎、混合***病(MCTD)、蚕食性角膜溃疡、穆-哈二氏病、重症肌无力、肌炎、嗜睡症、嗜中性白血球减少症、眼瘢痕性类天疱疮、骨关节炎、复发性风湿病、副肿瘤性小脑变性、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、Parsonnage-特纳综合征、扁平部睫状体炎(外周葡萄膜炎)、天疱疮、外周神经病、静脉周围性脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性动脉周围炎、I型、II型和III型自体免疫性多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开后综合征、孕酮皮炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、单纯性红细胞再生障碍性贫血、雷诺现象、反射***感神经性营养不良、赖特综合征、复发性多软骨炎、多动腿综合征、风湿热、肉样瘤病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、***和睾丸自体免疫性、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、交感性眼炎、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、自体免疫性甲状腺病、Tolosa-Hunt综合征、横贯性脊髓炎和坏死性脊髓病、溃疡性结肠炎、未分化***病(UCTD)、脉管炎、水泡性皮肤病、白癜风和韦格纳肉芽肿。
在另一方面，本发明提供本发明描述的抗体在制备治疗组合物中的应用，所述抗体能够特异识别选自PRT5、PRT6、PRT7和PRT8的多肽或其片段或衍生物。
本发明提供的抗PRT5抗体、抗PRT6抗体、抗PRT7抗体和抗PRT8抗体或其片段可以用于定量或定性检测样品中用作产生本发明抗体的抗原的蛋白或它们的片段。这可以通过给出视觉可检测的信号的技术完成，它可以是荧光(免疫荧光)、酶反应的发色产物、沉淀产生、化学发光或生物发光中任意一种。使用与如下描述的光显微方法、流式细胞术或荧光检测法联合的荧光标记或颜色标记的抗体。可以用于检测所述抗体的其它技术和标记物包括但不限于胶体金、放射性标签、GFP(绿色荧光蛋白)等等，抗生物素蛋白/链霉亲和素-生物素、磁珠以及对实际结合敏感的物理***，如纳米技术***。
本发明提供的抗体及其片段可以用于组织学染色，如免疫组织化学、免疫荧光检测或免疫电子显微术，以及用于蛋白的原位检测。可以通过从个体获取组织学标本，并用所述标记的本发明抗体接触所述标本来完成原位检测。通过对生物学样品(所述标本)涂覆或覆盖所述标记的抗体(或片段)接触所述抗体(或片段)。通过使用这样的方法，不仅可以测定所述抗原的存在，也可以测定其在被测组织上的分布。使用本发明，本领域普通技术人员将容易地意识到可以修改任意多种组织学方法，如染色方法，以实现这样的原位检测。
可以标记和直接检测本发明抗体的一种方式是将其与酶连接并用于酶免疫测定(EIA)。当之后与合适的底物接触时，这种酶与所述底物反应以产生化学基团，所述化学基团可以通过例如分光光度计、荧光方式或视觉方式检测。可以用于可检测地标记所述抗体的酶包括但不限于：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱-酯酶。所述检测可以通过使用酶的发色底物的比色方法完成。所述检测也可以通过底物与相似制备的标准物的酶反应程度的视觉比较来完成(该方法适于可溶的有色产物和不可溶的有色产物，如在硝化纤维或塑料支撑物上)。
在本发明中，在合适的例子中，通过使用与所述配体或反应抗体反应的二抗或其它配体可以进一步帮助检测所述抗体与抗原的反应，所述二抗或其它配体与不同表位特异或非特异反应。
酶免疫测定，如免疫荧光测定(IFA)、光度测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、ELISPOT测定以及免疫印迹可以容易地适于完成具体抗体的检测。
同样可以使用的其它检测***包括基于使用源自金黄色葡萄球菌Cowan株I的蛋白A、来自C群链球菌(26RP66株)的蛋白G的那些，或者使用生物素-抗生物素蛋白结合反应的***。
本发明抗体可以在其中使用的免疫酶检测的其它方法是蛋白质印迹和点印迹。所述样品通过电泳分离并转移至硝化纤维膜或其它合适的支撑物上。然后将需要被检测的样品(如，培养物上清液，组织样品)与所述膜接触并通过已经描述的方法检测形成的免疫复合物的存在。在本方法的一种变化形式中，在膜上以线或斑点涂覆纯化的抗体并使之结合。随后将所述膜与被测样品在培养之前和之后接触，并使用本文描述的技术检测形成的免疫复合物。
同样可以通过凝集检测抗体-抗原复合物的存在。例如，根据本发明的抗体可以用于包覆形成均质悬浮液的乳胶微粒。当与样品，如含有所述抗体所识别的特异抗原的血清混合时，引起所述乳胶微粒凝集并从视觉上可以检测大凝集物的存在。
可用于通过免疫测定技术测定抗体的免疫学和免疫测定方法的综述，见Basic and Clinical Immunology[D.Stites等.(eds.)(1994)Basic and ClinicalImmunology，第8版]。
通过使用通过本领域已知方法标记有可检测基团的抗体或配体，可以促进检测抗体和抗原的反应。这样的可检测基团允许沉淀或颜色变化的视觉检测、通过显微镜方法的视觉检测、或通过光谱测定或辐射测量的自动检测等等。可检测的基团的例子包括荧光素和若丹明(用于荧光显微镜法)，辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶(用于光学显微镜法或电子显微镜法和生物化学检测以及用于通过颜色变化的生物化学检测)，和生物素-链霉亲和素(用于光学或电子显微镜法)。所述检测方法和使用的基团可以选自例如上表或通过应用于如此选择的标准的其它合适例子[Harlow和Lane(1988)抗体：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY]。
