CN102586166B - 表达禽脑脊髓炎病毒vp1蛋白重组菌的构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白重组菌的构建。本发明通过合成了禽脑脊髓炎VP1基因的引物，构建了带有该基因的高效表达载体的重组菌，实现了禽脑脊髓炎VP1蛋白在大肠杆菌中的高效表达，可溶性蛋白表达量约占菌体总蛋白的60％。该表达产物为胞液中可溶性蛋白，具有天然VP1蛋白的抗原活性，用其制备成的禽脑脊髓炎VP1亚单位疫苗能有效地保护禽类免遭禽脑脊髓炎病毒的攻击。这将为工业化生产禽脑脊髓炎亚单位灭活疫苗奠定了坚实的基础。

Description

表达禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白重组菌的构建

技术领域

本发明涉及表达禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白重组菌的构建，属于分子生物学领域，也属于兽用生物制品领域。

背景技术

禽脑脊髓炎又称流行性震颤，是由禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus，AEV)引起的一种主要侵害雏鸡的传染病，其特征性病理变化为非化脓性脑脊髓炎，典型症状为运动失调，头颈震颤和渐进性麻痹(赵振华、禹旺盛、郝宪谱等.禽脑脊髓炎的发生与诊断.内蒙古畜牧科学.1994，3：34-37)。世界几乎所有饲养商品鸡的地区都发生过该病，我国自上世纪80年代以来各地陆续暴发此病，给养禽业带来较大的经济损失。由于本病具有突然出现，难以预测持续期，可通过水平接触和垂直传播等特点，所以对养禽业的危害非常严重，唯一有效办法是通过对产蛋种鸡接种疫苗来预防后代雏鸡的发病。目前国内对禽脑脊髓炎疫苗的研究大多集中在灭活疫苗的研制，国外为弱毒活疫苗的研究报道。

AEV是小RNA科肠病毒属成员，基因组为单链正股RNA(Calnek，B.W.，Luginbuhl，R.E.，Helmboldt，C.F.，1997.Avian encephalomyelitis diseases of Poultry.Iowa StateUniversity Press，Ames，IA，pp.571-581)。AEV仅有一个翻译起点，编码产生一个多聚蛋白，多聚蛋白在病毒编码的活性蛋白的作用下，级联水解成功能性蛋白，VP1是病毒的四种结构蛋白中的一种，与病毒的侵入及参与构成病毒的抗原成分有关。新加坡的Li Wei(2008)最近报道用细胞表达的VP1亚单位疫苗能有效地保护鸡免受AEV的感染。他们将AEV的主要抗原蛋白VP1、VP0、VP3分别在细胞SF9中进行表达，然后纯化蛋白，制成亚单位疫苗，并对VP1、VP0和VP3生物活性进行了检测，结果发现：VP1是主要的抗原蛋白，能有效地保护鸡免受AEV的感染(Wei L，Chee LL，Wei T et al.The VP1 protein of avian encephalomyelitisvirus is a major host-protective immunogen that serves as diagnosticpotential.J Virol Methods.2008Apr；149(1)：56-62.)。

完整的病原体含有许多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主产生保护性应答。其中某些抗原还能引起过敏，免疫抑制和其他副作用，这是使用完整的病原体做疫苗的缺陷。并且目前国内应用的灭活苗生产制备抗原过程繁琐，而弱毒疫苗现也有接种疫苗发病情况存在。而用亚单位疫苗则可以解决这个问题，尤其是这种疫苗除了具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，敏感性高，不产生其他不相关抗体，免疫效果检测方法方便准确外，还十分易于生产。不用动物体或是胚体生产，不会带有组织残留物。而且不需灭活，但安全性高。

通过对禽脑脊髓炎病毒VP1 cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中一段抗原表位较丰富、能够在原核细胞中高效表达的cDNA序列，构建了原核表达载体，进行原核表达，并成功地表达出可溶性的重组蛋白。

