CN102575255A - 具有配糖生物碱生物合成酶活性的蛋白及其编码基因 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了来源于属于茄科(Solanaceae)植物例如马铃薯(Solanum tuberosum)的配糖生物碱生物合成酶的DNA。特别公开了：具有来源于属于茄科植物例如马铃薯(Solanum tuberosum)的配糖生物碱生物合成酶活性的蛋白，以及使用编码所述蛋白的基因来产生/检定新生物体的方法。

Description

具有配糖生物碱生物合成酶活性的蛋白及其编码基因
技术领域
本发明涉及茄科植物例如马铃薯特征性的配糖生物碱化合物的制造方法，配糖生物碱生物合成酶，编码所述配糖生物碱生物合成酶的DNA，使用所述DNA培育或选择新茄科植物例如马铃薯的方法，以及不产配糖生物碱的茄科植物例如马铃薯。
背景技术
配糖生物碱是植物源化合物的成员，并被称为甾体生物碱。已报道，配糖生物碱结构具有N原子，是具有27碳链的类异戊二烯，并且在茄属植物中有422种配糖生物碱化合物(非专利文献1：7.8章)。除了属于茄属的茄科植物之外，已知属于百合科的植物含有配糖生物碱。重要的配糖生物碱是来自于茄科茄属的马铃薯(Solanumtuberosum)的查茄碱和茄碱以及来自于番茄(Solanum lycopersicum)的番茄碱。
马铃薯是全世界仅次于玉米、水稻和小麦的第四大生产作物。众所周知，从马铃薯的块茎萌发的芽和地上部分含有有毒物质查茄碱和茄碱。查茄碱和茄碱引起中毒症状例如腹痛、头昏和轻度意识模糊。此外，由于损伤或暴露于太阳光，块茎中容易蓄积查茄碱和茄碱。因此，存在因块茎管理失误而引起意外中毒的风险。配糖生物碱意外中毒时有发生。在最近的事件中，2009年7月16日在日本奈良市的小学发生了配糖生物碱意外中毒(由Asahi.com报道)。通过例如将块茎储存在暗处，将马铃薯块茎中的配糖生物碱水平控制在20mg/100g或以下。因此，一般来说，马铃薯块茎是安全食品。然而，考虑到上述意外中毒的风险，对于参与马铃薯相关产业中的育种、生产、储存、运输、贩卖或购买的人来说，降低马铃薯的配糖生物碱含量是关键问题。然而，到目前为止，降低马铃薯的配糖生物碱含量尚未实现。这是因为不存在不含配糖生物碱的野生型马铃薯株系，配糖生物碱生物合成途径尚未阐明(非专利文献1(图7.24A和B)和非专利文献2)，并且参与生物合成途径的基因的鉴定几乎没有进展。
已知配糖生物碱具有药用性质例如抗癌活性、护肝效应、镇痉效应、免疫***促进效应、抗真菌效应、抗原虫效应和杀贝剂活性，以及毒性性质例如抗胆碱酯酶活性和膜破坏效应(非专利文献1)。已报道，番茄中的配糖生物碱代谢物番茄皂苷A显示出抗动脉粥样硬化效应(非专利文献3)。然而，由于生物合成途径尚未阐明，抑制或有效生产代谢物的研究和开发基本上未取得进展。
近年中，关于糖转移到糖苷配基之后的糖基化所涉及的基因，已有一些报道(非专利文献4-6)。非专利文献4报道，UDP-半乳糖基转移酶基因参与从茄啶(糖苷配基)形成γ-茄碱的途径，并且它还报道了其中基因被抑制的植株。然而，还从未实现查茄碱的抑制(非专利文献4(图2))。非专利文献4报道，UDP-半乳糖基转移酶基因参与从茄啶形成γ-茄碱的途径，并且它还报道了其中基因被抑制的植株。然而，查茄碱和茄碱的抑制还基本上是不可能的(非专利文献5(图5))。非专利文献6报道了参与从β-查茄碱形成α-查茄碱的途径和从β-茄碱形成α-茄碱的途径的鼠李糖基转移酶基因。在这种情况下，当α-异构体减少时，β-异构体或γ-异构体增加。因此，了解到尽管通过抑制糖基化已可能改变配糖生物碱的分子种类，但控制配糖生物碱的总含量是非常困难的。
有一份报告试图通过参与植物甾类和植物激素生物合成的基因的过表达来减少配糖生物碱(非专利文献7)。然而，在这样的情况下，只可能将配糖生物碱含量最多降低到初始量的几乎一半(非专利文献7(图5))。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Eich，《茄科和旋花科植物：次级代谢物》(Soloanaceae and Convolvulaceae：Secondary Metabolite)，(2008)，Springer
非专利文献2：Ginzberg等，Patoto Research(2009)52：1-15
非专利文献3：藤原等，2008年农坛化学会大会要旨2B07，p.22
非专利文献4：McCue等，Plant Sci.(2005)168：267-273
非专利文献5：McCue等，Phytochemistry(2006)67：1590-1597
非专利文献6：McCue等，Phytochemistry(1998)68：327-334
非专利文献7：Arnqvist等，Plant Physiol.(2003)131：1792-1799
发明概述
发明要解决的问题
本发明的目的是提供茄科植物例如马铃薯特征性的配糖生物碱化合物的制造方法、配糖生物碱生物合成酶、编码所述配糖生物碱生物合成酶的DNA、使用所述DNA培育或选择新茄科植物例如马铃薯的方法、以及不产配糖生物碱的茄科植物例如马铃薯。
解决问题的手段
为了实现上述目的，本发明人进行了深入研究。首先，本发明人着眼于糖苷配基形成之前的过程。然后，本发明人在计算机上搜索参与生物合成途径的候选基因，并通过使部分候选基因进行表达以诱导RNAi来抑制内源候选基因的表达。结果，本发明人从转化体成功获得了配糖生物碱含量明显降低的马铃薯，并鉴定到配糖生物碱生物合成酶基因。此外，本发明人证实了通过选择上述基因的表达被抑制的植物，有可能获得缺少配糖生物碱的茄科植物例如马铃薯。此外，本发明人证实了通过所述基因的表达，有可能生产新的配糖生物碱化合物，并且通过将所述基因的基因组序列与不同茄科植物例如马铃薯的基因组序列进行比较也有可能分析多态性，从而有可能建立新培育的茄属植物品种例如马铃薯品种。这导致本发明的完成。同样地，本发明人通过以上述方式抑制内源基因，成功地产生了配糖生物碱含量降低的番茄。
具体来说，本发明涵盖下列发明。
[1]一种蛋白，其是下列(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：1或18所示的氨基酸序列的蛋白；或
(b)具有配糖生物碱生物合成酶活性并包含相对于SEQ ID NO：1或18所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的缺失、取代、***或添加的氨基酸序列的蛋白。
[2]一种基因，其包含选自下列(c)至(f)的DNA：
(c)由SEQ ID NO：2或19所示的核苷酸序列构成的DNA；
(d)在严紧条件下与由SEQ ID NO：2或19所示的核苷酸序列构成的DNA的互补核苷酸序列所构成的DNA杂交、并编码具有配糖生物碱生物合成酶活性的蛋白的DNA；
(e)由与SEQ ID NO：2或19所示的核苷酸序列具有80％以上序列同一性的核苷酸序列构成、并编码具有配糖生物碱生物合成酶活性的蛋白的DNA；或
(f)由SEQ ID NO：2或19所示的核苷酸序列的简并异构体构成的DNA。
[3]一种蛋白，其是下列(g)或(h)：
(g)包含SEQ ID NO：3或20所示的氨基酸序列的蛋白；或
(h)具有配糖生物碱生物合成酶活性、并包含相对于SEQ ID NO：3或20所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的缺失、取代、***或添加的氨基酸序列的蛋白。
[4]一种基因，其包含选自下列(i)至(1)的DNA：
(i)由SEQ ID NO：4或21所示的核苷酸序列构成的DNA；
(j)在严紧条件下与由SEQ ID NO：4或21所示的核苷酸序列构成的DNA的互补核苷酸序列所构成的DNA杂交、并编码具有配糖生物碱生物合成酶活性的蛋白的DNA；
(k)由与SEQ ID NO：4或21所示的核苷酸序列具有80％以上序列同一性的核苷酸序列构成、并编码具有配糖生物碱生物合成酶活性的蛋白的DNA；或
(1)由SEQ ID NO：4或21所示的核苷酸序列的简并异构体构成的DNA。
[5]一种重组载体，其包含[2]或[4]的基因。
[6]一种转化体，其中导入了[5]的重组载体。
[7][6]的转化体，其是植物。
[8]一种用于在植物中检测编码配糖生物碱生物合成酶的基因存在突变和/或多态性的方法，所述方法包含：
(i)从植物分离采取基因组DNA或RNA形式的核酸的步骤；
(ii)当(i)中的核酸是RNA时，经反转录合成cDNA的步骤；
(iii)从步骤(i)或(ii)中获得的DNA扩增包含SEQ ID NO：2、4或5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：19、21或22所示的核苷酸序列的基因片段的步骤；以及
(iv)确定DNA中突变和/或多态性的存在的步骤。
[9][8]的方法，其中植物是属于茄科的植物。