可以通过使用任意多种其它免疫测定完成检测。例如，通过放射性标记的抗体或抗体片段，通过使用放射性免疫测定(RIA)可能检测抗原。RIA的详细描述可以在Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，Work，T.S.等，North Holland Publishing Company，NY(1978)中发现，具体参考Chard，T的题目为“An Introduction to Radioimmune Assay and RelatedTechniques”章节，所述内容通过引用的方式并入本文中。通过使用γ/β计数器或闪烁计数器的方法或通过自动射线照相术可以检测放射性同位素。
同样可以用荧光化合物标记本发明的抗体。当所述荧光标记的抗体暴露于合适波长的光时，然后由于荧光可以检测它的存在。最常使用的荧光标记化合物是异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。
同样可以使用发出荧光金属如152E或其它稀土元素可检测地标记所述抗体。可以使用这样的金属螯合基团如二亚乙基三胺五乙酸(ETPA)将这些金属与所述抗体连接。
同样可以通过将抗体与化学发光化合物连接来可检测地标记所述抗体。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来检测所述化学发光标记的抗体的存在。具体有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
同样，生物发光化合物也可以用于标记本发明的抗体。生物发光是一类在生物***中发现的化学发光，其中催化蛋白增加了化学发光反应的功效。通过检测发光的存在测定生物发光蛋白的存在。用于标记目的的重要生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母蛋白。
本发明的抗体分子可以适于在免疫测定(也被认为是“双位点”或“夹心法”测定)中使用。在典型的免疫测定中，将一定量未标记的抗体(或抗体的片段)结合在固体支撑物或载体并加入一定量可检测标记的可溶抗体以使得检测和/或量化固相抗体、抗原和标记的抗体形成的三元复合物。
可以放射性标记本发明抗体以用于成像许多不同的癌症。放射性同位素如In111和Tc99用于标记抗体并通过成像技术使之可见。放免液闪法(RIS)是能够使得肿瘤体内成像的有用检测。这使用放射性标记的抗体和标准的γ-闪烁照相机完成。每一位病患接受一次全身检查。以全长的前部和后部全身探测实施全身检查。在每一种情况中，获取已知或疑似疾病的区域的选择性平面图(包括倾斜的和侧面视图)以增加损伤大小和位置的精确性。
本发明的抗体同样可以用在多元免疫测定中，以用于高通量筛选涉及人和鼠免疫***中的不同基本身体状况和疾病的化合物。多元免疫测定是本领域技术人员已知的并已经由Anderson和Davison描述[Anderson和Davison(1999)Am.J.Pathol.154：1017-1022]。
因此，如上所述，本发明可用于作为检测或指示个体中肿瘤或癌症的存在的筛选方法。当与本文所描述的可检测标记物直接连接时，通过将抗体或其片段注射入需要诊断的个体中并通过成像检测，所述抗体或其片段可用于体内检测抗原(或其片段)，并借助于成像技术使之可见，指示癌细胞的存在。
此外，本发明提供的抗体可以与细胞毒素药物联合，其本身或作为组合物的一部分用于癌症的治疗。
因此，如上所提及的，本发明提供的抗体适于作为毒性药物的递送***以杀死癌细胞或前癌细胞。
在另一方面，本发明提供一种在需要的个体中治疗疾病或紊乱的方法，所述方法包括对所述个体施用治疗有效剂量的抗体或包含其的组合物，所述抗体识别选自PRT5、PRT6、PRT7和PRT8的蛋白或其片段或其衍生物，所述疾病或紊乱选自：具有免疫学因素或病因的疾病、传染病、急性和慢性炎性疾病、癌症、移植病和自体免疫性疾病、与生育相关的疾病、碳水化合物代谢紊乱、糖尿病、代谢综合征、肥胖、内分泌疾病和肌肉疾病。
此外，本文提出的抗体可以用作药物的活性试剂，或可以用于毒性药物或治疗药物的递送***以达到需要被治疗的细胞。
细胞毒素药物的一个例子是抗增殖药物分子，其可以共价地与本发明的任意一种抗体(即抗PRT5抗体、抗PRT6抗体、抗PRT7抗体或抗PRT8抗体)直接连接或通过连接物与所述抗体连接，且其中所述抗体可选地由癌细胞中富含的或由癌细胞分泌的蛋白酶特异切割，因此通过蛋白酶的作用优选地在癌细胞内、附近或在癌细胞上释放抗增殖药物。
抗增殖药物的例子是：环磷酰胺、苯丁酸氮芥、马利兰、美法仑、噻替哌、异环磷酰胺、氮芥、甲氨蝶呤、5-氟脲嘧啶阿糖胞苷、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、阿霉素、道诺霉素、伊达比星、更生霉素、博莱霉素、丝裂霉素、普卡霉素、鬼臼毒素类、长春新碱、长春碱、vinclestin、依托泊苷、替尼泊苷、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲菌素、肾上腺类皮质激素、***、抗***、孕激素、芳香酶抑制剂、雄激素、抗雄激素、达卡巴嗪、六甲嘧胺、羟基脲、米托坦、丙卡巴肼、顺铂、卡铂、美法仑、甲氨蝶呤和苯丁酸氮芥。
可选地，所述抗PRT5抗体、抗PRT6抗体、抗PRT7抗体或抗PRT8抗体可以将特定物质如金属离子(铁或锌或其它)携带进肿瘤，并因此作为将毒性物质(如本文之前所述的放射性或细胞毒性化学物质，即，如蓖麻毒素或细胞毒素烷化剂或细胞毒素前药的毒素)递送至肿瘤的工具或载体。所述抗体和所述毒素或放射性同位素的连接可以是化学连接。直接连接的毒素的例子是阿霉素、苯丁酸氮芥、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素等。可以产生具有针对抗原和针对毒素的双特异性的杂交毒素。这样的二价分子可用于结合肿瘤或将细胞毒性药物递送至肿瘤或结合并活化细胞毒性淋巴细胞，如结合T3-Ti受体复合物。
