CN103897065A - 牛Asia1/O型***双价多表位疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛Asia1/O型***双价多表位疫苗及其制备方法和应用，属于兽用生物疫苗领域。本发明的一种牛Asia1/O型***病毒复合多表位重组抗原，是通过将我国流行的牛O型和Asia1型***病毒代表性毒株的优势抗原表位进行串联后与牛IgG重链恒定区偶联得到的。免疫效力实验证实本发明制备得到的牛Asia1/O型***双价多表位疫苗具有良好的免疫原性，无论是免疫豚鼠还是免疫牛后均能够诱导机体产生高水平的保护性抗体，而且接种后对免疫动物安全无害，是一种具有广阔前景的新型疫苗，对我国牛Asia1和O型***的防控提供物质储备和技术支撑，具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种牛***病毒重组抗原及其制备方法和应用，特别涉及一种牛Asia1/O型***双价多表位疫苗及其制备方法和应用，本发明属于兽用生物疫苗领域。
背景技术
***作为感染主要经济畜种猪、牛和羊的重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康发展，而且涉及动物源性食品安全以及其外贸出口。一旦发生疫情将损失惨重，政治影响恶劣。灭活疫苗在防控FMD疫情中发挥着十分重要的作用，但由于生产此类疫苗需要建设防止病原体逃逸的高级别生物安全生产车间，区分疫苗免疫和自然感染动物（DIVA）。更为严重的是病毒灭活不完全有引起疫苗毒株流行的危险。另外，***病毒不仅血清型众多，而且具有高度的遗传变异能力，具有准种属性。值得一提的是每个血清型之间无交叉免疫保护，病原的这种属性要求针对每个血清型要研制与其相对应的高效疫苗，这增加了***防控的难度，也增加了经费支出。因此，研制高效、安全的多价新型疫苗用于***的防控已刻不容缓。
采用分子生物学，蛋白组学以及反向疫苗学等相关技术研制安全、高效的FMD多价新型疫苗已成为可能。尽管已经有多项关于***新型疫苗的专利获批，包括上海复旦大学郑赵鑫教授研制的猪O型***病毒重组疫苗，本实验室研制的牛Asia1型***重组多表位疫苗（专利号：ZL200910259363.6），羊Asia1型***重组多表位疫苗（专利号：ZL200910224025.9），猪***病毒O型广谱多表位重组抗原及其应用（专利号：ZL201210130997.3）。这些都是针对单一血清型的疫苗，不能提供交叉免疫保护。一方面本发明为了实现“一针防多病”的目的，本着既降低免疫成本，又同时防控2种病原的效果，本发明以已研制的***多表位疫苗为基础，采用分子生物学技术以及先进的设计理念，针对我国牛O型和Asia1型2个主要血清型的***病毒毒株的主要抗原表位序列，研制了牛Asia1/O***双价广谱多表位疫苗，以期从根本上解决目前***疫苗只针对一个血清型的局限性，另一方面，本发明在通过进一步的深入研究对抗原表位序列进行了进一步的优化，在原有基础上提高了抗原表位的免疫原性，且双价疫苗之间的抗原并不互相干扰，进一步提高了由其制备得到的双价多表位疫苗的免疫保护效力，本发明的提出对控制和净化我国牛Asia1型和O型2个血清型的***具有重要的意义，也为研制更多效价的***新型疫苗具有借鉴意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种牛Asia1/O型***病毒复合多表位重组抗原，该抗原复合了我国流行的牛O型和Asia1型***病毒代表性毒株的优势抗原表位；
本发明的目的之二在于提供所述多表位重组抗原在制备牛Asia1/O型***双价多表位疫苗；
本发明的目的之三在于提供一种牛Asia1/O型***双价多表位疫苗，含有本发明所述的牛Asia1/O型***病毒复合多表位重组抗原。
为了达到所述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明采用全新的反向疫苗操作学技术和策略，将我国流行的牛O型和Asia1型***病毒代表性毒株的优势抗原表位进行优化和合理的串联后，并与进行优化的牛IgG免疫刺激片断（IgG重链恒定区）偶联，克隆入原核表达质粒如pET-30a（+）中构建重组表达质粒，转化BL21（DE3）表达重组抗原并采用Ni-NAT层析柱纯化后，经Bio-Rad蛋白定量试剂盒定量后发现经过以上优化后获得的重组抗原量明显增加，将其单独或与重组***病毒3D蛋白配伍制备疫苗，动物免疫试验结果显示，该疫苗配伍能够刺激机体同时产生针对2个血清型的高效价的保护性抗体，也证实了本发明采用全新设计研究的双价疫苗之间的抗原并不互相干扰，能达到“一针防多病”的目的，具有良好的应用前景。
