TWI708789B - 精胺琥珀酸合成酶之抗體及相關方法 - Google Patents
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Abstract
本案提供特異地結合至精胺琥珀酸合成酶之抗體及其抗原結合片段,以及其相關組成物、套組及使用方法,例如作為鑑定適於精胺酸剝奪或耗盡療法之適合的受試者的伴隨式診斷,該等精胺酸剝奪或耗盡療法諸如ADI-PEG 20及其他基於精胺酸脫亞胺酶(ADI)多肽之療法。
Description
本申請案根據35 U.S.C.§119(e)主張2014年7月8日申請的美國申請案第62/022,066號之優先權,該申請案係以全文引用方式併入。
與本申請案相關聯的序列表以電文格式替代紙質複本來提供,且據此以引用方式併入本說明書中。含有序列表之電文檔案之名稱為TDWG_005_01TW_ST25.txt。電文檔案為約25KB,其創建於2015年7月6日,且以電子方式經由EFS-Web提交。
本發明之實施例包括特異地結合至精胺琥珀酸合成酶之抗體及其抗原結合片段,以及其相關組成物、套組及使用方法,例如作為鑑定適於精胺酸剝奪或耗盡療法之受試者的伴隨式診斷,該等精胺酸剝奪或耗盡療法諸如ADI-PEG 20及其他基於精胺酸耗盡之療法。
精胺酸為人類之半必需胺基酸。對精胺酸為營養缺陷型之細胞需要自其週遭環境進行精胺酸攝取。精胺酸營養缺陷物(auxotrope)趨向於為營養缺陷的,因為其缺乏經由尿素循環自代謝前驅物產生其自身精胺酸之能力。
一些腫瘤展現就胺基酸、尤其就胺基酸L-精胺酸而言的營養缺陷行為,因為該等腫瘤缺少精胺琥珀酸合成酶(ASS),即負責將L-瓜胺酸轉化成L-精胺琥珀酸之酶。因而,此等腫瘤類型需要L-精胺酸之細胞外來源以合成蛋白質。
正在開發基於精胺酸剝奪或耗盡之療法以利用此營養缺陷
行為。例如,精胺酸脫亞胺酶(ADI)療法,例如ADI-PEG 20可減少L-精胺酸之生理含量,且使腫瘤缺失必需胺基酸,從而導致腫瘤死亡(參見,例如,Ott等人,Invest New Drugs.31:425-34,2013)。其他實例包括L-天門冬醯胺酶用於降低諸如急性淋巴母細胞性白血病之疾病之治療中天冬醯胺酸之循環含量的用途。亦描述了精胺酸降級酶之用途,此已證明在治療黑素瘤、肝瘤及一些肉瘤中之有效性。(參見,例如,Sugimura等人,Melanoma Res.2:191-6,1992;Takaku等人,Jpn.J.Cancer Res.86:840-6,1995)。
然而,精胺酸剝奪可能並非在所有患者中為有效的。為此,已開發用於鑑定最適合於精胺酸剝奪或耗盡療法之患者的方法,包括使用精胺琥珀酸合成酶表現作為診斷標誌物(參見,例如,WO 2002/063048;及WO 2013/151568)。因此,此項技術中需要改良試劑,該等改良試劑能夠偵測受試者或相關組織樣本中之精胺琥珀酸合成酶表現,且進而鑑定適於精胺酸剝奪或耗盡療法之患者。
本發明之實施例包括經分離之抗體或其抗原結合片段,其特異地結合至人類精胺琥珀酸合成酶多肽且(a)包含:重鏈可變區(VH)序列,該序列包含分別於SEQ ID NO:7、8及9中所列明的互補決定區VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3序列;以及輕鏈可變區(VL)序列,該序列包含分別於SEQ ID NO:10、11及12中列明的互補決定區VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3序列;或(b)競爭地抑制(a)與人類精胺琥珀酸合成酶多肽之結合。
在某些實施例中,VH序列與SEQ ID NO:1至少90%一致。在某些實施例中,VL序列與SEQ ID NO:3至少90%一致。在某些實施例中,VH序列包含SEQ ID NO:1且VL序列包含SEQ ID NO:3。
在某些實施例中,該經分離之抗體或其抗原結合片段競爭地抑制(a)與人類精胺琥珀酸合成酶多肽之結合,其中(a)為包含SEQ ID NO:1中列明的VH序列及SEQ ID NO:3中列明的VL序列之小鼠單株抗體。
在某些實施例中,該經分離之抗體或其抗原結合片段競爭地抑制(a)與人類精胺琥珀酸合成酶多肽之結合,其中(a)為亞型IgG1或IgG2A之小鼠單株抗體。
在某些實施例中,抗體為完整抗體。在某些實施例中,抗體為單株抗體。在某些實施例中,抗體係選自單鏈抗體、Fab或Fab’片段、F(ab’)2片段、ScFv、缺乏鉸鏈區之單價抗體及微型抗體。在某些實施例中,抗體包含小鼠或人類IgG Fc域、視情況IgG1或IgG2A Fc域。在某些實施例中,抗體為亞型IgG1或IgG2A之小鼠單株抗體。
在某些實施例中,經分離之抗體或其抗原結合片段包含共價連接的可偵測實體。在某些實施例中,可偵測實體為螢光團/螢光染料、基於碘之標籤、放射性同位素或奈米粒子。
亦包括組成物,該等組成物包含本文所述的抗體或其抗原結合片段及適合的載劑。
某些實施例係關於測定生物樣本中人類精胺琥珀酸合成酶多肽之量的方法,該等方法包含:(a)獲得或接收生物樣本,該生物樣本視情況來自受試者;(b)使生物樣本與本文所述的抗體或其抗原結合片段接觸;以及(c)量測樣本中抗體或其抗原結合片段之量,其中抗體或其抗原結合片段之量決定樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量。
亦包括鑑定生物樣本中精胺琥珀酸合成酶之缺少的方法,該等方法包含:(a)獲得或接收生物樣本,該生物樣本視情況來自受試者;(b)使生物樣本與本文所述的抗體或其抗原結合片段接觸;(b)量測樣本中抗體或其抗原結合片段之量,其中抗體或其抗原結合片段之量決定樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量;以及(c)若生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量相對於對照物減少,則鑑定為樣本中精胺琥珀酸合成酶之缺少。
一些實施例包括鑑定適於精胺酸剝奪療法之受試者的方法,該等方法包含:(a)獲得或接收來自受試者之生物樣本,該生物樣本視情況經由保健提供方獲得或接收;(b)使生物樣本與本文所述的抗體或其抗原結合片段接觸;(c)量測樣本中抗體或其抗原結合片段之量,其中抗體或其抗原結合片段之量決定樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量;以及(d)若生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量相對於對照物減少,則將受試者鑑定為適用於精胺酸剝奪療法。
在某些實施例中,步驟(a)包含自保健提供方接收生物樣
本,且步驟(d)包含向相同或不同保健提供方提供關於生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量的資訊。
某些實施例包含步驟(e):向(d)之受試者投與至少一種精胺酸耗盡劑。
在某些實施例中,精胺酸耗盡劑係選自精胺酸脫亞胺酶(ADI)多肽、精胺酸酶多肽、精胺酸脫羧酶多肽及精胺酸激酶多肽。在特定實施例中,ADI多肽為ADI-PEG 20。
在特定實施例中,步驟(b)包含執行免疫組織化學(IHC)測定。
亦包括用於診斷並治療受試者之方法,該等方法包含:(a)分析試驗之結果,該試驗指示來自受試者之生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量,其中試驗係使用本文所述的抗體或其抗原結合片段來執行;(b)若來自(a)之結果指示生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量相對於對照物減少,則將患者診斷為適用於精胺酸剝奪療法;以及(c)藉由投與至少一種精胺酸耗盡劑來治療(b)之受試者。
一些實施例包括用於治療受試者之方法,該等方法包含:(a)請求測定來自受試者之生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量的試驗,其中試驗係使用本文所述的抗體或其抗原結合片段來執行;以及(b)若來自(a)之試驗指示生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量相對於對照物減少,則向受試者投與至少一種精胺酸耗盡劑。
在某些實施例中,受試者為人類患者。在某些實施例中,受試者患有或疑似患有癌症。在某些實施例中,癌症係選自黑素瘤、視情況為肝細胞癌瘤之肝腫瘤、胰腺癌、***癌、間皮瘤、肉瘤、頭頸癌、白血病、急性骨髓白血病、復發性急性骨髓白血病、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌、神經膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食管癌、腦癌、子宮頸癌、睪九癌及胃癌。
在某些實施例中,生物樣本為生檢物樣本。在某些實施例中,生檢物樣本為癌症或懷疑癌症生檢物樣本。在某些實施例中,生檢物
樣本係選自皮膚組織、肝組織、胰腺組織、***組織、間皮組織、上皮組織、卵巢組織、結腸直腸組織、胃組織、腦組織、肺組織、腎組織、膀胱組織、子宮組織、食道組織、子宮頸組織、睪丸組織、***組織及間葉組織,諸如骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織、血液或造血細胞/組織。
在某些實施例中,對照物為參考標準、來自健康受試者之生物樣本或來自同一受試者之健康生物樣本。在某些實施例中,對照物為來自同一受試者之非癌性生物樣本,視情況具有相同組織類型。
在某些實施例中,生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量相對於對照物減少統計顯著量。
在某些實施例中,生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量相對於對照物減少約或至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在某些實施例中,生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量不可偵測或實質上不可偵測。
在某些實施例中,精胺酸耗盡劑係選自精胺酸脫亞胺酶(ADI)多肽、精胺酸酶多肽、精胺酸脫羧酶多肽及精胺酸激酶多肽。在某些實施例中,ADI多肽為ADI-PEG 20。
一些實施例包括用於診斷並治療人類患者之癌症的方法,該等方法包含:(a)分析試驗之結果,該試驗指示來自受試者之腫瘤生檢物中精胺琥珀酸合成酶多肽之量,其中試驗係使用本文所述的抗體或其抗原結合片段來執行;(b)若來自(a)之結果指示腫瘤生檢物中精胺琥珀酸合成酶多肽之量相對於對照物減少,則將患者診斷為適用於ADI-PEG 20療法;以及(c)藉由投與ADI-PEG 20來治療(b)之受試者。
亦包括用於治療受試者之癌症的方法,該等方法包含:(a)請求測定來自受試者之腫瘤生檢物中精胺琥珀酸合成酶多肽之量的試驗,其中試驗係使用本文所述的抗體或其抗原結合片段來執行;(b)若來自(a)之試驗指示生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量相對於對照物減少,則向受試者投與ADI-PEG 20。
在某些實施例中,癌症係選自黑素瘤及肝細胞癌瘤。
在特定實施例中,步驟(a)包含分析來自免疫組織化學(IHC)測定之載片、影像或其他結果。
一些實施例包括一或多種套組,該等套組包含本文所述的經分離之抗體或其抗原結合片段或組成物。某些套組包括用於根據本文所述的方法使用抗體之說明書。一些套組進一步包含用於例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)之材料,在該測定中將抗體連接至固體底質以用於執行ELISA。某些套組包含用於免疫組織化學(IHC)測定之材料。
一些套組包括用於使用抗體來鑑定適於精胺酸剝奪療法之受試者的說明書。在某些實施例中,精胺酸剝奪療法為精胺酸耗盡劑,視情況為ADI-PEG 20。某些套組進一步包含至少一種精胺酸耗盡劑。在某些實施例中,精胺酸耗盡劑係選自精胺酸脫亞胺酶(ADI)多肽、精胺酸酶多肽、精胺酸脫羧酶多肽及精胺酸激酶多肽。在某些實施例中,ADI多肽為ADI-PEG 20。
圖1展示用於測定針對蛋白質精胺琥珀酸合成酶的融合瘤抗體純系之免疫球蛋白亞型的ELISA分析之結果。
圖2A展示來自針對蛋白質精胺琥珀酸合成酶的融合瘤抗體純系之以下六個產出次純系之VH序列的胺基酸比對:6-H6(SEQ ID NO:13)、6-C5(SEQ ID NO:14)、6-C1(SEQ ID NO:15)、6-L7(SEQ ID NO:16)、6-A5(SEQ ID NO:17)及6-D6(SEQ ID NO:18)。圖2B展示來自以下五個產出次純系之VL序列的胺基酸比對:4-5(SEQ ID NO:19)、7-2(SEQ ID NO:20)、7-8(SEQ ID NO:21)、7-12(SEQ ID NO:22)及7-4(SEQ ID NO:23)。
圖3展示:次選殖VH及VL序列以相當於原始融合瘤之含量結合至精胺琥珀酸合成酶抗原。
圖4展示藉由利用抗精胺琥珀酸合成酶單株抗體之免疫組織化學染色(免疫組織化學;IHC)在人類癌細胞系A431(圖4A)及SKMEL-3(圖4B)中偵測精胺琥珀酸合成酶表現。
圖5展示藉由利用抗精胺琥珀酸合成酶單株抗體之免疫組
織化學染色在正常人類組織(圖5A,腎;圖5B,皮膚;圖5C,肝)中偵測精胺琥珀酸合成酶表現。
圖6展示藉由利用抗精胺琥珀酸合成酶單株抗體之免疫組織化學染色在人類肝細胞癌瘤(HCC)中偵測精胺琥珀酸合成酶表現。圖6A展示精胺琥珀酸合成酶表現之強陽性染色,且圖6B-6C展示精胺琥珀酸合成酶表現之陰性染色。
除非另外定義,否則本文所使用的所有技術及科技術語皆具有與本發明所屬領域之一般技藝人士通常所理解相同之含義。儘管與本文所述的彼等方法及材料類似或等效的任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試,但描述的為較佳方法及材料。出於本發明之目的,以下定義下列術語。本文中所列的所有專利及非專利文獻參考皆以全文引用方式併入。
冠詞「一(個/種)」在本文中用於指代一個(種)或一個(種)以上(亦即,至少一個(種))的該冠詞之語法客體。舉例而言,「一要素」意指一個要素或一個以上的要素。
