CN102532326B - 一种肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle5变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域,具体涉及一种肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体及其应用,该方法由CD13的配体肽段、连接肽、人纤溶酶原Kringle 5构建而成的人纤溶酶原Kringle 5变体蛋白质,该变体蛋白质在单独使用及与化疗药物联合使用时,都能够产生良好的抗肿瘤治疗效果。本发明还提供了一种在毕赤酵母中生产该变体蛋白的方法。
Description
一、技术领域:
本发明属生物技术领域,具体涉及一种肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体及其应用。
二、背景技术:
抗血管生成疗法作为一种新兴的抗肿瘤生物治疗方法,已经显示出了良好的抗肿瘤前景(Cao Y等,2004,Semin Cancer Biol 14:139-145)。人纤溶酶原Kringle 5(HumanPlasminogen Kringle 5,hPK5)是人纤溶酶原的第5个Kringle结构域片段(Cao Y等,2002,Curr Med Chem Anticancer Agents 2:667-681),hPK5是目前发现的抑制内皮细胞活性最强的纤溶酶原片段,具有许多优点(Yang X等,2010,J Cell Mol Med 14:2519-2530):(1)具有强的生物活性,其抑制内皮细胞增殖的半数有效剂量(ED50)为50nmol/L,是血管抑素的1/3;(2)高度的细胞特异性,选择地作用于增生血管内皮细胞,而对静止的内皮细胞和其它细胞无毒性或毒性很低;(3)氨基酸片段短、分子量小,易于表达、分离和纯化;(4)副作用小,不会引起炎症反应;(5)性质比较稳定,适合于长时间缓慢释放。目前对hPK5的应用主要集中在眼球视网膜血管疾病的治疗上,而在抑制肿瘤局部血管生成中的应用尚处于基础阶段,hPK5自身优点决定了它在***疾病中有潜在的临床价值和广阔的应用前景。
但是随着深入研究,尤其是近年来的临床试验结果显示,抗血管生成治疗中存在着一些问题:如在临床试验中,其临床疗效并不如人们预期的理想,在安全剂量用药时,抑瘤效果有限;人均几十毫克以上的蛋白用量,为生产、质量控制和生产成本都带来了巨大的挑战;而且如此大剂量的药物剂量也增加了产生副作用的可能性。因此,积极寻找安全有效的抗血管生成因子,提高其对肿瘤的靶向性,以降低用药剂量、增强抗肿瘤治疗效果,成为这一新型肿瘤生物疗法的新的研究重点。
hPK5是人纤溶酶原的第5个Kringle结构域,人纤溶酶原是人凝血***中的重要组成分子,因此,如何在肿瘤治疗时,避免hPK5对其它组织的毒副作用,如何降低其使用剂量,这是hPK5在潜在的临床应用中面临的难题。
三、发明内容:
本发明的目的就是针对抗血管生成疗法中存在的问题和不足,寻找有效的抗血管生成蛋白, 提高其肿瘤靶向性,开发一种具有良好的治疗效果,且有效用药剂量较低,易于生产的新型抗肿瘤药物。
新生血管内皮细胞的分子组成与正常血管不同,一些血管生长因子受体和细胞基质金属蛋白酶等只能在肿瘤新生血管内皮细胞上表达,而很少在正常静止状态下的血管内皮细胞上表达。CNGRC基序是利用噬菌体展示技术筛选到的可以特异结合氨基酞酶N(Aminopeptidase N,APN)/CD13蛋白的配体,而APN/CD13只表达在肿瘤新生血管内皮细胞上,处于静止状态的正常血管内皮细胞很少表达(Pasqualini R等,2000,Cancer Res60:722-7);更重要的是,近年来发现氨基酞酶N/CD13分子是肿瘤干细胞的分子标志物,与肿瘤的转移和预后相关联(Haraguchi N,Ishii H,Mimori K等,J Clin Invest.2010,120:3326-3339;Fontijn D,Duyndam MC,van Berkel MP等,Br J Cancer.2006,94:1627-1636;Fujii H,Nakajima M,Saiki I等,Clin Exp Metastasis.1995,13:337-344)。