本发明同样提供一种用于评估已经被诊断的癌症预后的方法。具体地，重要的是在治疗前、治疗中和治疗后持续进行。可选地，所述方法同样适用于癌症筛选，特别适用于当所述被测样品是血液样品的时候，所述血液样品是从病患取得的“患者最容易接受”类型的样品之一。
因此，在另一方面，本发明提供一种用于诊断个体的疾病或紊乱的方法，所述疾病或紊乱选自：具有免疫学因素或病因的疾病、传染病、急性和慢性炎性疾病、癌症、移植病和自体免疫性疾病、与生育相关的疾病、碳水化合物代谢紊乱、糖尿病、代谢综合征、肥胖、内分泌疾病和肌肉疾病，所述方法包括步骤：
a、提供来自所述个体的样品；
b、用本发明的抗体或包含其的组合物接触所述样品，所述抗体选自抗PRT5抗体、抗PRT6抗体、抗PRT7抗体和抗PRT8抗体；
c、通过检测方法检测所述至少一种抗体和它的特异抗原的复合物的形成；
从而检测到复合物表示所述个体患有癌症。
因此，在另一方面，本发明同样提供一种用于在样品中诊断癌症的方法，所述方法包括检测来自个体的样本中PRT7多肽或包含其的蛋白的存在；从而存在的PRT7的水平高于对照的样品指示癌症的存在。
在一种具体的实施方式中，所述癌症是肺癌或胰腺癌。
当本文涉及个体时，所述个体可以是哺乳动物、人或非人类。非人哺乳动物包括但不限于：母牛、马、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠等。通常，所述个体是人，特别是病患或健康个体。
在本发明的诊断方法的一种实施方式中，所述样品是血液样品。
在本发明的诊断方法的另一种实施方式中，所述样品是所述癌症的活组织切片。
因此，本发明同样提供一种监测癌症治疗功效的方法。监测治疗功效对于评估癌症治疗的预后是必要的。因此，本文描述的诊断方法可以在癌症治疗之前、之中或之后在个体中实现，且将从每一个时间点获得的结果(至少两个抗原-抗体复合物之间的关系模式)与同样复合物在正常人群中的模式进行比较分析。与正常人群的模式最接近的个体模式表示治疗成功。
本文涉及的癌症治疗表示根除疾病的任何治疗，包括放射疗法、化学疗法等。
如在本文中所使用的以描述本发明，“肿瘤”、“癌症”、“恶性增殖性疾病”和“恶性肿瘤”均相当地涉及组织或器官的增生。如果所述组织是淋巴或免疫***的一部分，恶性细胞可以包括循环细胞的非实体瘤。其它组织或器官的恶性肿瘤可以产生实体瘤。通常，非实体瘤和实体瘤例如是癌症、黑色素瘤、白血病和淋巴瘤。
癌症和肿瘤种类的非限定性例子包括：肾上腺皮质癌，膀胱癌，结肠癌，结肠直肠癌，直肠癌，神经外胚层和松果体癌，儿童脑干神经胶质瘤，儿童小脑星形细胞瘤，儿童脑星形细胞瘤，儿童成神经管细胞瘤，儿童视路神经胶质瘤，脑膜瘤，混合性神经胶质瘤，少突神经胶质瘤，星形细胞瘤，室鼓膜瘤，垂体腺瘤，听神经瘤，椎旁恶性畸胎瘤，乳腺癌，男性乳腺癌，乳腺瘤形成，卵巢癌，类癌瘤，***，子宫癌，子宫内膜癌，***癌，外阴癌，妊娠滋养细胞癌，输卵管癌，白血病如骨髓白血病、慢性骨髓性白血病、伴有化脓的急性骨髓性白血病、急性前髓细胞性白血病、伴有嗜碱性粒细胞增加的急性非淋巴细胞性白血病、急性淋巴性白血病，急性骨髓性白血病，急性单核细胞性白血病，伴有嗜酸性粒细胞增多的急性骨髓单核细胞性白血病，淋巴细胞性白血病如急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病，淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)，恶性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤，Burkitt淋巴瘤，骨髓及外骨髓增殖性疾病，良性脑膜瘤，唾液腺混合肿瘤，嘴唇和口腔、咽、喉、鼻旁窦内肿瘤，结肠腺瘤，导管癌，眼睑癌，眼球结膜癌，泪腺癌，肾细胞癌，移层腺癌，腺癌如小细胞肺癌、肾癌、子宫癌、***癌，鳞状上皮细胞癌，绒毛膜癌，成神经细胞瘤，成视网膜细胞瘤，肉瘤，横纹肌肉瘤，软组织肉瘤，卡波济肉瘤，尤文氏肉瘤，骨肉瘤，骨外黏液样软骨肉瘤，子宫肉瘤，眼眶肉瘤，脑瘤，脊髓瘤，血管***瘤，血管肉瘤，威尔姆斯瘤，范可尼贫血症，朗格罕细胞组织细胞增生症，恶性肾横纹肌样瘤，肝癌，内分泌癌，子宫内膜癌，食道癌，眼癌，胃癌，胃肠癌，泌尿生殖***癌症，神经胶质瘤，妇科癌症，头颈癌，肝细胞癌，下咽癌，胰岛细胞癌，肾癌，喉癌，肺癌，皮肤癌，非黑色素瘤皮肤癌，黑色素瘤，恶性黑色素瘤，结膜的恶性黑色素瘤，葡萄膜的恶性黑色素瘤，间皮瘤，多发性骨髓瘤，鼻咽癌，食道癌，胰腺癌，垂体癌，***癌，胃癌，睾丸癌，胸腺癌，甲状腺癌，移行细胞癌，滋养层癌，睾丸无性细胞瘤和卵巢无性细胞瘤。
如在本文中所定义的，“样品”指从个体、通常是哺乳动物个体获得的任何样品。生物学样品的例子包括体液和组织标本。所述样品的来源可以源自这样的生理学介质，如血液、血清、血浆、母乳、脓、脑脊髓液、拭样、组织刮屑、洗涤物、尿液、粪便、从体腔清洗获得的漂洗流体、痰、从身体区域(咽喉、***、耳、眼、皮肤、伤口组织如***等)取得的拭子。组织标本包括脾、***和任何包含淋巴细胞的组织的活组织切片。
本说明书和权利要求书中的术语“样品”在本文中使用它最宽的范围。
代表性地，初始而非流体的拭子和样品与液体介质接触，液体介质然后与检测试剂接触。
在本发明的一种具体实施方式中，在本发明方法中使用的所述样品是任何一种体液或源自培养物的样品。
源自培养物的样品可以是细胞提取物、介质样品或来自体液的培养物，如来自血液样品的培养物。
“全血”意思是从动物或人收集的血液。全血可以用肝素、EDTA、柠檬酸盐和其它防止凝固和凝结的任意物质收集。
可以用固相支撑物或载体如硝化纤维，或能够固定细胞、细胞微粒或可溶蛋白的其它固体支撑物或载体处理生物学样品。然后可以用合适的缓冲液清洗所述支撑物或载体，随后用如上所述的本发明的可检测标记的抗体处理。然后可以用缓冲液第二次清洗所述固相支撑物或载体以移除未结合抗体。然后通过常规方法检测所述固体支撑物或载体上的结合抗原或标记物的量。