[10]一种用于选择具有突变和/或多态性的植物的方法，所述方法包含通过[8]或[9]的方法检测编码配糖生物碱生物合成酶的基因的突变和/或多态性。
[11]一种在编码配糖生物碱生物合成酶的基因中具有突变和/或多态性的植物，所述植物通过[9]的方法选择。
[12][11]的植物，其是属于茄科的植物。
[13]一种根据[8]或[9]选择植物的方法，所述方法包含选择与现有品种相比，其中表达配糖生物碱生物合成酶编码基因的能力或所述基因编码的配糖生物碱生物合成酶的活性发生改变的植物。
[14]一种通过[13]的方法所选择的植物，在所述植物中，与现有品种相比，表达配糖生物碱生物合成酶编码基因的能力或所述基因编码的配糖生物碱生物合成酶的活性发生改变。
[15][14]的植物，其是属于茄科的植物。
本说明书包括了在日本专利申请2009-198889号和2010-108445号的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，所述日本专利申请是本申请的优先权文件。
发明的效果
根据本发明，有可能调控具有茄科植物例如马铃薯特征性的配糖生物碱化合物生物合成活性的蛋白和编码所述蛋白的基因的活性的表达。具体来说，提供了用于生产其中这种基因的活性受到调控的植物以及不产配糖生物碱的茄科植物例如马铃薯的方法。本发明能够培育具有包含配糖生物碱化合物的特点的茄科植物，例如马铃薯。本发明的酶的使用允许以低成本大量生产表现出各种有用生理活性的配糖生物碱化合物。
附图简述
图1-1显示了使用GENETYX DNA分析软件(GenetyxCorporation)来分析马铃薯和番茄之间生物合成基因C的同源性的结果。总体结果表明非常高的同源性。
图1-2显示了使用GENETYX DNA分析软件(GenetyxCorporation)来分析马铃薯和番茄之间生物合成基因C的同源性的结果(续图1-1)。
图1-3显示了使用GENETYX DNA分析软件(GenetyxCorporation)来分析马铃薯和番茄之间生物合成基因C的同源性的结果(续图1-2)。
图2显示了用于抑制候选C基因的载体构建物。图2显示了待导入的基因片段T-DNA中右边界(RB)与左边界(LB)之间的内部构造和限制性酶位点。
图3显示了α-茄碱的质子化母离子峰(M+H)+的MS谱图(A)和α-查茄碱的质子化母离子峰(M+H)+的MS谱图(B)。
图4显示了α-茄碱的校准曲线(LC-MS定量测定分析***)(A)、α-查茄碱的校准曲线(LC-MS定量测定分析***)(B)和芸苔素内酯的校准曲线(LC-MS定量测定分析***)(C)。
图5显示了参比品(α-茄碱、α-查茄碱和芸苔素内酯)的LC-MS色谱图。
图6显示了源自于茎的样品中α-茄碱、α-查茄碱和芸苔素内酯的LC-MS色谱图。
图7是显示了马铃薯转化体的体外(In vitro)茎中配糖生物碱含量的图。每个误差线指示标准偏差。
图8显示了从马铃薯转化体的体外茎提取的mRNA的RT-PCR结果。
图9是显示了马铃薯转化体的块茎表皮中配糖生物碱含量的图。每个误差线指示标准偏差。
图10是显示了番茄转化体的叶中配糖生物碱含量的图。每个误差线指示标准偏差。
图11-1显示了使用GENETYX DNA分析软件(GenetyxCorporation)来分析马铃薯和番茄之间生物合成基因D的同源性的结果。总体结果表明非常高的同源性。
图11-2显示了使用GENETYX DNA分析软件(GenetyxCorporation)来分析马铃薯和番茄之间生物合成基因D的同源性的结果(续图11-1)。
图11-3显示了使用GENETYX DNA分析软件(GenetyxCorporation)来分析马铃薯和番茄之间生物合成基因D的同源性的结果(续图11-2)。
图12显示了用于抑制候选D基因的载体构建物。图12显示了待导入的基因片段T-DNA中右边界(RB)与左边界(LB)之间的内部构造和限制性酶位点。
图13是显示了马铃薯转化体的体外茎中配糖生物碱含量的图。每个误差线指示标准偏差。
图14显示了从马铃薯转化体的体外茎提取的mRNA的RT-PCR结果。
图15是显示了马铃薯转化体的块茎表皮中配糖生物碱含量的图。每个误差线指示标准偏差。
图16是显示了番茄转化体的叶中配糖生物碱含量的图。每个误差线指示标准偏差。
发明的具体实施形式
下面对本发明进行详细描述。
1.新的配糖生物碱生物合成酶
本发明的蛋白/酶是茄科植物例如马铃薯中所含的配糖生物碱生物合成酶。属于茄科的植物例如马铃薯包括马铃薯(Solanumtuberosum)、番茄(Solanum lycopersicum)、茄子(Solanum melongena)和辣椒(Capsicum annum)。此外，本发明的酶是膜结合的细胞色素P450单氧化酶。使用本发明的酶获得的配糖生物碱的实例包括由茄科植物例如马铃薯合成的配糖生物碱。其实例包括马铃薯中包含的配糖生物碱例如查茄碱和茄碱，以及番茄中包含的配糖生物碱例如番茄碱。
可以用作本发明的配糖生物碱生物合成酶的底物的优选甾类化合物的实例包括胆甾醇类。胆甾醇类的实例包括胆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和菜籽甾醇。本发明的配糖生物碱生物合成酶是将羟基转移到上述任何胆甾醇上的羟化酶。
本发明的酶的全长氨基酸序列显示在SEQ ID NO：1或3(基因C)或SEQ ID NO：18或20(基因D)中。此外，本发明的蛋白包括具有配糖生物碱生物合成酶活性、并包含与SEQ ID NO：1或3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18或20所示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的蛋白。在这里，这种基本上同一的氨基酸序列的实例，是相对于上述氨基酸序列具有一个或几个氨基酸(1至10个氨基酸，优选1至7个氨基酸，更优选1至5个氨基酸，更优选1至3个氨基酸，更优选1个氨基酸或2个氨基酸)的缺失、取代、***和/或添加的氨基酸序列。或者，它是当使用例如BLAST(美国国家生物信息中心(National Center for Biological Information)的基本局域比对搜索工具(Basic Local Alignment Serach Tool))(基于例如缺省(即初始设定)参数)计算序列同一性时，与上述氨基酸序列具有至少85％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选97％以上的序列同一性的氨基酸序列。
本发明的配糖生物碱生物合成酶包括从植物分离的天然配糖生物碱生物合成酶和通过基因工程技术生产的重组配糖生物碱生物合成酶。
2.编码配糖生物碱生物合成酶的基因
本发明的基因是编码具有使羟基结合于甾类化合物的活性的配糖生物碱生物合成酶的基因，并且它还编码具有上述配糖生物碱生物合成酶活性的蛋白。
本发明的基因的DNA核苷酸序列是SEQ ID NO：2或4所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：19或21所示的核苷酸序列。此外，本发明的DNA包括：在严紧条件下与包含SEQ ID NO：2或4所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：19或21所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA杂交的DNA；当使用例如BLAST(美国国家生物信息中心(NationalCenter for Biological Information)的基本局域比对搜索工具(Basic LocalAlignment Serach Tool))(基于例如缺省(即初始设定)参数)计算序列同一性时，与SEQ ID NO：2或4所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：19或21所示的核苷酸序列具有至少85％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选97％以上的序列同一性的DNA；以及包含相对于由上述DNA编码的蛋白的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸(1至10个氨基酸，优选1至7个氨基酸，优选1至5个氨基酸，更优选1至3个氨基酸，更优选1个氨基酸或2个氨基酸)的缺失、取代、***和/或添加并包含具有配糖生物碱生物合成酶活性的蛋白的氨基酸序列的蛋白的编码DNA。在这里，术语“严紧条件”是指例如包含“1X SSC，0.1％SDS，37℃”的条件。更严紧条件包含“0.5X SSC，0.1％SDS，42℃”。更严紧条件包含“0.2X SSC，0.1％SDS，65℃”。此外，本发明的基因包括包含SEQ ID NO：3或4所示核苷酸序列的简并异构体的DNA。
