CN102533888A

CN102533888A - 连续化酶法生产l-叔亮氨酸

Info

Publication number: CN102533888A
Application number: CN2010106221828A
Authority: CN
Inventors: 罗积杏; 壮晓健; 沈文和; 车大庆
Original assignee: Zhejiang Jiuzhou Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Ruibo Hangzhou Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date: 2010-12-29
Filing date: 2010-12-29
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-12-29
Also published as: CN102533888B

Abstract

本发明涉及一种使用酶连续拆分含氮有机化合物外消旋体制备旋光异构体的方法，特别是涉及一种使用氨基酰化酶拆分制备L-叔亮氨酸的方法，具体为连续化酶法生产L-叔亮氨酸。本发明以N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸和无机碱为原料，纯水为反应介质，配制成一定浓度的底物溶液，以一定流量通过氨基酰化酶反应柱，在酶催化作用下选择性水解N-苯乙酰-L-叔亮氨酸，生成L-叔亮氨酸和苯乙酸，反应结束后，反应液调酸酸化后抽滤，分离出未反应的N-苯乙酰-D-叔亮氨酸，滤液用有机溶剂萃取分离出苯乙酸，L-叔亮氨酸位于水相中，无效体N-苯乙酰-D-叔亮氨酸经高温回流消旋后再投入拆分反应。

Description

连续化酶法生产L-叔亮氨酸

技术领域

本发明涉及一种使用酶拆分含氮有机化合物外消旋体制备旋光异构体的方法，特别是涉及一种使用氨基酰化酶拆分制备L-叔亮氨酸的方法。

背景技术

L-叔亮氨酸，英文名称L-tert-Leucine，化学名为L-2-氨基-3，3-二甲基丁酸，是一种具有以下结构的化合物，

L-叔亮氨酸

L-叔亮氨酸是一种非蛋白原的手性氨基酸，是一种重要的医药中间体，主要用于制备抗癌、抗艾滋病(HIV)药物，目前已有施贵宝、辉瑞、雅培等制药公司上市的蛋白酶抑制剂类抗HIV新药都用本产品作为中间体，如抗HIV药物阿扎那韦(Atazanavir)，其2006年全球销售额达到32.26亿美元，另外有六种正在临床试验的抗HIV抗肿瘤新药也用L-叔亮氨酸作为中间体。

已报道的L-叔亮氨酸的合成方法非常多，包括物理法，化学合成或拆分法，以及生物酶合成或拆分法。

物理法是采用模拟移动床色谱分离技术分离N-酰化-DL-叔亮氨酸消旋体(Chirality，2002，14(4)：313-317)，其缺点是需要专业设备投资大，固定相昂贵，流动相消耗大，分离条件需要优化确定。

化学合成主要有以手性原料如(R)-叔丁基甘氨醇和(R)-4-苯基-2-唑烷酮等经过多步合成得到L-叔亮氨酸(氨基酸和生物资源，2003，25(4)：14-19；Eur.J.Org.Chem.1999，10：2583-2591；Tetrahedron.Lett.，1998，39：2111-2114)，该合成方法手性起始原料昂贵，污染物排放多，产品收率不高。

另一种化学合成方法是不对称合成，采用手性诱导试剂如(R)-苯基甘氨酸酰胺或手性a-苯乙胺分别与特戊醛或叔丁基酮酸反应合成L-叔亮氨酸(Organic Letters，2001，3(8)：1121-1124；氨基酸和生物资源，2005，27(2)：42-44)。如叔丁基酮酸与(S)-α-苯乙胺反应，然后经过Pd/C催化氢化和NaBH4还原，生成光学活性的L-叔亮氨酸，产品e.e.值可以达80％以上。但不对称合成需要用到的催化剂价格昂贵，污染严重且不适合大规模生产。

也可以通过化学拆分的方法合成L-叔亮氨酸，报道的手性拆分剂有10-樟脑磺酸，光学纯酒石酸，光学纯扁桃酸等(DK200400936A，ZL200710044378.1)。存在的缺点是手性拆分剂昂贵，无效对映体需分离及消旋，收率不高，有机溶剂用量大。

由于生物酶催化的高度选择性及温和的反应条件成为合成光学纯叔亮氨酸的重要方法，已经有不少文献报道。如以氰基水解酶选择性水解D，L-叔亮氨基腈(Engineering In LifeSciences，2004，4(6)：547-556)；蛋白酶选择性水解N-乙酰叔亮氨酸酯(Biosci.Biotechno/.Biochem.，2001，6S (9)：1977-1980，)；海因酶和L-氨甲酰水解酶水解叔丁基乙内酰脲(US5707837，1998)；利用D-叔亮氨酸脱氢酶催化DL-叔亮氨酸选择性氧化脱氨得到酮酸和L-叔亮氨酸，辅酶再生利用NADH-氧化酶(Org.Lett.2003，5：3649-3650)；以及用脂肪酶和碱性蛋白酶水解4-叔丁基-2-苯基-吖内酯合成L-叔亮氨酸，这些方法由于制造成本太高均没有实现工业化生产。

