JP6159161B2 - ステロイド骨格の16位を酸化する酵素をコードする遺伝子および該遺伝子の発現が低下した植物体 - Google Patents
ステロイド骨格の16位を酸化する酵素をコードする遺伝子および該遺伝子の発現が低下した植物体 Download PDFInfo
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Description
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
[2] 植物体が栽培品種である[1]の方法。
(a) 配列番号1または配列番号3に示すアミノ酸配列からなるタンパク質;および
(b) 配列番号1または配列番号3に示すアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化するタンパク質;
である、[1]または[2]の方法。
(c) 配列番号2または配列番号4に示す塩基配列からなるDNA;
(d) 配列番号2または配列番号4に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化する活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(e) 配列番号2または配列番号4に示す塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化するタンパク質をコードするDNA;および
(f) 配列番号2または配列番号4に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA;
にコードされるものである、[1]または[2]の方法。
(g) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなるタンパク質;および
(h) 配列番号3に示すアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化するタンパク質;
である、[1]または[2]の方法。
(i) 配列番号4に示す塩基配列からなるDNA;
(j) 配列番号4に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化するタンパク質をコードするDNA;
(k) 配列番号4に示す塩基配列と80%以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、
ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化するタンパク質をコードするDNA;および
(l) 配列番号4に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA;
にコードされるものである、[1]または[2]の方法。
[8] ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化する酵素の活性の抑制、または該酵素をコードする遺伝子の発現の抑制が、前記酵素をコードする遺伝子の欠失によりもたらされるものである[1]〜[6]のいずれかの方法。
[9] ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化する酵素の活性が抑制されているか、該酵素をコードする遺伝子の発現が抑制されている植物体を母本として、交配により得られた後代を選抜することを含む、[1]〜[6]のいずれかの方法。
[11] 母本が、野生株のスクリーニングにより得られたものである、[9]の方法。
[12] 母本の取得と後代の選抜において、ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化する酵素をコードする遺伝子の突然変異または多型の存在を検出するものである、[9]の方法。
(i) ゲノムDNAまたはRNAである核酸を植物から単離する工程、
(ii) (i)の核酸がRNAである場合に逆転写しcDNAを合成する工程、
(iii) (i)または(ii)の工程で得られたDNAから配列番号2、配列番号4または配列番号5に示す塩基配列の少なくとも一部を含有する遺伝子断片を増幅する工程、ならびに
(iv) DNA中に突然変異または多型の存在を決定する工程、
を含むものである、[12]の方法。
[15] ジャガイモである、[14]の栽培品種。
[17] [13]の方法において使用する、遺伝子増幅のためのプライマー配列。
[19] グリコアルカロイドを蓄積しないものである、[18]の栽培品種。