本发明的一种牛Asia1/O型***病毒复合多表位重组抗原，其特征在于所述的重组抗原是将我国流行的牛O型和Asia1型***病毒代表性毒株的优势抗原表位进行串联后与牛IgG重链恒定区偶联得到的，其中，牛O型***病毒代表性毒株的优势抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，牛Asia1型***病毒代表性毒株的优势抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，牛IgG重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
对于牛O型***病毒代表性毒株的优势抗原表位的氨基酸序列的确定，本发明通过用DNAStar生物软件对我国分离的牛O型***病毒代表毒株O/China/99（GenBank accession number:AF506822）进行序列分析，确定了优势抗原表位为140–160氨基酸，200–213氨基酸为另外一个B抗原表位。同时选用VP1蛋白区的21–40氨基酸、VP4的20–34位氨基酸为T细胞表位，并对其氨基酸序列进行了优化，优化后得到的牛O型***病毒代表性毒株的优势抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，优选的，所述的重组抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。
进一步的，本发明还提出了编码所述的牛Asia1/O型***病毒复合多表位重组抗原的核苷酸序列。
在本发明中，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
含有所述的核苷酸序列重组表达载体以及含有该重组表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。
更进一步的，本发明提出了所述的牛Asia1/O型***病毒复合多表位重组抗原在制备预防牛Asia1/O型***双价多表位疫苗中的应用。及
所述的核苷酸序列在制备预防牛Asia1/O型***双价多表位疫苗中的应用。
本发明的一种牛Asia1/O型***双价多表位疫苗，其特征在于含有以上任一项所述的多表位重组抗原。
优选的，所述的牛Asia1/O型***双价多表位疫苗中还含有***病毒3D蛋白的全长氨基酸序列或其片段，所述的***病毒3D蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，***病毒3D蛋白片段选自如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列中的至少一种。
免疫效力实验证实，本发明制备得到的牛Asia1/O型***双价多表位疫苗具有良好的免疫原性，无论是免疫豚鼠还是免疫牛后均能够诱导机体产生高水平的保护性中和抗体，而且接种后对免疫动物安全无害，是一种具有广阔前景的新型疫苗，将对我国牛Asia1和O型***防控提供物质储备和技术支撑，具有重要的意义。
相较于现有技术，本发明的优点在于：
1、采用分子生物学技术以及先进的设计理念，针对我国牛O型和Asia1型2个主要血清型的***病毒毒株的主要抗原表位序列，研制了牛Asia1/O***双价广谱多表位疫苗，实现了“一针防多病”的目的，从根本上解决目前***疫苗只针对一个血清型的局限性；同时也大大降低了免疫成本，实现了对2个不同血清型病原的防控，提高了免疫效率；
2、对抗原表位进行了进一步的优化，使得来自2个不同血清型病毒的抗原表位在进行合理串联后能够最大限度的保持彼此的免疫原性，从而给免疫动物提供更高、更全面的保护。
附图说明
图1为重组多表位抗原Asia1/O/BCIgG单独或与3D蛋白联合免疫豚鼠后产生的针对O型***病毒的中和抗体效价结果；
结果显示，重组抗原单独或与3D蛋白联合免疫豚鼠均能诱导机体产生针对O型***病毒的较高水平的保护性中和抗体，加强免疫后血清中和抗体效价进一步升高，显示出该重组抗原免疫豚鼠后能够诱导机体产生高水平的针对O型***病毒的特异性中和抗体；
图2为重组多表位抗原Asia1/O/BCIgG单独或与3D蛋白联合免疫豚鼠后产生的针对Asia1型***病毒的中和抗体效价结果；
结果显示，重组抗原单独或与3D蛋白联合免疫豚鼠均能诱导机体产生针对Asia1型***病毒的高水平的保护性中和抗体；
图3为重组多表位抗原Asia1/O/BCIgG单独或与3D蛋白联合免疫牛体后产生针对O型***病毒的中和抗体效价结果；
结果显示，重组抗原单独或与3D蛋白联合免疫牛后均能诱导机体产生针对O型***病毒的高水平的保护性中和抗体；
图4为重组多表位抗原Asia1/O/BCIgG单独或与3D蛋白联合免疫牛体后产生的针对Asia1型***病毒的中和抗体效价结果；