工业化酶法生产L-叔亮氨酸的方法主要有如下几种(Chemical & Engineering News，2001，79(21)：37-43)：(1)Great Lakes Fine Chemicals公司利用产转氨酶微生物全细胞催化叔丁基酮酸与氨基供体化合物转氨反应合成L-叔亮氨酸；(2)DSM开发了化学-酶催化方法合成L-叔亮氨酸，Strecker反应合成消旋D，L-叔亮酰胺，然后L-酰胺酶水解拆分得到L-氨基酸；(3)Degussa利用叔亮氨酸脱氢酶催化相应的酮酸与氨水氨化反应合成L-叔亮氨酸，辅酶再生利用甲酸脱氢酶；上述方法生产的产品光学纯度高，但可供商业酶源有限，有的需要辅酶再生，酶成本高，开发周期长。

氨基酰化酶特别是青霉素酰化酶应用于手性氨基酸如L-丙氨酸的合成在1960年代就实现工业化，而且这些酶能够以合理价格大量供应，因此利用它们来合成L-叔亮氨酸是个很好的选择。

利用氨基酰化酶催化N-乙酰-D，L-叔亮氨酸选择性水解活性并不高(J.Am.Chem.Soc.，1989，111(16)：6354-6364)。

利用氨基酰化酶或青霉素酰化酶水解催化N-苯乙酰-D，L-叔亮氨酸选择性水解结果好得多，甚至达到工业化水平。如利用固定化青霉素G酰胺酶水解100g底物N-苯乙酰化-D，L-叔亮氨酸可制备得到23g产物L-叔亮氨酸，光学纯度

(C＝1，水)(EP0141223A1，1984)；

用固定化米曲霉氨基酰化酶选择性水解(R，S)-苯乙酰基叔亮氨酸合成L-叔亮氨酸，收率按L-原料计可达90％以上，产品光学纯度大于99％(CN 101074446A，2006)；采用Kluyveracitrophila青霉素酰化酶在双水相体系中水解N-苯乙酰-D，L-叔亮氨酸，产物L-叔亮氨酸收率按L-原料计为83.1％，ee％值99％(Preparative Biochemistry & Biotechnology，2006，36(3)：235-41)。但前述方法均采用批式反应，生产效率低；反应过程需要不断调节pH，过程繁琐；反应结束后直接酸化萃取无效体N-苯乙酰-D-叔亮氨酸和苯乙酸，溶剂消耗量大，且两种物质不好分离利用；无效体没有加以利用或虽有消旋处理但条件复杂。

发明内容

本发明的目的是克服前述方法的不足，开发一种以氨基酰化酶作为催化剂，温和高效、环境友好、成本低、可连续化的循环拆分N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸，制备L-叔亮氨酸的方法，生产过程流程图见附图。

本发明采用如下技术方案合成L-叔亮氨酸：

本发明以进行概括：N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸和无机碱的水溶液，在氨基酰化酶催化下水解，酸化抽滤，所得固体高温回流消旋再投入反应，滤液提纯得L-叔亮氨酸。

所述反应中，所述无机碱优选为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、氨水或碳酸钠，更优选为氢氧化钠。

所述反应中，所述底物溶液pH为5.0-9.0，优选控制pH为7.0-8.0，配制的底物溶液的浓度优选为1-50％，更优选为5-20％。

所述反应过程具体为：

所述反应中，所述氨基酰化酶优选为Amano氨基酰化酶(Acylase from Aspergillusgenus)，BioChemika氨基酰化酶(Acylase from Aspergillus melleus)，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)青霉素酰化酶，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)青霉素酰化酶，更优选为巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶。所述底物溶液通过所述酶反应柱的流量优选为酶柱体积的0.01-50倍体积/小时，更优选采用的流量为酶柱体积的0.2-5倍体积/小时。根据过柱流出反应液的底物转化率情况，决定是否继续循环通过酶柱反应还是后继处理。采用固定化酶酶反应柱能够长时间运行，而不明显降低酶活力，在连续运行一个月后，测定酶活力损失小于10％。

反应过程以高效液相色谱检测底物浓度及转化率，手性高效液相色谱分析产物的光学纯度。

从酶反应柱流出的反应溶液底物转化率达到40-50％时，收集反应液，反应液直接加酸酸化至pH1.0-5.0，最佳调节为pH至2.5-3.0，酸化可采用的酸优选为盐酸、硫酸或磷酸等，更优选为盐酸，酸化后有大量固体析出，直接过滤或抽滤分离出析出的固体即为N-苯乙酰-D-叔亮氨酸。