本発明のステロイド骨格の16位を酸化する酵素タンパク質は、ジャガイモ等ナス科植物(Solanaceae)に含まれるグリコアルカロイド生合成酵素である。バレイショ等ナス科には、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、トマト(Solanum lycopersicum)、ナス(Solanum melongena)、トウガラシ(Capsicum annuum)等が含まれる。本発明の酵素により得られるグリコアルカロイドは、ジャガイモ等のナス科植物に合成されるグリコアルカロイドが含まれ、例えばジャガイモのチャコニンおよびソラニン等のグリコアルカロイド、トマトのトマチン等のグリコアルカロイドが挙げられる。本発明のグリコアルカロイド生合成酵素は、ステロイド骨格の16位を酸化する酵素活性を有するタンパク質であり、グリコアルカロイドを合成するために必須の酵素である。本発明のグリコアルカロイド生合成酵素の基質となる好ましいステロイド化合物としては、コレステロール類が挙げられる。コレステロール類としては、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、22ヒドロキシコレステロール26ヒドロキシコレステロール、22,26ジヒドロキシコレステロールなどが挙げられる。本発明のステロイド骨格の16位を酸化する酵素はこれらを酸化する酵素である。本明細書では、上述の酵素活性を「16位酸化酵素活性」、該酵素活性を有する酵素を「16位酸化酵素」と言う。また、本発明の酵素タンパク質は、2-オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼに属する。
本明細書中で使用する「DNA」という用語は、ゲノムDNA、遺伝子、cDNAおよび化学修飾DNAを包含するものとする。
本発明で使用する16位酸化酵素をコードするDNAは、ステロイド骨格の16位を酸化する活性を有する酵素をコードするDNAである。
(a) 配列番号1または、配列番号3に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b) 配列番号1または、配列番号3に示すに示すアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、16位酸化酵素活性を有するタンパク質;
(c) 配列番号1または、配列番号3に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、16位酸化酵素活性を有するタンパク質;
のいずれかからなる群から選択されるタンパク質をコードする。
(d) 配列番号2または配列番号4に示す塩基配列を含むDNA;
(e) 配列番号2または配列番号4に示す塩基配列を含むDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、16位酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(f) 配列番号2または配列番号4に示す塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつ、16位酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(g) 配列番号2または配列番号4に示す塩基配列において縮重配列を含むDNA;
のいずれかからなる群から選択される。
本発明のDNAは、それを発現可能にするために、制御配列を含む適切なベクターに挿入される。このようにして得られた組換え体DNAが組換えベクターである。
本発明は、植物におけるステロイド骨格の16位を酸化する酵素をコードする遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。抑制する方法は、遺伝子組換えによるRNAi法、アンチセンス法、ウイルスベクターを利用したPTGS法、small RNA等を直接導入する方法などの方法を用いることができる。また、ZFN(zinc finger nuclease)法、TALEN(Tale nuclease)法 [Science,333,307(2011)]、Cre-loxP部位特異的組換え法などのゲノム自体を改変する方法も用いることができる。これらの方法には、本発明で提供される配列を直接変異の導入部位として利用するものが含まれる。あるいは本発明で提供される配列とゲノム情報等から近接領域の配列を特定し、当該近接領域の配列を利用することにより、ステロイド骨格の16位を酸化する酵素をコードする遺伝子の全領域を欠失させることもできる。本明細書において、「遺伝子の発現を抑制する」とは、遺伝子(DNA)の転写産物としてのRNA、翻訳産物としてのタンパク質、あるいはタンパク質の機能としての酵素活性のいずれかの量を低下させるか、消失させることを言う。ステロイド骨格の16位を酸化する酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することにより、植物体におけるステロイド骨格の16位を酸化する酵素の活性が低下または消失する。
本発明は、植物におけるステロイド骨格の16位を酸化する酵素をコードする遺伝子突然変異、一塩基多型(SNP)等の多型、遺伝子発現変異の存在を検出するための方法を提供する。変異個体は放射線によるもの、化学処理によるもの、UV照射によるもの、自然突然変異によるものであっても構わない。