为达到实现肿瘤坏死因子相关凋亡配体肿瘤组织靶向输送,提高其抗肿瘤疗效、降低其毒副作用的目的,本发明提供了一种肿瘤靶向性的hPK5变体蛋白,其特征是通过在hPK5蛋白的N端增加含NGR序列的新生血管靶向性肽和连接肽序列进行修饰,增强hPK5蛋白的肿瘤靶向性。
本发明是通过以下技术方案来实现的:一种具有肿瘤组织靶向性的hPK5变体,是具有序列表中序列1氨基酸残基序列的蛋白质,它是通过基因工程方法构建由CD13的配体、连接肽、hPK5的NGR-hPK5变体蛋白质,即利用常规基因工程方法通过人工合成或者克隆构建hPK5变体的编码基因、重组表达和分离纯化。所述CD13的配体是一种含有NGR序列的多肽,优选为一种带有环状结构的、含有NGR序列的多肽,例如短肽CNGRC。在NGR序列和hPK5之间必须有连接肽序列。
上述NGR-hPK5变体蛋白质在CD13的配体和hPK5之间添加了一段具有柔性结构的、不含支链氨基酸的短肽,其中,短肽为3-10个氨基酸残基,主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等不含支链的氨基酸组成。
进一步地,本发明提供了一种表达纯化hPK5变体蛋白的方法,其特征是通过毕赤酵母表达***,获得分泌型表达的高活性NGR-hPK5蛋白。
进一步地,本发明提供了一种hPK5变体蛋白的应用,其特征是能够在LLC和Colo205实体瘤模型中,显著抑制肿瘤的生长,提高了hPK5的肿瘤靶向性和抗肿瘤治疗效果。
进一步地,本发明提供了一种增强传统肿瘤化疗效果的治疗策略,其特征是通过将 NGR-hPK5与化疗、放疗等物理化学治疗方法联合治疗,显著提高了肿瘤对治疗的敏感性。
同时,本发明公开NGR-hPK5变体的cDNA,它可以通过hPK5变体的dDNA增加编码的CD13配体和连接肽的DNA序列制备。上述组成的NGR-hPK5变体的cDNA可用于基因治疗。
本发明的NGR-hPK5变体可以通过采用聚乙二醇、脂肪酸化、重组加上抗体Fc片段或白蛋白等方法修饰,从而延长NGR-hPK5变体的半衰期,达到更好的药代动力学效果。
与现有的抗肿瘤治疗药物或抗肿瘤治疗策略相比,本发明的创新和特殊之处在于:
(1)发明了一种新的肿瘤靶向性的血管生成抑制剂蛋白NGR-hPK5,该蛋白药物结合了hPK5良好的抗血管生成作用和NGR肽肿瘤新生血管靶向能力,在LLC和Colo205实体肿瘤模型中发挥了更为显著的抗肿瘤治疗效果,1.25mg/kg体重/天连续给药5天,抑瘤率已经超过55%,抗肿瘤活性明显高于以往所报道的其它抗血管生成蛋白。
(2)连接肽的优化和设计大大提高了NGR-hPK5的抗肿瘤效果。在本发明中,我们通过将分子设计与实验探索相结合,发现NGR-hPK5变体分子必须要有连接肽,其长度为3-10氨基酸残基。而这一点在以往的研究中是被忽略的,例如,同样为抗血管生成抑制剂,NGR-Endostatin(Yokoyama Y等,2005,Cancer 104:321-331)在线性NGR序列和Endostatin之间没有添加任何连接肽;而NGR-Tumstatin(Meng J等,2006,J Biochem.140:299-304)设计中则将环状CNGRC序列加在Tumstatin蛋白的C端。在肿瘤动物模型上,上述两种变体蛋白的效果分别为:在小鼠乳腺癌LM3肿瘤模型中,NGR-Endostatin用药剂量为20mg/kg体重/天,连续给药12天时,即治疗药物总剂量为240mg/kg时,在第12天,NGR-Endostatin将抑瘤率从Endostatin抑瘤率的50%提高到61%,抑瘤率提高11%。在小鼠S180肿瘤模型中,Tumstatin-NGR的用药剂量为10mg/kg体重/天,连续给药12天,即治疗药物总剂量为120mg/kg时,在第12天,Tumstatin-NGR抑瘤率从Tumstatin抑瘤率的27%提高到37.8%,抑瘤率提高10.8%。而同为血管生成抑制剂,本发明的NGR-hPK5由于增加了连接肽,在小鼠Lewis肺癌肿瘤模型中,当NGR-hPK用药剂量均为1.25mg/kg体重/天,连续给药5天,即治疗药物总剂量为6.25mg/kg时,在第12天,NGR-hPK5的抑瘤率从为hPK5抑瘤率的35.52%增加到55.68%,抑瘤率提高20%以上;而且0.25mg/kg体重/天剂量的NGR-hPK5的治疗效果与1.25mg/kg体重/天剂量的hPK5治疗效果相当,即相同疗效下,NGR-hPK5所需剂量为hPK5的1/5。与野生型蛋白质的治疗效果相比,NGR-hPK5的治疗总剂量仅为NGR-Endostatin的1/38,为Tumstatin-NGR的1/19时,其抗肿瘤疗效增加幅度显著高于上述两种大剂量使用的抗血管生成蛋白质变体。这充分表现出本发明连接肽 设计所取得的出乎意料的效果。