「約」意指數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度變化多達參考數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度之30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。
如本文所使用,術語「胺基酸」意欲指天然存在胺基酸及非天然存在胺基酸以及胺基酸類似物及模擬物。天然存在胺基酸包括在蛋白質生物合成期間利用的20種(L)-胺基酸以及其他胺基酸,諸如,例如4-羥基脯胺酸、羥基離胺酸、鎖鏈素、異鎖鏈素、高半胱胺酸、瓜胺酸及鳥胺酸。非天然存在胺基酸包括例如(D)-胺基酸、正白胺酸、正纈胺酸、對氟苯基丙胺酸、乙硫胺酸及類似物,其為熟習此項技術者所知。胺基酸類似物包括天然存在胺基酸及非天然存在胺基酸之經修飾形式。此等修飾可包括例如胺基酸上化學基團及部分之取代置換,或胺基酸之衍生作用。胺基酸模擬物包括例如有機結構,該等有機結構在功能上展現類似性質,諸如參考胺基酸之電荷及電荷間距特性。例如,模擬精胺酸(Arg或R)之有機結構
將具有正電荷部分,該正電荷部分位於類似分子空間中且具有與天然存在Arg胺基酸之側鏈之ε-胺基相同的移動性程度。模擬物亦包括限制結構以便維持胺基酸或胺基酸官能基之最佳間距及電荷相互作用。熟習此項技術者知曉或可判定何種結構構成功能上等效的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。
在本說明書全文中,除非上下文另外需要,否則「包含(comprise)」、「包含(comprises)」及「包含(comprising)」等詞將理解為暗示包括所述步驟或要素或步驟或要素之群組,而不排除任何其他步驟或要素或步驟或要素之群組。「由以下組成」意指包括且限於片語「由以下組成」後接之內容。因此,片語「由...組成」指示所列要素為必需或必備的,且不可存在其他要素。「基本上由以下組成」意指包括該片語之後所列的任何要素,且限於不干擾或貢獻於本揭示內容中對所列要素所規定的活動或動作之其他要素。因此,片語「基本上由以下組成」指示:所列要素為必需或必備的,但其他要素為可選的且可或可不存在,此取決於該等其他要素是否實質上影響所列要素之活動或動作。
術語「生物樣本」包括可自受試者收集且結合生物學狀態之診斷或監測一起使用的生物材料。生物樣本可包括:臨床樣本,包括體液樣本,諸如體腔液、尿液、腦脊髓液、血液及其他生物學起源之液體樣本;以及組織樣本,諸如生檢物樣本、腫瘤或疑似腫瘤樣本,及生物學起源之其他實體樣本。生物樣本亦可包括在其收集之後以某一方式操縱的彼等樣本,諸如針對某些生物學成分、培養物或來源於該等培養物之細胞及其後代藉由利用試劑處理、培養、溶解化、富集進行操縱。
術語「結合物」包括由於藥劑或其他分子與本文所述的抗體之共價或非共價連接或鍵聯而形成的實體,該藥劑或其他分子例如可偵測實體、生物活性分子、PEG或其他聚合物。
諸如「對照受試者」或「對照組織」之「對照物」包括健康受試者或健康組織樣本,例如非病理性或患病之組織樣本。在某些實施例中,對照物包括來自不同健康受試者或受測試或診斷之相同受試者的非患病(例如,非癌性)組織。對照物亦可包括參考標準,例如,自一或多個健康受試者或組織產生的標準值。
如本文所使用,術語「功能」及「功能性」及類似物係指生物功能、酶促功能或治療功能。
「同源性」係指為一致的或構成保守取代之胺基酸的數目百分比。同源性可使用序列比較程式判定,該等序列比較程式諸如GAP(Deveraux等人,Nucleic Acids Research.12,387-395,1984),其以引用方式併入本文。以此方式,具有與本文中引用的彼等序列類似或實質上不同長度之序列可藉由在比對序列中***空隙來比較,此等空隙係例如藉由GAP所使用的比較演算法來判定。
「(經)分離」意指實質上或基本上不含在呈材料之天然狀態時通常伴隨該材料的組分。例如,如本文所使用的「分離肽」或「分離多肽」及類似物包括自肽或多肽分子之天然細胞環境及自與細胞之其他組分的締合物活體外分離及/或純化該肽或多肽分子,亦即,其並不顯著地與活體內物質相關聯。在特定實施例中,分離多肽為抗體。
「減小」量或「減少」量典型地為「統計顯著」量,且可包括例如相對於對照物之5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%減小(包括其間所有整數及範圍)。本文描述比較及「統計顯著」量之其他實例。
在某些實施例中,組成物中任何給定藥劑(例如,抗體)之「純度」可受特定定義。例如,某些組成物可包含至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%純(包括其間所有小數)的藥劑,如例如且不意謂限制地藉由高效液相層析(HPLC)所測定,該高效液體層析為常用於生物化學及分析化學中以分離、鑑定並定量化合物之管柱層析法之熟知形式。
術語「多肽」及「蛋白質」可在本文中互換使用以指代胺基酸殘基之聚合物及該聚合物之變異體及合成類似物。因此,此等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基為合成非天然存在胺基酸的胺基酸聚合物,諸如相應天然存在胺基酸之化學類似物;以及適用於天然存在胺基酸聚合物。本文所述的多肽不限於產物之特定長度;因此,肽、寡肽及蛋白質包
括於多肽之定義內,且除非另外特別指示,否則此等術語可在本文中可互換使用。本文所述的多肽亦可包含表現後修飾,諸如醣基化、乙醯化、磷酸化及類似物,以及此項技術中已知的其他修飾,其為天然存在的及非天然存在的。多肽可為整個蛋白質,或其子序列、片段、變異體或衍生物。
術語「參考序列」通常係指另一序列正在與之比較的核酸編碼序列或胺基酸序列。本文所述的所有多肽及多核苷酸序列係作為參考序列來包括,包括由名稱來描述的彼等序列以及表中及序列表中描述的彼等序列。
如本文所使用的術語「序列一致性」或例如包含「與...50%一致之序列」係指在比較窗口上基於核苷酸對核苷酸或胺基酸對胺基酸而言序列為一致之程度。因此,「序列一致性之百分比」可藉由以下方式來計算:在比較窗口上比較兩個最佳比對序列,判定兩個序列中出現一致核酸鹼基(例如,A、T、C、G、I)或一致胺基酸殘基(例如,Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及Met)所處位置之數目以得出匹配位置之數目,將匹配位置之數目除以比較窗口中位置之總數(亦即,窗口大小),且將結果乘以100來得出序列一致性之百分比。所包括核苷酸及多肽具有與本文所述的任何參考序列至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%之序列一致性(參見,例如,序列表),典型地,其中多肽變異體維持參考多肽之至少一種生物活性。
用於描述兩種或兩種以上多核苷酸或多肽之間的序列關係之術語包括「參考序列」、「比較窗口」、「序列一致性」、「序列一致性之百分比」及「實質一致性」。「參考序列」為至少12個但常常為15個至18個且常常為至少25個單體單元長度,包括核苷酸及胺基酸殘基。因為兩種多核苷酸可各自包含(1)在兩種多核苷酸之間類似的序列(亦即,完全多核苷酸序列之僅一部分);以及(2)在兩種多核苷酸之間為發散的序列,兩種(或兩種以上)多核苷酸之序列比較典型地藉由在「比較窗口」上比較兩種多核苷酸之序列來執行,以鑑定且比較具有序列相似性之局部區域。「比較窗口」參考至少6個鄰接位置、通常約50個至約100個鄰接位置、更通常為約100
個至約150個鄰接位置之概念性節段,在該比較窗口中在將兩個序列最佳比對之後,將序列與具有相同數目之鄰接位置的參考序列相比較。比較窗口可包含在與參考序列(不包含添加或缺失)相比較時約20%或更少之添加或缺失(亦即,空隙),以達兩個序列之最佳比對。用於比對比較窗口的序列之最佳比對可藉由演算法之電腦化實行方案(Wisconsin Genetics軟體套件7.0發佈版中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Drive Madison,WI,USA)或藉由檢查及由所選各種方法中之任何方法所產生的最佳比對(亦即,在比較窗口上產生更高百分比同源性)來進行。亦可對如例如藉由Altschul等人,Nucl.Acids Res.25:3389,1997所揭示的BLAST家族程式進行參考。序列分析之詳細論述可在Ausubel等人,「Current Protocols in Molecular Biology,」John Wiley & Sons Inc.,1994-1998,第15章之第19.3單元中找到。
「統計顯著」意指結果不可能偶然發生。統計顯著性可藉由此項技術中已知的任何方法來判定。顯著性之常用量度包括p值,其為在虛無假設為真的情況下,將發生所觀察事件的頻率或機率。若所獲得p值小於顯著性位準,則拒絕虛無假設。在簡單狀況下,顯著性位準係定義在0.05或更小之p值。
術語「溶解度」係指本文所述的抗體溶解在液體溶劑中且形成均質溶液之性質。溶解度係典型地表示為濃度,表示為每單位體積溶劑之溶質質量(每公斤溶劑之溶質公克數、g/dL(100mL)、mg/mL等等)、莫耳濃度、重量莫耳濃度、莫耳分數或其他類似濃度描述。每一溶劑量可溶解的溶質之最大平衡量為在規定條件下,彼溶質於彼溶劑中之溶解度,該等規定條件包括溫度、壓力、pH溶劑之性質。在某些實施例中,溶解度係於生理學pH下或其他pH下量測,例如在pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0或pH 7.4下量測。在某些實施例中,溶解度係於水或諸如PBS或NaCl(具有或不具有NaP)之生理緩衝液中量測。在特定實施例中,溶解度係於相對較低pH(例如,pH 6.0)及相對較高鹽(例如,500mM NaCl及10mM NaP)下量測。在某些實施例中,溶解度係於諸如血液或血清之生物學流體(溶劑)中量測。在某些實施例中,溫度可為約室溫(例如,約20、21、22、23、24、25℃或約體
溫(約37℃)在某些實施例中,抗體在室溫下或在約37℃下具有至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30mg/mL之溶解度。
如本文所使用的「受試者」包括展現症狀或病狀或冒有展現症狀或病狀之風險或疑似展現症狀或病狀的任何動物,其可利用本文所述的抗體來診斷。適合的受試者(患者)包括實驗室動物(諸如小鼠、大鼠、兔或天竺鼠),農場動物及家畜或寵物(諸如貓或狗)。包括非人類靈長類動物及較佳地人類患者。
如本文所使用的「受試者亞族群」或「患者亞族群」包括表徵為具有一或多個區別性可量測及/或可鑑定特性的受試者或患者子集,該等特性將該受試者或患者子集與所屬較寬疾病類別(例如,癌症)中的其他者相區別。此等特性包括疾病亞類、性別、生活方式、健康史、所涉及器官/組織、治療史等等。在一些實施例中,患者或受試者亞族群之特徵為在例如腫瘤樣本之生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之(例如,減少)量或含量。
「實質上」或「基本上」意指幾乎全部地或完全地,例如某一給定數量之95%、96%、97%、98%、99%或更大。
「實質上無」係指幾乎完全或完全不存在給定數量,例如,某一給定數量之小於約10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或更小。例如,某些組成物可「實質上無」細胞蛋白質、膜、核酸、內毒素或其他污染物。
如本文所使用的「治療(treatment/treating)」包括對疾病或病狀之症狀或病理學的任何合乎需要之效應,且可包括所治療疾病或病狀之一或多種可量測標記物之甚至最小改變或改良。「治療(treatment或treating)」未必指示疾病或病狀或其相關聯症狀之完全根除或治癒。接收此治療之受試者為有需要之任何受試者。臨床改良之示範性標記物對熟習此項技術者而言為明顯的。
術語「野生型」係指當與天然存在來源分離時具有基因或基因產物之特性的彼基因或基因產物。野生型基因或基因產物(例如,多肽)為在群體中最常觀察到的且因此經任意設計而呈現基因之「正常」或「野生型」形式的彼基因或基因產物。
抗體
某些實施例係關於特異地結合至人類精胺琥珀酸合成酶多肽之抗體,包括結合至其一或多個鄰接或非鄰接片段或抗原決定基之彼等抗體。在一些實施例中,抗體係藉由本文所述的輕鏈可變區序列及/或重鏈可變區及/或其中所含的互補決定區(CDR)序列或抗原結合區(ABR)來定義,包括特異地結合至人類精胺琥珀酸合成酶的此等序列之變異體及組合。亦包括競爭地抑制此等抗體與人類精胺琥珀酸合成酶之結合的抗體。
示範性抗體序列提供於以下表1中。
因此,在某些實施例中,抗體或其抗原結合片段包含表1中序列之一或多者(例如,SEQ ID NO:1、3、7-12),包括其組合及變異體。例如,在特定實施例中,抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:1中列明的VH序列及/或SEQ ID NO:3中列明的VL序列。在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段包含:重鏈可變區(VH),該重鏈可變區包含SEQ ID NO:1中所含的互補決定區VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3序列(例如,分別為SEQ ID NO:7、8及9);及/或輕鏈可變區(VL),該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:3中所含的互補決定區VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3序列(例如,分別為SEQ ID NO:10、11及12)。在一些實施例中,CDR序列係根據Kabat、Clothia之規則或其組合來定義(亦參見IMGT®,國際ImMunoGeneTics資訊系統®)。
如本文所使用的術語「抗原結合片段」係指多肽片段,其含有結合至所關注抗原的免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈之至少一個CDR。就此而
言,本文描述的抗體之抗原結合片段可包含來自特異地結合至治療或診斷標靶(諸如人類精胺琥珀酸合成酶多肽,包括其片段)之抗體的VH及VL序列之1、2、3、4、5個或所有6個CDR。
術語「抗原」係指分子或分子之一部分,其能夠藉由選擇性抗體或其抗原結合片段結合,且另外能夠用於動物中以產生能夠結合至彼抗原之抗原決定基的抗體。抗原可具有一或多個抗原決定基。