上記により得られた変異株または選抜された野生株を母本として、グリコアルカロイドの蓄積が低減または消失した栽培品種を作出することができる。栽培品種から得られた変異株を母本とする場合は、当該変異株同士を交配するか、目的とする同じ遺伝子の異なる部位に変異を有する変異株同士を交配することが変異を早期に固定する上で有利と考えられる。ジャガイモやジャガイモ近縁種との交配については、古典的な自家不和合性や胚乳均衡数(EBN: Endosperm Balance Number)説による不和合などの障害が知られているが、これらは胚珠への直接受粉、胚珠培養、正逆の交雑の実施、体細胞融合等の処理を行うことで交配または交配と同等の処理を実施することが可能である。これらについては「ジャガイモ辞典」(2012)財団法人いも類振興会編集、全国農村教育協会や「Handbook of potato production, inprovement, and postharvest management」(2006) GopalとPaul Khurana編集 p.77-108 Haworth Press Inc.を参考にすることができる。野生株を、変異を有する遺伝子を持つ導入元とする場合は、導入先の親を栽培種とし導入先の親との戻し交配を行うことで、栽培種の持つ食味や栽培上の優れた特性を維持したまま変異を有する遺伝子を導入することができる。また、当該遺伝子の変異した部位を塩基配列レベルで解析することにより、変異に関する遺伝子マーカーを取得することができる。さらに、昨年、報告されたジャガイモゲノムシークエンス(Nature. 2011;475:189-95)等のゲノム情報を参照することにより、当該遺伝子の近傍に位置する遺伝子マーカーを複数取得し、所望の変異部位のみが導入された後代の選抜を効率的に実施することもできる。当該遺伝子の近傍だけでなく、ゲノム全体をカバーする領域に詳細なマーカーを得ていれば、必要な部分(遺伝子領域)だけを導入元から導入先に入れることができる。この場合、マーカーが導入したい遺伝子(形質)と遺伝距離がある場合は、ある程度の確率でマーカーと形質の分離が起こる可能性があり、形質の検定が必須となる。しかし、本発明で見出した遺伝子変異は形質と一致しているため、形質の検定が必須ではなく、交配した種子は発芽しDNAが得られた時点で確実な検定が実施できる。これらのDNAマーカーによる検定技術については鵜飼 保雄「ゲノムレベルの遺伝解析―MAPとQTL」(2001)東京大学出版会等を参考にすれば実施できる。例えば、前記DNAマーカーはプライマー等のポリヌクレオチドを用いて存在を決定することができる。DNAマーカーによる遺伝的変異の検定とグリコアルカロイドの分析による形質の検定を併用することもできる。特に栽培品種を確定する段階においては、植物体の生育からジャガイモ塊茎の貯蔵の各段階において、グリコアルカロイドの蓄積が低減または消失していることを分析により確認することが望ましい。
ジャガイモの萌芽は極めて大量のグリコアルカロイドを蓄積することが知られている。グリコアルカロイドの生合成経路は不明な点が多いが、コレステロールを初発物質としていると考えられている。ジャガイモの萌芽は16位酸化酵素遺伝子を同定する遺伝子源として優れていると考えた。
上記遺伝子断片を使って、St16DOXについては、ナス科ゲノムネットワーク(http://solgenomics.net/index.pl)の配列データSGN-U268477を基に全長配列を取得するためのプライマーU997(caccATGGCGGAGCTTCTTTCAAAC(配列番号6): caccはベクターにクローニングするための付加配列)とU998(TTAAGCATCGATTTTGAAGGGC)(配列番号7)を合成した。実施例1の全RNAから全cDNAの合成をスーパースクリプト ファーストストランド システム(インビトロジェン社)を用いて行った。このcDNAを鋳型に用い、アニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 PrimeSTAR HS DNA Polymeraseを使用)によって遺伝子を増幅した。これをpENTR(商標)/D-TOPOエントリーベクター(インビトロジェン社)へクローニングした。得られた8個の独立クローンについてポリヌクレオチド配列を決定した。これにより得られた配列は、配列番号2であり、それから推定されるポリペプチド配列は配列番号1である。これらベクターをpTOPO-St16DOXとした。
ゲノムDNAをDNeasy(キアゲン社)で「サッシー」から抽出した。実施例1と同じプライマーU997(caccATGGCGGAGCTTCTTTCAAAC(配列番号6)と U998(TTAAGCATCGATTTTGAAGGGC)(配列番号7)を用いて、PCRを行い、全長ゲノムDNAの塩基配列を決定した。
遺伝子を形質転換によって抑制する方法としては、強力なプロモーターで駆動する構成を持つ逆方向の相補鎖遺伝子断片の発現(植物で一般的にRNAi法と呼ばれる)で行った[Chuangと Meyerowitz Proc Natl Acad Sci U S A., 97, 4985-90 (2000)、WesleyらPlant J., 27, 581-90 (2001)]。実施例1で取得した全長cDNAに対し、プライマー[U1003: GAGCTCTAGATTTGGGAAAAGCTAATGGT(配列番号8)、U1004: GGATCCATATGCACCAATAACCTCC(配列番号9)]を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 ExTaq DNA Polymeraseを使用)によって遺伝子を増幅した。これをpCR4-TOPOベクター(インビトロジェン社)へクローニングし、遺伝子断片を取得した。バイナリーベクターpKT11(特開2001-161373号公報)を基本として、カルフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、当該遺伝子断片を順方向、シロイヌナズナのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子(AT4g14210)の第3イントロン、当該遺伝子断片を逆方向、カルフラワーモザイクウイルスの35S RNAターミネーターの順に連結を行い、植物形質転換用ベクターpKT258を作成した(図2)。