(3)发明了一种获得高活性NGR-hPK5蛋白的生产工艺方法,该方法利用毕赤酵母表达***,高效、低成本地生产分泌型表达的高生物活性NGR-hPK5蛋白药物。
(4)发明了一种NGR-hPK5联合Cisplatin抗肿瘤治疗策略,利用该策略达到了降低化疗用药剂量、提高疗效的目的。
综上所述,本发明研发了一种肿瘤靶向性的血管生成抑制剂hPK5变体蛋白,该变体蛋白将NGR肽的肿瘤靶向性与hPK5蛋白的抗血管生成活性联合,产生具有肿瘤新生血管靶向性的高活性融合蛋白,并建立了在毕赤酵母中生产该变体蛋白的方法,获得了良好的抗肿瘤治疗效果。
四、附图说明
图1、NGR-hPK5蛋白纯化、鉴定和抗血管生成活性检测
(1A)NGR-hPK5蛋白纯化:1、培养上清总蛋白;2、NGR-hPK5蛋白(0.1M NaCl洗脱);3、杂蛋白(0.5M NaCl洗脱);4、分子量标准品。
(1B)hPK5的Western blot鉴定:1、hPK5;2、NGR-hPK5;3、分子量标准品。
(1C)鸡胚***实验(CAM)检测抗血管生成活性:1、PBS对照;2、hPK5(1μg/鸡胚);3、NGR-hPK5(1μg/鸡胚)。
图2、NGR-hPK5和hPK5在LLC和Colo205肿瘤模型治疗效果比较
(2A)C57BL/6J小鼠Lewis肺癌(LLC)实体肿瘤模型:1、PBS对照;2、hPK5(1.25mg/kg体重/天);3、NGR-hPK5(0.25mg/kg体重/天);4、NGR-hPK5(1.25mg/kg体重/天);5、NGR-hPK5(6.25mg/体重/天)。
(2B)无胸腺裸鼠结肠癌(Colo205)实体肿瘤模型:1、PBS对照;2、hPK5(2.5mg/kg体重/天);3、NGR-hPK5(2.5mg/kg体重/天)。
图3、NGR-hPK5肿瘤靶向性的Western blot分析
(3A)肿瘤组织分析结果:1、PBS对照;2、hPK5(0.5小时);3、hPK5(2小时);4、hPK5(8小时);5、NGR-hPK5(0.5小时);6、NGR-hPK5(2小时);7、NGR-hPK5(8小时)。
(3B)肾脏分析结果:1、PBS对照;2、hPK5(0.5小时);3、hPK5(2小时);4、hPK5(8小时);5、NGR-hPK5(0.5小时);6、NGR-hPK5(2小时);7、NGR-hPK5(8小时)。
图4、免疫组织化学法分析肿瘤局部的微血管密度
1、PBS对照;2、hPK5(2.5mg/kg体重/天);3、NGR-hPK5(2.5mg/kg体重/天)。
图5、hPK5/NGR-hPK5和Cisplatin对LLC肿瘤的治疗效果比较
(5A)hPK5与高剂量Cisplatin联合治疗效果:1、PBS对照;2、Cisplatin(2mg/kg体重/天);3、hPK5(1.25mg/kg体重/天);4、hPK5(1.25mg/kg体重/天)+Cisplatin(2mg/kg体重/天)。
(5B)NGR-hPK5与高剂量Cisplatin联合治疗效果:1、PBS对照;2、Cisplatin(2mg/kg体重/天);3、hPK5(1.25mg/kg体重/天)+Cisplatin(2mg/kg体重/天);4、NGR-hPK5(1.25mg/kg体重/天);5、NGR-hPK5(1.25mg/kg体重/天)+Cisplatin(2mg/kg体重/天)。
(5C)hPK5与低剂量Cisplatin联合治疗效果:1、PBS对照;2、Cisplatin(0.5mg/kg体重/天);3、hPK5(1.25mg/kg体重/天);4、hPK5(1.25mg/kg体重/天)+Cisplatin(0.5mg/kg/day)。
(5D)NGR-hPK5与低剂量Cisplatin联合治疗效果:1、PBS对照;2、Cisplatin(0.5mg/kg体重/天);3、NGR-hPK5(1.25mg/kg体重/天);4、NGR-hPK5(1.25mg/kg体重/天)+Cisplatin(0.5mg/kg体重/天)。