3.重组载体
本发明的载体是其中已***SEQ ID NO：2或4所示的DNA或SEQ ID NO：19或21所示的DNA的重组载体。对于这样的载体来说，可以使用用于酵母、植物细胞、昆虫细胞等的广泛的已知载体。用于酵母的已知载体的实例包括pDR196、pYES-DEST 52、Yip5、Yrp17和Yep24。用于植物细胞的已知载体的实例包括pGWB载体、pBiE12-GUS、pIG121-Hm、pBI121、pBiHyg-HSE、pB119、pBI101、pGV3850和pABH-Hm1。用于昆虫细胞的已知载体的实例包括pBM030、pBM034、和pBK283。在本发明中使用的载体含有参与基因表达或抑制的组分，例如启动子、终止子和增强子。如有必要，载体含有选择标志(例如药物抗性基因、抗生素抗性基因和报告基因)。对于参与基因表达或抑制的组分来说，优选其掺入到重组载体中的方式使得它们能够独立地发挥与其性质相符的功能。本技术领域的专业人员完全能够执行这样的掺入程序。
4.转化体
本发明的转化体是具有本发明的重组载体的转化体。这样的转化体可以通过将其中已***编码酶的基因的重组载体以使目标基因在宿主中表达的方式导入到宿主中来获得。可以使用适合于载体的宿主。宿主的实例包括酵母、植物细胞、昆虫细胞(例如Sf9)和植物病毒。其优选实例包括酵母、植物细胞和植物病毒。对于导入重组载体的方法没有特别限制，只要它是用于将DNA导入微生物的方法即可。这样的方法的实例包括使用钙离子的方法(Cohen，S.N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69：2110(1972))、电穿孔方法和三亲交配法。此外，用于生产转化植物的方法的实例，是使用病毒、土壤杆菌的Ti质粒或Ri质粒等作为载体的方法。宿主植物的实例包括单子叶植物例如水稻、大麦和玉米，以及双子叶植物例如大豆、油菜籽、番茄和马铃薯。转化的植物可以通过使用本发明的基因转化的植物细胞进行再生来获得。从植物细胞再生植物可以通过已知方法来执行。
5.生产配糖生物碱生物合成酶的方法和生产配糖生物碱化合物的方法
本发明的配糖生物碱生物合成酶是膜结合型细胞色素P450单氧化酶，并且它可以从普通植物收集(例如Collu等，2001，FEBS Lett.508：215-220)。此外，本发明的配糖生物碱生物合成酶可以通过例如使用用于本发明的基因转化的微生物(例如酵母)或昆虫细胞的表达***进行大量生产来生产。使用昆虫细胞的实例已经由Morikawa等报道(2006，Plant Cell 18：1008-1022)。
本发明的配糖生物碱生物合成酶可以使用这样的***以高活性蛋白的形式表达。因此，可以通过向转化的酵母或昆虫细胞培养液添加配糖生物碱生物合成酶的底物，来生产配糖生物碱化合物。例如，通过向转化的酵母培养液施加胆甾醇作为底物，可以有效地大量生产羟化胆甾醇。已报道，酵母在胞质溶胶中具有DMAPP生物合成途径(甲羟戊酸途径)，并且通过将甲羟戊酸途径导入大肠杆菌(Escherichiacoli)可以生产前体或底物(Harada & Misawa，2009Aug 12.Epub ApplMicrobiol Biotechnol.)。同时表达膜结合型细胞色素P450单氧化酶和不同基因以便以上述方式生产配糖生物碱，变得可能。例如，通过使用大肠杆菌(由Chang等报道(2007 Nat.Chem.Biol.3：274-277))和酵母(由Seki等报道(2008 PNAS 105：14204-14209))表达膜结合型细胞色素P450单氧化酶，获得了代谢物。在上述案例中使用的技术的组合应用，允许生产配糖生物碱化合物。
6.基因突变、多态性和基因表达突变的选择
根据本发明，提供了用于检测植物中存在配糖生物碱生物合成酶基因突变、多态性例如单核苷酸多态性(SNP)、或基因表达突变的方法。突变体可以通过辐射、化学处理、UV照射或天然突变来获得。
上述方法包含：从突变体植物、不同品种或品系的植物分离基因组DNA或RNA、并且如果分离到的是RNA则执行反转录以合成cDNA的步骤；使用DNA扩增技术从DNA扩增含有配糖生物碱生物合成酶基因的基因片段的步骤；以及确定DNA中突变的存在的步骤。在提取DNA或RNA的方法中可以使用可商购试剂盒(例如DNeasy或RNeasy(QIAGEN))。此外，对于cDNA合成，也可以使用可商购试剂盒(例如SuperScript第一链***(Invetrogen))。例如，诸如所谓的PCR和LAMP技术的技术可以用作使用DNA扩增技术来扩增基因片段的方法。这样的技术包含在涉及使用聚合酶以便在连续的聚合酶反应中扩增(即增加拷贝数)特定DNA序列的技术类群中。这样的反应可以代替克隆来使用。在这样的情况下，反应唯一需要的是核酸序列信息。为了执行DNA扩增，设计与待扩增的DNA序列互补的引物。然后通过自动DNA合成来生产引物。DNA扩增方法在本技术领域中是已知的，因此本技术领域的专业人员能够根据这里描述的教示和指导容易地执行这样的方法。一些PCR方法(及相关技术)描述在例如美国专利4,583,195、4,683,202、4,800,159和4,965,188号中，以及Innis等主编的《PCR方案：方法和应用指南》(PCR Protocols：A guide to methodand applications)中。
在确定DNA中多态性或突变的存在的步骤中，可以使用利用突变基因与正常基因之间的同源性的检测方法。这样的方法的实例包括核苷酸序列测定法(Applied Biosystems)和TILLING方法，后者包含使用能够切开错配对的一个成员的酶来检测突变体(Till等，2003，Genome Res 13：524-530)。可以通过将使用这样的方法获得的序列数据与SEQ ID NO：2、4或5所示基因片段的核苷酸序列或SEQ ID NO：19、21或22所示基因片段的核苷酸序列进行比较，来执行检测。
在确定mRNA量的差异的步骤中，可以对上述cDNA进行定量PCR，其可以是例如实时PCR(使用例如LightCycler
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(RocheDiagnostics))，利用根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：19或21所示的核苷酸序列产生的引物。然后，可以根据获得的结果与源自于“Sassy”品种的cDNA量的比较，来确定mRNA量的差异。
在特别优选的实施方案中，将上面定义的用于确定配糖生物碱生物合成酶基因突变的存在的方法，应用于从茄科植物马铃薯获得的材料。
根据上述突变和/或多态性确定方法，可以在核苷酸水平上鉴定编码配糖生物碱生物合成酶的基因的突变或多态性。此外，可以选择其中编码配糖生物碱生物合成酶的基因具有突变和/或多态性的植物。本发明涵盖了由此获得的其中编码配糖生物碱生物合成酶的基因具有突变和/或多态性的植物。
此外，通过确定突变或多态性或mRNA量的差异，并通过如下所述分析配糖生物碱含量，可以选择其中表达配糖生物碱生物合成酶编码基因的能力或配糖生物碱生物合成酶的活性已变化的植物。
这里，“表达配糖生物碱生物合成酶编码基因的能力或配糖生物碱生物合成酶的活性的变化”，是指由突变例如人工突变引起的表达基因的能力或配糖生物碱生物合成酶活性的改变，以及由于多态性的存在而引起的表达基因的能力或配糖生物碱生物合成酶活性的改变。
“由突变引起的植物中配糖生物碱生物合成酶活性的改变”，是指在目标植物物种的现有品种中这种活性的改变。这样的现有品种包括野生型品种。然而，即使野生型品种是天然存在的品种，但如果它不是现有的产业上利用的品种，它也不包括在现有品种中。现有品种包括在获得其中配糖生物碱生物合成酶活性已被改变的植物时，已被证实存在的所有品种。由人工操作例如杂交或基因操作产生的品种，也包括在内。此外，在活性改变的情况下，没有必要发生与所有现有品种相比的活性变化。如果特定现有品种中的活性被改变，被改变的品种可以包括在“具有改变的配糖生物碱生物合成酶活性的植物”之中。这种“具有改变的配糖生物碱生物合成酶活性的植物”也包括通过自发突变而不是人工操作被改变活性的植物。通过本发明的方法，可以选择其中活性被自发改变的植物，并将其确立为新品种。此外，在对现有品种进行诱变处理以便产生具有改变的配糖生物碱生物合成酶活性的植物的情形中，与所产生的植物进行比较的植物可以是与进行诱变处理的品种相同的现有品种。或者，它可以是不同的现有品种。此外，也可能获得其中基因中的突变被固定、并且表达配糖生物碱生物合成酶基因的能力或配糖生物碱生物合成酶活性已被改变的植物新品种。可以通过将从自然界选择或通过诱变处理产生并且在编码配糖生物碱生物合成酶的基因中具有突变或多态性的植物进行杂交，来获得这样的植物。