利用本发明可以生产出禽脑脊髓炎亚单位疫苗，具有商业使用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种能表达禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白重组菌的构建，得到的重组菌，以求为大规模工业化生产禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白亚单位疫苗提供生产用菌株。

1.禽脑脊髓炎病毒VP1重组菌的构建

本发明设计合成了能生产禽脑脊髓炎VP1蛋白的基因，这种基因含有如下核苷酸序列(序列1)：

5′-ATGGGGAAAG AGGATGAAGG AGGATTTTCC AGTGTGCCTG AAGTGGAGCA ACATGTTGTT GAGGACAAGGAACCACAGGG ACCTTTGCAC GTGACACCTT TTGGCGCTGT TAAAGCCATG GAGGACCCTC AGTTGGCGAGGAAAACACCT GGTACATTTC CTGAATTAGC TCCTGGTAAA CCTCGACACA CAGTAGACCA TATGGATCTGTATAAGTTTA TGGGGCGTGC CCATTACTTG TGGGGACATA AATTTACCAA AACTGATATG CAGTACACATTCCAGATACC ATTGAGTCCC ATCAAGGAGG GTTTTGTGAC GGGAACGCTT AGGTGGTTTT TAAGTCTTTTCCAATTGTAT CGTGGTTCTC TCGACATTAC CATGACATTC GCAGGAAAGA CTAATGTAGA CGGCATTGTATACTTTGTGC CTGAGGGTGT TGCGATAGAG ACTGAGAGGA AGGAACAGAC CCCTCTGCTC ACGTTGAACTACAAAACATC GGTAGGTGCC ATTAGGTTTA ATACTGGACA AACTACAAAT GTCCAGTTTA GGATCCCTTTCTACACGCCA CTGGAGCACA TCGCAACCCA TTCTAAAAAC GCGATGGACT CAGTCTTGGG GGCAATTACAACTCAGATCA CCAATTATAG TGCTCAGGAT GAGTACCTGC AGGTCACCTA CTATATCAGC TTTAATGAAGATTCACAGTT TTCTGTTCCC AGAGCGGTAC CAGTGGTTAG CTCATTCACT GACACATCTA GCAAGACAGTGATGAATACA TATTGGCTCG ATGATGACGA GTTGGTGGAA GGGTCCTCCC ATTTTAGTTT CGATGAAATTGAGGAGGCCC AATGTTAA-3′