图6、hPK5/NGR-hPK5和Cisplatin治疗后对动物体重的影响
1、PBS对照;2、Cisplatin(1):2mg/kg体重/天,隔日1次,共治疗6次;3、Cisplatin(2):2mg/kg体重/天,每日1次、共治疗12次;4、hPK5:1.25mg/kg体重/天,隔日1次,共治疗6次;5、hPK5+Cisplatin(1);6、NGR-hPK5:1.25mg/kg体重/天,隔日1次,共治疗6次;7、NGR-hPK5+Cisplatin(2)。
五、具体实施方式:
实施例1:NGR-hPK5的构建、表达纯化、鉴定和活性检测方法:
(1)NGR-hPK5的克隆构建方法:
NGR-hPK5 PCR引物设计:在毕赤酵母表达载体pPIC9K中信号肽序列末端为5’-CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT-3’,在设计NGR-hPK5的上游PCR引物时用表达基因序列代替信号肽切割位点以后序列(即AGAGGCTGAAGCT),使得外源基因重组到毕赤酵母诱导表达后,蛋白N端连有信号肽,在信号肽切割位点处切割后分泌到胞外。NGR靶向肽的编码序列为TGCAATGGTCGTTGC,并在其后加入连接肽编码序列 (GGTGGTGGTGGT),上下游引物分别引入Xho I(CTCGAG)和EcoR I(GAATTC)酶切位点。上游引物序列为5’-CGCTCGAGAAAAGATGCAATGGTCGTTGCGGTGGTGGTGGTGTCCTGCTTCCAGATGTAG-3’;下游引物序列为5’-GCGAATTCTAGGCCGCACACTGAGGGAC-3’。
以100ng pPIC9K-hPK5为模板进行PCR,循环参数为:94℃ 2min,(94℃ 45sec,55℃ 45sec,72℃ 1min)25个循环,72℃ 10min。PCR产物经Xho I和EcoR I酶切,构建至毕赤酵母表达载体pPIC9K中。
(2)筛选NGR-hPK5毕赤酵母表达工程菌:
将重组质粒pPIC9K-NGR-hPK5电转化毕赤酵母GS115,电转条件为电压1.5kV,电容25μF,电阻200Ω。经PCR鉴定阳性克隆,将阳性克隆同时接种于MD(1.34%YNB,4′10-5%Biotin,2%dextrose,1.5%agar)、MM(1.34%YNB,4′10-5%生物素,0.5%甲醇,1.5%Agar)平板上,若该克隆在MD和MM板上都能生长,则为Mut+型,即甲醇利用快型;若该克隆只能MD板上生长,则为Muts型,即甲醇利用慢型。不同的Mut基因型,表达的方法也不同。本发明筛选的NGR-hPK5毕赤酵母表达工程菌为Muts型。
(3)NGR-hPK5蛋白表达纯化:
将筛选出Muts单克隆接种于含有4ml YPD培养基的试管中,30℃,300rpm培养过夜,以1%接种于含400ml BMGY培养基(1%Yeast extract,2%Peptone,100mM Potassiumphosphate,pH6.0,1.34%YNB,4′10-5%Biotin,1%Glycerol)的2L三角瓶,30℃ 250rpm培养16小时~18小时;室温下1500′g离心5min收集菌体细胞,诱导表达,弃去上清液并将菌体细胞沉淀悬浮在BMMY培养基(1%Yeast extract,2%Peptone,100mM Potassiumphosphate,pH6.0,1.34%YNB,4′10-5%Biotin,1%Methanol)中,用1/2的原初始培养液体积(大约200mL);将菌体悬浮液置于2L三角瓶中,重新盖上三角瓶,再放回培养箱继续生长。每12小时加100%甲醇至终浓度为0.5%,保持诱导。甲醇诱导48小时后,4℃,5000rpm离心15min,上清液立即加入1mmol/L EDTA,防止蛋白酶的作用,将表达上清用70%硫酸胺沉淀浓缩,12000rpm离心30min取沉淀,沉淀溶于50-100ml平衡盐缓冲液中,4℃透析过夜,透析液为(20mM Tris-HCl,1mM EDTANa2,pH8.5)。透析样品离心去少量沉淀,用DEAE-SepharoseFast Flow层析(柱参数:柱高10cm,直径1Gm,流速1ml/min);柱平衡液用缓冲液为20mMTris-HCl,2mM EDTANa2,pH 8.5;0.1M NaCl洗脱目的蛋白NGR-hPK5;0.5M NaCl洗脱杂蛋白。收集各峰,Tricine SDS-PAGE电泳检验。