如果植物是马铃薯，其现有品种的实例包括“Cynthia”、“Sassy”、“Cherie”、“男爵”、“May Queen”和“Sayaka(农林登陆号：农林36号)”。在这里，“其中表达配糖生物碱生物合成酶编码基因的能力或配糖生物碱生物合成酶的活性与现有品种相比已被改变的植物”，是指其中表达配糖生物碱生物合成酶编码基因的能力与现有品种相比已被增强或减弱的植物。它还指其中配糖生物碱生物合成酶的活性与现有品种相比已提高或降低的植物。本发明也涵盖了其中表达配糖生物碱生物合成酶编码基因的能力或配糖生物碱生物合成酶活性与现有品种相比已被改变的植物。
其中毒性物质配糖生物碱的生物合成酶的活性已经降低的植物是特别优选的。在这样的植物中，合成的配糖生物碱生物合成酶的量低，或不能合成配糖生物碱生物合成酶。此外，植物中配糖生物碱生物合成酶含量低或不存在配糖生物碱生物合成酶。或者，植物中配糖生物碱生物合成酶活性低或不存在。因此，植物具有低的配糖生物碱含量或丧失配糖生物碱。例如，如果植物是马铃薯，配糖生物碱例如查茄碱或茄碱不合成，因此马铃薯块茎中合成的或存在的配糖生物碱例如查茄碱或茄碱的量低。此外，如果植物是番茄，配糖生物碱例如番茄碱不合成，因此番茄果实中合成的或存在的配糖生物碱例如番茄碱的量低。
如果其中配糖生物碱生物合成酶活性低或不存在的植物是马铃薯，在块茎中不合成配糖生物碱例如查茄碱或茄碱，或者块茎中合成的配糖生物碱例如查茄碱或茄碱的量低于上述现有品种中的量。此外，在这样的情况下，块茎中存在的配糖生物碱例如查茄碱或茄碱的含量可能低。
7.配糖生物碱分析和纯化
使用液相色谱的已知配糖生物碱含量分析方法和配糖生物碱纯化方法，已由例如Matsuda等(Phytochem.Anal.15：121-124，2004)和Kozukue等(J.Agric.Food Chem.52：2079-2083，2004)公开。然而，在任一种情况下，样品的预处理都是繁难的，不能达到足够的可测量限度，或者强酸的使用为柱或装置强加了负担。这是成问题的。因此，根据本发明，可以使用利用液相色谱的方法，其中使用能够有效纯化GA(配糖生物碱)并执行高精度分析的耐碱性反相色谱柱(公开在日本专利申请2009-170317号中)。将该方法应用于马铃薯的实例描述在实施例5中。
任何柱都可以用为上述方法中的柱，只要它是出色的耐碱性柱即可。可以使用的出色的耐碱性柱的实例是亚乙基交联柱。优选，使用商标名为XbridgeTM(商标)(Waters)的柱。特别优选，使用WatersXbridgeTM Shield RP18(Waters)和Waters XbridgeTM C18。根据本发明的方法，XbridgeTM Shield RP18柱的优点在于处理单一样品所需的时间短。同时，Waters XbridgeTM C18柱的优点在于它具有良好的耐用性。
可以使用碱性缓冲液作为液相色谱的流动相。优选使用挥发性碱性缓冲液。当对通过液相色谱纯化的样品进行质谱分析时，使用挥发性碱性缓冲液作为流动相是方便的，以便防止碱性缓冲液残留在样品中。可以使用的挥发性碱性缓冲液的实例包括三乙胺和碳酸氢铵。然而，优选使用具有出色缓冲效果的碳酸氢铵。
用作流动相的碳酸氢铵的浓度是5至20mM，优选为5至15mM，更优选为10mM。碳酸氢铵的pH可以被调整至优选pH 9.0至11.0，更优选为pH 10.0。如果流动相的pH被调整至10.0，可以进一步提高碳酸氢铵的缓冲性能。
使用碱性缓冲液和有机溶剂，利用等度方法或梯度方法，可以将GA洗脱到流动相中。然而，优选使用等度方法执行洗脱，其在操作方面方便。
可以用于流动相的有机溶剂的实例包括但不限于甲醇、乙醇、四氢呋喃(THF)和乙腈(MeCN)。优选使用MeCN。
在等度方法中，取决于目标GA的类型，以30∶70至70∶30的比率、优选40∶60至60∶40的比率适当使用碱性缓冲液和有机溶剂，其优选为碳酸氢铵溶液和MeCN。例如，如果目标GA是α-茄碱或α-查茄碱，使用比率为40∶60的碱性缓冲液和有机溶剂，其优选为碳酸氢铵溶液和MeCN。如果目标GA是α-番茄碱，使用比率为60∶40的碱性缓冲液和有机溶剂，其优选为碳酸氢铵溶液和MeCN。
液相色谱可以使用可商购的HPLC装置来执行。可以根据柱尺寸或样品体积适当确定柱平衡和流速。
通过液相色谱获得的级份，可以使用下述的质谱术、UV或多波长检测器等进行分析。
优选，在液相色谱之前，对植物来源的样品进行如下所述的预处理以进行粗纯化。
植物来源的样品含有GA和作为外来物质的各种聚合物(例如淀粉、蛋白质和纤维素)。因此，需要去除样品中包含的作为外来物质的聚合物并对GA进行粗纯化和洗涤，以便实现GA的有效纯化和高精度分析。
对于用来去除作为外来物质的聚合物的方法来说，可以使用本技术领域的专业人员使用的通用方法，例如醇沉淀方法。乙醇或甲醇可以用作醇。然而，甲醇是优选的。在这样的情况下，向醇加入酸，以便以良好的效率将GA以盐形式提取出来。可以使用的酸的实例包括但不限于乙酸、盐酸和甲酸。优选添加甲酸。适当确定向醇添加的酸的量，以便不破坏目标GA。如果使用甲酸，将其加入到醇中以便获得0.1％至2％(v/v)、优选0.1％(v/v)的浓度。如果使用甲酸之外的酸，它可以被添加到其浓度达到与上述添加的甲酸的规定度同等的水平。
在常规样品制备方法(参见Matsuda等，Phytochem.Anal.15：121-124，2004)的情况下，需要长时间并且复杂的预处理。这包含将样品匀浆许多小时，执行多次离心以去除样品中大量包含的作为外来物质的聚合物例如淀粉，以及对得到的物质进行过滤的步骤。同时，根据本发明的制备方法，通过如上所述从快速破碎获得的植物碎片进行醇沉淀，有可能快速除去作为外来物质的聚合物例如淀粉。因此，可以容易地在短时间内执行样品制备。
在醇沉淀后，将含有GA的上清液用酸稀释，例如用0.1％至2％(v/v)的甲酸或乙酸，优选为0.1％(v/v)的甲酸。将稀释液在上述条件下进行液相色谱。
经液相色谱纯化的级份可以进一步进行质谱分析。在这样的情况下，质谱可以通过LC-MS执行，其是将液相色谱与质谱结合的技术。
质谱可以通过扇形场质谱、双重聚焦扇形场质谱、四极质谱、四极离子阱质谱、飞行时间质谱、离子回旋质谱(傅里叶变换质谱)等来执行。
对用于质谱的样品进行电离可以使用的方法的实例包括EI(电子电离)方法、CI(化学电离)方法、DEI(解吸电子电离)方法、DCI(解吸化学电离)方法、FAB(快原子轰击)方法、FRIT-FAB(FRIT-快原子轰击)方法、ESI(电喷雾电离)方法和MALDI(基质辅助激光解吸电离)方法。
在实施例中具体描述了质谱条件。然而，本技术领域的专业人员可以根据用作分析物的GA的类型适当确定条件。
按照本技术领域的专业人员使用的通用方法，可以使用LC-MS对GA的参比分析物进行分析以产生校准曲线。对于马铃薯来源的样品，特别是在α-茄碱或α-查茄碱分析***中，可以使用β-D-葡萄糖胺五乙酸作为内部参比物质。然而，优选使用具有与α-茄碱或α-查茄碱类似的甾类骨架的芸苔素内酯。同时，对于番茄来源的样品，特别是在α-番茄碱分析***中，优选使用水溶性胺。可以用作内部参比物质的水溶性胺的实例包括丝氨酸甲酯和丙氨酸甲酯。然而，由于在柱中达到足够的持留，丙氨酸甲酯是特别优选的。因此，对马铃薯来源的样品使用芸苔素内酯和对番茄来源的样品使用丙氨酸甲酯，可以显著提高定量分析的可靠性。
根据本发明的方法，可以使用具有广泛用于HPLC的尺寸的柱。本文中使用的条件可以直接应用于使用UV或多波长检测器的分析。
实施例
在后文中参考下述实施例对本发明进行更详细描述，但本发明不限于这些实施例。
(实施例1)候选配糖生物碱生物合成基因C的全长序列的获取
使用RNeasy(QIAGEN)，从马铃薯品种“Sassy”的芽提取mRNA。使用SuperScript第一链***(Invitrogen)执行总cDNA合成。据说配糖生物碱的糖苷配基是用胆甾醇形成的，但是这尚未证实(非专利文献1)。然而，假定用胆甾醇相关化合物形成糖苷配基，则必定存在一些羟化步骤。在这种情况下，至少三种类型的酶(即细胞色素P450单加氧酶、双加氧酶和/或NADPH-黄素还原酶)可能参与羟化步骤。其中，细胞色素P450单加氧酶在本文中被指定为靶。作为在马铃薯中表达的基因，根据DFCI马铃薯基因索引第11.0版(Release 11.0 of theDFCI Potato Gene Index)(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html)中公开的信息，选择了TC135549基因，对其已从芽中分离了许多EST克隆。