其氨基酸序列为序列2：

Met Gly Lys Glu Asp Glu Gly Gly Phe Ser Ser Val Pro Glu Val Glu

Gln His Val Val Glu Asp Lys Glu Pro Gln Gly Pro Leu His Val Thr

Pro Phe Gly Ala Val Lys Ala Met Glu Asp Pro Gln Leu Ala Arg Lys

Thr Pro Gly Thr Phe Pro Glu Leu Asp Pro Gly Lys Pro Arg His Thr

Val Asp His MetAsp Leu Tyr Lys Phe Met Gly Arg Ala His Tys Leu

Trp Gly His Lys Phe Thr Lys Thr Asp Met Gln Tyr The Phe Gln Ile

Pro Leu Ser Pro Ile Lys Glu Gly Phe Val Thr Gly Thr Leu Arg Trp

Phe Leu Ser Leu Phe Gln Leu Tyr Arg Gly Ser Leu Asp Ile Thr Met

Thr Phe Ala Gly Lys Thr Asn Val Asp Gly Ile Val Tyr Phe Val Pro

Glu Gly Val Ala Ile Glu Thr Glu Arg Lys Glu Gln Thr Pro Leu Leu

Thr Leu Asn Tyr Lys Thr Ser Val Gly Ala Ile Arg Phe Asn Thr Gly

Gln Thr Thr Asn Val Gln Phe Arg Ile Pro Phe Tyr Thr Pro Leu Glu

His Ile Ala Thr His Ser Lys Asn Ala Met Asp Ser Val Leu Gly Ala

Ile Thr Thr Gln Ile Thr Asn Tyr Ser Ala Gln Asp Glu Tyr Leu Gln

Val Thr Tyr Tyr Ile Ser Phe Asn Glu Asp Ser Gln Phe Ser Val Pro

Arg Ala Val Pro Val Val Ser Ser Phe Thr Asp Thr Ser Ser Lyr Thr

Val Met Asn Thr Tyr Trp Leu Asp Asp Asp Glu Leu Val Glu Gly Ser

Ser His Phe Ser Phe Asp Glu Ile Glu Glu Ala Gln Cys

为扩增如上所述的基因，本发明设计并合成了如下相应引物：

primer 1：5′-GGGGAATTCATGGGGAAAGAGGATGAAGGAGGA-3′(序列3)

primer 2：5′-GGGGTCGACTTAACATTGGGCCTCCTCAATTTC-3′(序列4)

将含有如上所述核苷酸序列的基因(禽脑脊髓炎VP1蛋白基因)连入克隆载体PM-18T，并转入大肠埃希氏菌DH5α。将鉴定正确的阳性质粒pMD18-T-VP1，用ECORI和SalI双酶切后，经1.2％琼脂糖凝胶电泳，回收到VP1基因。回收的VP1基因连入pET-32a，构建成禽脑脊髓炎VP1蛋白基因的表达质粒pET-32a-VP1，转化表达型大肠埃希氏菌Rossetta，获得可表达禽脑脊髓炎VP1蛋白的基因工程大肠埃希氏菌。

表达载体pET-32a(+)带有高效表达的T7启动子，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制，能在乳糖的作用下，由宿主菌提供的T7RNA聚合酶进行诱导。构建的禽脑脊髓炎VP1蛋白表达质粒pET-32a-VP1，转化表达型大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Rossetta(购自博迈德公司)后构建成重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Rossetta/pET-32a-VP1(该菌株已于2011年12月13日送北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为；CGMCC No.5581)加入0.2mmol/L乳糖溶液的诱导剂，使禽脑脊髓炎VP1蛋白获得高效表达。

2.表达产物的制备

(1)发酵及诱导表达

将本发明中重组大肠埃希氏菌(Escherichia coii)Rossetta/pET-32a-VP1接种于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑取菌落，在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养液和大肠埃希氏菌培养基(配方为：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％)中培养至菌液OD600为0.6～0.8时，加入终浓度为0.02M的乳糖，25～37℃进行诱导培养5～7h，然后4℃，5000rpm离心5min，收集菌体。用PBS重悬浮菌体。

(2)表达产物的鉴定

将PBS重悬浮的菌体用超声波裂解后，12000r/min离心15min，取上清加入蛋白电泳上样缓冲液(购自北京博迈德科技发展有限公司)，沸水煮8min后，用12％的分离胶进行SDS-PAGE鉴定(图5中，从左到右分别是蛋白marker，对照，全菌-1，全菌-2)。采用硫酸铵沉淀(每100ml上清加5.6g硫酸铵，4℃过夜，然后10000r/min离心10min，收集沉淀，用10mlPBS(pH7.2)进行悬浮)、Ni-NTA对上清液进行纯化(见附注1)。将用Ni-NTA纯化的产物进行SDS-PAGE分析(图6，从左到右分别是洗脱液洗脱下的第一管、第二管和第三管)。

(3)重组蛋白的抗原活性检测(参考图7)

将上述Ni-NTA亲和层析纯化得到的蛋白上清加入到等量的弗氏佐剂(购于sigma公司)中制备亚单位疫苗。取1.5mL对2月龄的试验兔多点皮下注射免疫，在首免后28d，56d分别用弗氏不完全佐剂(购于sigma公司)和纯化蛋白制成的油乳剂疫苗加强免疫，第三次免疫7d后收集血清，用琼脂扩散实验检测抗血清的活性。(图7中，1、7为纯化的VP1蛋白；2、4、6为免疫后的兔血清；3、5为表达菌株Rossetta破碎后的上清-阴性对照)