術語「抗原決定基」包括任何決定子、較佳為多肽決定子,其能夠特異結合至免疫球蛋白或T細胞受體。抗原決定基為抗原的藉由抗體結合之區域。在某些實施例中,抗原決定基決定子包括分子之化學活性表面基團,諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基,且在某些實施例中,可具有特定三維結構特性及/或特定電荷特性。抗原決定基可相對於抗原之主要結構為鄰接或非鄰接的。
若與抗體、其抗原結合片段與替代細胞或物質反應或締合相比,該抗體、其抗原結合片段更頻繁地、更快速地以更大持續時間及/或以更大親和力與特定細胞或物質反應或締合,則將該抗體、其抗原結合片段稱為展現「特異結合」或「優先結合」。若與抗體結合至其他物質相比,該抗體以更大親和力、親合力更為容易地及/或以更大持續時間結合標靶,則該抗體「特異地結合」或「優先地結合」至該標靶。例如,特異地或優先地結合至特定抗原決定基之抗體為與該抗體結合至其他抗原決定基相比,以更大親和力、親合力更為容易地及/或以更大持續時間結合彼特定抗原決定基之抗體。亦應理解係藉由例如以下方式來解讀此定義:特異性或優先地結合至第一靶標之抗體(或部分或抗原決定基)可或可不特異性或優先地結合至第二靶標。因而,「特異結合」或「優先結合」未必需要(儘管其可包括)唯一結合。通常但並非必要地,對結合之提及意指優先結合。
免疫結合通常係指例如舉例說明而非限制地由於靜電、離子、親水性及/或疏水性吸引或排斥、立體力、氫鍵結、凡得瓦力及其他相互作用而在免疫球蛋白分子與免疫球蛋白對其而言具特異性之抗原之間發生的非共價相互作用類型。免疫結合相互作用之強度或親和力可以相互作用之解離常數(Kd)來表示,其中較小Kd表示較大親和力。所選多肽之免疫
結合性質可使用此項技術中熟知的方法來定量。一種此類方法需要量測抗原結合位點/抗原複合物形成及解離之速率,其中彼等速率取決於複合物搭配物之濃度、相互作用之親和力,且取決於在兩個方向上同等地影響速率之幾何參數。因此,「締合速率常數」(kon)及「解離速率常數」(koff)可藉由計算濃度及締合及之實際速率來測定。koff/kon之比率允許消除不與親和力相關的所有參數,且因此等於解離常數Kd。
抗體及其抗原結合片段之免疫結合性質可使用此項技術中熟知的方法來定量(參見Davies等人,Annual Rev.Biochem.59:439-473,1990)。在一些實施例中,當平衡解離常數為約10-7或10-8M時,抗體稱為特異地結合抗原或其抗原決定基。在一些實施例中,蛋白質平衡解離常數可為約10-9M或10-10M。在某些例示性實施例中,蛋白質具有對本文所述的抗原或標靶(該蛋白質特異地與之結合)的約、至少約或不超過約0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40或50nM之親和力(Kd)。
如上所述,本文所述的抗體特異地結合至人類精胺琥珀酸合成酶多肽或其片段或抗原決定基。精胺琥珀酸合成酶或合成酶(ASS或ASS1)(EC 6.3.4.5)為催化精胺琥珀酸自瓜胺酸及天冬胺酸酯之合成的酶。精胺琥珀酸合成酶負責尿素循環之第三步驟及瓜胺酸-NO循環之反應之一。人類精胺琥珀酸合成酶之主要胺基酸序列展示於以下表2中。
因此,本文所述的抗體特異地結合至SEQ ID NO:5之多肽或其片段或抗原決定基。在某些實施例中,此等抗體特異地結合至具有SEQ ID NO:5之約或至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40或50個或50個以上胺基酸之鄰接片段。
在某些實施例中,如本文所述的抗體及其抗原結合片段包括分別***重鏈架構區(FR)組與輕鏈架構區(FR)組之間的重鏈CDR組及輕鏈CDR組,該等架構區(FR)組對CDR提供支撐且界定CDR相對於彼此之空間關係。如本文所使用,術語「CDR組」係指重鏈V區或輕鏈V區之三個高變區。自重鏈或輕鏈之N末端起,此等區域分別表示為「CDR1」、「CDR2」及「CDR3」。抗原結合位點因此包括六個CDR,包含來自重鏈V區及輕鏈V區中每一者之CDR組。包含單一CDR(例如,CDR1、CDR2或CDR3)之多肽在本文中稱為「分子識別單元」。許多抗原抗體複合物之結晶學分析已證明:CDR之胺基酸殘基與所結合抗原形成廣泛接觸,其中最廣泛抗原接觸係與重鏈CDR3之接觸。因此,分子識別單元主要負責抗原結合位點之特異性。
如本文所使用,術語「FR組」係指四個側接胺基酸序列,其限定重鏈V區或輕鏈V區之CDR組之CDR。一些FR殘基可接觸所結合抗原;然而,FR主要負責將V區折疊成抗原結合位點、尤其為直接相鄰於CDR之FR殘基。在FR內,某些胺基殘基及某些結構特微為極高度保守的。就此而言,所有V區序列含有大約90個胺基酸殘基之內部二硫化物環。當V區折疊成結合位點時,CDR係顯示為形成抗原結合表面之突出環模體。公認的是,存在FR的影響CDR環成為某些「典型」結構之折疊形狀的保守結構區-與精確CDR胺基酸序列無關。另外,已知某些FR殘基參與非共價域間接觸,從而穩定抗體重鏈及輕鏈之相互作用。
可參考Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest.第4版,US Department of Health and Human Services.1987及其更新內容來判定免疫球蛋白可變域之結構及位置。
在一些實施例中,抗體為「單株抗體」,其係指同源抗體群
體,其中單株抗體包含涉及抗原決定基之選擇性結合的胺基酸(天然存在胺基酸及非天然存在胺基酸)。單株抗體具針對單一抗原決定基之高特定性。術語「單株抗體」不僅涵蓋完整單株抗體及全長單株抗體,而且涵蓋其片段(諸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(scFv)、其變異體、包含抗原結合部分之融合蛋白質、人類化單株抗體、嵌合單株抗體及免疫球蛋白分子之任何其他修飾組態,該免疫球蛋白分子包含具有所需特異性及結合至抗原決定基之能力的抗原結合片段(抗原決定基識別位點)。並非意欲就抗體之來源或製成(例如,藉由融合瘤、噬菌體選擇、重組表現、基因轉殖動物製成)該抗體之方式而言來進行限制。術語包括在「抗體」之定義下的本文所述的完整免疫球蛋白以及片段等等。
蛋白解酶木瓜酶優先地裂解IgG分子以產生若干片段,其中兩個片段(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原結合位點之共價異源二聚物。酶胃蛋白酶能夠裂解IgG分子以提供若干片段,包括包含兩個抗原結合位點之F(ab’)2片段。根據本發明之某些實施例來使用的Fv片段可藉由IgM及在極少情形下IgG或IgA免疫球蛋白分子之優先蛋白解裂解來產生。然而,Fv片段更通常使用此項技術中已知的重組技術來得到。Fv片段包括非共價VH::VL異源二聚物,其包括保持天然抗體分子之大部分抗原識別及結合能力之抗原結合位點。參見Inbar等人,PNAS USA.69:2659-2662,1972;Hochman等人,Biochem.15:2706-2710,1976;以及Ehrlich等人,Biochem.19:4091-4096,1980。
在某些實施例中,涵蓋單鏈Fv或scFV抗體。例如,κ抗體(Ill等人,Prot.Eng.10:949-57,1997);微型抗體(Martin等人,EMBO J 13:5305-9,1994);雙功能抗體(Holliger等人,PNAS 90:6444-8,1993);或Janusins(Traunecker等人,EMBO J 10:3655-59,1991;以及Traunecker等人,Int.J.Cancer Suppl.7:51-52,1992)可使用標準分子生物學技術遵循本申請案關於選擇具有所欲特異性之抗體的教示內容來製備。
單鏈Fv(sFv)多肽為共價連接VH::VL異源二聚物,其表現自包括藉由肽編碼連接子連接的VH編碼基因及VL編碼基因之基因熔融物。Huston等人,(PNAS USA.85(16):5879-5883,1988)。已描述許多方法來分辨
用於將來自抗體V區之天然聚集-但化學分離-輕鏈多肽鏈及重鏈多肽鏈轉化成sFv分子之化學結構,該sFv分子將折疊成實質上類似於抗原結合位點之結構的三維結構。參見,例如,Huston等人之美國專利第5,091,513號及第5,132,405號;以及Ladner等人之美國專利第4,946,778號。
在某些實施例中,抗體或其抗原結合片段為人類化的。此等實施例係指嵌合分子,其通常使用重組技術製備,具有來源於來自非人類物種之免疫球蛋白的抗原結合位點及具有基於人類免疫球蛋白之結構及/或序列的分子之剩餘免疫球蛋白結構。抗原結合位點可包含融合於恆定域上之完全可變域,或僅接枝於可變域中之適當架構區上的CDR。抗原決定基結合位點可為野生型或藉由一或多個胺基酸取代修飾。此消除作為人類個體中之免疫原的恆定區,但保留對外來可變區之免疫反應之可能性(LoBuglio等人,PNAS USA 86:4220-4224,1989;Queen等人,PNAS USA.86:10029-10033,1988;Riechmann等人,Nature.332:323-327,1988)。用於抗體之人類化之說明性方法包括美國專利第7,462,697號中所述的方法。
另一方法不僅關注於提供源於人類之恆定區,而且關注修飾可變區以便將該等可變區盡可能緊密地改造成人類形式。已知的是,重鏈及輕鏈兩者之可變區含有三個互補決定區(CDR),其回應於所論述之抗原決定基變化且決定結合能力,其側接有四個架構區(FR),該等架構區在給定物種中相對保守且推定地提供用於CDR之骨架。當相對於特定抗原決定基來製備非人類抗體時,可變區可藉由將來源於非人類抗體之CDR接枝於存在於人類抗體中待修飾之FR上來「改造」或「人類化」。此方法對各種抗體之應用已由以下者報導:Sato等人,Cancer Res.53:851-856,1993;Riechmann等人,Nature 332:323-327,1988;Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536,1988;Kettleborough等人,Protein Engineering.4:773-3783,1991;Maeda等人,Human Antibodies Hybridoma 2:124-134,1991;Gorman等人,PNAS USA.88:4181-4185,1991;Tempest等人,Bio/Technology 9:266-271,1991;Co等人,PNAS USA.88:2869-2873,1991;Carter等人,PNAS USA.89:4285-4289,1992;以及Co等人,J Immunol.148:1149-1154,1992。在一些實施例中,人類化抗體保存所有CDR序列(例如,人類化小鼠抗體,其含有來自小鼠抗體
之所有六個CDR)。在其他實施例中,人類化抗體具有一或多個CDR(一個、兩個、三個、四個、五個、六個),其相對於原始抗體經改變,亦稱為「來源於」來自原始抗體之一或多個CDR之一或多個CDR。
本文所述的抗體及其抗原結合片段可包含來自任何種類之哺乳動物的具有任何種類之免疫球蛋白亞型(例如,IgA、IgD、IgE、IgG、IgM,包括其子類及組合,例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之輕鏈恆定區重鏈恆定區(例如,Fc區),該等哺乳動物諸如小鼠、人類、兔或山羊。「Fc區」序列通常來源於免疫球蛋白(Ig)分子之重鏈。典型Ig分子由兩個重鏈及兩個輕鏈構成。重鏈可分成至少三個功能區:Fd區、Fc區(片段可結晶區)及鉸鏈區,後者僅在IgG、IgA及IgD免疫球蛋白中找到。Fd區包含重鏈之可變(VH)域及恆定(CH1)域,且連同輕鏈之可變(VL)域及恆定(CL)域一起形成抗原結合片段或Fab區。
IgG、IgA及IgD免疫球蛋白之Fc區包含重鏈恆定域2及3,其分別命名為CH2區及CH3區;且IgE及IgM免疫球蛋白之Fc區包含重鏈恆定域2、3及4,其分別命名為CH2區、CH3區及CH4區。Fc區主要負責免疫球蛋白效應物功能,其包括例如補體固定及對效應物細胞之同源Fc受體之結合。
鉸鏈區(在IgG、IgA及IgD找到)充當可撓性間隔物,其允許Fab部分在空間中相對於Fc區自由地移動。與恆定區對比,鉸鏈區在結構上多樣,在免疫球蛋白類別及子類中在序列及長度兩者上有所變化(參見以上)。鉸鏈區亦可含有一或多個醣基化位點,其包括許多結構上相異類型之位點以用於碳水化合物連接。例如,IgA1在鉸鏈區之17胺基酸節段內含有五個醣基化位點,從而為鉸鏈區多肽賦予對腸蛋白酶之顯著抵抗力。CH2域之鉸鏈近端區中之殘基亦可影響免疫球蛋白與其相應Fc受體之間的相互作用之特異性(參見,例如,Shin等人,Intern.Rev.Immunol.10:177-186,1993)。
如本文所使用的術語「Fc區」或「Fc片段」或「Fc」因此係指抗體之一部分,或其抗原結合片段,其含有來自一或多個所選免疫球蛋白之CH2區、CH3區及/或CH4區之一或多者,包括其片段及變異體以
及組合。「Fc區」亦可包括免疫球蛋白之重鏈恆定區之一或多個鉸鏈區。在某些實施例中,Fc區不含有免疫球蛋白之CH1區、CL區、VL區及/或VH區之一或多者。
Fc區可包含任何一或多個免疫球蛋白類別之CH2區、CH3區、CH4區及/或鉸鏈區,包括但不限於IgA、IgD、IgE、IgG、IgM,包括其子類及組合。在一些實施例中,Fc區係來自IgA免疫球蛋白(例如,小鼠、人類、兔、山羊),包括子類IgA1及/或IgA2。在某些實施例中,Fc區係來自IgD免疫球蛋白(例如,小鼠、人類、兔、山羊)。在特定實施例中,Fc區係來自IgE免疫球蛋白(例如,小鼠、人類、兔、山羊)。在一些實施例中,Fc區係來自IgG免疫球蛋白(例如,小鼠、人類、兔、山羊),包括子類IgG1、IgG2、IgG3及/或IgG4。在某些實施例中,Fc區係來自IgM免疫球蛋白(例如,小鼠、人類、兔、山羊)。
亦包括抗體或其抗原結合片段,其包含表1中之序列之「變異體」(例如,SEQ ID NO:1、3、7-12之變異體)。如本文中所使用的術語「變異體」序列係指與本文揭示的參考序列(例如,表1,SEQ ID NO:1、3、7-12)相差一或多個取代、缺失(例如,截斷)、添加及/或***之多肽或多核苷酸序列。某些變異體因此包括本文所述的參考序列之片段。變異體多肽為生物活性的,亦即,其持續擁有參考多肽之結合活性。此等變異體可由例如遺傳多型性及/或人類操縱而產生。