基于上述序列，使用引物(U841：GCTTGCTCTGTTCTTGTACATCTC(SEQ ID NO：6)和U842：TGAAAAGCAGAATTAGCAGCA(SEQ ID NO：7))执行了PCR(PCR条件：95℃ 5分钟；95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 3分钟共30个循环；以及72℃10分钟)。使用TOPOTA测序用克隆试剂盒(Invitrogen)对扩增产物进行克隆。进一步使用ABI310(Applied Biosystems)测定核苷酸序列。包含ORF区域的序列显示在SEQ ID NO：2中，由cDNA序列编码的酶的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：1中。与上述情形中相同，在本文中使用的番茄的同源基因对应于DFCI番茄基因索引(DFCITomato Gene Index)中的TC192845。包含ORF区域的序列显示在SEQID NO：4中，由cDNA序列编码的酶的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：3中。作为这些基因的核苷酸序列比较的结果，发现其间的同源性为95％(图1)。此外，番茄的同源基因与Bartoszewski等报道的序列一致(Acta Physiol.Plant.22，269-271(2000))。Bartoszewski等报道，鉴定到与烟草中存在的CYP72A2的序列同源(75％)的序列、该基因发生创伤诱导的表达、该基因表现出昼夜节律、并且该基因常常在年轻组织中表达。然而，没有报道关于基因功能的结果或讨论。因此，没有任何关于所述基因参与配糖生物碱生物合成的报道。
(实施例2)候选配糖生物碱生物合成基因C的基因组基因的分离
使用RNeasy(QIAGEN)从“Sassy”提取基因组DNA。使用在实施例1中所使用的引物执行PCR，以测定全长基因组DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。发现DNA含有四个内含子。
(实施例3)用于产生具有被抑制的候选配糖生物碱生物合成基因C的转化体的载体构建
通过转化来抑制上述基因，所使用的方法包含诱导反向互补链的基因片段的表达，该基因片段被构造成由强启动子驱动(这种方法一般被称为植物的RNAi方法)(Chuang和Meyerowitz，Proc Natl AcadSci，USA，97，4985-90(2000)；Wesley等，Plant J.，27，581-90(2001))。使用引物(U724：GAGCTCTAGAGAAGCAAAGAAAACACC(SEQ IDNO：8)和U725：GGATCCATATGCTAACCAATTCCTCCCATC(SEQID NO：9))对在实施例1中获得的全长cDNA进行PCR(PCR条件：95℃ 5分钟；95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 30秒共30个循环；以及72℃ 10分钟)。由此获得了基因片段。使用pKT11二元载体(日本专利公布2001-161373A号)作为参比载体，通过依次连接花椰菜花叶病毒35S RNA启动子、所述基因片段(正向方向)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)八氢番茄红色去饱和酶基因(AT4g14210)的第7个内含子、所述基因片段(反向方向)和花椰菜花叶病毒35S RNA终止子，制备了用于植物转化的pKT226载体(图2)。
(实施例4)转化的马铃薯植物的产生
通过电穿孔方法，将实施例3中制备的载体导入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3110菌株(Gelvin和Schilperoor，《植物分子生物学手册》(Plant Molecular Biology Manual)，C2，1-32(1994)，Kluwer Academic Publishers)。将包含所述载体的根癌土壤杆菌GV3110菌株，在增补有50ppm卡那霉素的YEB液体培养基(5g/l牛肉提取物，1g/l酵母提取物，5g/l蛋白胨，5g/l蔗糖和2mM硫酸镁(pH7.2))中，在28℃进行12小时振摇培养。将培养液(1.5ml)以10,000rpm离心3分钟进行收获，然后用LB培养基(1ml)清洗以除去卡那霉素。进一步以10,000rpm离心3分钟进行收获。将得到的菌重悬浮在含有3％蔗糖的MS培养基(1.5ml)中(Murashige & Skoog，Physiol.Plant.，15，473-497(1962))。由此获得了用于感染的细菌悬液。
马铃薯的转化按照常规方法来执行(Monma(1990)，PlantBiotechnology 7：57-63)。将从马铃薯品种“Sassy”获得的试管微型薯(Kirin Agribio Company，Limited.)切成厚度为2至3mm的片，由此制备了用于土壤杆菌感染的材料。将切片浸泡在上述土壤杆菌细胞悬液中，然后放置在无菌滤纸上以除去过量土壤杆菌细胞。将切片置于皮氏培养皿中的MS培养基上(增补有玉米素(1ppm)、IAA(0.1ppm)、乙酰丁香酮(100μM)和琼脂(0.8％))。在包含16小时光照(光子通量密度：32μE/m2s)/8小时无光照的条件下，在25℃执行3天的培养。接下来，在增补有羧苄青霉素(250ppm)代替乙酰丁香酮的培养基中执行1周的培养。然后，将培养产物进一步转移到增补有卡那霉素(50ppm)的培养基上，随后以2周的时间间隔进行传代培养。在传代培养期间，发生不定芽形成和随后的苗形成。将长出的苗置于含有羧苄青霉素(250ppm)和卡那霉素(100ppm)并且不含植物生长调节剂的MS培养基上。通过PCR，从生根的苗长出的卡那霉素抗性植物中检测具有作为外来基因的卡那霉素抗性基因的每个个体(PCR条件：95℃ 5分钟；95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟共30个循环；以及72℃ 10分钟)，从而证实重新分化的植物是转化的植物。在这里，使用下列引物作为能够特异性扩增卡那霉素抗性基因序列的引物：TAAAGCACGAGGAAGCGGT(SEQ ID NO：10)；和GCACAACAGACAATCGGCT(SEQ ID NO：11)。因此，获得了用pKT226载体转染的28个转化的马铃薯植物株系。
(实施例5)转化的植物中配糖生物碱含量和候选基因C的表达的分析
在传代培养后，让在实施例4中获得的28个株系的体外茎生长一个月。收集2至4个茎，将重量调整至约100mg。通过下面描述的包含使用耐碱性反相色谱柱的液相层析的方法(其已公开在日本专利申请2009-170317号中)，测定配糖生物碱含量。
马铃薯中包含的GA(α-茄碱和α-查茄碱)的分析
1.样品制备
在传代培养后，让在实施例4中获得的28株个体的体外茎生长一个月。收集2至4个茎，将重量调整至约100mg。向其加入用作内部参比物的含有0.1％甲酸和芸苔素内酯(Brassino Co.，Ltd.)(10μg/μL)的80％甲醇水溶液(990μL)，然后使用混合磨进行破碎(1/25秒，5分钟，4℃)。将获得的破碎物离心(10,000rpm，5分钟)，然后进行醇沉淀。然后收集一部分上清液(25μL)，并使用0.1％甲酸溶液调整至500μL。在下述条件下对由此获得的样品进行LC-MS。使用LCMS-2010EV(岛津制作所)作为LC-MS仪器。
2.LC-MS条件
(i)LC条件
将具有出色耐碱性的亚乙基交联柱(XBridgeTM Shield RP18-5(Φ2.1x 150nm，Waters))用于LC***。在等度条件下，使用含有上述样品溶剂的A∶B比率为40∶60的下述流动相：流动相A：10mM碳酸氢铵溶液(pH 10.0)；流动相B：MeCN。在本文中使用的其他条件如下所述。
流速：0.2mL/min
柱箱：40℃
(ii)MS条件
首先，通过扫描模式证实每种组分的MS谱(参见图3)。结果，使用SIM模式的检测方法(m/z：481(芸苔素内酯)，869(α-茄碱)，853(α-查茄碱))。
在本文中使用的其他MS条件如下所述。
MS检测：正离子模式
电离方法：ESI
事件时间：1秒
检测器电压：1.5kV
分析时间：8分钟
3.使用参比产品(α-茄碱、α-查茄碱和芸苔素内酯)产生校准曲线
将α-茄碱(和光纯药)(2mg)和α-查茄碱(Sigma-Aldrich)(2mg)分别溶解在0.1％(v/v)甲酸溶液(1mL)中(以便获得每种产品的2μg/μL溶液)。将等体积的两种不同溶液混合，以制备含有浓度为1μg/μL(＝1000ng/μL)的α-茄碱和α-查茄碱的溶液。将溶液用0.1(v/v)甲酸溶液以逐步方式稀释10倍，然后进行LC-MS。由此产生了校准曲线。此外，还获得了这两种物质的检出限。
将芸苔素内酯(Brassino Co.，Ltd.)(1mg)溶解在甲醇溶液(1mL)中(1μg/μL)。将得到的溶液用50％(v/v)甲醇水溶液以逐步方式稀释10倍，然后进行LC-MS。由此产生了校准曲线。
图4显示了为α-茄碱、α-查茄碱和芸苔素内酯产生的校准曲线。如图4所示，证实α-茄碱和α-查茄碱在0.05至50ng的范围内有良好的线性，置信系数为0.99以上。对于这两种物质来说，当含量超过100ng时，观察到信号饱和，导致失去线性。此外，这两种物质的检出限为0.02ng(每次进样2μL)。