(4)表达蛋白的纯化过程：将收集的菌体用生理盐水进行悬浮，置超声波破碎菌体。加固体硫酸铵至浓度达到10％，充分溶解后4℃存放过夜。离心收集沉淀。用生理盐水重溶沉淀，并用透析袋(北京瑞达恒辉科技发展有限公司生产，截留量：14KD)进行透析。用AGP法(张淑霞，杨增岐.禽脑脊髓炎琼扩抗原的研制和应用.动物医学进展，2001，22(2)：59-60)测定回收物抗原滴度。

3.本发明所涉及重组菌表达产物制备的疫苗与其他疫苗的比较

见表1。

表1本发明所涉及的疫苗与现在使用的疫苗比较

本发明的积极意义：

本发明涉及一种表达禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白的重组菌的构建。本发明通过合成了禽脑脊髓炎VP1基因的引物，构建了带有该基因的高效表达载体的重组菌，实现了禽脑脊髓炎VP1蛋白在大肠埃希氏菌中的高效表达，可溶性蛋白表达量约占菌体总蛋白的60％。该表达产物为胞液中可溶性蛋白，具有天然VP1蛋白的抗原活性，用其制备成的禽脑脊髓炎VP1亚单位疫苗能有效地保护禽类免遭禽脑脊髓炎病毒的攻击。这将为工业化生产禽脑脊髓炎亚单位灭活疫苗奠定了坚实的基础。

本发明所涉及的微生物

本发明所涉及的微生物为重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Rossetta/pET-32a-VP1，该菌株已于2011年12月13日送北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为；CGMCC No.5581。

附图说明

图1是本发明实施例禽脑脊髓炎VP1蛋白cDNA序列与现有禽脑脊髓炎病毒VR株(购自中国兽医药品监察所，青岛易邦生物工程有限公司保存)核苷酸序列对照图

图2是本发明实施例禽脑脊髓炎VP1蛋白基因PCR的扩增鉴定图其中：1为VP1 PCR产物，M为DNA Maker 2000。

图3是本发明实施例pMD18T-VP1的酶切鉴定图其中：1为pMD18-T-VP1双酶切产物，M为DNA Maker 2000。

图4是本发明实施例禽脑脊髓炎VP1蛋白表达质粒的构建示意图

图5是本发明实施例工程菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检定图其中：从左到右分别是蛋白marker，对照，全菌-1，全菌-2。

图6是本发明实施例纯化的禽脑脊髓炎VP1蛋白SDS-PAG电泳检定图其中：从左到右分别是洗脱液洗脱下的第一管、第二管和第三管。

图7是本发明实施例禽脑脊髓炎VP1蛋白产物的琼脂扩散试验检定图其中：1、7为纯化的VP1蛋白；2、4、6为免疫后的兔血清；3、5为大肠埃希氏菌Rossetta破碎后的上清阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例进行具体说明：

实施例1

1.AEV的繁殖

将AEV VR株无菌接种6日龄SPF鸡胚卵黄囊，37℃孵化，接种第9天后将鸡胚放入4℃冰箱收集有典型病变鸡胚的脑，胰，胃肠道以及尿囊液；用所收集尿囊液作为稀释液处理病料，经研磨，反复冻融3次，7000r/min离心10min，得病毒悬液，-80℃保存。

2.PCR扩增VP1基因，克隆与序列测定(见图1、图2、图3)