结果显示，重组抗原单独或与3D蛋白联合免疫牛后均能诱导机体产生针对Asia1型***病毒的高水平的保护性中和抗体；
图5为两种O型***多表位疫苗免疫豚鼠血清中和抗体效价比较结果；
图6为两种O型***多表位疫苗免疫牛血清中和抗体效价比较结果；
图7为O型***单价疫苗、Asia1/O型***双价疫苗免疫豚鼠血清针对O型***病毒的特异性中和抗体血清效价；
图8为Asia1型***单价疫苗、Asia1/O型***双价疫苗免疫豚鼠血清针对Asia1型***病毒的特异性中和抗体血清效价；
图9为O型***单价疫苗，Asia1/O型***双价疫苗免疫牛后针对O型***病毒的中和抗体效价；
图10为Asia1型***单价疫苗，Asia1/O型***双价疫苗免疫牛后针对Asia1型***病毒的中和抗体效价。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1牛Asia1/O型***病毒复合多表位重组抗原（Asia1/O/BCIgG）的制备
1、O型***病毒VP1基因的生物信息学分析：
***病毒结构蛋白VP1是病毒的优势抗原，无论是分离纯化的天然VP1蛋白还是重组表达产物都能诱导机体产生保护性中和抗体，具有型特异性。本研究用DNAStar生物软件对我国分离的牛O型***病毒代表毒株O/China/99（GenBankaccession number:AF506822）进行序列分析，确定了优势抗原表位为140–160氨基酸，200–213氨基酸为另外一个B抗原表位。同时选用VP1蛋白区的21–40氨基酸、VP4的20–34位氨基酸为T细胞表位，并对其氨基酸序列进行了优化。
2、Asia1型***病毒基因的生物信息学分析：
选用Asia1型***病毒JS/05毒株全基因组序列(GenBank accession number:EF149009.1)进行多表位的设计，即选取主要结构蛋白基因VP1上的两个免疫原性B细胞表位（136-160aa，198-211aa）作为优势抗原表位。
3、牛IgG重链恒定区基因（CIgG）的PCR扩增：
用primer5.0引物软件设计扩增包括牛IgG整个重链恒定区基因全长的特异性引物，正链引物：5′-AAGACGGCCCCATCGGT-3′，负链引物：
5′-TTTACCCGGAGTCTTGGA-3′，获得包含IgG重链恒定区目的基因的DNA片段，然后用带有酶切位点的特异性引物Cattle IgG HC HindⅢ，
5′-gctaagcttgcggtggtggctctGGTGCCCTGAAGAGCG GCGT-3′；Cattle IgG HC xho1
5′-gctctcgagtcaTTTACCCGCAGACTTAGAGGTGGAC-3′对目的基因进行扩增、纯化、回收，用HindⅢ/xhol双酶切并纯化后，–20℃保存备用。扩增的到的编码牛IgG重链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其对应的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。
4、基因克隆及其蛋白表达，纯化
4.1多表位基因的设计及其合成：
为了防止在构建基因时出现新表位，在相邻两表位之间引入能保证各个表位结构正确展示的间隔子序列GGGS或GGSSGG，O型***病毒多表位基因的串联顺序为21–40-GGGS-20–34-GGSSGG-140–160-GGSSGG-200–213-GGSSGG—140–160-GGSSGG-200–213，并在基因的5'-端和3'-端分别引入特异性酶切位点如EcoRⅠ和HindⅢ，优化后得到的牛O型***病毒代表性毒株的优势抗原表位的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；Asia1型***病毒多表位基因的串联顺序为：136-160-GGSSGG-198-211-GGSSGG-136-160-GGSSGG-198-211，在基因的5'-端和3'-端分别引入特异性酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ，得到牛Asia1型***病毒代表性毒株的优势抗原表位的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。所有串联基因宝生物工程（大连）有限公司合成。将合成的多表位基因分别定向***原核表达载体pET-30a（+），构建重组表达质粒pAsia1/O。纯化回收的牛IgG重链恒定区基因经HindⅢ/Xho1酶切后***用相应酶线性化重组表达质粒pAsia1/O，构建重组表达质粒pAsia1/O/BCIgG，转化JM109感受态进行阳性筛选，通过序列测定确定阳性重组子。