(4)NGR-hPK5蛋白鉴定:
采用Western blot技术,用人纤溶酶原抗体鉴定表达纯化得到的NGR-hPK5蛋白,并以改构前的野生型hPK5蛋白为对照。利用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白样品浓度,加入上样缓冲液在沸水浴中煮样3min,进行12%SDS-PAGE电泳。接下来使用半干法将SDS-PAGE胶中蛋白转印至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上,10V恒压电转1h。然后将转印后的膜放在新鲜配制的5%脱脂奶粉(PBST配制)中进行封闭,室温作用1h。封闭结束后,根据抗体说明用含5%脱脂奶粉的PBST溶液稀释一抗至最佳工作浓度,将膜包被于一抗中置于4℃作用过夜。然后将膜置于摇床上用PBST轻轻摇荡洗涤3次,每次5min。洗涤完成后包被二抗,将HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗用含有5%脱脂奶粉的PBST溶液按适当比例稀释,与膜共同孵育1小时,同样以PBST洗涤3次,每次5min。最后,按照产品说明配制发光底物溶液(ECL化学发光底物)滴加于PVDF膜上,室温放置1-2min,用滤纸将多余发光液吸干,将膜用保鲜膜包被后放入压片夹移入暗房,取X光片置于膜上曝光适当时间后,冲洗胶片,根据曝光条带判断蛋白的表达结果。
(5)抗血管生成活性检测:
采用鸡胚***实验(CAM)检测NGR-hPK5的抗血管生成活性,并以野生型hPK5为对照。取8天龄受精鸡卵,在照卵灯下寻找胚头右下方血管稀少区,划定1×1Gm开窗位置,在鸡胚气室端钻1mm小孔并穿透壳膜;用75%乙醇消毒开窗部位,用手术剪轻轻揭去蛋壳及壳膜,暴露出鸡胚***,将甲基纤维素膜轻轻放置于***上血管较少的部位,用微量进样器将20ml待测蛋白(1mg)滴入甲基纤维素膜中,阴性对照组用等体积无菌PBS溶液;用无菌透明胶带封窗后放入孵化箱,37.8℃继续孵化;48小时后揭去透明胶带,加入2ml甲醇、丙酮等体积混合固定液,在室温下固定15分钟;待绒毛***血管中的血液凝固后,以纤维素小碟为中心剪下直径约3cm的***,放入盛有水的平皿内展开,然后平铺悬浮于PBS中,观察给药区血管形成情况。
实施例2:NGR-hPK5治疗小鼠Lewis肺癌(LLC)模型的抗肿瘤疗效分析:
(1)LLC肿瘤模型的建立与治疗:
于C57BL/6J小鼠颈背部皮下接种LLC细胞1×106个/50μl/只,待肿瘤直径达5mm左右时将动物随机分组,每组8只,进行治疗。给药方式为连续腹腔注射5天,对照组于腹腔内注射等体积(100μl)的PBS。NGR-hPK5给药剂量分别为0.25、1.25和6.25mg/kg体重/天。hPK5给药剂量为1.25mg/kg体重/天。用游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤,3天测量一次,分别量取肿瘤的长径(L)和短径(W),根据公式V=L×W2×0.52计算肿瘤体积。
(2)肿瘤局部微血管密度检测:
接种LLC肿瘤的C57BL6/J小鼠用hPK5、NGR-hPK5或对照PBS腹腔注射给药,2.5mg/kg体重/天连续给药5天,每组3只小鼠。在治疗结束后第一天取出肿瘤,利用CD31作为特异性探针,对肿瘤切片进行免疫组织化学染色,检测肿瘤局部的微血管密度,采用石蜡切片SP方法:
1)移植瘤经10%中性***固定,石蜡包埋。制成切片,厚5μm。
2)脱蜡和水化
3)PBST洗2~3次各5分钟。
4)0.3%过氧化氢作用15分钟。
5)PBST洗2~3次各5分钟。
6)抗原热修复,0.1%的胰蛋白酶37℃消化15分钟。
7)PBST洗2~3次各5分钟。
8)山羊血清封闭30min,将多余的血清吸出。
9)滴加CD31抗体(1∶50倍稀释),4℃过夜。
10)4℃过夜后需在37℃复温45分钟。11)PBST洗3次各5分钟;
12)滴加通用型生物素标记二抗,37℃ 1小时。13)PBST洗3次每次5分钟。
14)滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素,37℃ 30分钟。