“固相支撑物”、“固相载体”、“固体支撑物”、“固体载体”、“支撑物”或“载体”指能够结合抗原或抗体的任何支撑物或载体。公知的支撑物或载体包括：玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺和磁铁矿。出于本发明的目的，所述载体的性质可以是一定程度可溶或不可溶。所述支撑物材料实际上可能具有任何可能的结构构造，只要连接的分子能够结合抗原或抗体。因此，所述支撑物或载体构造可以是球形，如在珠子内；圆柱形，如在测试管的内表面，或在杆的外表面。在同一管内，对于不同抗原可以使用不同载体。可选地，所述表面可以是平的，如薄片、测试条等。特定支撑物或载体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员将知道用于结合抗体或抗原的许多其它合适载体，或将能够通过例行试验确定这些载体。
当对于具体环境是惯例的或必须的时，其它步骤如清洗、搅动、摇动、过滤等可以加入至所述测定中。
如在本文中所定义的，“培养基”指可以用于维持样品以实践本发明的任何培养基，包括但不限于：含有或不含有胎牛(牛)血清的RPMI 1640，优选地补充有合适的抗生素和谷氨酸盐，以及可选地补充有其它添加剂如抗真菌剂、非必需氨基酸、DTT、丙酮酸钠等。可以用于实践本发明的其它培养基包括但不限于：Eagles培养基、Dulbecco培养基、McCoy培养基、199培养基、Waymouth培养基和含有或不含有补充物的无血清培养基。在另一种实施方式中，所述刺激物是没有培养基。
本发明同样提供一种在需要的个体中治疗疾病或紊乱的方法，所述疾病或紊乱选自：具有免疫学因素或病因的疾病、传染病、急性和慢性炎性疾病、癌症、移植病和自体免疫性疾病、与生育相关的疾病以及碳水化合物代谢紊乱，所述方法包括对所述个体施用治疗有效剂量的本发明的多肽或抗体。具体地，当用于治疗时，所述多肽或抗体与细胞毒素药物连接，或作为用于将毒性物质递送至靶细胞或组织的载体。在本文中，靶细胞是与所述疾病或紊乱相关的细胞。
在下文的实施例中，本发明人已经显示了在一些类型的癌症中PRT7水平变高。具体地，本发明人证明了在患有胰腺癌或肺癌的男性病患中，PRT7显著变高。
因此，本发明提供一种诊断样品中癌症的方法，所述方法包括检测来自个体的样本中PRT7多肽或包含其的蛋白的存在，从而，PRT7水平比对照高的样品表示存在癌症。
在另一方面，本发明提供一种用于诊断疾病或紊乱和/或监测疾病或紊乱的治疗功效和/或评估疾病或紊乱的预后的诊断试剂盒，所述疾病或紊乱选自：具有免疫学因素或病因的疾病、传染病、急性和慢性炎性疾病、癌症、移植病和自体免疫性疾病、与生育相关的疾病以及碳水化合物代谢紊乱，所述试剂盒包括以下成分：
a、本文中描述的本发明抗体或包含其的组合物；
b、用于完成检测样品中抗原存在的说明书，其中所述抗原被所述抗体特异识别。
所述试剂盒进一步包括至少一种以下成分：
a、至少一种用于收集被测样品的工具；
b、至少一种用于检测所述抗原被所述抗体识别所必需的试剂；和
c、至少一种对照样品。
本发明提供的试剂盒的一个具体实施例是包含特异识别PRT7多肽、其片段或衍生物、或包含其的蛋白的抗体的试剂盒，所述试剂盒可以有效诊断癌症。
所述个体可以是哺乳动物、人或非人。通常，所述个体是人病患或健康个体。
在一种实施方式中，任何这样的试剂盒是抗体(或识别试剂)捕捉测定试剂盒，如ELISA试剂盒，其包括固体支撑物、至少一种如在本发明中定义的抗体，以及适当时可选地二抗。所述试剂盒可以进一步可选地包括任何其它必要的试剂，如如上所述的可检测的基团、酶底物和显色剂。所述抗体捕捉诊断试剂盒可选地是免疫印迹试剂盒，其通常包括上文所述的成分和试剂。本发明的诊断试剂盒包括的具体试剂和其它成分可以根据所述试剂盒中实践的具体诊断方法选自本领域可用的那些。这样的试剂盒可以用于检测生物学样品中的抗体，所述生物学样品如从个体获得的组织或体液，特别是全血、在培养前和/或培养后PBMC或白细胞。
当在本发明的诊断方法中提及合适方法时，所述合适方法可以是免疫亲和方法、酶测定或用于检测结构特征的方法等。
当所述合适方法是免疫亲和方法时，所述方法是酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀、FACS或任何其它使用本发明描述的抗体的免疫亲和方法中的任意一种。
在一种具体的实施方式中，通过捕捉ELISA实现检测。
捕捉ELISA(也被认为是“三明治”ELISA)是一种量化皮克至微克量物质(如激素、细胞信号转导化学物质、传染病抗原和细胞因子)的灵敏测定。当需要被分析的物质太稀而不能结合聚苯乙烯微孔板(如在细胞培养上清液中的蛋白)或不能与塑料(如小的有机分子)很好结合时，特别追求这类ELISA。根据经验确定对于捕捉抗体、样品、对照和检测抗体的最佳稀释以及孵育时间并需要广泛的滴定。理想地，实验者可以使用酶标记的检测抗体。但是，如果检测抗体是未标记的，所述二抗将不能与包覆抗体或样品交叉反应。应当包括合适的阴性和阳性对照物。
应当在碳酸盐-重碳酸盐缓冲液或PBS中稀释所使用的捕捉或包覆抗体。代表性地，以0.2～10μg/ml放置捕捉抗体。优选地，使用亲和纯化的抗体或最低程度使用IgG片段。通常，样品在PBS中稀释至10ng～10μg/孔的范围(越敏感的测定，需要越少量的样品)。
如在本文说明书中所使用的，术语“可检测的基团”表示任何原子、分子或其一部分，可以直接或间接地监测它们的存在、缺乏或水平。一个实施例包括放射性同位素。其它实施例包括(i)可以催化显色或光发射(发光)反应的酶和(ii)荧光团。假如可检测的基团本身是可检测的，例如，在荧光团的情况下，可以直接检测可检测的基团。可选地，可以间接检测可检测的基团。在后一种情况下，优先使用与可检测基团反应的其本身可以直接检测的第二种基团。所述可检测基团可以是抗体固有的。例如，抗体的恒定区可以作为间接可检测的基团，具有直接可检测的基团的二抗可以与其特异结合。
因此，二抗是在本发明方法中检测所述抗体的特别合适的方法。所述二抗可以是其本身与可检测的基团连接。本发明抗体可以被可检测标记的一种方式是通过将所述抗体与酶连接。当之后与合适的底物接触时，这种酶将与所述底物反应以产生化学基团，所述化学基团可以通过例如分光光度计、荧光方式或视觉方式检测。可以用于可检测地标记所述抗体的酶包括但不限于：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