在許多情況下,生物活性變異體將含有一或多個保守取代。「保守取代」為胺基酸由具有類似性質之另一胺基酸取代以使得熟習肽化學技術者將預期多肽之二級結構及疏水性質實質上不會改變的取代。如上所述,可在本發明之多核苷酸及多肽之結構中進行修飾,且仍獲得編碼具有合乎需要特性之變異體或衍生多肽之功能分子。當意欲改變多肽之胺基酸序列以產生本發明之多肽之等效或甚至改良變異體或部分時,熟習此項技術者將典型地改變根據以下表A之編碼DNA序列之密碼子中之一或多者。
例如,蛋白質結構中之某些胺基酸可由其他胺基酸取代,而沒有與諸如例如抗體之抗原結合區或底質分子上之結合位點的結構之相互作用結合容量的可觀損失。因為蛋白質之相互作用容量及性質界定蛋白質之生物功能活性,所以可在蛋白質序列中且當然可在其基本DNA編碼序列中做出某些胺基酸序列取代,而雖然如此仍獲得具有類似性質之蛋白質。因此涵蓋的是,可在所揭示組成物之肽序列或編碼該等肽之相應DNA序列中做出各種改變,而沒有其實用性之可觀損失。
在做出此等改變時,可考慮胺基酸之疏水指數。此項技術中通常理解疏水胺基酸指數在對蛋白質賦予相互作用生物功能中之重要性(Kyte & Doolittle,1982,以引用方式併入本文)。所接受的是,胺基酸之相對疏水特性有助於所得蛋白質之二級結構,其繼而界定蛋白質與其他分子之相互作用,該等其他分子例如酶、底質、受體DNA、抗體、抗原及類似物。已基於各種胺基酸之疏水性及電荷特性來指定該等胺基酸之疏水指數(Kyte & Doolittle,1982)。此等值為:異白胺酸(+4.5);纈胺酸(+4.2);白胺酸(+3.8);苯基丙胺酸(+2.8);半胱胺酸(+2.5);甲硫胺酸(+1.9);丙胺酸(+1.8);甘胺
酸(-0.4);蘇胺酸(-0.7);絲胺酸(-0.8);色胺酸(-0.9);酪胺酸(-1.3);脯胺酸(-1.6);組胺酸(-3.2);麩胺酸(-3.5);麩醯胺酸(-3.5);天冬胺酸酯(-3.5);天冬醯胺酸(-3.5);離胺酸(-3.9);及精胺酸(-4.5)。此項技術中已知的是,某些胺基酸可由具有類似疏水或記分之其他胺基酸取代,且產生具有類似生物活性之蛋白質,亦即,仍獲得生物學上功能等效之蛋白質。在做出此等改變時,疏水指數在±2內之胺基酸之取代為較佳的,疏水指數在±1內之胺基酸之取代為尤其較佳的,且疏水指數在±0.5內之胺基酸之取代為甚至尤其更佳的。
此項技術中亦理解的是,可基於親水性來有效地做出類似胺基酸之取代。美國專利4,554,101(特別地以全文引用方式併入本文中)闡述:如受蛋白質之相鄰胺基酸之親水性所支配的,蛋白質之最大局部平均親水性與該蛋白質之生物性質有關。如美國專利4,554,101中所詳述的,已對胺基酸殘基指定以下親水性值:精胺酸(+3.0);離胺酸(+3.0);天冬胺酸酯(+3.0±1);麩胺酸(+3.0±1);絲胺酸(+0.3);天冬醯胺酸(+0.2);麩醯胺酸(+0.2);甘胺酸(0);蘇胺酸(-0.4);脯胺酸(-0.5±1);丙胺酸(-0.5);組胺酸(-0.5);半胱胺酸(-1.0);甲硫胺酸(-1.3);纈胺酸(-1.5);白胺酸(-1.8);異白胺酸(-1.8);酪胺酸(-2.3);苯基丙胺酸(-2.5);色胺酸(-3.4)。應理解,胺基酸可由具有類似親水性值之另一胺基酸取代,且仍獲得生物學上等效及尤其免疫學上等效的蛋白質。在此等改變中,親水性值在±2內之胺基酸之取代為較佳的,親水性值在±1內之胺基酸之取代為尤其較佳的,且親水性值在±0.5內之胺基酸之取代為甚至尤其更佳的。
如以上所概述,胺基酸取代因此通常係基於胺基酸側鏈取代基之相對相似性,例如基於其疏水性、親水性、電荷、大小及類似者。將各種前述特性考慮在內的示範性取代為熟習此項技術者所熟知,且包括:精胺酸及離胺酸;麩胺酸及天冬胺酸酯;絲胺酸及蘇胺酸;麩醯胺酸及天冬醯胺酸;以及纈胺酸、白胺酸及異白胺酸。
胺基酸取代可進一步基於殘基之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或兩親性質之相似性來做出。例如,帶負電胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸;帶正電胺基酸包括離胺酸及精胺酸;且具有未帶電極性頭
部基團的具有類似親水性值之胺基酸包括白胺酸、異白胺酸及纈胺酸;甘胺酸及丙胺酸;天冬醯胺酸及麩醯胺酸;以及絲胺酸、蘇胺酸、苯基丙胺酸及酪胺酸。可表示保守改變之其他胺基酸群組包括:(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr;(2)cys、ser、tyr、thr;(3)val、ile、leu、met、ala、phe;(4)lys、arg、his;以及(5)phe、tyr、trp、his。
變異體亦可或替代地含有非保守改變。在一較佳實施例中,變異體多肽與天然或參考序列相差約或少於約10、9、8、7、6、5、4、3、2個胺基酸或甚至1個胺基酸之取代、缺失或添加。變異體亦可(或替代地)藉由例如對多肽之免疫原性、二級結構、酶促活性及/或疏水性質具有最小影響的胺基酸之缺失或添加來修飾。
一般而言,變異體將顯示與參考多肽序列(例如,表1,SEQ ID NO:1、3、7-12)至少約30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相似性或序列一致性或序列同源性。此外,涵蓋與參考序列相差約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個胺基酸(包括其間所有整數及範圍)之添加(例如,C末端添加、N末端添加、兩者兼有)、缺失、截斷、***或取代(例如,保守取代),但保持親本或參考多肽序列之性質或活性的序列。
在一些實施例中,變異體多肽與參考序列相差至少一個但小於50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2個胺基酸殘基。在其他實施例中,變異體多肽與參考序列相差殘基之至少1%但小於20%、15%、10%或5%。(若此比較需要比對,則序列應針對最大相似性來比對。)在一些情況下,因缺失或***或失配而處於「環」外的序列視為差異。
序列之間的序列相似性或序列一致性(該等術語在本文中可互換使用)之計算係如下執行。為判定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性百分比,針對最佳比較目的來比對序列(例如,可將空隙引入第一胺基酸或核酸序列及第二胺基酸或核酸序列之一或兩者中以達最佳比對,且出
於比較目的可忽視非同源序列)。在某些實施例中,用於比較目的的所比對參考序列之長度為參考序列之長度之至少30%、較佳至少40%、更佳至少50%、60%且甚至更佳至少70%、80%、90%、100%。隨後比較相應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之位置由與第二序列中相應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時,則分子在彼位置處為一致的。
兩個序列之間的一致性百分比隨序列共用的一致位置之數目而變化,此考慮了空隙之數目及每一空隙之長度,需要引入該等空隙以達兩個序列之最佳比對。
可使用數學演算法來完成序列之比較及兩個序列之間的一致性百分比之判定。在一較佳實施例中,使用已併入GCG軟體套件中之GAP程式中的Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453,1970)演算法、使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4之空隙加權值及1、2、3、4、5或6之長度加權值來判定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比。在又一較佳實施例中,使用GCG軟體套件中之GAP程式、使用NWSgapdna.CMP矩陣及40、50、60、70或80之空隙加權值及1、2、3、4、5或6之長度加權值來判定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比。一組較佳參數包括Blossum 62記分矩陣,其中空隙罰分為12、空隙延伸罰分為4且框架移位空隙罰分為5。
兩個胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比可使用已併入ALIGN程式(2.0版)中之E.Meyers及W.Miller(Cabios.4:11-17,1989)之演算法、使用PAM120加權殘基表、為12之空隙長度罰分及為4之空隙罰分來判定。
本文所述的核酸及蛋白質序列可用作「查詢序列」以執行針對公眾資料庫之搜索,以便例如鑑定其他家族成員或相關序列。此等搜索可使用Altschul,等人,(1990,J.Mol.Biol,215:403-10)之NBLAST及XBLAST程式(2.0版)執行。BLAST核苷酸搜索可利用NBLAST程式、記分=100、字長=12來執行,以獲得與本發明之核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可利用XBLAST程式、記分=50、字長=3來執行,以
獲得與本發明之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為獲得用於比較目的的空隙化比對,可利用如Altschul等人,(Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)中所述的空隙化BLAST。當利用BLAST及空隙化BLAST程式時,可使用相應程式(例如,XBLAST及NBLAST)之預設參數。
在一個實施例中,如上所述,可使用BLAST比對工具評估多核苷酸及/或多肽。局部比對簡單地由一對序列節段組成,序列節段之一來自受比較序列之每一者。Smith-Waterman或Sellers演算法之修改形式將找出記分無法藉由延伸或修整而改良的對所有節段對,其稱為高記分節段對(HSP)。BLAST比對之結果包括統計學量度,以指示可有機會單獨預期BLAST記分之可能性。
原始記分S係由與每一比對序列相關聯的空隙及取代之數目計算,其中較高相似性記分指示更顯著比對。取代記分係藉由檢查表(參見PAM,BLOSUM)給出。
空隙記分係典型地計算為空隙開放罰分G及空隙延伸罰分L之總和。對於長度n之空隙而言,空隙耗值將為G+Ln。空隙耗值、G及L之選擇係經驗性的,但習慣對G選擇高值(10-15),例如11,而對L選擇低值(1-2),例如1。
位元記分S’係得自原始比對記分S,其中已考慮所使用記分系統之統計學性質。位元記分相對於記分系統加以正規化,因此該等位元記分可用於比較來自不同搜索之比對記分。術語「位元記分」及「相似性記分」可互換使用。位元記分給出對該比對良好程度如何之指示;記分愈高,比對愈好。
E-值或預期值描述具有類似記分之序列將有機會出現在資料庫中之可能性。其為具有相當於或好於S之記分的不同比對數目之預測值,預期該等記分有機會出現在資料庫搜索中。E-值愈小,比對愈顯著。例如,具有e-117之E值的比對意指:具有類似記分之序列極不可能有機會簡單地出現。另外,用於比對一對隨機胺基酸之預期記分需要為負,否則長的比對將趨向於具有高記分,此獨立於所比對節段是否相關。另外,BLAST演算法使用適當取代矩陣、核苷酸或胺基酸,且針對空隙化比對而
言,使用空隙創建及延伸罰分。例如,多肽序列之BLAST比對及比較典型地使用BLOSUM62矩陣、為11之空隙存在罰分及為1之空隙延伸罰分來進行。
在一個實施例中,序列相似性記分係自使用BLOSUM62矩陣、為11之空隙存在罰分及為1之空隙延伸罰分進行的BLAST分析來報導。
在特定實施例中,本文中提供的序列一致性/相似性記分係指使用GAP第10版(GCG,Accelrys,San Diego,Calif.)、使用以下參數獲得的值:對核苷酸序列之一致性%及相似性%而言,使用為50之空隙加權值及為3之長度加權值,以及nwsgapdna.cmp記分矩陣;對胺基酸序列之一致性%及相似性%而言,使用為8之空隙加權值及為2之長度加權值,以及BLOSUM62記分矩陣(Henikoff及Henikoff,PNAS USA.89:10915-10919,1992)。GAP使用Needleman及Wunsch(J Mol Biol.48:443-453,1970)之演算法來找出最大化匹配數目並最小化空隙數目之兩個完全序列之比對。
在一個特定實施例中,變異體多肽包含可與參考多肽序列最佳比對的胺基酸序列(參見,例如,表、序列表;SEQ ID NO:1、3、7-12),以產生為至少約50、60、70、80、90、100、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或1000以上之BLAST位元記分或序列相似性記分,包括其間所有整數及範圍,其中BLAST比對使用BLOSUM62矩陣、為11之空隙存在罰分及為1之空隙延伸罰分。
如上所述,參考多肽可以包括胺基酸取代、缺失、截斷、添加及***之各種方式改變。用於此等操縱之方法為此項技術中通常已知的。例如,參考多肽之胺基酸序列變異體可藉由DNA中之突變來製備。此
項技術中熟知用於突變誘發及核苷酸序列改變之方法。參見,例如,Kunkel(PNAS USA.82:488-492,1985);Kunkel等人,(Methods in Enzymol.154:367-382,1987);美國專利第4,873,192號;Watson,J.D.等人,(「Molecular Biology of the Gene」,第四版,Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)及其中引用的參考文獻。關於不影響所關注蛋白質之生物活性之適當胺基酸取代的指導可在Dayhoff等人,(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)之模型中找到。
用於篩選藉由此等修飾製成的組合文庫之基因產物以及用於篩選cDNA文庫之具有所選性質之基因產物的方法在此項技術中已知。對快速篩選藉由參考多肽之組合突變誘發所產生的基因文庫而言,此等方法為可接受的。作為一個實例,遞迴系集突變誘發(REM)可與篩選測定組合使用來鑑定多肽變異體,該遞迴系集突變誘發為一種增強文庫中功能突變體之出現頻率的技術(Arkin及Yourvan,PNAS USA 89:7811-7815,1992;Delgrave等人,Protein Engineering.6:327-331,1993)。