同时，证实芸苔素内酯在2至200ng的范围内有良好的线性(参见图4)。当含量不低于500ng时，这引起了与上面的情况相同的信号饱和。
图5显示了参比产品(α-茄碱、α-查茄碱和芸苔素内酯)的典型色谱图。
4.使用芸苔素内酯作为内部参比物对马铃薯中的GA进行LC-MS分析
在上述条件下，将在上面1中制备的每种样品(10μL或20μL)注射到LC-MS***中。
发现用作内部参比物的芸苔素内酯的回收率为50％至110％。根据芸苔素内酯的定量值执行校正，然后根据上述校准曲线对每个样品中的α-茄碱和α-查茄碱的量进行定量测定。计算每100mg(FW)每个样品的α-茄碱和α-查茄碱的量。
图6显示了分析的典型色谱图。
在从28个株系中选择的4个株系(#20、#35、#45和#67)中，发现蓄积的配糖生物碱的量低，并具有良好的可重复性。因此，如上所述，将这4个株系的体外茎在液氮中粉碎。使用每种破碎物的一半部分进行配糖生物碱含量测定。使用RNeasy(QIAGEN)对其另一半部分进行mRNA提取。使用SuperScript第一链***(Invitrogen)执行总cDNA合成。发现这些株系的个体中蓄积的配糖生物碱的量明显低于非转化体(两个个体)中的量(图7)。此外，作为使用引物(U724：GAGCTCTAGAGAAGCAAAGAAAACACC(SEQ ID NO：12)和U840：GGGCATGAACATAGGAAGGA(SEQ ID NO：13))进行RT-PCR的结果，发现在任一个体中mRNA以明显低的水平表达，或不能被观察到(图8)。这些结果揭示出候选基因C的表达的抑制引起配糖生物碱蓄积的显著减少，并且它们也揭示出候选基因C是编码配糖生物碱生物合成酶的基因。让4个株系的体外植物与非转化体一起增殖。将每个株系的三个个体在可商购的植物培养土中适应，并按照通用方法栽培在生物危害温室中，然后收获块茎。发现4个株系(#20、#35、#45和#67)的各个个体与非转化体生长相当。尽管发现#35株系的单个块茎平均重量低，但有可能收获平均重量与非转化体的平均重量相当的块茎(表1)。
表1：马铃薯转化体块茎产量
Figure BDA0000155033560000261
此外，剥去每个株系的三个收获块茎每个的中央部分的表皮约1mm的厚度。然后按照上述方式分析配糖生物碱含量。结果，令人吃惊地证实，块茎中的配糖生物碱含量极低，其值低于采用同样方式对已知具有低配糖生物碱含量的品种“Sayaka”所测定的值(图9)。
(实施例6)转化的番茄植物的产生
按照常规方法执行番茄转化(Sun等，(2006)Plant Cell Physiol.47：426-431)。对包含实施例3中制备的pKT226载体的根癌土壤杆菌AGL0菌株进行培养，以获得用于感染的细菌悬液。将通过无菌播种获得的被称为“Micro-Tom”的番茄实验株系植株的子叶切片(厚度：5mm以下)，在上述用于感染的土壤杆菌悬液中浸泡10分钟，然后置于无菌滤纸上以除去过量的土壤杆菌细胞。将叶切片置于皮氏培养皿中的共培养MS培养基上(增补有玉米素(1.5mg/l)、乙酰丁香酮(40μM)和Gelrite
Figure BDA0000155033560000262
(0.3％))(Murashige & Skoog，Physiol.Plant.，15，473-497(1962))。将皮氏培养皿在暗处在25℃下进行3天培养。使用选择性MS培养基1(增补有玉米素(1.5mg/l)、卡那霉素(100mg/l)、奥格门汀(375mg/l)和Gelrite
Figure BDA0000155033560000263
(0.3％))，在包含16小时光照(光子通量密度：32μE/m2s)/8小时无光照的条件下，在25℃下对切片进行时间间隔为2周的传代培养。在传代培养期间，发生不定芽形成和随后的苗形成。为了使苗进一步生长，将苗移植到选择性MS培养基2(增补有玉米素(1.0mg/l)、卡那霉素(100mg/l)、奥格门汀(375mg/l)和Gelrite
Figure BDA0000155033560000264
(0.3％))。将长出的苗在1/2浓度的选择性MS培养基(增补有卡那霉素(100mg/l)、奥格门汀(375mg/l)和Gelrite
Figure BDA0000155033560000271
(0.3％))中生根。通过PCR，从生根苗长出的卡那霉素抗性植物中检测具有作为外来基因的卡那霉素抗性基因的每个个体(PCR条件：95℃ 5分钟；95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟共30个循环；以及72℃ 10分钟)，从而证实重新分化的植物是转化的植物。在这里，使用下列引物作为能够特异性扩增卡那霉素抗性基因序列的引物：TAAAGCACGAGGAAGCGGT(SEQ ID NO：14)；和GCACAACAGACAATCGGCT(SEQ ID NO：15)。于是，获得了被pKT226载体转染的32个转化的番茄植物株系。将获得的28个个体在温室中适应，并栽培约2个月。每个株系称取三片新生叶，约100mg。与马铃薯的情况相同，通过实施例5中描述的包含使用耐碱性反相色谱柱的液相色谱方法，测定配糖生物碱含量。注意，对于分析条件来说，在等度条件下，使用含有上述样品溶剂的A∶B比率为60∶40的下述流动相：流动相A：10mM碳酸氢铵溶液(pH 10.0)；流动相B：MeCN。结果，发现32个株系中的7个株系具有每100mg鲜重(FW)50μg或以下的明显低的番茄碱含量(图11)。
(实施例7)具有候选配糖生物碱生物合成基因C突变的植物的筛选
从对马铃薯品种(“Sassy”)进行包括粒子束辐射(NIRS-HIMAC辐射装置；0.1Gy至3Gy的氩离子束(500MeV/核子)，0.2Gy至3Gy的氖离子束(400MeV/核子)或0.5Gy至5Gy的碳离子束(290MeV/核子))(由Kirin Agribio Company，Limited的Okamura博士(主研究员)提供)的突变处理而获得的体外植物的10个个体收集叶片。然后使用DNeasy获得基因组DNA。使用引物(U841：GCTTGCTCTGTTCTTGTACATCTC(SEQ ID NO：16)和U842：TGAAAAGCAGAATTAGCAGCA(SEQ ID NO：17))对基因组DNA的结构基因进行PCR(PCR条件：95℃ 5分钟；95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 5分钟共30个循环；以及72℃ 10分钟)。由此获得基因区域。此外，使用TOPOTA测序用克隆试剂盒进行克隆。进一步使用ABI310测定核苷酸序列。结果发现，在本文提供的10个原株中不含具有突变基因的株系。然而，通过使用经历过充分突变处理的植物重复执行上述程序，有可能获得具有突变基因的植物。
(实施例8)候选配糖生物碱生物合成基因D的全长序列的获取
使用RNeasy(QIAGEN)，从马铃薯品种“Sassy”的芽提取mRNA。使用SuperScript第一链***(Invitrogen)执行总cDNA合成。据说配糖生物碱的糖苷配基是用胆甾醇形成的，但是这尚未证实(非专利文献1)。然而，假定糖苷配基是由胆甾醇相关化合物形成的，则必定存在一些羟化步骤。在这种情况下，至少三种类型的酶(即细胞色素P450单加氧酶、双加氧酶和/或NADPH-黄素还原酶)可能参与羟化步骤。其中，细胞色素P450单加氧酶在本文中被指定为靶。作为在马铃薯中表达的基因，根据DFCI马铃薯基因索引第11.0版(Release 11.0 of theDFCI Potato Gene Index)(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html)中公开的信息，选择了TC141445基因，对其已从芽中分离了许多EST克隆。
基于上述序列，使用引物(U883：AGCAATCAAACATGGGTATTG(SEQ ID NO：23)和U876：TGATGTGAACTTGAGATTGGTG(SEQID NO：24))执行了PCR(PCR条件：95℃ 5分钟；95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 3分钟共30个循环；以及72℃ 10分钟)。使用TOPOTA测序用克隆试剂盒(Invitrogen)对扩增产物进行克隆。进一步使用ABI310(Applied Biosystems)测定核苷酸序列。包含ORF区域的序列显示在SEQ ID NO：19中，由cDNA序列编码的酶的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：18中。在本文中使用的番茄的同源基因对应于sol基因组网(http://solgenomics.net/)的Lycopersicon Combined(Tomato)Unigene中的SGN-U567668。包含ORF区域的序列显示在SEQ ID NO：21中，由cDNA序列编码的酶的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：20中。作为这些基因的核苷酸序列比较的结果，发现其间的同源性为95％(图11)。此外，番茄的同源基因的基因组序列与报告为SL1.00sc04687的序列一致，其具有茄科基因组网(http://solgenomics.net/index.pl)中已报道包含4个内含子的基因组结构。然而，网站上对其功能没有任何报告。