所述检测可以通过比色方法实现，所述方法使用酶的发色底物。所述检测也可以通过底物的酶反应程度与相似制备的标准物的酶反应程度的视觉比较来完成。
所述一抗结合的固体支撑物可以是任何不溶于水、不悬浮于水的固体支撑物。合适的固体支撑物的例子包括：如聚苯乙烯的大珠子、滤纸、试管和微孔板。所述一抗可以通过共价结合或吸附的方式与固体支撑物结合。使用固体支撑物的优势是对于固相和液相的分离不需要离心步骤。
上述固体支撑物可以包括聚合物如聚苯乙烯、琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、玻璃珠和纤维素或其它聚合物的磁性微粒。所述固体支撑物可以是大的或小的珠子或微粒、管子、板的形式或其它形式。
作为固体支撑物，优选使用试管或微孔板，它们的内壁覆盖有一抗，如本发明人制备的抗PRT5抗体、抗PRT6抗体、抗PRT7抗体或抗PRT8抗体或其任何片段或衍生物。
本发明诊断方法中使用的“测量”包括估计、定量、计算或引申出在特定样品中存在的生物标记物的量。这可以通过测量终点指示完成，所述终点指示例如可以是可检测产物的出现、例如底物水平的任何可检测的变化或产物出现速率的变化或底物的消失；或者通过测量与本发明描述的生物标记物结合的抗体的量完成。
在所有所述检测试剂盒中，用于收集被测样品的工具可以是拭子、吸液管或相似的收集工具，且所述孵育方式可以是置于板、试管、玻璃或塑料表面、孔或吸水纸一条带上的液体或半固体培养基，或相似方式。
应当意识到，已经设计了任何版式的试剂盒以使得所述测试在扫描仪上进行并将结果实时输入至计算机中。这将保证可以将全部信息通过邮件直接发送至所有相关人员并且可以完整保存这些信息以用于未来参考。
在所述试剂盒的另一种实施方式中，所述样品是体液和源自培养物的样品的任一种。
与本发明抗体接触的样品可以安排在阵列中。
本发明的方法和试剂盒中使用的术语“阵列”表示识别试剂(即，至少一种本发明的抗体)的“编址”空间排列。所述阵列的每一个“地址”都是包含识别试剂的预定的特异空间区。例如，一个阵列可以是多个容器(试管)、板、每一个都包含了不同抗体的微板中的微孔。阵列也可以是在不同区域(点、线、列)中容纳不同和已知识别试剂(例如，抗体)的任何固体支撑物。所述阵列优选地包括内置的合适对照物，如不含有样品的区域，不含有抗体的区域，不含有二者的区域(即，仅含有溶剂和试剂的区域)和含有被所述抗体识别的合成或分离蛋白或肽的区域(阳性对照)。将在下文更详细地描述用于与本发明提供的试剂盒有关的本发明阵列的固体支撑物。
适用于本发明试剂盒的固体支撑物代表性地基本上不溶于液相。本发明的固体支撑物是但不限于特定类型的支撑物。更确切地，大量的支撑物可以使用且是本领域普通技术人员已知的。因此，有用的固体支撑物包括固体和半固体基质，如气凝胶和水凝胶、树脂、珠子、生物芯片(包括薄膜覆盖的生物芯片)、微流控芯片、硅芯片、多孔板(也称为微孔板或微板)、膜、过滤器、导电和不导电的金属、玻璃(包括显微镜载物片)和磁性支撑物。有用的固体支撑物的更具体例子包括硅胶、高分子膜、微粒、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化铝凝胶、多糖如琼脂糖凝胶、尼龙、乳胶珠、磁珠、顺磁性珠、超顺磁性珠、淀粉等。
应当进一步注意，本发明任何方法和试剂盒中包括的任何试剂应当以包埋、连结、连接、粘合放置或融合至任何上述固体支撑物材料的试剂提供。
应当注意，本发明的方法和试剂盒使用的任何抗体同样可以是多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体，如嵌合抗体或源自本发明抗体的单链抗体(ScFv)。
本发明由权利要求书限定，权利要求书的内容应当被认为是包括在说明书公开的内容中。
应当理解，本发明公开和描述的内容不限于本文公开的具体实施例、过程步骤和材料，因为这些过程步骤和材料可以稍微变化。同样应当理解，本文使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的而使用，并不意味着限制本发明，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求书和其等价形式限制。
必须应当注意的是，除非另有其它明确的表述，在本说明书和所附的权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。
除非内容有其它需要，在贯穿本说明书和随后的权利要求书中，词语“包含”和变化形式如“包括”、“含有”应当被理解为暗示包括指定的整体或步骤或整体或步骤的集合，但不是排除任何其它整体或步骤或整体或步骤的集合。
以下的实施例代表了本发明人在实现本发明方面中使用的技术。应当意识到，虽然这些技术例示了用于实现本发明的优选实施方式，本领域技术人员根据本发明公开的内容，将意识到可以做出多种修正而不背离本发明计划的范围。
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。
实施例
普通分子生物学方法
一些分子生物学方法并没有在本文中详细描述，因为它们是本领域技术人员公知的。这样的方法包括：PCR、cDNA的表达、人细胞转染等。描述这些方法的教科书如Sambrook等(1989)分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，ISBN：0879693096；F.M.Ausubel(1988)Current Protocols in Molecular Biology，ISBN：047150338X，John Wiley&Sons，Inc。此外，一些免疫学技术并没有在本文公开的每一个实施例中详细描述，例如蛋白质印迹，因为它们是本领域技术人员公知的。见，如Harlow和Lane(1988)抗体：实验室手册，冷泉港实验室。
ELISA常规方案