実施例4で作製したベクターをエレクトロポレーション法(GelvinとSchilperoor編, Plant Molecular Biology Manual, C2, 1-32 (1994), Kluwer Academic Publishers)により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ−フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/lスクロ−ス、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5 mlを10,000rpm、3分間遠心して集菌後、カナマイシンを除くために1mlのLB培地で洗浄した。更に10,000rpm、3分間遠心して集菌後、1.5 mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
実施例5で得られた41個体のin vitro茎を継代後一ヶ月伸張させ、その部分2〜4本をまとめて約100mgにしアルカリ耐性の逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィーを用いた以下の方法(特開2011-27429号公報)によりグリコアルカロイド含量を測定した。サンプルに0.1%ギ酸 in 80%MeOH aq. 990μLおよび内部標準としてブラシノライド(ブラシノ社)10μg/10μLを添加し、ミキサーミルで破砕した(1/25 sec, 10 min, 4℃)。得られた破砕物を遠心分離(10,000 rpm, 5 min, 4℃)に供しアルコール沈殿を行った。上清25μLを分取し、0.1%ギ酸水で475μLを加え、マルチスクリーンソルビナート(ミリポア社)でフィルターろ過しLC-MS(島津製作社、LCMS-2010EV、またはウォーターズ社、Alliance e2795 Q-micro)を用い解析した。LCの条件はカラム(XBridge(商標) Shield RP18-5(φ2.1×150 mm, ウォーターズ社))で移動相(A:10 mM炭酸水素アンモニウム水(pH 10):B:アセトニトリル=40:60)アイソクラティック(カラムオーブン:40℃)で分離し解析した。標準品(チャコニン、ソラニン(いずれもシグマ・アルドリッチ社))を用いて定量した。
非形質転換体とともに、これら低グリコアルカロイド5系統のin vitro植物を増殖し、各3個体を市販されている野菜用の培養土に馴化しバイオハザード温室で定法に従い栽培し塊茎を収穫した。この5系統(#5, #16, #28, #39, #41)は、非形質転換体と同等の生育を示し、#28はやや総収穫量が劣っていたが、他は同等の塊茎を収穫することができた(表1)。
トマトの形質転換は[Sunら (2006) Plant Cell Physiol. 47:426-431.]に従い実施した。(実施例4)で作製したベクターpKT258を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を培養し感染用菌液とした。トマト(Solanum lycopersicum)系統「アリッサクレッグ」(NBRP (National BioResource Project)トマトプロジェクトより分譲)の無菌播種植物体の子葉を5mm以下の切片を、上記のアグロバクテリウム懸濁液に浸し、10分間感染した後、滅菌済みの濾紙上に葉を置いて過剰のアグロバクテリウムを除いた。シャーレ内の共存MS培地(ゼアチン1.5mg/l、アセトシリンゴン40μM及びゲルライト0.3%を含む)[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]上に葉を置き、シャーレを暗所で3日間25℃で培養した。切片は選択MS培地1(ゼアチン1.5mg/l、カナマイシン100mg/l、オーグメンチン375mg/l及びゲルライト0.3%を含む)で25℃、16時間照明(光量子束密度32μE/m2s)/8時間無照明の条件下で2週間ごとに継代した。この間に不定芽が形成し、シュートを生じた。さらにシュートを伸張させるため、選択MS培地2(ゼアチン1.0mg/l、カナマイシン100mg/l、オーグメンチン375mg/l及びゲルライト0.3%を含む)に移植し、伸張したシュートは選択1/2濃度MS培地(カナマイシン100mg/l、オーグメンチン375mg/l及びゲルライト0.3%を含む)で発根させた。シュートをカナマイシン耐性の生長した植物体の中から外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、上述のカナマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーによるPCRを行うことで検出し、該再分化植物体が形質転換植物体であることを確認した。ベクターpKT258が導入されたトマトの形質転換植物体21系統を取得した。得られた21系統in vitroの若い葉を各約100mg秤量し、ジャガイモと同様に実施例6の方法によりグリコアルカロイド含量(αトマチン量、標品のαトマチンはシグマ・アルドリッチ社)を測定した。ただし、分析条件は移動相A:移動相B=60:40の割合を用いた。21系統のうち9系統は対照の平均である新鮮重100mgあたり536μgの1/10以下(< 53μg)と顕著にトマチン含量が低かった(図6)。これらの系統の生育は正常であった。