按照已发表序列设计合成一对引物P1(序列3)含ECORI酶切位点和引物P2(序列4)含SalI酶切位点。纯化病毒悬液加入Trizol裂解，氯仿抽提，异丙醇沉淀，焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。下游引物42℃进行反转录，得到cDNA。PCR扩增目的片段，并将产物回收用DNA凝胶回收试剂盒回收(购自上海生工生物工程有限公司)。回收产物与pMD18-T载体(大连宝生物公司)进行连接并转化大肠埃希氏菌DH5α。挑取菌落并筛选阳性克隆pMD18-T-VP1。(图1为本发明克隆VP1基因序列与标准AEV VR株序列比较图。图2为1为VP1 PCR产物，M为DNA Maker 2000。图3中1为pMD18-T-VP1双酶切产物，M为DNA Maker2000。)

3.VP1基因的表达(见图4)

将阳性克隆质粒pMD18-T-VP1和表达载体pET-32a载体分别用Ecor I和Sal I双酶切，产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒回收，分别收取0.85kb的VP1和5.9kb的pET-32a片段，在16℃定向连接构建pET-32a-VP1表达质粒，转化至大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，筛选出PCR鉴定正确的阳性克隆。测序验证序列和读码框无误后，将阳性质粒pET-32a-VP1转化至表达型大肠埃希氏菌Rossetta(购自北京博迈德科技发展有限公司)中，构建出重组大肠埃希氏菌Rossetta/pET-32a-VP1，该菌株已于2011年12月13日送北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为；CGMCC No.5581。。挑取含阳性质粒pET32a-VP1的单克隆菌落接种于含氨苄青霉素和氯霉素LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。次日收获菌液再次接种于含氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基进行扩大培养，37℃振荡培养至测定A600＝0.6～0.8时，按终浓度0.02mmol/L加入0.2mmol/L乳糖，25～37℃诱导6h，4℃，5000r/min离心5min。用PBS重悬浮菌体。

4.表达菌的裂解和蛋白电泳(见图5、图6)

将PBS重悬浮的菌体用超声波裂解后，12000r/min离心15min，取上清加入蛋白电泳上样缓冲液(购自北京博迈德科技发展有限公司)，沸水煮8min后，用12％的分离胶进行SDS-PAGE鉴定(图5中，从左到右分别是蛋白marker，对照，全菌-1，全菌-2)。采用硫酸铵沉淀(每100ml上清加5.6g硫酸铵，4℃过夜，然后10000r/min离心10min，收集沉淀，用10mlPBS(pH7.2)进行悬浮)、Ni-NTA对上清液进行纯化(见附注1)。将用Ni-NTA纯化的产物进行SDS-PAGE分析(图6，从左到右分别是洗脱液洗脱下的第一管、第二管和第三管)。

5.重组蛋白的抗原活性检测(见图7)

将上述Ni-NTA亲和层析纯化得到的蛋白上清加入到等量的弗氏佐剂(购于sigma公司)中制备亚单位疫苗。取1.5mL对2月龄的试验兔多点皮下注射免疫，在首免后28d，56d分别用弗氏不完全佐剂(购于sigma公司)和纯化蛋白制成的油乳剂疫苗(弗氏不完全佐剂∶纯化蛋白＝1∶1)加强免疫，第三次免疫7d后收集血清，用琼脂扩散实验检测抗血清的活性。(图7中，1、7为纯化的VP1蛋白；2、4、6为免疫后的兔血清；3、5为大肠埃希氏菌Rossetta破碎后的上清阴性对照)

实施例2

1.发酵及诱导表达

将重组大肠埃希氏菌Rossetta/pET-32a-VP1接种于氨苄青霉素+氯霉素的LB平板上，37℃培养10～12h。挑取10个较大的光滑菌落，接种于500mL加氨苄青霉素+氯霉素的LB培养液中。37℃震荡培养过夜。按2％的体积比将饱和菌液转接于20,000mL的大肠埃希氏菌培养基(配方为胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％)中。37℃，30％氧饱和度培养至培养液的0D值为0.6～0.8时，加入0.2M乳糖至终浓度为0.02M，再继续培养5～7h。离心收集菌体。按1份菌体湿重加入4份生理盐水。重悬菌体，-20℃保存。