通过使用与容易测定的酶连接的抗体或抗原，酶联免疫吸附测定(ELISA)结合了抗体的特异性和简单酶测定的灵敏度。ELISA可以提供一种实用的测量抗原或抗体浓度的方法。ELISA是一种五步过程：1)用经过PBS稀释的抗原包被微孔板的孔，在4℃下孵育并清洗；2)用含有BSA/FCS的PBS封闭所有未结合的位点以防止假阳性结果，孵育1小时并清洗；3)向孔中加入抗体，孵育1小时并清洗；4)加入与酶连接的抗人IgG，孵育1小时并清洗；5)底物与酶的反应产生了有色产物，指示阳性反应。
FACS方案
1、收获、清洗细胞并用冰冷PBS、10％FCS、1％叠氮化钠将细胞悬浮液调整至1-5×106细胞/ml的浓度。
2、加入0.1-10μg/ml的初级标记的抗体。如果需要，用3％BSA/PBS稀释所述抗体。
3、在室温或4℃下孵育至少30分钟。
4、通过在400g下离心5分钟并用500μl-1ml的冰冷PBS、10％FCS、1％叠氮化钠重悬浮以清洗细胞三次。
5、用流式细胞仪分析所述细胞。
ELISA方案
1、校准曲线：在PBS(Biological Industries，目录号02-023-5A)中制备梯度稀释的蛋白，从2000pg/ml至31pg/ml。
2、将样品在37℃浴中快速解冻。
3、样品加样：将70μl的每一种血液样品(未稀释)一式两份和70μl的标准样品一式三份放置于Maxisorp96孔板(NUNC，F96 Maxisorp，目录号442404)中，并在4℃下摇动孵育过夜。
4、清洗：移除液体并使用多通道移液管用300μl的含有0.05％TW-20(Amresco，目录号0777-1L)的PBS清洗板4次。
5：封闭：用PBS稀释5％BSA(MP biomedicals，目录号160069)。向每个孔中加入300μl的封闭缓冲液。并在室温下摇动孵育1小时。
6、清洗：重复步骤4。
7、检测：用稀释液(含有0.05％TW-20、0.1％BSA的PBS)以1∶250比例稀释特异抗体(亲和纯化的)。向每个孔中加入100μl的检测抗体。在室温下摇动孵育2小时。
8、清洗：重复上述步骤4。
9、HRP偶联：用稀释液以1∶200比例稀释山羊抗兔HRP偶联抗体(Cellsignaling，目录号7074)。向每个孔中加入100μl的HRP偶联物。在室温下摇动孵育30分钟。
10、清洗：重复上述步骤4，但清洗5次而非4次。
11、显色：向每个孔中加入100μl的TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，辣根过氧化物酶底物，Millipore，目录号ES001-500ML)，等待显现出蓝色，然后加入50μl的2N H2SO4(Frutarom，目录号5552540)。
12、读板：用酶标仪在450nm处检测孔的吸光率。
多克隆抗体的制备
使用制备多克隆抗体的标准方法在兔子中制备多克隆抗体。
使用PRT5的C-末端片段(包含所述多肽的最后14个氨基酸)作为抗原，在兔子中生产抗PRT5多克隆抗体。该片段在本文中由SEQ ID NO.17表示。
使用PRT6的C-末端片段(包含所述多肽的最后14个氨基酸)作为抗原，在兔子中生产抗PRT6多克隆抗体。该片段在本文中由SEQ ID NO.18表示。
使用PRT7的C-末端片段(包含所述多肽的最后14个氨基酸)作为抗原，在兔子中生产抗PRT7多克隆抗体。该片段在本文中由SEQ ID NO.19表示。
使用PRT8的C-末端片段(包含所述多肽的最后14个氨基酸)作为抗原，在兔子中生产抗PRT8多克隆抗体。该片段在本文中由SEQ ID NO.20表示。
一些免疫学技术并没有在本文公开的每一个实施例中详细描述，因为它们是本领域技术人员公知的，并在如Harlow和Lane(1988)抗体：实验室手册，冷泉港实验室中详细描述。
逆转录酶PCR(RT-PCR)
在多种组织中进行RT-PCR分析以确定新分离蛋白的表达模式。使用的PCR条件是95℃进行2分钟，接着40个循环的：95℃进行45秒、59℃进行45秒以及72℃进行5分钟，最后以72℃进行5分钟结束。
序列
本文中所涉及的所有序列呈现在下面的表1中。
表1：本发明中提供的序列
实施例1：PRT5的表征
从人cDNA库中分离新cDNA，它的蛋白产物命名为PRT5。
下面的引物用于RT-PCR分析：
SEQ ID NO.9：gaagccaatggaaagatggtggtc
SEQ ID NO.10：ggtgaccgtgcatctgtgtttct
对PCR产物进行测序。用琼脂糖凝胶分析PCR产物并用Cyber Green(Invitrogene)染色，使用BioRad ChemiDoc分析仪评估所述PCR产物的强度。所述结果在下面的表2中列出，证明了在胰腺和睾丸中的高度表达，以及在脾、卵巢和小肠中的可鉴定的表达。
表2
cDNA库 信号 G3PDH (信号/G3PDH) 最小比例
胰腺* 8384 3898 2.150847 3.845123
脾 35476 20116 1.76 1.35
睾丸* 35710 15003 2.38 1.85
卵巢 24435 18072 1.288606 1
小肠 23247 15424 1.507 1.117
实施例2：PRT5施用对C57Bl小鼠的葡萄糖水平的作用
如上所显示的，PRT5在胰腺中的高表达表示PRT5可能涉及葡萄糖代谢。因此，该实验的目的是验证PRT5施用对葡萄糖水平和转变的作用。
步骤：
按下述方式对7周龄的雌性C57Bl小鼠(购自Harlan Laboratories Ltd.，耶路撒冷，以色列)进行注射：
-盐水-3只小鼠×4；
-1μg PRT5/鼠-3只小鼠×4；
-5μg PRT5/鼠-3只小鼠×4。
将所述小鼠分为4组。第一组饥饿并在注射后一天；第二组-注射后两天；第三组-注射后三天；第四组-注射后四天检查血糖水平(Accu-ChekPerforma装置，罗氏诊断产品有限公司)。饥饿进行过夜(注射葡萄糖之前的晚上)，然后在第二天对每只小鼠注射2mg/kg的葡萄糖。用在t＝0、30、90、120、150和240分钟时检测的葡萄糖水平进行葡萄糖水平的时间进程分析。PRT5施用和葡萄糖测量的方案在下面的表3中列出。