ジャガイモ品種「ホッカイコガネ」の自殖種子に量子ビーム照射(NIRS-HIMAC照射装置(RADIATION RESEARCH 154, 485-496 (2000))、ネオンイオンビーム30 kev/μmを90〜470 Gy、鉄イオンビーム185 kev/μmを20〜80 Gy)で変異処理を行った。その種子をジベレリン(協和発酵キリン社)2,000ppmの溶液中で2日間浸漬し、市販の培養土に播種した。日長14時間、温度23℃で栽培し、およそ20日目に長さ約3cm、本葉が4枚以上展開した段階で、茎頂を最下段の本葉の上まで切り戻した。およそ2週間後、切り戻した節から脇芽が伸張し、そこから展開した葉のDNAを抽出した。4個体の葉を合わせて1サンプルとし、450μLの抽出液(0.1M Tris-HCl, pH 8.5、40 mM EDTA、0.6 M NaCl)を添加し、ジルコニアビーズとミキサーミル(レッチェ社)で破砕した(振幅1/25 秒、 5分間)。プロテアーゼK(10mg/ml)を10μl加え55℃で20分間処理を行った。その後、5M酢酸カリウム160μlを加え15000 rpm 5分間遠心した。上清100μlを等量イソプロパノール沈殿して、100μlのTE液(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)で溶解しDNAプールサンプルとした。変異の検出はTilling法(Nature Protocol 1, 2465-2477)を用いて行った。
Claims (9)
- ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化する酵素の活性を抑制する工程、もしくは該酵素をコードする遺伝子の発現を抑制する工程、およびグリコアルカロイド含有量を測定しグリコアルカロイド含量が低減された植物体を選抜する工程を含むことを特徴とする、グリコアルカロイドの蓄積リスクの低減した植物体を作出する方法であって、該酵素が以下の(a)〜(c)のいずれかのDNAからなる遺伝子にコードされるものである、方法:
(a) 配列番号2または配列番号4に示す塩基配列からなるDNA;
(b) 配列番号2または配列番号4に示す塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化するタンパク質をコードするDNA;および
(c) 配列番号2または配列番号4に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。 - 植物体が栽培品種である請求項1記載の方法。
- ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化する酵素の活性の抑制、または該酵素をコードする遺伝子の発現の抑制が、遺伝子の組換えによりもたらされるものである請求項1又は2に記載の方法。
- ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化する酵素の活性の抑制、または該酵素をコードする遺伝子の発現の抑制が、前記酵素をコードする遺伝子の欠失によりもたらされるものである請求項1又は2に記載の方法。
- ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化する酵素の活性が抑制されているか、該酵素をコードする遺伝子の発現が抑制されている植物体を母本として、交配により得られた後代を選抜することを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 母本が、変異処理によるナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化する酵素をコードする遺伝子の人為的改変により得られたものである、請求項5に記載の方法。
- 母本が、野生株のスクリーニングにより得られたものである、請求項5に記載の方法。
- 母本の取得と後代の選抜において、ナス科植物のステロイド骨格の16位を酸化する酵素をコードする遺伝子の突然変異または多型の存在を検出するものである、請求項5に記載の方法。
- 前記突然変異または多型の存在の検出が、
(i) ゲノムDNAまたはRNAである核酸を植物から単離する工程、
(ii) (i)の核酸がRNAである場合に逆転写しcDNAを合成する工程、
(iii) (i)または(ii)の工程で得られたDNAから配列番号2、配列番号4または配列番号5に示す塩基配列の少なくとも一部を含有する遺伝子断片を増幅する工程、ならびに
(iv) DNA中に突然変異または多型の存在を決定する工程、
を含むものである、請求項8に記載の方法。
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