亦包括抗體或其抗原結合片段,其「競爭地抑制」本文所述的抗體(參見,例如,實例1)與人類精胺琥珀酸合成酶多肽之結合。用於藉由競爭性抑制測定mAb特異性及親和力之方法可例如在Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988);Colligan等人編,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993);Muller,Meth.Enzymol.92:589-601,1983;以及Jia,X-C.等人,J.Immunol.Methods 288:91-98,2004(其中每一者以引用方式併入)中找到。
特定實施例包括抗體或其抗原結合片段,其競爭地抑制抗體與人類精胺琥珀酸合成酶(SEQ ID NO:5)之結合,其中抗體(其受競爭地抑制)包含SEQ ID NO:1中列明的VH序列及/或SEQ ID NO:3中列明的VL序列。在特定實施例中,抗體(其受競爭地抑制)為單株抗體,例如,完整單株抗體,諸如IgG抗體,如本文所述。在特定實施例中,抗體(其受競爭地抑制)為IgG1或IgG2a免疫球蛋白亞型。
在某些實施例中,抗體或其抗原結合片段結合或共價地連接
至可偵測實體,例如以促進偵測。示範性可偵測實體包括而不限於基於碘之標籤、放射性同位素、螢光團/螢光染料及奈米粒子。
示範性基於碘之標籤包括泛影酸(Hypaque®,GE Healthcare)及其陰離子形式,即泛影酸鹽。泛影酸為用於諸如CT掃描之先進X射線技術中的放射性顯影劑。亦包括以下所述的碘放射性同位素。
可用作可偵測實體之示範性放射性同位素包括32P、33P、35S、3H、18F、11C、13N、15O、111In、169Yb、99mTC、55Fe,以及碘之同位素,諸如123I、124I、125I以及131I。此等放射性同位素具有不同半衰期、衰變類型及能量位準,其經特製而匹配特定協定之需要。
可用作直接可偵測實體之螢光團或螢光色素之實例包括螢光黃、四甲基玫瑰紅、德克薩斯紅、奧勒岡綠®及許多其他者(例如,Haugland,Handbook of Fluorescent Probes-第9版,2002,Molec.Probes,Inc.,Eugene OR;Haugland,The Handbook:A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies-第10版,2005,Invitrogen,Carlsbad,CA)。亦包括發光染料或其他可偵測染料。藉由染料發射的光可為可見光或不可見光,諸如紫外光或紅外光。在示例性實施方案中,染料可為螢光共振能量傳遞(FRET)染料;二苯并哌喃染料,諸如螢光黃及玫瑰紅;在α或β位置具有胺基之染料(諸如萘胺染料、1-二甲基胺基萘基-5-磺酸鹽、1-苯胺基-8-萘磺酸鹽及2-對甲苯胺基-6-萘磺酸鹽);具有3-苯基-7-異氰酸基香豆素之染料;吖啶,諸如9-異硫氰基吖啶及吖啶橙;芘,苯并噁二唑及二苯乙烯;具有3-(ε-羧基戊基)-3’-乙基-5,5’-二甲基氧雜羰花青(CYA)之染料;6-羧基螢光黃(FAM);5&6-羧基玫瑰紅-110(R110);6-羧基玫瑰紅-6G(R6G);N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基玫瑰紅(TAMRA);6-羧基-X-玫瑰紅(ROX);6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基螢光黃(JOE);ALEXA FLUORTM;Cy2;德克薩斯紅及玫瑰紅;6-羧基-2’,4,7,7’-四氯螢光黃(TET);6-羧基-2’,4,4’,5’,7,7’-六氯螢光黃(HEX);5-羧基-2’,4’,5’,7’-四氯螢光黃(ZOE);NAN;NED;Cy3;Cy3.5;Cy5;Cy5.5;Cy7;以及Cy7.5;IR800CW,ICG,Alexa Fluor 350;Alexa Fluor 488;Alexa Fluor 532;Alexa Fluor 546;Alexa Fluor 568;Alexa Fluor 594;Alexa Fluor 647;Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 750。
奈米粒子之大小通常在約1-1000nm範圍變化,且包括多樣化學結構,諸如金及銀粒子及量子點。當利用成角度入射白光來照射時,在約40-120nm範圍變化的銀或金奈米粒子將散射具有高強度之單色光。散射光之波長取決於粒子之大小。四至五種緊密接近的不同粒子將各自散射單色光,當單色光疊加時將得到特定、唯一色彩。諸如銀或金粒子之衍生化奈米粒子可連接至較寬分子陣列,包括蛋白質、抗體、小分子、受體配位體及核酸。奈米粒子之特定實例包括金屬奈米粒子及金屬奈米殼,諸如金粒子、銀粒子、銅粒子、鉑粒子、鎘粒子、複合物粒子、金中空球、金塗佈矽石奈米殼以及矽石塗佈金殼。亦包括為矽石、乳膠、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、PVDF奈米粒子及任何此等材料之有色粒子。
量子點為直徑約1-5nm之發螢光晶體,其可藉由在大的波長範圍上之光激發。在藉由具有適當波長之光激發之後,此等晶體以取決於該等晶體之化學組成及大小的波長發射光,諸如單色光。諸如CdSe、ZnSe、InP或InAs之量子點擁有獨特光學性質;此等及類似量子點可購自許多商業來源(例如,NN-Labs,Fayetteville,AR;Ocean Nanotech,Fayetteville,AR;Nanoco Technologies,Manchester,UK;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。
抗體可藉由一般技藝人士已知的各種技術中之任何技術來製備。參見,例如,Harlow及Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。對所關注多肽具特異性之單株抗體可例如使用Kohler及Milstein,Eur.J.Immunol.6:511-519,1976之技術及對該技術之改良來製備。亦包括利用諸如小鼠之基因轉殖動物來表現人類抗體之方法。參見,例如,Neuberger等人,Nature Biotechnology 14:826,1996;Lonberg等人,Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101,1994;以及Lonberg等人,Internal Review of Immunology 13:65-93,1995。特定實例包括REGERNEREX®之VELOCIMMUNE®(參見,例如,美國專利第6,596,541號)。抗體亦可藉由本文所述及此項技術中已知的重組技術來製備。
本發明之抗體可用於本文所述的任何診斷及分析方法及組成物。
多核苷酸、寄主細胞及產生方法
某些實施例係關於編碼抗體及其抗原結合片段之多核苷酸,及例如包含此等多核苷酸之載體,其中多核苷酸可操作連接至一或多個調節元件。亦包括重組寄主細胞,其包含此等多核苷酸、載體、抗體及其抗原結合片段;另外包括前述者之重組產生的方法。
抗體及其抗原結合片段可使用標準技術來製備。在特定實施例中,抗體或其抗原結合片段在表現系統中表現為重組蛋白質,如本文所述及此項技術中已知的。
多核苷酸可含有編碼抗體或其抗原結合片段之核酸之一個或多個複本。在特定實施例中,多核苷酸序列包含以下表3中之至少一個序列或其變異體或片段。
適合的載體可經選擇或構築而含有適當調節序列,包括啟動子序列、終止子序列、多腺苷酸化序列、強化子序列、標記基因及適當時其他序列。載體可為病毒性質體,例如噬菌體,或適當時為噬質體。對進一步細節而言,參見,例如,Molecular Cloning:a Laboratory Manual:第2版,Sambrook等人,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。用於操縱核
酸,例如用於製備核酸構築體、突變誘發、測序、將DNA引入細胞中並基因表現以及分析蛋白質之許多已知的技術及協定詳細地描述於Current Protocols in Molecular Biology,第二版,Ausubel等人編,John Wiley & Sons,1992或其後續更新中。
如將藉由熟習此項技術者所理解的,在一些情況下可能有利的是:產生擁有非天然存在密碼子之編碼多肽的核苷酸序列。例如,受特定原核或真核寄主偏好的密碼子可經選擇以增加蛋白質表現之速率,或產生具有合乎需要性質之重組RNA轉錄物,該等性質諸如半衰期,其比自天然存在序列產生的轉錄物之半衰期長。此等多核苷酸通常稱為「密碼子最佳化的」。本文所述的任何多核苷酸可用於密碼子最佳化形式。在某些實施例中,多核苷酸可經密碼子最佳化以用於特定細菌,諸如,大腸桿菌(E.coli)或酵母,諸如啤酒酵母菌(S.cerevisiae)(參見,例如,Burgess-Brown等人,Protein Expr Purif.59:94-102,2008)。
在一些實施例中,編碼抗體或其抗原結合片段之核酸或載體係直接引入寄主細胞中,且在足以誘發編碼多肽之表現的條件下孵育細胞。因此,根據某些相關實施例,提供重組寄主細胞,其包含編碼本文所述的一或多種抗體或其抗原結合片段(視情況與抗體之其他組分(例如,Fc區)組合)之多核苷酸,且視情況包含另外的外源多核苷酸。
抗體或其抗原結合片段於寄主細胞中之表現可藉由在適當條件下培養重組寄主細胞(含有多核苷酸)而達成。在藉由表現而產生之後,可使用任何適合的技術將抗體或其抗原結合片段分離及/或純化,且隨後按需要使用。術語「寄主細胞」係用於指代已引入或能夠引入編碼本文所述的抗體或其抗原結合片段中之一或多者的核酸序列之細胞。術語包括親本細胞之後代,無論該後代在形態上或在遺傳構成上是否與原始親本細胞一致,只要所選擇基因存在即可。寄主細胞可針對某些特性來選擇,該等特性例如胺基醯基tRNA合成酶之表現,該胺基醯基tRNA合成酶可將非天然胺基酸併入抗體或其抗原結合片段中。
用於在各種不同寄主細胞中選殖及表現異源或重組蛋白質之系統為熟知的。適合的寄主細胞包括哺乳動物細胞、細菌、酵母及桿狀
病毒系統。此項技術中可利用於表現蛋白質之哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、嬰兒倉鼠腎細胞、HEK-293細胞、NSO小鼠黑素瘤細胞及許多其他細胞。有用的哺乳動物寄主細胞系之另外實例包括藉由SV40轉型的猴腎CV1系(COS-7,ATCC CRL 1651);人類胚腎系(針對在懸浮液培養物中之生長來次選殖的293或293細胞,Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977));嬰兒倉鼠腎細胞(BHK,ATCC CCL 10);小鼠塞氏細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);人類宮頸癌瘤細胞(HELA,ATCC CCL 2);犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34);水牛鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);人類肺細胞(W138,ATCC CCL 75);人類肝細胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51);TR1細胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC 5細胞;FS4細胞;以及人類肝腫瘤系(Hep G2)。其他有用的哺乳動物寄主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等人,PNAS USA 77:4216(1980));以及骨髓瘤細胞系,諸如NSO及Sp2/0。為回顧適用於抗體產生之某些哺乳動物寄主細胞系,參見,例如,Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C Lo編,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),第255-268頁。某些較佳哺乳動物細胞表現系統包括基於CHO及HEK293-細胞之表現系統,其包括293F細胞。哺乳動物表現系統可利用例如T形燒瓶、滾瓶或細胞工廠中之黏附細胞系,或例如1L及5L旋轉器、5L、14L、40L、100L及200L攪拌槽生物反應器或20/50L及100/200L生物反應器以及此項技術中已知的其他者中之懸浮液培養物。
常用的較佳細菌寄主為大腸桿菌。蛋白質於諸如大腸桿菌之原核細胞中之表現在此項技術中已良好確立。為回顧,參見,例如Pluckthun,A.Bio/Technology.9:545-551(1991)。在培養物中之真核細胞中之表現亦可由熟習此項技術者利用來作為用於多肽之重組產生之選擇(參見Ref,Curr.Opinion Biotech.4:573-576,1993;以及Trill等人,Curr.Opinion Biotech.6:553-560,1995)。在特定實施例中,蛋白質表現可藉由T7 RNA聚合酶(例如,pET載體系列)控制。此等及相關實施例可利用表現寄主菌株BL21
(DE3),一種BL21之λDE3溶原,其支援T7介導之表現且在lon及ompT蛋白酶中缺少以達改良標靶蛋白質穩定性。亦包括運載極少用於大腸桿菌中的編碼tRNA之質體的表現寄主菌株,諸如RosettaTM(DE3)及Rosetta 2(DE3)菌株。細胞溶解及樣本處置亦可使用諸如Benzonase®核酸酶及BugBuster®蛋白質提取試劑之試劑來改良。對細胞培養而言,自動誘發培養基可改良包括高產量表現系統之許多表現系統之效率。此類型之培養基(例如,Overnight ExpressTM自動誘發系統)經由代謝遷移而不添加諸如IPTG之人工誘發劑來逐步引出蛋白質表現。特定實施例使用六組胺酸標記(諸如His˙Tag®融合物),繼之以固定金屬親和力層析(IMAC)純化或相關技術。然而,在某些態樣中,臨床等級蛋白質可在使用或不使用親和力標記的情況下自大腸桿菌包涵體分離(參見,例如,Shimp等人,Protein Expr Purif.50:58-67,2006)。作為另一實例,某些實施例可使用冷休克誘發的大腸桿菌高產率生產系統,因為在低溫下蛋白質於大腸桿菌中之過表現改良其溶解度及穩定性(參見,例如,Qing等人,Nature Biotechnology.22:877-882,2004)。