4.2重组蛋白的表达及其生物活性鉴定：
将阳性重组表达质粒pAsia1/O/BCIgG转化BL21（DE3）（Novagen），挑选单克隆接种LB培养液（Kan+）经IPTG诱导表达及表达形式鉴定后，大规模表达重组蛋白，即从LAB平板上挑单菌落接种5ml含卡那霉素的LB培养液，于37℃培养箱220rpm过夜培养，将过夜培养物按1%加入新制备的无菌LB培养液中（kan+），于37℃培养箱220rpm培养至OD600≈0.4～0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG诱导表达4～6小时，2000rpm离心30min收获培养物，按原培养物体积的20%加入蛋白裂解液，冰浴条件下经超声破碎处理（30min），20000g离心20min收集沉淀（4℃），弃上清。按照Ni-NTA组氨酸纯化柱（Novagen）说明书纯化蛋白，纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析，重组蛋白Asia1/O/BCIgG大小与预期相符，分别能与Asia1型和O型***病毒感染血清及辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG的抗体发生免疫反应，说明表达的重组蛋白具有生物活性。
获得的纯化后的重组蛋白（抗原）Asia1/O/BCIgG的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码该重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例2牛Asia1/O型***双价多表位疫苗的制备及免疫效力实验
1、疫苗制备：
实施例1得到的纯化蛋白Asia1/O/BCIgG经Bio-Rad定量试剂盒定量后稀释成1mg/ml，单独或与纯化的全长3D蛋白（SEQ ID NO：10所示）与重组抗原按1：2（浓度比）配置后，加入等体积的油佐剂ISA206（France）乳化成疫苗制剂。
2、豚鼠免疫效力试验：
用制备的疫苗，按每只豚鼠0.5ml经肌肉途径接种豚鼠（50μg抗原或50μg抗原+25μg3D蛋白）分别免疫5只豚鼠，免疫实验结果显示，首次免疫28天后，无论是Asia1/O/BCIgG重组抗原单独还是与3D蛋白联合免疫豚鼠均能刺激机体产生较高水平的针对Asia1型***病毒特异性中和抗体，而针对O型***病毒的特异性抗体水平较低（图1），加强免疫后中和抗体水平明显升高。与O型中和抗体水平相比，首次免疫后28天，针对Asia1型的特异性中和抗体效价较高，而且加强免疫后，抗体效价进一步升高，达到OIE规定的阳性标准（图2），提示本研究研制的Asia1/O型***双价多表位疫苗具有良好的免疫效果。
3、牛体免疫效力试验
用制备的疫苗，按每头份2ml经肌肉途径接种免疫牛（500μg抗原或500μg抗原+250μg3D蛋白）分别免疫5头无***特异性抗体及非结构蛋白抗体健康牛。结果显示，首免后28天，无论是重组抗原Asia1/O/BCIgG单独还是与3D蛋白联合免疫牛均能刺激机体产生针对Asia1型和O型***病毒的特异性中和抗体，针对Asia1型***病毒的中和抗体水平较高（图4），而针对O型***病毒的中和抗体水平相对较低（图3）。但加强免疫后14天，无论是针对Asia1型***病毒（图4），还是O型***病毒的特异性中和抗体效价明显升高（图3），均达到OIE规定的标准，提示Asia1/O型***双价多表位疫苗能诱导牛产生高效价的保护性中和抗体，具有良好的免疫效果。免疫动物注射部位没有出现红肿、发热等现象，也没有出现接种不良反应，食欲正常，精神状态良好，提示本发明制备的牛Asia1/O型***双价多表位疫苗具有良好的免疫原性，无论是豚鼠还是牛免疫后均能够诱导机体产生高水平的保护性抗体，而且接种后对免疫动物安全无害，是一种具有广阔前景的新型疫苗，将对我国牛Asia1和O型***防控提供物质储备和技术支撑，具有重要的意义。
对比例1
为了进一步说明本发明与现有技术相比的技术优势，本发明进行了如下对比实验：
1、两种O型***病毒多表位疫苗的免疫效力的对比
实验组：采用本发明优化后得到的牛O型***病毒代表性毒株的优势抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
对比组：采用专利号为ZL201210130997.3的专利中所公开的O/China/99的抗原表位串联序列，连接顺序如下所示：
135–160-GGSSGG-200–213-GGSSGG—135–160-GGSSGG-200–213
表位抗原蛋白的表达、表位疫苗的制备及免疫效力实验等均与实施例1和2相同。