表3：用于PRT5施用和葡萄糖测量的方案的总结
所述结果在图1A-1D中表示。在所有的小鼠中，葡萄糖水平在注射后第一个30分钟达到高峰。但是，在施用PRT5后两天开始观察到令人惊讶的结果，其中施用1μg/kg或5μg/kg的小鼠的葡萄糖水平明显低于施用盐水的小鼠的葡萄糖水平。该结果自身重复直到测量葡萄糖水平的最后一天、所述实验的第5天、注射PRT5后4天。
本发明人同样已经观察到PRT5能够增加用PRT5处理的小鼠的骨骼肌中胰岛素受体的水平(数据未显示)。
实施例3：健康人和II型糖尿病人的血液中PRT5水平
该实验的目的是比较健康个体和II型糖尿病个体中的PRT5的水平。
样品：
从Bioreclamation，Inc获得来自年龄在50-80岁的男性和女性的20份人血清样品，具体如下：
-10份样品来自健康个体(5位男性/5位女性)；
-10份样品来自II型糖尿病病患(6位男性/4位女性)
样品在-80℃保存。样品的详细信息显示在下面的表4a和表4b中。所有的样品均来自高加索人种个体。
表4a：用于检测PRT5水平的样品的详细信息(健康)
瓶# 性别 年龄
1 男性 60
2 男性 60
3 男性 61
4 男性 60
5 男性 61
6 女性 62
7 女性 60
8 女性 61
9 女性 63
10 女性 65
表4b：用于检测PRT5水平的样品的详细信息(II型糖尿病)
使用抗PRT5抗体，通过ELISA检测PRT5水平。ELISA步骤在上文中描述。血样不稀释，而抗PRT5抗体用稀释液(含有0.05％吐温20、0.1％BSA的PBS)以1∶250稀释。对于校准曲线，用PBS制备梯度稀释的PRT5，从4000pg/ml至62.5pg/ml。
所述结果在图2A-2B中显示。如特别在图2B中所显示的，在II型糖尿病样品中PRT5的水平明显减少。
这里显示的结果以及在上面实施例2中描述的结果一起强烈地表示了PRT5与葡萄糖代谢、特别是它的调节密切相关。最重要地，两个系列的结果均支持了PRT5作为治疗糖尿病的治疗剂的应用。
实施例4：PRT6的表征
从人cDNA库中分离出第二种新的cDNA，它的蛋白产物命名为PRT6。
下述引物用于RT-PCR分析：
SEQ.ID.NO.11：ggcttggttgttgtagtcaatgtgg
SEQ.ID.NO.12：attcctcagggccaaggcaatagt
如在上述的实施例1中所描述的，使用RT-PCR进行组织表达分析，观察到的结果总结在下面的表5中。基本上，发现PRT6专有地在睾丸中表达。
表5：PRT6的表达
cDNA库 信号 G3PDH (信号/G3PDH) 最小比例
睾丸* 5710 19003 0.300479 1.430852
实施例5：PRT6施用对雄性Balb/C睾酮水平的作用
如在表5中所示的PRT6在睾丸中的高表达表示PRT6可能涉及睾酮表达。因此，本发明的目的是确定PRT6施用对睾酮水平的作用。
步骤：
使用两组Balb/C小鼠：
■3-4周龄的雄性Balb/C-用于睾酮的阴性对照-18只小鼠
■7-8周龄的雄性Balb/C小鼠-18只小鼠
每一组分成3个亚组(每个亚组6只)。每一组每天注射200μl的一种以下物质，进行4天周期：
■含有4％DMSO的双蒸水(DDW)
■0.5μg/kg的PRT6(用DDW稀释)
■5μg/kg的PRT6(用DDW稀释)
4天后，从小鼠中提取血清并检测睾酮的水平。使用R&D***的睾酮免疫测定(R&D***，目录号KGE010)测量睾酮。该测定基于竞争结合技术。特异于睾酮的单克隆抗体与包覆在微板上的山羊抗小鼠抗体结合。清洗以移除过量的单克隆抗体后，样品中存在的睾酮与固定量的辣根过氧化物酶(HRP)标记的睾酮竞争单克隆抗体上的位点。然后再次清洗以移除过量的结合和未结合的样品。向孔中加入底物溶液以确定结合的酶活性。终止显色并读取450nm处的吸光率。颜色强度与样品中的睾酮的浓度成反比。
所述结果显示在图3A-3B中。有趣的是，用PRT6处理的小鼠表现出睾酮水平明显升高。尽管两种处理都导致睾酮水平升高，施用5μg/kg的作用比施用0.5μg/kg以下的作用更显著。
实施例6：PRT7的表征
从cDNA库中分离出第三种新的cDNA，它的蛋白产物命名为PRT7。
下述引物用于RT-PCR分析：
SEQ.ID.NO.13：ttgttcctccttccttagctgctg
SEQ.ID.NO.14：tccagtacagacaatgatgagtcggg
如上述实施例1，使用RT-PCR进行组织表达分析，得到的结果总结在下面的表6中。主要地，发现PRT7在胎儿脑、以及骨骼肌和肝脏中显著表达。
表6：PRT7的表达
cDNA库 信号 G3PDH (信号/G3PDH) 最小比例
脑 3340 5971 0.55937 1.00000
肝脏 7809 6002 1.3 2.32
骨骼肌 10849 6273 1.72 3.074
胎儿脑 8272 4069 2.032932 3.62
实施例7：健康个体的人血和胰腺癌或肺癌病患的人血中PRT7水平
本实验的目的是确定健康个体的血液和胰腺癌或肺癌病患血液中PRT7的水平。
样品：
-胰腺癌(I)：
从Bioreclamation，Inc.获得19份人血清样品，具体如下：
■健康个体：5位男性/4位女性
■胰腺癌：5位男性/5位女性
-胰腺癌(II)：
从Bioreclamation，Inc.获得10份男性人血清样品，具体如下：
■5位健康个体
■5位胰腺癌病患
-肺癌：
从Bioreclamation，Inc.获得20份来自男性和女性的人(男性和女性)血清样品：
■10位健康的(5位男性/5位女性)
■10位肺癌(5位男性/5位女性)
样品在-80℃下保存。样品的详细信息显示在下面的表7a-7b、8a-8b和9a-9b中。所有的样品来自于高加索人种个体。
表7a：胰腺癌(I)样品的详细信息(健康个体-用作对照)
瓶# 性别 年龄
1 男性 60
2 男性 60
3 男性 61
4 男性 60
5 男性 61
6 女性 62
7 女性 60
8 女性 61
9 女性 63
10 女性 65
表7b：胰腺癌(I)样品的详细信息(病患-男性+女性)