15)PBST洗3次每次5分钟。16)DAB显色5~10分钟,在显微镜下掌握染色程度。
17)PBST或自来水冲洗10分钟。
18)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化。
19)自来水冲洗10~15分钟。
20)脱水、透明、封片、镜检。
以一张已知阳性的人乳腺癌石蜡切片为质量控制片,阴性对照采用PBS缓冲液代替一抗。微血管计数:任何被CD31抗体染成棕黄或棕褐色的分界清楚的内皮细胞或内皮细胞簇团,均作为一个血管计数,光镜下先以放大40倍或100倍视野选择3个微血管生长最活跃区,然后在400倍视野下计数各视野的平均微血管数,即间质微血管密度。
(3)肿瘤靶向性分析:
接种LLC肿瘤的C57BL/6J小鼠腹腔注射等剂量(2.5mg/kg)NGR-hPK5或hPK5,对照组于腹腔内注射等体积(100μl)的PBS,每组3只小鼠。注射后0.5小时、2小时和8小时 分别收集肿瘤和肾脏样品,提取总蛋白,考马斯亮蓝法测定蛋白样品浓度,各取100μg用Westernblot技术检测NGR-hPK5或hPK5的分布情况和滞留时间。Western blot方法同实施例1。
实施3:NGR-hPK5治疗人源Colo205结肠癌模型的抗肿瘤疗效分析:
于无胸腺裸鼠颈背部皮下接种Colo205细胞1×106个/50μl/只,待肿瘤直径达5mm左右时将动物随机分组,每组8只,进行治疗。给药方式为连续腹腔注射5天,对照组于腹腔内注射等体积(100μl)的PBS。NGR-hPK5和hPK5给药剂量均为2.5mg/kg体重/天。用游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤,3天测量一次,分别量取肿瘤的长径(L)和短径(W),根据公式V=L×W2×0.52计算肿瘤体积。
实施例4:NGR-hPK5与Cisplatin联合治疗小鼠Lewis肺癌(LLC)模型的抗肿瘤疗效分析:
(1)LLC肿瘤模型的建立与治疗:
模型建立和肿瘤体积测量的方法同实施例2。给药方式为隔日腹腔注射NGR-hPK5或hPK56次(在第0、2、4、6、8和10天),剂量均为1.25mg/kg体重/天;在每组治疗结束24h后,腹腔注射Cisplatin 6次(在第1、3、5、7、9和11天),高剂量组为2mg/kg体重/天,低剂量组为0.5mg/kg体重/天;对照组动物注射等体积(100μl)PBS。
(2)***毒性初步分析:
未荷瘤C57BL/6J小鼠腹腔注射NGR-hPK5、hPK5或Cisplatin,每组5只动物。hPK5或NGR-hPK5的给药剂量均为1.25mg/kg体重/天,隔日注射6次。Cisplatin给药剂量为2mg/kg体重/天,隔日注射6次或连续每日注射12次。于治疗结束后第1天测量动物体重,以初步分析NGR-hPK5/hPK5蛋白治疗和Cisplatin化疗的***毒性。
本发明利用毕赤酵母表达***表达纯化NGR-hPK5蛋白,目的蛋白分子量略大于14.4KD,与理论值符合,纯度超过90%(图1A2),用Western blot进行了蛋白鉴定(图1B2),并通过鸡胚***实验验证了其抑制新生血管生成活性(图1C3)。
分别在小鼠Lewis肺癌(LLC)和人结肠癌(Colo205)实体肿瘤模型上评价NGR-hPK5蛋白药物的抗肿瘤效率。在小鼠Lewis肺癌肿瘤模型中,NGR-hPK5治疗能显著地抑制LLC实体肿瘤的生长,第12天,0.25、1.25和6.25mg/kg体重/天剂量给药组抑瘤率分别为30.30%、55.68%和68.10%,NGR-hPK5抑制肿瘤生长活性呈剂量依赖性关系(图2A3-5)。等剂量(1.25mg/kg体重/天)NGR-hPK5治疗组的抑瘤率(图2A4)明显高于野生型hPK5治疗(图2A2),1/5剂量即0.25mg/kg体重/天NGR-hPK5治疗效果(图2A3)与 1.25mg/kg体重/天hPK5治疗相似(图2A2);在无胸腺裸鼠人源结肠癌肿瘤模型中,NGR-hPK5治疗也能显著地抑制Colo205实体肿瘤的生长(图2B3),并且其抑瘤效果也明显高于hPK5(图2B2),在第12天,NGR-hPK5和hPK5治疗的抑瘤率分别为33.75%和54.76%。