另外,寄主細胞菌株可針對其調變***序列之表現或以所欲方式加工所表現蛋白質之能力來加以選擇。多肽之此等修飾包括但不限於轉譯後修飾,諸如乙醯化、羧基化、醣基化、磷酸化、脂溶化及醯化。裂解蛋白質之「蛋白質前體(prepro)」形式的轉譯後加工亦可用於促進正確的***、折疊及/或功能。除細菌細胞之外,可選擇諸如酵母、CHO、HeLa、MDCK、HEK293及W138之不同寄主細胞來確保所關注蛋白質(例如,抗體)之正確修飾及加工,該等寄主細胞具有或甚至缺乏達成此等轉譯後活性之特定細胞機器及特性機制。
對重組蛋白質之長期、高產率生產而言,穩定表現通常較佳。例如,穩定地表現所關注多核苷酸之細胞系可使用表現載體來轉型,該等表現載體可含有複製之病毒起源及/或內源性表現元件,以及處於相同或單獨載體上之可選擇標記基因。在載體引入之後,可使細胞在富集培養基中生長約1-2天,之後將培養基交換為選擇性培養基。可選擇標誌物之目的為賦予選擇抵抗力,且可選擇標誌物之存在允許成功地表現所引入序列之細胞之生長及回收。穩定轉型細胞之抗性純系可使用對細胞類型為適當
的組織培養技術來增殖。亦可使用諸如藉由暫態轉染或感染進行的暫態生產。適用於暫態生產之示範性哺乳動物表現系統包括基於HEK293(例如,293F細胞)及CHO之系統。
利用所關注多核苷酸序列轉型之寄主細胞可在適用於自細胞培養物表現及回收蛋白質之條件下培養。某些特定實施例利用無血清細胞表現系統。實例包括可在無血清培養基上生長之HEK293細胞及CHO細胞(參見,例如,Rosser等人,Protein Expr.Purif.40:237-43,2005;以及美國專利第6,210,922號)。
藉由重組細胞產生的蛋白質可根據此項技術中已知的各種技術純化及表徵。用於執行蛋白質純化並分析蛋白質純度之示範性系統包括快速蛋白質液體層析(FPLC)(例如,AKTA及Bio-Rad FPLC系統)、高效液相層析(HPLC)(例如,Beckman及Waters HPLC)。用於純化之示範性化學方法包括離子交換層析(例如,Q、S)、粒徑排阻層析、鹽梯度、親和力純化(例如,Ni、Co、FLAG、麥芽糖、麩胱甘肽、蛋白質A/G)、凝膠過濾、逆相、陶瓷HyperD®離子交換層析以及疏水性相互作用管柱(HIC),以及此項技術中已知的其他者。亦包括諸如以下者之分析方法:SDS-PAGE(例如,考馬斯、銀染色)、免疫墨點、Bradford及ELISA,該等方法可用於生產或純化製程之任何步驟期間,典型地用以量測蛋白質組成物之純度。
亦包括將重組產生的蛋白質(例如,抗體)濃縮之方法。實例包括凍乾,其典型地在溶液含有不同於所關注蛋白質之可溶性低的組分時使用。凍乾常常在HPLC運作之後執行,且可自混合物移除最具揮發性組分或所有揮發性組分。亦包括超濾技術,其典型地使用一或多種選擇性可滲透膜來濃縮蛋白質溶液。該膜允許水及小分子通過且保留蛋白質;溶液可藉由機械泵、氣體壓力或離心以及其他技術來抵靠膜而受力。
在某些實施例中,如根據此項技術中之例行技術所量測,抗體或其抗原結合片段具有至少約90%之純度。在某些實施例中,作為診斷組成物或某些治療組成物,抗體或其抗原結合片段具有至少約95%之純度。在特定實施例中,作為治療或醫藥組成物,抗體或其抗原結合片段具有至少約97%或98%或99%之純度。在其他實施例中,當用作參考或研究
試劑時,抗體或其抗原結合片段可具有較小純度,且可具有至少約50%、60%、70%或80%之純度。純度可整體量測或相對於諸如其他蛋白質之所選組分來量測,例如量測基於蛋白質之純度。
在某些實施例中,本文所述的組成物為實質上約無內毒素的,包括例如約95%無內毒素的、較佳約99%無內毒素的且更佳約99.99%無內毒素的。可根據此項技術中之例行技術來偵測內毒素之存在,如本文所述的。在特定實施例中,抗體或其抗原結合片段係於實質上無血清培養基中由諸如哺乳動物或人類細胞之真核細胞製成。
使用方法
本發明之實施例包括使用本文所述的抗體及其抗原結合片段來測定諸如生物樣本之樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之存在、不存在、量或含量的方法。此等方法包括例如使用抗體或其抗原結合片段作為伴隨式診斷來鑑定適於精胺酸剝奪療法、包括適於至少一種精胺酸耗盡劑之投藥的受試者。在一些實施例中,若生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量相對於對照物減少,則受試者視為適用於精胺酸剝奪療法。在特定實施例中,該等方法包括使用抗體或其抗原結合片段作為伴隨式診斷來鑑定患有或疑似患有展現精胺琥珀酸合成酶之缺少(例如,精胺琥珀酸合成酶之減少表現)的癌症或腫瘤之受試者,且治療待利用精胺酸剝奪療法治療的受試者或使該受試者利用精胺酸剝奪療法來治療。
某些實施例因此包括測定生物樣本中人類精胺琥珀酸合成酶多肽之量的方法,該等方法包含:(a)獲得或接收生物樣本,該生物樣本視情況來自受試者;(b)使生物樣本與本文所述的抗體或其抗原結合片段接觸;以及(c)量測樣本中抗體或其抗原結合片段之量,其中抗體或其抗原結合片段之量決定樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量。
亦包括鑑定生物樣本中精胺琥珀酸合成酶之缺少的方法,該等方法包含:(a)獲得或接收生物樣本,該生物樣本視情況來自受試者;(b)使生物樣本與本文所述的抗體或其抗原結合片段接觸;(c)量測樣本中抗體或其抗原結合片段之量,其中抗體或其抗原結合片段之量決定樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量;以及(d)若生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量
相對於對照物減少,則鑑定為樣本中精胺琥珀酸合成酶之缺少。
一些實施例包括鑑定適於精胺酸剝奪或耗盡療法之受試者的方法,該等方法包含:(a)獲得或接收來自受試者之生物樣本,該生物樣本視情況經由保健提供方獲得或接收;(b)使生物樣本與本文所述的抗體或其抗原結合片段接觸;(c)量測樣本中抗體或其抗原結合片段之量,其中抗體或其抗原結合片段之量決定樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量;以及(d)若生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量相對於對照物減少,則將受試者鑑定為適用於精胺酸剝奪療法。
在一些實施例中,步驟(a)包含自保健提供方接收生物樣本,該保健提供方諸如醫師、診療所或醫院。接收生物樣本及/或執行測試之實體可與保健提供方相關聯或與保健提供方分離。在特定實施例中,接收樣本及/或執行測試之實體為第三方診斷公司。在一些實施例中,接收樣本及/或執行測試之實體為臨床或醫院相關聯的診斷實驗室。在一些實施例中,該方法(例如,步驟(c)或(d))包含向相同或不同保健提供方(例如,醫師)提供關於生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量的資訊。
任何此等及相關實施例可進一步包含向(d)之受試者投與如本文所述及/或此項技術中已知的至少一種精胺酸耗盡劑。
亦包括用於診斷並治療受試者之方法,該等方法包含:(a)分析試驗之結果,該試驗指示來自受試者之生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量,其中該試驗係使用本文所述的抗體或其抗原結合片段來執行;(b)若來自(a)之結果指示生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量相對於對照物減少,則將患者診斷為適用於精胺酸剝奪療法;以及(c)藉由投與至少一種精胺酸耗盡劑來治療(b)之受試者。
用於治療受試者之方法包含:(a)請求測定來自受試者之生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量的試驗,其中該試驗係使用本文所述的抗體或其抗原結合片段來執行;以及(b)若來自(a)之試驗指示生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量相對於對照物減少,則向受試者投與至少一種精胺酸耗盡劑。
在特定實施例中,受試者為哺乳動物,例如,人類患者。
在某些實施例中,受試者患有或疑似患有癌症或腫瘤。癌症及腫瘤之實例包括黑素瘤、肝腫瘤、胰腺癌、***癌、間皮瘤、肉瘤、頭頸癌、白血病、急性骨髓白血病、復發性急性骨髓白血病、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌、神經膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、諸如腎細胞癌瘤之腎癌、膀胱癌、子宮癌、食管癌、腦癌、子宮頸癌、睪丸癌及胃癌。
術語「黑素瘤」包括由皮膚及其他器官之黑色素細胞系統產生的惡性或良性腫瘤,該等其他器官包括口腔、食道、肛管、***、軟腦膜及/或結膜或眼睛。作為非限制性實例,術語「黑素瘤」包括肢端小痣性黑素瘤、無黑色素黑素瘤、良性幼年黑素瘤、小痣性惡性黑素瘤、惡性黑素瘤、結節狀黑素瘤、甲下黑素瘤及淺表擴散性黑素瘤。
「肝腫瘤」可為肝之惡性或良性腫瘤,作為非限制性實例,其包括肝細胞癌瘤、惡性肝腫瘤、纖維層狀肝腫瘤及肝細胞膽管癌、混合型肝細胞膽管癌,以及未分化肝細胞癌瘤。
術語「肉瘤」包括在結締組織中產生的惡性或良性腫瘤,作為非限制性實例,該結締組織包括骨、軟骨及橫紋肌。肉瘤之實例包括但不限於脂肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、纖維肉瘤、神經纖維肉瘤、腸胃基質瘤(GIST)、尤恩氏肉瘤、骨肉瘤及軟骨肉瘤。
「乳癌」係指***中產生的惡性或良性腫瘤,且包括但不限於局部階段性乳癌、區域階段性腫瘤及遠側階段性癌症。乳癌之實例包括但不限於腺癌(包括管狀癌瘤及小葉性癌瘤)、小葉原位癌(LCIS)髓質癌瘤、黏液素癌、乳頭之佩吉特氏病、葉狀腫瘤及管狀癌瘤。
此等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、垂體癌、食管癌、星狀細胞瘤、軟組織肉瘤、非小細胞肺癌、肺之腺癌、肺之鱗狀細胞癌、腹膜之癌症、肝細胞癌、腸胃癌、胰腺癌、神經膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌瘤、唾液腺癌瘤、腎癌、肝癌、***癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌瘤、腦癌、子宮內膜癌、睪丸癌、膽管癌、膽囊癌瘤、胃癌、黑素瘤及各種類型之頭頸癌。在特定實施例中,癌症為以下者之癌
症:***、頭腦、***、腎、胰腺、肺、甲狀腺、結腸、子宮頸、卵巢、睪丸、直腸、膽囊、肛門、脾、肝、皮膚、骨、垂體、子宮內膜、胃、血液或淋巴腺。
生物樣本可包括任何種類之樣本、流體或組織。生物樣本之非限制性實例包括血液、血漿、皮膚、毛髮、毛囊、唾液、口腔黏膜、***黏膜、汗液、淚液、上皮組織、尿、***、***、精漿、攝護腺液、***物、生檢物、腹水、腦脊髓液、淋巴、組織提取物樣本及生檢物樣本,諸如癌症或腫瘤生檢物樣本或疑似癌症或腫瘤生檢物樣本。癌性或腫瘤生檢物樣本之特定實例包括來自以下者之彼等生檢物樣本:皮膚組織、肝組織、胰腺組織、***組織、間皮組織、上皮組織、卵巢組織、結腸直腸組織、胃組織、腦組織、肺組織、腎組織、膀胱組織、子宮組織、食道組織、子宮頸組織、睪丸組織、***組織及間葉組織,諸如骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織、血液及造血細胞/組織。
在一些實施例中,若生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量或含量相對於對照物減少,則將生物樣本鑑定為缺少精胺琥珀酸合成酶,或將受試者鑑定或診斷為適用於精胺酸剝奪療法。在一些實施例中,對照物為參考標準、來自健康受試者之生物樣本或來自同一受試者之健康生物樣本。在一些實施例中,對照物為來自同一受試者之非癌性生物樣本,例如來自與癌症或疑似癌症相同組織類型之非癌性生物樣本。
在特定實施例中,例如,為鑑定適於精胺酸剝奪療法之受試者,生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量或含量相對於對照物(例如,非癌性組織、參考標準)減少統計顯著量。僅僅舉例說明,在一些態樣中,生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量或含量相對於對照物減少約或至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%,包括其間所有整數及範圍。在特定實施例中,生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量或含量不可偵測或實質上不可偵測。
樣本中抗體及因此精胺琥珀酸合成酶多肽之存在、不存在、量或含量可根據此項技術中的任何種類之技術量測。例如,某些實施例可使用標準方法及偵測器。實例包括免疫組織化學(IHC)、西方墨點、免測沈
澱法、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、狹縫墨點及肽質量指紋鑑定。某些實施例可使用細胞分選或細胞可視化或成像裝置/技術,以偵測或定量抗體之量或含量。實例包括流式細胞術(或FACS)、免疫螢光分析(IFA)及原位雜交技術,諸如螢光原位雜交(FISH)。
某些實施例可使用習知生物學方法、軟體及系統以達診斷目的。電腦軟體產品或方法典型地包括或使用具有電腦可執行指令之電腦可讀媒體以用於執行方法之邏輯步驟。適合的電腦可讀媒體包括軟碟、CD-ROM/DVD/DVD-ROM、硬碟機、快閃記憶體、ROM/RAM、磁帶等等。電腦可執行指令可以適合的電腦語言或若干種語言之組合來寫入。基本的計算生物學方法描述於例如Setubal及Meidanis等人,Introduction to Computational Biology Methods(PWS Publishing Company,Boston,1997);Salzberg,Searles,Kasif,(編),Computational Methods in Molecular Biology,(Elsevier,Amsterdam,1998);Rashidi及Buehler,Bioinformatics Basics:Application in Biological Science and Medicine(CRC Press,London,2000),以及Ouelette及Bzevanis Bioinformatics:A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins(Wiley & Sons,Inc.,2nd ed.,2001)中。參見美國專利第6,420,108號。