(实施例9)候选配糖生物碱生物合成基因D的基因组基因的分离
使用RNeasy(QIAGEN)从“Sassy”提取基因组DNA。使用在实施例1中所使用的引物执行PCR，用来测定全长基因组DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：22)。发现DNA含有四个内含子。
(实施例10)用于产生候选配糖生物碱生物合成基因D被抑制的转化体的载体构建
通过转化来抑制上述基因，所使用的方法包含诱导反向互补链的基因片段的表达，该基因片段被构造成由强启动子驱动(这种方法一般被称为用于植物的RNAi方法)(Chuang和Meyerowitz，Proc NatlAcad Sci，USA，97，4985-90(2000)；Wesley等，Plant J.，27，581-90(2001))。使用引物(U726：GAGCTCTAGAGGTTAAGAGTTTGTGCCAACG(SEQ ID NO：25)和U727：GGATCCATATGGCTTTCTCTTGCCAATCTG(SEQ ID NO：26))对在实施例1中获得的全长cDNA进行PCR(PCR条件：95℃ 5分钟；95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 30秒共30个循环；以及72℃ 10分钟)。由此获得了基因片段。使用pKT11二元载体(日本专利公布2001-161373A号)作为参比载体，通过依次连接花椰菜花叶病毒35SRNA启动子、所述基因片段(正向方向)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)八氢番茄红色去饱和酶基因(AT4g14210)的第3个内含子、所述基因片段(反向方向)和胭脂氨酸合成酶基因终止子，制备了用于植物转化的pKT227载体(图12)。
(实施例11)转化的马铃薯植物的产生
通过电穿孔方法，将实施例10中制备的载体导入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3110菌株(Gelvin和Schilperoor，《植物分子生物学手册》(Plant Molecular Biology Manual)，C2，1-32(1994)，Kluwer Academic Publishers)。将包含所述载体的根癌土壤杆菌GV3110菌株，在增补有50ppm卡那霉素的YEB液体培养基(5g/l牛肉提取物，1g/l酵母提取物，5g/l蛋白胨，5g/l蔗糖和2mM硫酸镁(pH7.2))中，在28℃进行12小时振摇培养。将培养液(1.5ml)以10,000rpm离心3分钟进行收获，然后用LB培养基(1ml)清洗以除去卡那霉素。进一步以10,000rpm离心3分钟进行收获。将得到的菌重悬浮在含有3％蔗糖的MS培养基(1.5ml)中(Murashige & Skoog，Physiol.Plant.，15，473-497(1962))。由此获得了用于感染的细菌悬液。
马铃薯的转化按照常规方法来执行(Monma(1990)，PlantBiotechnology 7：57-63)。将从马铃薯品种“Sassy”获得的试管微型薯(Kirin Agribio Company，Limited.)切成厚度为2至3mm的片，由此制备了用于土壤杆菌感染的材料。将切片浸泡在上述土壤杆菌细胞悬液中，然后放置在无菌滤纸上以除去过量土壤杆菌细胞。将切片置于皮氏培养皿中的MS培养基上(增补有玉米素(1ppm)、IAA(0.1ppm)、乙酰丁香酮(100μM)和琼脂(0.8％))。在包含16小时光照(光子通量密度：32μE/m2s)/8小时无光照的条件下，在25℃执行3天的培养。接下来，在增补有羧苄青霉素(250ppm)代替乙酰丁香酮的培养基中执行1周的培养。然后，将培养产物进一步转移到增补有卡那霉素(50ppm)的培养基上，随后以2周的时间间隔进行传代培养。在传代培养期间，发生不定芽形成和随后的苗形成。将长出的苗置于含有羧苄青霉素(250ppm)和卡那霉素(100ppm)并且不含植物生长调节剂的MS培养基上。通过PCR，从生根的苗长出的卡那霉素抗性植物中检测具有作为外来基因的卡那霉素抗性基因的每个个体(PCR条件：95℃ 5分钟；95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟共30个循环；以及72℃ 10分钟)，从而证实重新分化的植物是转化的植物。在这里，使用下列引物作为能够特异性扩增卡那霉素抗性基因序列的引物：TAAAGCACGAGGAAGCGGT(SEQ ID NO：10)；和GCACAACAGACAATCGGCT(SEQ ID NO：11)。于是，获得了用pKT227载体转染的31个转化的马铃薯植物株系。
(实施例12)转化的植物中配糖生物碱含量和候选基因D表达的分析
以实施例5中使用的方式，对实施例11中获得的31个株系进行配糖生物碱含量测定。
在从31个株系选出的4个株系(#9、#28、#45和#59)中，发现积累蓄积的配糖生物碱的量低，并具有良好的可重复性。因此，如上所述，将4个株系的体外茎在液氮中粉碎。使用各破碎物的一半部分进行配糖生物碱含量测定。使用RNeasy(QIAGEN)对其另一半部分进行mRNA提取。使用SuperScript第一链***(Invitrogen)执行总cDNA合成。发现这些株系的个体中蓄积的配糖生物碱的量明显低于非转化体(两个个体)中的量(图13)。此外，作为使用引物(U871：TCGGGTGAGTTCAGAAAACC(SEQ ID NO：27)和U727：GGATCCATATGGCTTTCTCTTGCCAATCTG(SEQ ID NO：28))进行RT-PCR的结果，发现在任一个体中mRNA以明显低的水平表达，或不能被观察到(图14)。这些结果揭示出候选基因D表达的抑制引起配糖生物碱蓄积的显著减少，并且它们也揭示出候选基因D是编码配糖生物碱生物合成酶的基因。让4个株系的体外植物与非转化体一起增殖。将每个株系的三个个体在可商购的植物培养土中(在一个种植盆中)适应，并按照通用方法栽培在生物危害温室中，然后收获块茎。发现4个株系(#9、#28、#45和#59)的每个个体与每个非转化体(在两个种植盆中的两个转化体的)生长相当。转化体之间块茎的数量不存在差异。同时发现，在1个块茎的平均重量和1株的总重量方面，几乎所有的转化体都低于非转化体。然而，有可能收获在重量之外的其他条件方面与非转化体相当的块茎(表2)。
表2：马铃薯转化体块茎产量
  株系号   块茎平均数量   1个块茎的平均重量(g)   1株的总重量(g)
  非转化体   9.3   20.6   192.2
  非转化体   25.0   6.9   172.1
  #9   8.3   5.9   49.0
  #28   14.3   3.9   56.4
  #45   11.7   7.9   91.9
  #59   9.7   11.6   111.8
此外，剥去每个株系的三个收获块茎的每个中央部分表皮约1mm的厚度。然后按照上述方式分析配糖生物碱含量。结果令人吃惊地证实，块茎中的配糖生物碱含量极低，其值低于采用同样方式对已知具有低配糖生物碱含量的品种“Sayaka”所测定的值(图15)。
(实施例13)转化的番茄植物的产生
按照常规方法执行番茄转化(Sun等，(2006)Plant Cell Physiol.47：426-431)。对包含实施例10中制备的pKT227载体的根癌土壤杆菌AGL0菌株进行培养，以获得用于感染的细菌悬液。将通过无菌播种获得的被称为“Micro-Tom”的番茄实验株系植株的子叶切片(厚度：5mm以下)，在上述用于感染的土壤杆菌悬液中浸泡10分钟，然后置于无菌滤纸上以除去过量的土壤杆菌细胞。将叶切片置于皮氏培养皿中的共培养MS培养基上(增补有玉米素(1.5mg/l)、乙酰丁香酮(40μM)和Gelrite
Figure BDA0000155033560000321
(0.3％))(Murashige & Skoog，Physiol.Plant.，15，473-497(1962))。将皮氏培养皿在暗处在25℃下进行3天培养。使用选择性MS培养基1(增补有玉米素(1.5mg/l)、卡那霉素(100mg/l)、奥格门汀(375mg/l)和Gelrite