两种O型***多表位疫苗免疫豚鼠血清中和抗体效价比较结果如图5所示。结果显示改进后的O型***病毒多表位疫苗的中和抗体效价（实验组）要优于改进前的（对比组）。
两种O型***多表位疫苗免疫牛血清中和抗体效价比较结果如图6所示。结果显示改进后O型***多表位疫苗的中和抗体效价（实验组）要优于改进前的疫苗（对比组），尤其是加强免疫后，改进后的疫苗的中和抗体效价要高于改进前疫苗抗体效价1个滴度或以上，明显增强了免疫效力。
2、Asia1/O型***双价疫苗相较于O型***单价疫苗以及Asia1型***单价疫苗的免疫效力评价
Asia1/O型***双价疫苗：采用本发明实施例1以及实施例2的方法制备。同时制备含有全长3D蛋白（SEQ ID NO：10所示）佐剂的疫苗以及不含有全长3D蛋白（SEQ ID NO：10所示）佐剂的疫苗。
O型***单价疫苗：采用本发明实施例1以及实施例2的方法制备，区别在于不串联Asia1型***抗原表位。同时制备含有全长3D蛋白（SEQ ID NO：10所示）佐剂的疫苗以及不含有全长3D蛋白（SEQ ID NO：10所示）佐剂的疫苗。
Asia1型***单价疫苗：采用本发明实施例1以及实施例2的方法制备，区别在于不串联O型***病毒抗原表位。同时制备含有全长3D蛋白（SEQ ID NO：10所示）佐剂的疫苗以及不含有全长3D蛋白（SEQ ID NO：10所示）佐剂的疫苗。
抗原表位重组蛋白的表达、表位疫苗的制备及免疫效力实验等均与实施例1和2相同。
O型***单价疫苗、Asia1/O型***双价疫苗免疫豚鼠血清针对O型***病毒的特异性中和抗体血清效价结果如图7所示；Asia1型***单价疫苗、Asia1/O型***双价疫苗免疫豚鼠血清针对Asia1型***病毒的特异性中和抗体血清效价结果如图8所示；O型***单价疫苗，Asia1/O型***双价疫苗免疫牛后针对O型***病毒的中和抗体效价结果如图9所示；Asia1型***单价疫苗，Asia1/O型***双价疫苗免疫牛后针对Asia1型***病毒的中和抗体效价结果如图10所示。
从上述结果能够看出本发明的Asia1/O型***双价疫苗相较于O型***单价疫苗或Asia1型***单价疫苗，能够刺激机体同时产生针对Asia1型和O型2个不同血清型的高效价的保护性抗体，而且双价疫苗之间的抗原并不互相干扰，能达到“一针防多病”的目的，具有良好的应用前景。
Claims (10)
1.牛Asia1/O型***病毒复合多表位重组抗原，其特征在于所述的重组抗原是将我国流行的牛O型和Asia1型***病毒代表性毒株的优势抗原表位进行串联后与牛IgG重链恒定区串联得到的，其中，牛O型***病毒代表性毒株的优势抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，牛Asia1型***病毒代表性毒株的优势抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，牛IgG重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.如权利要求1所述的牛Asia1/O型***病毒复合多表位重组抗原，其特征在于所述的重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.编码权利要求1或2所述的牛Asia1/O型***病毒复合多表位重组抗原的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
5.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求3或4所述的核苷酸序列。
6.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求5所述的重组表达载体。
7.权利要求1或2所述的牛Asia1/O型***病毒复合多表位重组抗原在制备牛Asia1/O型***双价多表位疫苗中的应用。
8.权利要求3或4所述的核苷酸序列在制备牛Asia1/O型***双价多表位疫苗中的应用。
9.一种牛Asia1/O型***双价多表位疫苗，其特征在于含有权利要求1或2所述的多表位重组抗原。
10.如权利要求9所述的牛Asia1/O型***双价多表位疫苗，其特征在于还含有***病毒3D蛋白的全长氨基酸序列或其片段，所述的***病毒3D蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，***病毒3D蛋白片段选自如SEQ IDNO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列中的至少一种。
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