然后用免疫组织化学方法检测NGR-hPK5及hPK5对LLC肿瘤模型治疗后肿瘤局部的微血管密度,PBS对照组的微血管密度为36.4±10.4(图3:1),hPK5治疗组为19.5±9.25(图3:2),NGR-hPK5治疗组为2.2±7.81(图3:3),野生型和NGR修饰hPK5均能显著抑制LLC肿瘤内部新生血管生成,并且NGR-hPK5的抑制血管生成活性更为显著,说明其强有力的抗肿瘤活性与抑制血管生成活性是相关的。
进一步验证NGR-hPK5的肿瘤靶向性能,用Western blot检测小鼠肿瘤、肾脏、肺脏和肝脏等脏器中的蛋白滞留量和滞留时间。hPK5蛋白经NGR靶向肽修饰后,在肿瘤中的分布量增高、滞留时间延长(图4A),延缓了代谢器官对蛋白的***时间(图4B)。蛋白药物在肺脏和肝脏等其它脏器中的分布量很少,低于Westem blot检测范围。说明NGR可有效携带hPK5蛋白,靶向滞留在肿瘤局部,证明了NGR肽的肿瘤新生血管靶向性。
在肿瘤靶向性hPK5变体的计算机辅助分子设计中,我们利用对hPK5变体进行了结构模拟和分子设计,在hPK5结构的基础上,对hPK5与CD13配体之间的连接肽氨基酸序列和长度进行分子模建和分子设计,确定连接肽的氨基酸长度。结果发现:在计算机分子设计时计算的添加3-10个氨基酸短肽长度内,只要短肽由不含支链的、柔性较大的氨基酸残基、例如:甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等组成,都不会对hPK5的结构产生任何影响,也不会影响CD13配体的功能。
连接肽的优化和设计大大提高了NGR-hPK5的抗肿瘤效果。在本发明中,我们通过将分子设计与实验探索相结合,发现NGR-hPK5变体分子必须要有连接肽,其长度为3-10氨基酸残基。而这一点在以往的研究中是被忽略的,例如,同样为抗血管生成抑制剂,NGR-Endostatin(Yokoyama Y等,2005,Cancer 104:321-331)在线性NGR序列和Endostatin之间没有添加任何连接肽;而NGR-Tumstatin(Meng J等,2006,J Biochem.140:299-304)设计中则将环状CNGRC序列加在Tumstatin蛋白的C端。与野生型蛋白质的治疗效果相比,NGR-hPK5的治疗总剂量仅为NGR-Endostatin的1/38,为Tumstatin-NGR的1/19时,其抗肿瘤疗效增加幅度显著高于上述两种大剂量使用的抗血管生成蛋白质变体。这充分表现出本发明连接肽设计所取得的出乎意料的效果。
将NGR-hPK5蛋白药物与肿瘤化疗传统药物顺铂(Cisplatin)联用,在LLC实体肿瘤模型上评价其抑瘤效果。在第18天,单独高剂量(2mg/kg体重/天)Cisplatin治疗抑瘤 率为66.00%(图5A2),显示了明显的抗肿瘤效果(与对照组相比p<0.05),hPK5联合高剂量Cisplatin化疗(图5A4)没有体现联合效果,抑瘤效果与单纯高剂量化疗效果相似。而在相同剂量下NGR-hPK5与Cisplatin化疗联合时(图5B5)出现了很好的协同效应(与Cisplatin组相比p<0.05),在第18天肿瘤体积只有356.76±20.16mm3,分别为对照组(图5B:1)的11.34%和Cisplatin化疗组(图5B2)的33.45%。单独低剂量(0.5mg/kg体重/天)Cisplatin治疗(图5C2)只有边界治疗效果,而重组蛋白联合Cisplatin治疗比单独蛋白或Cisplatin治疗的效果更加明显。在第18天,hPK5联合Cisplatin治疗(图5C4)为单独Cisplatin治疗组(图5C2)的59.92%(p<0.05)。NGR-hPK5联合Cisplatin治疗(图5D4)表现出了更加显著的抗肿瘤效果,为单独Cisplatin治疗组(图5D2)的68.94%(p<0.05)。NGR-hPK5在与高低剂量Cisplatin联合治疗过程中均发现较好的联合作用,且疗效明显高于hPK5,说明NGR-hPK5在与其他肿瘤传统疗法联合治疗LLC肺癌实体瘤方面也具有明显优势。
同时,通过测量用药后的动物体重初步评价NGR-hPK5治疗的***毒性。单独的hPK5(图6:4)或NGR-hPK5(图6:6)腹腔给药后体重与对照组(图6:1)没有差别,大剂量(2mg/kg体重/天)腹腔注射Cisplatin 6次(图6:2)或12次(图6:3)处理组的体重显著下降,分别只有对照组的77.38%和59.40%,体现出了很大的***毒性。hPK5(图6:5)或NGR-hPK5(图6:7)联合Cisplatin治疗组的体重与单纯Cisplatin治疗组的体重没有显著差异,说明NGR-hPK5蛋白治疗末见明显的***毒性。