滤液加入一倍体积的有机溶剂分两次萃取，分离出苯乙酸，萃取溶剂优选可以是乙酸乙酯、乙酸丁酯、***、异丙醚或二氯甲烷等，更优选采用乙酸乙酯。减压蒸馏溶剂即得到苯乙酸。

分离得到的苯乙酸可以重新用于底物N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸的合成，分离得到的N-苯乙酰-D-叔亮氨酸经过高温回流消旋后得到N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸，重新用于酶催化拆分反应，消旋温度为100-250℃，优选为165-185℃，消旋时间为5-60分钟，优选为15分钟，消旋过程中用旋光仪测定消旋的效果。

本发明提供的方法所使用的酶可不经分离，直接循环使用；分离得到的苯乙酸可以重新用于底物N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸的合成，经济环保，且过程简单；同时本发明大大降低溶剂的使用量，酶利用率高，生产成本低，可连续化生产；分离得到的N-苯乙酰-D-叔亮氨酸经过高温回流消旋后得到N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸，原料利用率高，具有理论上可100％转化为产物的优点。

附图说明

附图是连续化酶法生产L-叔亮氨酸工艺流程，其中DL-PLeu为N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸，D-PLeu为N-苯乙酰-D-叔亮氨酸，L-Leu为L-叔亮氨酸。

具体实施方式：

以下以具体实例来说明本发明的技术方案，但保护的范围并不仅限于此。实施例中采用N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸和氢氧化钠为原料，纯水为反应介质，所使用的生物酶为通过载体共价键合固定化的氨基酰化酶，具体可以为：Amano氨基酰化酶(Acylase from Aspergillusgenus)，BioChemika氨基酰化酶(Acylase from Aspergillus melleus)，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)青霉素酰化酶，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)青霉素酰化酶，载体直径100-300μm，均＞400目筛孔。酶柱为带转换接头的中压玻璃柱，包括玻璃柱、顶部紧固件、下部紧固件，筛网目数：500目，最大柱压：0.15×10⁶帕斯卡(1.5倍标准大气压)，柱内径3.5cm，柱高100cm，柱体积960mL，装酶量800mL。输料泵为双通道恒流泵，输出流量：2×(10-14500)mL/h，输出压力：≥3kg/cm²(3倍标准大气压)，输出通道：双通道。

实施例1

将N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸200g加入到纯水2000mL中，5M氢氧化钠165mL充分溶解，配制成底物浓度9.24％，pH7.0的底物溶液，用恒流泵将底物溶液以1000mL/h流量通过巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶反应柱，室温约25℃下进行反应，反应1h取样测定转化率16.4％，反应6h分析转化率49.7％。收集反应液，并用200mL纯水置换柱中残留的反应液，最终得到含L-叔亮氨酸反应液2200mL，滴加5M盐酸166mL，减压抽滤得到白色析出固体，烘箱60℃烘干，称重为103.2g，未反应底物含量91.3％，为N-苯乙酰-D-叔亮氨酸，取固体1g甲醇10mL溶解，测旋光为(+)1.140，滤液加入1000mL乙酸乙酯分两等份萃取两次，合并有机相，加无水硫酸钠少许脱水，减压蒸干得到固体51.7g，苯乙酸含量92.7％其余为未反应底物，水相直接蒸馏干得到白色固体为L-叔亮氨酸和氯化钠，手性色谱分析产物ee值100％。前述未反应底物固体100g加入到一个500mL的圆底两颈反应瓶，接上回流管，置于油浴中消旋反应，温度设定为170℃，反应5分钟时取样1g甲醇10mL溶解，测旋光为(+)0.216，反应15分钟取样1g甲醇10mL溶解，测旋光为0，消旋完全。

实施例2

将N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸400g加入到纯水2000mL中，5M氢氧化钠331mL充分溶解，配制成底物浓度17.16％，pH7.0的底物溶液，用恒流泵将底物溶液以500mL/h流量通过固定化Amano氨基酰化酶反应柱，室温约25℃下进行反应，反应2h取样测定转化率12.7％，反应12h分析转化率48.3％。收集反应液，并用200mL纯水置换柱中残留的反应液，最终得到含L-叔亮氨酸反应液2350mL，滴加5M盐酸333mL，减压抽滤得析出固体，烘箱60℃烘干，称重为210.8g，为未反应底物含量89.7％，主要为N-苯乙酰-D-叔亮氨酸其余为苯乙酸，取固体1g甲醇10mL溶解，测旋光为(+)1.117，滤液加入1000mL乙酸乙酯分两等份萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠脱水，减压蒸干得到固体101.5g，苯乙酸含量87.3％其余为未反应底物，水相直接蒸馏干得到L-叔亮氨酸和氯化钠，手性色谱分析产物ee值100％。前述未反应底物210g固体加入到一个500mL的圆底两颈反应瓶，接上回流管，置于油浴中温度170℃消旋反应15分钟取样测旋光为0，消旋完全。

