CN102978248A - 一种调节酶反应体系pH的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药和生物化工领域，具体涉及一种调节酶反应体系pH的方法，它提供一种调节利用酶反应体系，特别是葡萄糖脱氢酶提供辅酶循环的酶反应体系的pH的方法，解决了传统酶法辅酶套用工艺中补碱方式不适当的问题；它提高了酶催化效率，在某些反应中缩短了反应时间；减少了强碱引起的副反应，在某些反应中提高了产物的光学纯度。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药和生物化工领域，具体涉及一种调节酶反应体系pH的方法。
背景技术
在利用氧化还原酶生产手性醇、手性氨及其它需要氢供体的酶法工艺中，为了避免添加昂贵的化学计量的辅酶，通常利用葡萄糖脱氢酶进行原位辅酶循环。葡萄糖脱氢酶还原体系效率高，但是氧化葡萄糖产生的与产物等当量的葡萄糖酸会引起反应体系pH的变化。为了维持反应体系pH的稳定，避免酶因此失活，需要添加碱来中和产生的葡萄糖酸。另外，在利用水解酶进行手性拆分反应时，酯或酰胺水解产生的有机酸也需要添加碱来中和产生的有机酸以维持体系pH的稳定和酶的活力。目前此类工艺存在着补碱方法不适当的问题。专利号为CN200780036841.6、CN200880104011.7、CN200980141486.8等利用葡萄糖脱氢酶提供原位辅酶循环的反应中，需要加入4-8 N NaOH进行pH调节。使用NaOH进行调节，在生产中容易导致pH失控，以及副反应，包括酶的失活，并非最合理的方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。
本发明旨在解决现有技术问题的至少之一。本发明一方面提供一种调节酶反应体系pH的方法，采用采用氧化还原酶生产手性醇、手性氨及氢供体时利用弱碱调节pH值。
根据本发明的具体示例，本发明进一步利用葡萄糖脱氢酶进行原位辅酶循环反应时利用弱碱调节pH值。
根据本发明的实施例，上述弱碱包括NaHCO3、Na2CO3的至少一种。
根据本发明的具体示例，本发明进一步在使用酮还原酶还原生产手性醇、手性氨的反应中，利用葡萄糖脱氢酶和葡萄糖原位提供辅酶循环，同时利用弱碱调节pH值。
根据本发明的具体示例，本发明进一步包括如下步骤：
A、将底物和葡萄糖加入反应溶剂，充分搅拌混合；
B、加入NADP+或NAD+粗粉、工程酮还原酶及葡萄糖脱氢酶，维持恒温反应；
C、采用饱和碳酸钠溶液滴定反应体系pH使之保持6-8之间；
根据本发明的具体示例，上述NADP+或NAD+粗粉、工程酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的用量比例为0.1:1:1。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了利用水解酶进行手性拆分反应时利用弱碱调节pH值。
根据本发明的实施例，上述弱碱包括NaHCO3、Na2CO3的至少一种。
根据本发明的具体示例，本发明进一步在利用水解酶拆分酯或酰胺水解反应时，滴加弱碱维持反应体系pH值。
根据本发明的具体示例，本发明进一步包括如下步骤：
A、在反应体系中，加入底物，和水解酶，恒温搅拌；
B、用饱和碳酸氢钠溶液和饱和碳酸钠溶液滴定反应体系pH使之保持在6-8之间；
C、待pH不再变化或检测底物消耗完毕结束反应。
本发明提供一种调节利用酶反应体系，特别是葡萄糖脱氢酶提供辅酶循环的酶反应体系的pH的方法。现有技术是利用强碱NaOH调节pH值，而本发明是利用弱碱NaHCO3或Na2CO3调节pH值。利用弱碱可以提高酶催化效率，在某些反应中缩短反应时间；减少强碱引起的副反应，在某些反应中可以提高产物的光学纯度。
反应结束后分别检测产品(R)-3-羟基戊二酸单乙酯的光学纯度，其中以饱和碳酸钠溶液滴定的反应产物光学纯度>99%，以2 M NaOH溶液滴定的反应产物光学纯度为97%。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例一
向带有支管的50 mL三口瓶中添加1000 mg 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和1500 mg葡萄糖，再向反应瓶中加入8.5 mL pH为6.5，0.1 M PBS缓冲液。反应体系置于35℃，600 rpm磁力搅拌水浴锅中搅拌。待温度稳定后，向反应瓶中加入50 mg工程酮还原酶，50 mg葡萄糖脱氢酶和5 mg NADP+粗粉，开始计时反应。反应温度保持在30℃。分别用2 M NaOH溶液和饱和碳酸钠溶液滴定反应体系pH使之保持在7.0。反应中取样观测进程，以饱和碳酸钠溶液滴定的反应于16 h结束，以2 M NaOH溶液滴定的反应于24 h结束。
实施例二
1000 ml三口烧瓶中，加入pH为7.0，0.1 M PBS缓冲液，100 g底物，10 g脂肪酶，维持温度为0℃，机械搅拌100 rpm开始反应。分别用2 M NaOH溶液和饱和碳酸钠溶液滴定反应体系pH使之保持在7.0。反应结束后分别检测产品(R)-3-羟基戊二酸单乙酯的光学纯度，其中以饱和碳酸钠溶液滴定的反应产物光学纯度>99%，以2 M NaOH溶液滴定的反应产物光学纯度为97%。
以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例索描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，已达到相同技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种调节酶反应体系pH的方法，其特征在于，采用氧化还原酶生产手性醇、手性氨时利用弱碱调节pH值。
2.如权利要求1所述的调节酶反应体系pH的方法，其特征在于，利用葡萄糖脱氢酶进行原位辅酶循环反应时利用弱碱调节pH值。
3.如权利要求2所述的调节酶反应体系pH的方法，其特征在于，弱碱包括NaHCO3、Na2CO3的至少一种。
4.如权利要求3所述的调节酶反应体系pH的方法，其特征在于，在使用酮还原酶还原生产手性醇、手性氨的反应中，利用葡萄糖脱氢酶和葡萄糖原位提供辅酶循环，同时利用弱碱调节pH值。
5.如权利4所述的调节酶反应体系pH的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、将底物和葡萄糖加入反应溶剂，充分搅拌混合；
B、加入NADP+或NAD+粗粉、工程酮还原酶及葡萄糖脱氢酶，维持恒温反应；
C、采用饱和碳酸钠溶液滴定反应体系pH使之保持在6-8之间。
6.如权利 1所述的调节酶反应体系pH的方法，其特征在于，利用水解酶进行手性拆分反应时利用弱碱调节pH值。
7.如权利 6所述的调节酶反应体系pH的方法，其特征在于，弱碱包括NaHCO3、Na2CO3的至少一种。
8.如权利 6所述的调节酶反应体系pH的方法，其特征在于，在利用水解酶拆分酯或酰胺水解反应时，滴加弱碱维持反应体系pH值。
9.如权利 8所述的调节酶反应体系pH的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、在反应体系中，加入底物，和水解酶，恒温搅拌；
B、用饱和碳酸氢钠溶液和饱和碳酸钠溶液滴定反应体系pH使之保持在6-8之间；
C、待pH不再变化或检测底物消耗完毕结束反应。
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- 2012-12-03 CN CN2012105082121A patent/CN102978248A/zh active Pending
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