综上所述,本发明提供了一种将hPK5进行NGR肽修饰后的新型具有肿瘤靶向性的抗肿瘤蛋白质及其应用,该药物利用NGR肽的肿瘤新生血管靶向性,有效携带抗血管生成蛋白hPK5,增强其对肿瘤的靶向性,能够显著抑制各种实体肿瘤生长,并且可降低肿瘤治疗时的化疗剂量,显著提高肿瘤对顺铂化疗药物的敏感性。
本发明与以往所报道的其它抗肿瘤药物相比,在降低等效剂量、提高疗效方面明显具有显著优势,NGR-hPK5蛋白分子量小,易于表达和纯化,生产工艺简单易行。1.25mg/kg体重/天连续给药5天,抑瘤率已经超过55%,抗肿瘤活性明显高于以往所报道的其它抗血管生成蛋白。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体,其特征是由CD13的配体肽段、连接肽、人纤溶酶原Kringle 5构建而成的人纤溶酶原Kringle 5变体蛋白质,所述的CD13的配体肽段为一种带有环状结构的、含有CNGRC序列的多肽,连接肽为3-10个不含支链的氨基酸残基组成的肽段,不含支链的氨基酸包含甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸。
2.一种肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体,其特征是将权利要求1所述的一种肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体用聚乙二醇、脂肪酸化、重组加上抗体Fc片段或白蛋白修饰的人纤溶酶原Kringle 5变体。
3.根据权利要求1所述的肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体的制备方法,其特征是通过人工合成或者基因克隆构建肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体的编码基因,实现该编码基因的基因工程表达和分离纯化。
4.根据权利要求1所述的肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体的表达方法,其特征是肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体在毕赤酵母中分泌型表达。
5.根据权利要求1所述的肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体的分离纯化方法,其特征是权利要求1所述的肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体通过硫酸胺沉淀、透析、DEAE离子交换层析获得纯化。
6.一种编码权利要求1所述的肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体的cDNA。
7.一种包含权利要求6的cDNA的基因治疗载体。
8.根据权利要求1或2所述的肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
9.根据权利要求1或2所述的肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体在制备肿瘤治疗药物中的应用,其特征是与顺铂类化疗药物在肿瘤治疗中的联合应用。
10. 根据权利要求6或7所述的肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体cDNA或其基因治疗载体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
11.根据权利要求6或7所述的肿瘤靶向的人纤溶酶原Kringle 5变体cDNA或其基因治疗载体在制备肿瘤治疗药物中的应用,其特征是与顺铂类化疗药物在肿瘤治疗中的联合应用。
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