实施例3

将例1和例2消旋得到的底物300g(N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸含量90.2％，其余为苯乙酸)加入到纯水2000mL中，5M氢氧化钠275mL充分溶解，配制成底物浓度11.89％，pH7.0的底物溶液，用恒流泵将底物溶液以1000mL/h流量通过粪产碱杆菌青霉素酰化酶反应柱，室温约25℃下进行反应，反应3h取样测定转化率28.3％，反应7h分析转化率48.3％。收集反应液，并用200mL纯水置换柱中残留的反应液，最终得到含L-叔亮氨酸反应液2300mL，滴加5M盐酸279mL，减压抽滤得到白色析出固体，烘箱60℃烘干，称重为154.7g，为未反应底物含量85.7％，主要为N-苯乙酰-D-叔亮氨酸其余为苯乙酸，取样1g甲醇溶解测旋光为(+)1.011，滤液加入1000mL乙酸乙酯分两等份萃取两次，合并有机相，加无水硫酸钠少许脱水，减压蒸干得到固体86.2g，苯乙酸含量92.4％其余为未反应底物，水相直接蒸馏干得到白色固体为L-叔亮氨酸和氯化钠，手性色谱分析产物ee值100％。前述未反应固体150g加入到一个500mL的圆底两颈反应瓶，接上回流管，置于油浴中温度170℃消旋反应15分钟取样测旋光为0，消旋完全。

实施例4

将N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸20kg加入到纯水200L中，5M氢氧化钠16.8L充分溶解，配制成底物浓度9.22％，pH7.0的底物溶液，用恒流泵将底物溶液以300mL/h流量通过BioChemika氨基酰化酶反应柱，室温约25℃下进行反应，定时取流出反应液分析，反应1h转化率45.7％，反应36h转化率46.3％，反应240h转化率44.9％，反应480h转化率43.1％，反应720h转化率41.8％，最终运行30天3小时，最后用200mL纯水置换柱中残留的反应液，收集反应液216.8L，滴加5M盐酸16.9L，抽滤得白色析出固体，烘箱60℃烘干，称重为11.3Kg，未反应底物含量90.5％，其余为苯乙酸，取样测旋光为(+)1.129，滤液加入200L乙酸乙酯分两等份萃取两次，合并有机相，加无水硫酸钠少许脱水，减压蒸干得到固体4.1Kg，苯乙酸含量88.7％其余为未反应底物，水相直接蒸馏干得到白色固体为L-叔亮氨酸和氯化钠，手性色谱分析产物ee值100％。前述未反应底物固体11Kg加入到一个50L带加热夹套反应釜，温度170℃消旋反应15分钟取样测旋光为0，消旋完全。

综上所述，本发明涉及连续化酶法生产L-叔亮氨酸，上述制备方法是以N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸和无机碱为原料，纯水为反应介质，配制成一定浓度的底物溶液，以一定流量通过氨基酰化酶反应柱，在酶催化作用下选择性水解N-苯乙酰-L-叔亮氨酸，生成L-叔亮氨酸和苯乙酸，反应液酸化抽滤，分离出未反应的N-苯乙酰-D-叔亮氨酸，滤液用有机溶剂萃取分离出苯乙酸，水相即为L-叔亮氨酸，无效体N-苯乙酰-D-叔亮氨酸经高温回流消旋后再投入拆分反应。

需要说明的是在本发明中提及的所有文献在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。

Claims

1.一种连续化酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于：N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸和无机碱的水溶液，在氨基酰化酶催化下水解，酸化抽滤，所得固体高温回流消旋再投入反应，滤液提纯得L-叔亮氨酸。

2.根据权利要求1所述的连续化酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述反应中的底物溶液pH为5.0-9.0，底物浓度为1-50％。

3.根据权利要求1所述的连续化酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述反应中底物溶液通过酶柱的流量为酶柱体积的0.01-50倍体积/小时。

4.根据权利要求1所述的连续化酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，抽滤所得固体高温回流消旋，温度为100-250℃。

5.根据权利要求4所述的连续化酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述温度为165-185℃。

6.根据权利要求1所述的连续化酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、氨水或碳酸钠。

7.根据权利要求1所述的连续化酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述氨基酰化酶为Amano氨基酰化酶，BioChemika氨基酰化酶，巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶或粪产碱杆菌青霉素酰化酶。

8.根据权利要求1所述的连续化酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，从酶反应柱流出的反应溶液底物转化率40-50％时，收集反应液。