Figure BDA0000155033560000322
(0.3％))，在包含16小时光照(光子通量密度：32μE/m2s)/8小时无光照的条件下，在25℃下对切片进行时间间隔为2周的传代培养。在传代培养期间，发生不定芽形成和随后的苗形成。为了使苗进一步生长，将苗移植到选择性MS培养基2(增补有玉米素(1.0mg/l)、卡那霉素(100mg/l)、奥格门汀(375mg/l)和Gelrite(0.3％))。将长出的苗在1/2浓度的选择性MS培养基(增补有卡那霉素(100mg/l)、奥格门汀(375mg/l)和Gelrite
Figure BDA0000155033560000331
(0.3％))中生根。通过PCR，从生根的苗长出的卡那霉素抗性植物中检测具有作为外来基因的卡那霉素抗性基因的每个个体(PCR条件：95℃ 5分钟；95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟共30个循环；以及72℃10分钟)，从而证实重新分化的植物是转化的植物。在这里，使用下列引物作为能够特异性扩增卡那霉素抗性基因序列的引物：TAAAGCACGAGGAAGCGGT(SEQ ID NO：14)；和GCACAACAGACAATCGGCT(SEQ ID NO：15)。于是，获得了被pKT227载体转染的21个转化的番茄植物株系。将获得的21个株系在温室中适应，并栽培约2个月。每个株系称取三个新发生的叶，约100mg。与马铃薯的情况相同，通过实施例5中描述的包含使用耐碱性反相色谱柱的液相色谱方法，测定配糖生物碱含量。注意，对于分析条件，在等度条件下，使用含有上述样品溶剂的A∶B比率为60∶40的下述流动相：流动相A：10mM碳酸氢铵溶液(pH 10.0)；流动相B：MeCN。结果，发现21个株系中的6个株系具有每100mg鲜重50μg以下的明显低的番茄碱含量(图16)。
(实施例14)具有候选配糖生物碱生物合成基因D突变的植物的筛选
从对马铃薯品种(“Sassy”)进行包括粒子束辐射(NIRS-HIMAC辐射装置；0.1Gy至3Gy的氩离子束(500MeV/核子)，0.2Gy至3Gy的氖离子束(400MeV/核子)或0.5Gy至5Gy的碳离子束(290MeV/核子))(由Kirin Agribio Company，Limited的Okamura博士(主研究员)提供)的突变处理而获得的体外植物的10个个体收集叶片。然后使用DNeasy获得基因组DNA。使用引物(U883：AGCAATCAAACATGGGTATTG(SEQ ID NO：27)和U876：TGATGTGAACTTGAGATTGGTG(SEQ ID NO：28))对基因组DNA的结构基因进行PCR(PCR条件：95℃ 5分钟；95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 5分钟共30个循环；以及72℃ 10分钟)。由此获得基因区域。此外，使用TOPOTA测序用克隆试剂盒进行克隆。进一步使用ABI310测定核苷酸序列。结果发现，在本文提供的10个原株中不含具有突变基因的株系。然而，通过使用经历过充分突变处理的植物重复执行上述程序，有可能获得具有突变基因的植物。
在本文中引用的所有出版物、专利和专利申请在此以其全文引为参考。
工业实用性
配糖生物碱生物合成酶和利用本发明基因的生物体生产/检测方法，可用于开发使用生物体例如植物进行配糖生物碱化合物的生产以及茄科植物品种例如马铃薯的选择。
序列自由文本名单
引物：SEQ ID NOS：6至17和23至28
Figure IDA0000155033650000011
Figure IDA0000155033650000021
Figure IDA0000155033650000031
Figure IDA0000155033650000051
Figure IDA0000155033650000061
Figure IDA0000155033650000081
Figure IDA0000155033650000091
Figure IDA0000155033650000111
Figure IDA0000155033650000131
Figure IDA0000155033650000141
Figure IDA0000155033650000151
Figure IDA0000155033650000161
Figure IDA0000155033650000171
Figure IDA0000155033650000181
Figure IDA0000155033650000191
Figure IDA0000155033650000211
Figure IDA0000155033650000221
Figure IDA0000155033650000231
Figure IDA0000155033650000241
Figure IDA0000155033650000251
Figure IDA0000155033650000261
Figure IDA0000155033650000271

Claims (15)

1.一种蛋白，其是下列(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：1或18所示的氨基酸序列的蛋白；或
(b)具有配糖生物碱生物合成酶活性并包含相对于SEQ ID NO：1或18所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的缺失、取代、***或添加的氨基酸序列的蛋白。
2.一种基因，其包含选自下列(c)至(f)的DNA：
(c)由SEQ ID NO：2或19所示的核苷酸序列构成的DNA；
(d)在严紧条件下与由SEQ ID NO：2或19所示的核苷酸序列构成的DNA的互补核苷酸序列所构成的DNA杂交、并编码具有配糖生物碱生物合成酶活性的蛋白的DNA；
(e)由与SEQ ID NO：2或19所示的核苷酸序列具有80％以上序列同一性的核苷酸序列构成、并编码具有配糖生物碱生物合成酶活性的蛋白的DNA；或
(f)由SEQ ID NO：2或19所示的核苷酸序列的简并异构体构成的DNA。
3.一种蛋白，其是下列(g)或(h)：
(g)包含SEQ ID NO：3或20所示的氨基酸序列的蛋白；或
(h)具有配糖生物碱生物合成酶活性并包含相对于SEQ ID NO：3或20所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的缺失、取代、***或添加的氨基酸序列的蛋白。
4.一种基因，其包含选自下列(i)至(l)的DNA：
(i)由SEQ ID NO：4或21所示的核苷酸序列构成的DNA；
(j)在严紧条件下与由SEQ ID NO：4或21所示的核苷酸序列构成的DNA的互补核苷酸序列所构成的DNA杂交、并编码具有配糖生物碱生物合成酶活性的蛋白的DNA；
(k)由与SEQ ID NO：4或21所示的核苷酸序列具有80％以上序列同一性的核苷酸序列构成、并编码具有配糖生物碱生物合成酶活性的蛋白的DNA；或
(l)由SEQ ID NO：4或21所示的核苷酸序列的简并异构体构成的DNA。
5.一种重组载体，其包含权利要求2或4的基因。
6.一种转化体，所述转化体中中导入权利要求5的重组载体。
7.权利要求6的转化体，其是植物。
8.一种用于在植物中检测编码配糖生物碱生物合成酶的基因的突变和/或多态性的存在的方法，所述方法包含：
(i)从植物分离基因组DNA或RNA形式的核酸的步骤；
(ii)当(i)中的核酸是RNA时，经反转录合成cDNA的步骤；
(iii)从步骤(i)或(ii)中获得的DNA扩增包含SEQ ID NO：2、4或5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：19、21或22所示的核苷酸序列的基因片段的步骤；以及
(iv)确定DNA中突变和/或多态性的存在的步骤。
9.权利要求8的方法，其中植物是属于茄科的植物。
10.一种用于选择具有突变和/或多态性的植物的方法，所述方法包含通过权利要求8或9的方法检测编码配糖生物碱生物合成酶的基因的突变和/或多态性。
11.一种在编码配糖生物碱生物合成酶的基因中具有突变和/或多态性的植物，所述植物通过权利要求9的方法选择。
12.权利要求11的植物，其是属于茄科的植物。
13.一种选择权利要求8或9中所述植物的方法，所述方法包含选择植物，所述植物与现有品种相比，其中表达配糖生物碱生物合成酶编码基因的能力或所述基因编码的配糖生物碱生物合成酶的活性发生变化。
14.一种通过权利要求13的方法所选择的植物，在所述植物中，与现有品种相比，表达配糖生物碱生物合成酶编码基因的能力或配糖生物碱生物合成酶的活性发生变化。
15.权利要求14的植物，其是属于茄科的植物。
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