亦包括利用精胺酸剝奪或耗盡療法治療受試者之方法。在一些實施例中,精胺酸剝奪或耗盡療法包括精胺酸耗盡劑之投藥。精胺酸耗盡劑之非限制性實例包括精胺酸脫亞胺酶(ADI)多肽、精胺酸酶多肽、精胺酸脫羧酶多肽及精胺酸激酶多肽。
在特定實施例中,精胺酸耗盡劑為ADI多肽,例如重組ADI多肽。治療ADI多肽之實例描述於例如WO 2013/151568;及美國申請案第US 14/214,040號;第US 13/214,398號;第US 10/645,723號;第US 10/757,843號中;其皆以全文引用之方式併入。ADI多肽可自包括例如微生物、重組生物技術或其任何組合之任何來源獲得、選殖或產生。例如,ADI基因及多肽可自以下屬之微生物選殖並製備:黴漿菌屬(Mycoplasma)、梭菌屬(Clostridium)、桿菌屬(Bacillus)、疏螺旋體屬(Borrelia)、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)及梨形鞭
毛蟲屬(Giardia)。在某些實施例中,ADI多肽來自肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae)、人型黴漿菌(Mycoplasma hominis)、精胺酸黴漿菌(Mycoplasma arginini)、產膿鏈球菌(Steptococcus pyogenes)、肺炎鏈球菌(Steptococcus pneumoniae)、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、阿氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)、腸蘭賈地鞭毛蟲(Giardia intestinalis)、產氣莢膜芽胞梭菌(Clostridium perfringens)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)或其任何組合。
在某些實施例中,ADI多肽來自黴漿菌屬之微生物。在一些實施例中,ADI來自人型黴漿菌、關節炎黴漿菌(Mycoplasma arthritides)、精胺酸黴漿菌或其任何組合。在特定實施例中,ADI多肽包含SEQ ID NO:6(來自人型黴漿菌之ADI,參見以下表4)之胺基酸序列,或其具有ADI活性(例如,能夠將精胺酸代謝成瓜胺酸及氨)之變異體或片段。在某些實施例中,ADI多肽經修飾(例如,藉由取代、缺失修飾)以移除SEQ ID NO:6之位置112、374、405及/或408處之至少一個離胺酸。
天然ADI可在微生物中找到,且為抗原性的並自患者之循環快速清除。可藉由修飾ADI來克服此等問題。因此,在某些實施例中,ADI多肽包含(例如,共價連接至)改質劑,包括但不限於巨分子聚合物、蛋白質、肽、多醣或其他化合物。ADI多肽及改質劑可藉由共價鍵或非共價相互作用連接,以形成穩定結合物或穩定組成物,從而達成所需效應。在某些實施例中,經修飾ADI多肽保持ADI之生物活性,且相對於未修飾ADI而具有更長活體內半衰期及更低抗原性。在一些實施例中,ADI多肽
經由連接基共價鍵結至聚乙二醇。在特定實施例中,ADI多肽為ADI-PEG 20。
在一些實施例中,精胺酸耗盡劑為精胺酸酶I多肽,例如,重組精胺酸酶I多肽。在特定實施例中,精胺酸酶I多肽包含人類精胺酸酶I蛋白質之至少50個鄰接胺基酸(參見UniProt:P05089)。在特定實施例中,精胺酸耗盡劑為精胺酸酶II多肽,例如,重組精胺酸酶II多肽。在特定實施例中,重組人類精胺酸酶II多肽包含人類精胺酸酶II蛋白質之至少50個鄰接胺基酸(參見UniProt:P78540)。在一些實施例中,精胺酸耗盡劑為包含諸如鈷原子或錳原子之金屬輔因子之精胺酸酶多肽。在某些實施例中,含鈷精胺酸酶多肽為如例如WO 2010/051533中所述的多肽。
在一些實施例中,精胺酸耗盡劑為精胺酸脫羧酶多肽,例如重組精胺酸脫羧酶多肽。在一些實施例中,精胺酸耗盡劑包含人類精胺酸脫羧酶之至少50個鄰接胺基酸(參見UniProt:Q96A70)。
在特定實施例中,精胺酸耗盡劑為聚乙二醇化多肽。
在一些情況下,本文中提供的方法可包括在精胺酸耗盡劑之投藥之前、與該投藥並行或在該投藥之後向受試者投與一或多種化療劑或其他抗癌劑。在某些實施例中,待利用精胺酸剝奪療法治療的受試者經歷、已經歷或將要經歷手術、輻射療法、免疫療法及/或激素療法。
組成物及套組
亦包括組成物,該等組成物包含本文所述的抗體或其抗原結合片段,其視情況與適合的載劑組合。組成物或載劑可為液體、半液體、半固體或固體。
溶液或懸浮液可包括例如無菌稀釋劑(諸如水),鹽水溶液(例如,磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、生理鹽水、林格氏溶液、等張氯化鈉),固定油,聚乙二醇,甘油,丙二醇或其他合成溶劑;抗微生物劑(諸如苄醇及對羥基苯甲酸甲酯);抗氧化劑(諸如抗壞血酸及亞硫酸氫鈉),螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA));及/或緩衝液(諸如,乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽及其他有機酸),包括前述者之組合。作為適合的載劑,亦包括含有增稠劑及助溶劑之溶液,該等增稠劑及助溶劑諸如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合
物。可添加界面活性劑以促進均質溶液或懸浮液之形成。界面活性劑為與抗體或其抗原結合片段非共價地相互作用以便促進結合物於水性系統中之溶解或均質懸浮的化合物。
載劑之另外實例包括低分子量(例如,小於約10個殘基)多肽或肽;蛋白質,諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯啶酮;胺基酸,諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸;單醣、雙醣及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;糖醇,諸如甘露糖醇或山梨糖醇;成鹽相對離子,諸如鈉;非離子界面活性劑,諸如聚山梨醇酯20(TWEENTM)、聚乙二醇(PEG)及泊洛沙姆(PLURONICSTM)及類似物。
在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段可圍堵於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合作用製備之微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠態藥物遞送系統(例如,脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或***液中。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Oslo,A.編(1980)中。粒子或脂質體可進一步包含其他診斷劑,諸如可偵測實體。
在特定實施例中,抗體或其抗原結合片段為冷凍-乾燥或凍乾、冷凍乾燥。此等術語係指冷凍抗體組成物且隨後減少周圍壓力以允許組成物中之冷凍水直接自固相昇華至氣相的脫水製程。亦包括固體組成物,諸如粉末、顆粒、壓縮錠劑、丸劑、膠囊及類似物。在一些實施例中,固體組成物含有一或多種稀釋劑或可食用載劑。在某些實施例中,可存在以下一或多者:黏合劑,諸如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍膠或明膠;以及賦形劑,諸如澱粉、乳糖或糊精;崩解劑,諸如海藻酸、海藻酸鈉、Primogel、玉米澱粉及類似物。
某些實施例包括套組,其包含如本文所述的一或多種抗體或其抗原結合片段,其視情況處於一或多個容器中。套組可包括關於如何使用及/或製備抗體以例如用作偵測劑及/或診斷劑之書面說明書。在一些實施例中,書面說明書描述如何使用抗體或其抗原結合片段來鑑定適於例如利用精胺酸耗盡劑之精胺酸剝奪療法的受試者。在一些實施例中,套組包含
用於例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)或類似測定之材料,其中抗體或其抗原結合片段連接或可連接至固體底質以用於執行ELISA或類似測定。在一些實施例中,套組包含用於免疫組織化學(IHC)測定之材料。
本文中之套組亦可包括適合於或意欲用於所治療適應症或所欲診斷應用的一或多種另外的治療劑或其他組分。另一治療劑可在需要時含於第二容器中。另外的治療劑之實例包括例如如本文所述的精胺酸耗盡劑,諸如精胺酸脫亞胺酶(ADI)多肽、精胺酸酶多肽、精胺酸脫羧酶多肽及精胺酸激酶多肽。在特定實施例中,精胺酸耗盡劑為ADI-PEG 20。
以下實例經由說明方式且不經由限制方式來提供。
實例
執行實驗來鑑定針對蛋白質精胺琥珀酸合成酶之融合瘤抗體純系之VH及VL序列。執行酶聯免疫吸附測定(ELISA)分析來判定作為小鼠IgG2A之融合瘤亞型(參見圖1)。隨後自融合瘤細胞提取RNA,且藉由聚合酶鏈反應(PCR)擴增重鏈及輕鏈之可變區且將其次選殖至小鼠IgG1表現載體中。
為表徵VH序列,鑑定並比對六個產出次純系之胺基酸序列(參見圖2A)。為表徵VL序列,鑑定及比對五個產出次純系之胺基酸序列(參見圖2B)。基於此等純系問之序列相似性,判定VH及VL核苷酸及胺基酸序列,如以下表E1所示。
在293F細胞中重組表現次選殖VH及VL序列(於小鼠IgG1表現載體中),將其分離,且藉由ELISA測試相對於原始融合瘤而言與精胺琥珀酸合成酶抗原之結合。如圖3所示,來自以上表E1之VH及VL序列展示與精胺琥珀酸合成酶抗原0218及0529之強的特異結合。
執行實驗來判定用於偵測各種臨床樣本中精胺琥珀酸合成酶之表現含量的免疫組織化學測定之準確度及精確度。針對精胺琥珀酸合成酶之單株抗體(參見實例1)係與Leica Bond聚合物精製偵測套組一起組合使用,以在超過100種不同組織中偵測表現,該等組織包括正常組織及各種腫瘤組織,諸如肝腫瘤(例如,肝細胞癌瘤)、淋巴瘤、腎細胞癌瘤、橫紋肌肉瘤、神經胚細胞瘤、精細胞瘤、黑素瘤、骨髓(AML)、結腸癌瘤、肺癌瘤、甲狀腺癌瘤、子宮癌瘤、胃癌瘤、腦癌瘤及***癌瘤。臨床樣本組由總共103種組織組成:60種陽性組織及43種陰性組織。
精胺琥珀酸合成酶免疫反應性典型地位於細胞質中,但亦可
觀察到核染色。對染色之解釋係藉由病理學家手動執行。報導具有陽性染色之腫瘤細胞之百分比及平均染色強度。
方法。將福馬林固定、石蠟包埋試樣以4-5μm切斷且裝於帶正電載片上。使載片風乾且隨後置放於60℃烘箱中歷時60分鐘。使用Leica Bond III儀器將載片染色。使用標準Leica Bond脫蠟協定自載片移除石蠟。利用Bond ER1將組織做抗原抽取歷時5分鐘,或利用Bond ER2進行20分鐘。
將小鼠抗精胺琥珀酸合成酶單株抗體以0.625μg/mL之濃度塗覆於載片且孵育15min,或以0.4μg/mL之濃度塗覆且孵育30分鐘。使用Leica Bond聚合物精製偵測套組使後初次染色(staining-post primary)可視化8分鐘,且使聚合物可視化8分鐘。隨後利用Peroxide Block處理載片五分鐘,繼之以Mixed DAB Refine處理十分鐘。利用蘇木精將染色區段對比染色7分鐘。隨後將載片脫水且加以滑動覆蓋。
結果。總體而言,103個樣本中之60個展示上皮細胞及內皮細胞之一致陽性細胞質染色,而各種腫瘤類型中之腫瘤細胞不展示精胺琥珀酸合成酶之表現。腫瘤之染色圖案對比正常組織之染色圖案在所有情況下與文獻中所報導相符。測定間再現性研究展示染色批次之間的100%協和性。將如文獻中報導的陽性樣本及陰性樣本測試多次,且與文獻一致。在脫鈣樣本及非脫鈣樣本之間未觀察到顯著染色差異。
示範性結果展示於圖4-6中。
圖4展示藉由利用抗精胺琥珀酸合成酶單株抗體之免疫組織化學染色在人類癌細胞系A431(圖4A)及SKMEL-3(圖4B)中偵測精胺琥珀酸合成酶表現。
圖5展示藉由利用抗精胺琥珀酸合成酶單株抗體之免疫組織化學染色在正常人類組織(圖5A,腎;圖5B,皮膚;圖5C,肝)中偵測精胺琥珀酸合成酶表現。
圖6展示藉由利用抗精胺琥珀酸合成酶單株抗體之免疫組織化學染色在人類肝細胞癌瘤(HCC)中偵測精胺琥珀酸合成酶表現。圖6A展示精胺琥珀酸合成酶表現之強陽性染色,且圖6B-6C展示精胺琥珀酸合
成酶表現之陰性染色。
此等研究指示:藉由免疫組織化學(IHC)分析測得的抗精胺琥珀酸合成酶單株抗體之效能特性在各種組織類型中對臨床診斷應用而言為可接受的。
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<213> 人工序列
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<223> 藉由六個產出次純系之比對判定的VH鏈
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 藉由六個產出次純系之比對判定的VH鏈
<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 藉由五個產出次純系之比對判定的VL鏈
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 藉由五個產出次純系之比對判定的VL鏈
<210> 5
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<212> PRT
<213> 智人
<210> 6
<211> 409
<212> PRT
<213> 人型黴漿菌
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 藉由六個產出次純系之比對判定的VH CDR1