2、表达蛋白的纯化过程：将冻存的菌体混悬液在4℃解冻。加生理盐水至1∶10的比例。置超声波下至95％以上的菌体破碎。加固体硫酸铵至浓度为10％，充分溶解后4℃存放过夜。12000r/min离心20min。收集沉淀。用生理盐水重溶沉淀，转入透析袋中。用生理盐水透析48h。用AGP法测定回收物抗原滴度。加生理盐水稀释至抗原滴度为1∶16。纯化产物用紫外光吸收的方法测定总蛋白含量为1mg/ml，然后用AGP法测定抗原滴度为1∶512。得单位蛋白重量下AGP滴度值为1∶512。

实施例3

疫苗的制备：

用实施例二得到的重组菌CGMCC No.5581表达产物作为制备亚单位疫苗的抗原，按常规矿物油佐剂灭活疫苗方法制成疫苗。

实施例4(列表说明试验结果更好)

将制备的亚单位疫苗颈部皮下注射(0.5ml/只)免疫14周龄罗曼蛋种鸡10只，另10不免疫作对照。免疫后2、7、14、21、27、36、48、50周采血，用爱德士的禽脑脊髓炎抗体检测试剂盒进行抗体检测；免疫后14、36、52周，随机各抽取免疫后的鸡下的种蛋30枚，孵化至6日龄时，取受精胚各20枚，分别卵黄囊接种10倍稀释的AE强毒(VR株)，0.2ml/枚，37℃孵育(48h内死亡者弃去，不入记录)至正常出雏日。结果(下表1)表明：免疫后2周后用爱德士禽脑脊髓炎抗体检测试剂盒检测抗体为阳性；所产种蛋，孵化后接种禽脑脊髓炎强毒，雏鸡正常出壳。说明该亚单位疫苗效果确实，免疫种蛋鸡所产种(蛋孵化后)能有效抵抗禽脑脊髓炎强毒攻击。

表1蛋种鸡免疫效力试验结果

注：ELISA抗体阳性判定标准，S/P≥0.2者为阳性。

附注1

Ni-NTA亲和层析方法：

1.Ni-NTA His蛋白纯化介质装柱，3倍介质体积的MillQ洗涤介质表面；

2.加入0.1mol/L NiSO4至介质全部变蓝，MillQ洗涤至流出液无色；

3.1×Start Buffer平衡纯化介质，将蛋白上清通过柱介质进行目的蛋白结合；

4.1×Start Buffer洗涤至没有蛋白流出(以分光光度仪检测OD判断)；

5.以含不同咪唑浓度的缓冲液进行梯度洗脱，分管收集各浓度下起蛋白峰(根据流出液OD值的变化通过自动平衡记录仪记录在格线纸上)的流出液至最后无蛋白流出为止。

Claims (2)

1.一种表达禽脑脊髓炎VP1蛋白重组菌，其特征在于该重组菌是将含有所述禽脑脊髓炎VP1蛋白基因的核苷酸片段连入克隆载体pMD18-T，并转入大肠埃希氏菌DH5α，其中禽脑脊髓炎VP1蛋白基因的核苷酸序列如序列1所示；将鉴定正确的阳性质粒，pMD18-T-VP1用ECORI和SalI双酶切后，经1.2%琼脂糖凝胶电泳，回收到VP1基因；回收的VP1基因连入pET-32a，构建成禽脑脊髓炎VP1蛋白基因的表达载体pET-32a-VP1，转化表达型大肠杆菌Rossetta，获得可表达禽脑脊髓炎VP1蛋白的基因工程大肠埃希氏菌pET-32a-VP1/Rossetta株，该菌株已于2011年12月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.5581。 

2.权利要求1所述一种表达禽脑脊髓炎VP1蛋白重组菌的应用，其特征在于该表达禽脑脊髓炎VP1蛋白重组菌CGMCCNo.5581用于制备禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白亚单位疫苗。 

Images