瓶# 性别 年龄 药物 阶段
C1 男性 69 健择RT 2
C2 男性 71 健择 4
C3 男性 69 无 2
C4 女性 64 健择 2
C5 女性 64 健择 2
C6 女性 63 健择 3
C7 女性 80 健择 4
C8 女性 75 健择 3
C9 男性 71 希罗达、健择 3
C10 男性 80 无 4
表8a：胰腺癌(II)样品的详细信息(全部男性)(健康个体-用作对照)
瓶# 年龄
1 62
2 63
3 48
4 47
5 54
表8b：胰腺癌(II)样品的详细信息(病患-全部男性)
瓶# 年龄 药物 阶段
C1 46 健择、紫杉醇 4
C2 69 健择 2
C3 57 无 2
C4 61 健择 2
C5 58 健择 2
表9a：肺癌样品的详细信息(健康个体-用作对照)
瓶# 性别 年龄
1 男性 60
2 男性 60
3 男性 61
4 男性 60
5 男性 61
6 女性 62
7 女性 60
8 女性 61
9 女性 63
10 女性 65
表9b：肺癌样品的详细信息(病患，男性+女性)
使用抗PRT7抗体通过ELISA检测PRT7水平。ELISA步骤如上所述。用PBS以1∶3稀释血液样品，并用稀释液(含有0.05％吐温20、0.1％BSA的PBS)以1∶200稀释抗PRT7抗体。对于校准曲线，用PBS制备梯度稀释的PRT7，从4000pg/ml至62.5pg/ml。
所述结果显示在图4A-4F中。令人惊奇地，男性胰腺癌病患的样品中的PRT7水平明显更高(图4B-4D)，但是来自女性的样品中PRT7水平不高(图4A-4B)。相似地，PRT7同样在男性肺癌病患的样品中显著提高，但是在来自女性的样品中不高(图4E-4F)。
这些结果显示PRT7可以是男性胰腺癌和肺癌的标记物，并因此可以用作诊断男性胰腺癌和肺癌的诊断工具。
更令人惊奇地，本发明人已经观察到，PRT7可以诱导p53的表达(数据未显示)。
实施例8：PRT8的表征
从人cDNA库中分离出第四种新的cDNA，它的蛋白产物命名为PRT8。
以下引物用于RT-PCR分析：
SEQ.ID.NO.15：ttcttgaagctttggcctcagtgc
SEQ.ID.NO.16：gtctctggcttgagtgaccaagta
如上述实施例1，使用RT-PCR进行组织表达分析，获得的结果总结在下面的表10中。主要地，发现PRT8在睾丸、肝脏和胰腺中表达。
表10：PRT8的表达
cDNA库 信号 G3PDH (信号/G3PDH) 最小比例
睾丸* 7710 16003 0.48 0.48
肝脏 4809 6702 0.71 1.0
胰腺* 3384 3998 0.84 1.18
实施例9：PRT8施用对C57Bl小鼠的葡萄糖水平的作用
PRT8在胰腺中的表达表示PRT8可能涉及胰腺功能，具体地，涉及葡萄糖代谢。因此，检测PRT8施用对葡萄糖水平的作用。
步骤：
7周龄雌性C57Bl小鼠(购自Harlan Laboratories Ltd.，耶路撒冷，以色列)用以下物质注射：
-盐水-3只小鼠×2组
-1μg PRT8/鼠-3只小鼠×2组
-10μg PRT8/鼠-3只小鼠×2组
所有的小鼠均在第一天注射PRT8(或盐水)。第一组小鼠在第二天饥饿并在第三天检测血糖水平(使用Accu-ChekPerforma装置，罗氏诊断产品有限公司)。第二组饥饿并在注射后三天检测血糖水平。过夜饥饿(注射葡萄糖前的夜晚)，并在第二天对每只小鼠注射2mg/kg的葡萄糖。用在注射葡萄糖后在t＝0，30、60和120分钟检测的葡萄糖水平进行葡萄糖水平的时间进程分析。
所述结果呈现在图5A-5B中。在所有的处理中，在注射后的第一个30分钟，葡萄糖水平达到峰值。但是，在PRT8施用后2天开始观察到令人惊奇的结果，其中，施用1μg/kg或10μg/kg的PRT8的小鼠的葡萄糖水平明显低于施用盐水的小鼠的葡萄糖水平。当注射PRT8后三天分析葡萄糖水平时，这个作用更加明显。这些结果强烈地表示PRT8与葡萄糖代谢密切相关，并可以用于它的调节。

Claims (14)

1.一种分离多肽，所述分离多肽由SEQ ID NO.4表示的氨基酸序列组成。
2.一种分离核酸分子，编码根据权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求2所述的分离核酸分子，其序列是由SEQ ID NO.8表示的核酸序列。
4.一种表达载体，包含根据权利要求2或3所述的分离核酸分子。
5.一种包含根据权利要求4所述的表达载体的宿主细胞。
6.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述分离多肽以及至少一种制药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
7.一种根据权利要求6所述的药物组合物，用于治疗葡萄糖代谢疾病。
8.一种根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述葡萄糖代谢疾病选自由糖尿病、代谢综合征和肥胖组成的组中。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述葡萄糖代谢疾病为糖尿病。
10.根据权利要求1所述的分离多肽在制备治疗葡萄糖代谢疾病的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其中所述葡萄糖代谢疾病选自由糖尿病、代谢综合征和肥胖组成的组中。
12.根据权利要求10所述的应用，其中所述葡萄糖代谢疾病为糖尿病。
13.一种抗由SEQ ID NO.4表示的氨基酸序列组成的多肽的多克隆抗体，其中所述抗体通过用由SEQ ID NO.20表示的氨基酸序列组成的多肽免疫动物而产生。
14.一种药物组合物，其包含根据权利要求13所述的抗体以及至少一种制药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
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