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 藉由六個產出次純系之比對判定的VH CDR2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 藉由六個產出次純系之比對判定的VH CDR3
<210> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 藉由五個產出次純系之比對判定的VL CDR1
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<213> 人工序列
<220>
<223> 藉由五個產出次純系之比對判定的VL CDR2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 藉由五個產出次純系之比對判定的VL CDR3
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<212> PRT
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<220>
<223> 來自融合瘤抗體純系之產出次純系(6-H6)之VH序列
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<223> 來自融合瘤抗體純系之產出次純系(6-C5)之VH序列
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<220>
<223> 來自融合瘤抗體純系之產出次純系(6-C1)之VH序列
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<220>
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<212> PRT
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<223> 來自融合瘤抗體純系之產出次純系(6-A5)之VH序列
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<223> 來自融合瘤抗體純系之產出次純系(6-D6)之VH序列
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<223> 來自融合瘤抗體純系之產出次純系(4-5)之VL序列
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<223> 來自融合瘤抗體純系之產出次純系(7-2)之VL序列
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<220>
<223> 來自融合瘤抗體純系之產出次純系(7-8)之VL序列
<210> 22
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<220>
<223> 來自融合瘤抗體純系之產出次純系(7-12)之VL序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自融合瘤抗體純系之產出次純系(7-4)之VL序列
Claims (47)
- 一種經分離之抗體或其抗原結合片段,其特異地結合至人類精胺琥珀酸合成酶多肽且包含:重鏈可變區(VH)序列,該序列包含分別於SEQ ID NO:7、8及9中所列明的互補決定區VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3序列;以及輕鏈可變區(VL)序列,該序列包含分別於SEQ ID NO:10、11及12中列明的互補決定區VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3序列。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之抗體或其抗原結合片段,其中該VH序列與SEQ ID NO:1至少90%一致。
- 如申請專利範圍第1或2項之經分離之抗體或其抗原結合片段,其中該VL序列與SEQ ID NO:3至少90%一致。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之抗體或其抗原結合片段,其中該VH序列包含SEQ ID NO:1且該VL序列包含SEQ ID NO:3。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體為完整抗體。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體為單株抗體。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之抗體或其抗原結合片段,其係選自單鏈抗體、Fab或Fab’片段、F(ab’)2片段、ScFv、缺乏鉸鏈區之單價抗體及微型抗體。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含小鼠或人類IgG Fc域。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體為亞型IgG1或IgG2A之小鼠單株抗體。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之抗體或其抗原結合片段,其包含共價連接的可偵測實體。
- 如申請專利範圍第10項之經分離之抗體或其抗原結合片段,其中該可偵測實體為螢光團/螢光染料、基於碘之標籤、放射性同位素或奈米粒子。
- 一種組成物,其包含如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體及適 合的載劑。
- 一種測定生物樣本中人類精胺琥珀酸合成酶多肽之量的方法,該方法包含:(a)獲得或接收生物樣本;(b)使該生物樣本與如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸;以及(c)量測該樣本中該抗體或其抗原結合片段之量,其中該抗體或其抗原結合片段之該量決定該樣本中該精胺琥珀酸合成酶多肽之該量。
- 一種鑑定生物樣本中精胺琥珀酸合成酶之缺少的方法,該方法包含:(a)獲得或接收生物樣本;(b)使該生物樣本與如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸;(b)量測該樣本中該抗體或其抗原結合片段之量,其中該抗體或其抗原結合片段之該量決定該樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量;以及(c)若該生物樣本中該精胺琥珀酸合成酶多肽之該量相對於對照物減少,則鑑定為該樣本中精胺琥珀酸合成酶之缺少。
- 一種鑑定適於精胺酸剝奪療法之受試者的方法,該方法包含:(a)獲得或接收來自該受試者之生物樣本;(b)使該生物樣本與如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸;(c)量測該樣本中該抗體或其抗原結合片段之量,其中該抗體或其抗原結合片段之該量決定該樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量;以及(d)若該生物樣本中該精胺琥珀酸合成酶多肽之該量相對於對照物減少,則將該受試者鑑定為適用於精胺酸剝奪療法。
- 如申請專利範圍第13至15項中任一項之方法,其中步驟(a)包含自保健提供方接收該生物樣本,且其中步驟(d)包含向相同或不同保健提供方提供關於該生物樣本中該精胺琥珀酸合成酶多肽之該量的資訊。
- 如申請專利範圍第13至15項中任一項之方法,其中步驟(b)包含執行免疫組織化學(IHC)測定。
- 一種用於診斷受試者之活體外方法,該方法包含:(a)分析試驗之結果,該試驗指示來自該受試者之生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量,其中該試驗係使用如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體或其抗原結合片段執行;及(b)若來自(a)之該等結果指示該生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之該量相對於對照物減少,則將該患者診斷為適用於 精胺酸剝奪療法。
- 一種至少一種精胺酸耗盡劑之用途,其用於製備治療受試者之癌症之藥劑,其中該治療包含:(a)請求測定來自該受試者之生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之量的試驗,其中該試驗係使用如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體或其抗原結合片段執行;以及(b)若來自(a)之該試驗指示該生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽該之量相對於對照物減少,則向該受試者投與至少一種精胺酸耗盡劑。
- 如申請專利範圍第19項之用途,其中該受試者為人類患者。
- 如申請專利範圍第19項之用途,其中該癌症係選自黑素瘤或、肝腫瘤(heptoma)、肝細胞癌瘤(hepatocellular carcinoma)、胰腺癌、***癌、間皮瘤、肉瘤、頭頸癌、白血病、急性骨髓白血病、復發性急性骨髓白血病、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌、神經膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食管癌、腦癌、子宮頸癌及睪丸癌。
- 如申請專利範圍第19項之用途,其中該生物樣本為生檢物樣本。
- 如申請專利範圍第22項之用途,其中該生檢物樣本為癌症或懷疑癌症生檢物樣本。
- 如申請專利範圍第23項之用途,其中該生檢物樣本係選自皮膚組織、肝組織、胰腺組織、***組織、間皮組織、上皮組織、卵巢組織、結腸直腸組織、胃組織、腦組織、肺組織、腎組織、膀胱組織、子宮組織、食道組織、子宮頸組織、睪丸組織、***組織及間葉組織。
- 如申請專利範圍第24項之用途,其中該間葉組織為骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織、血液或造血細胞/組織。
- 如申請專利範圍第19項之用途,其中該對照物為參考標準、來自健康受試者之生物樣本或來自同受試者之健康生物樣本。
- 如申請專利範圍第26項之用途,其中該對照物為來自該同受試者之非癌性生物樣本,該生物樣本為具有相同組織類型之生物樣本或非相同組織類型之生物樣本。
- 如申請專利範圍第19項之用途,其中該生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之該量相對於該對照物減少統計顯著量。
- 如申請專利範圍第28項之用途,其中該生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之該量相對於該對照物減少約或至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。
- 如申請專利範圍第29項之用途,其中該生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之該量不可偵測或實質上不可偵測。
- 如申請專利範圍第19項之用途,其中該精胺酸耗盡劑係選自精胺酸脫亞胺酶(ADI)多肽、精胺酸酶多肽、精胺酸脫羧酶多肽及精胺酸激酶多肽。
- 如申請專利範圍第31項之用途,其中該ADI多肽為ADI-PEG 20。
- 一種用於診斷人類患者之癌症之活體外方法,該方法包含:(a)分析試驗之結果,該試驗指示來自該受試者之腫瘤生檢物中精胺琥珀酸合成酶多肽之量,其中該試驗係使用如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體或其抗原結合片段執行;及(b)若來自(a)之該等結果指示該腫瘤生檢物中精胺琥珀酸合成酶多肽之該量相對於對照物減少,則將該患者診斷為適用於ADI-PEG 20療法。
- 一種ADI-PEG 20之用途,其用於製備治療受試者之癌症之藥劑,其中該治療包含:(a)請求測定來自該受試者之腫瘤生檢物中精胺琥珀酸合成酶多肽之量的試驗,其中該試驗係使用如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體或其抗原結合片段執行;以及(b)若來自(a)之該試驗指示該生物樣本中精胺琥珀酸合成酶多肽之該量相對於對照物減少,則向該受試者投與ADI-PEG 20。
- 如申請專利範圍第33項之方法,其中該癌症係選自黑素瘤及肝細胞癌瘤。
- 如申請專利範圍第34項之用途,其中該癌症係選自黑素瘤及肝細胞癌瘤。
- 如申請專利範圍第33項之方法,其中步驟(a)包含分析來自免疫組織化學(IHC)測定之載片或結果。
- 如申請專利範圍第34項之用途,其中步驟(a)包含分析來自免疫組織化學(IHC)測定之載片或結果。
- 一種套組,其包含如申請專利範圍第1至11項中任一項之經分離之抗 體或如申請專利範圍第12項之組成物。
- 如申請專利範圍第39項之套組,其包含用於根據如申請專利範圍第13至18、33、35及37中任一項之方法或如申請專利範圍第19至32、34、36及38中任一項之用途使用該抗體之說明書。
- 如申請專利範圍第39項之套組,其進一步包含用於免疫組織化學(IHC)測定之材料及/或說明書。
- 如申請專利範圍第39項之套組,其進一步包含用於酶聯免疫吸附測定(ELISA)之材料及/或說明書,在該測定中將該抗體連接至固體底質以用於執行ELISA。
- 如申請專利範圍第39項之套組,其包含用於使用該抗體來鑑定適於精胺酸剝奪療法之受試者的說明書。
- 如申請專利範圍第43項之套組,其中該精胺酸剝奪療法為精胺酸耗盡劑。
- 如申請專利範圍第39項之套組,其進一步包含至少一種精胺酸耗盡劑。
- 如申請專利範圍第45項之套組,其中該精胺酸耗盡劑係選自精胺酸脫亞胺酶(ADI)多肽、精胺酸酶多肽、精胺酸脫羧酶多肽及精胺酸激酶多肽。
- 如申請專利範圍第46項之套組,其中該ADI多肽為ADI-PEG 20。
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