CN110760008B - 低pH***肽的融合蛋白、药物组合物及应用 - Google Patents

低pH***肽的融合蛋白、药物组合物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了低pH***肽的融合蛋白、药物组合物及应用。所述低pH***肽的融合蛋白是由低pH***肽通过Linker与CD20的功能结构域连接而成。本发明的融合蛋白在酸性环境下***到肿瘤细胞膜上并在细胞表面展示CD20，成功被CD20抗体药物识别。本发明的融合蛋白与抗体药物联合应用可显著抑制小鼠肿瘤生长，本发明的研究成果为临床***提供了一种广谱的药物，该药物可适用于任何肿瘤治疗。

Description

低pH***肽的融合蛋白、药物组合物及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种低pH***肽的融合蛋白、药物组合物及应用。
背景技术
近年来，随着我国经济迅速发展，人民物质文化水平不断提高，生活方式也发生巨大改变，伴随着我们的生存环境也发生了变化，如水质恶化，空气质量下降等等。由于生活方式的改变以及环境质量的下降，我国人口死亡原因发生了很大变化，恶性肿瘤、心血管疾病以及慢性疾病等非传染性疾病已成为我国居民死亡的主要原因，其中恶性肿瘤所带来的死亡占据很大的比率，成为我们无法忽视的问题。
目前，恶性肿瘤常用的治疗方法有手术治疗、化学治疗、放射治疗等，但由于恶性肿瘤具有分化程度低，细胞形态与正常组织细胞相差甚远，排列紊乱以及经常复发或转移等特点，恶性肿瘤的诊断与治疗仍存在许多尚未解决的难题。恶性肿瘤早期常无任何症状，当出现身体上的症状时，主要是肿瘤浸润、压迫器官及远处转移所致，这时往往已是中、晚期，中、晚期肿瘤采用各种治疗效果都不甚理想，绝大多数无法治愈。目前只有未发生转移的肿瘤可采取手术切除治疗，晚期恶性肿瘤手术困难且术后若干年仍会复发或转移。化学药物疗法是肿瘤治疗中的重要手段，然而目前的抗肿瘤药物存在靶向性差、治疗效果不佳、毒副作用大等缺点，易破坏人体免疫力。因此，当今抗癌药物面临着巨大挑战即如何在避免损伤其它正常组织的同时使用有效载体将药物富集于肿瘤组织。
19世纪中叶，法国生理学家Bernard首先提出了“内环境”的概念，也就是细胞生存的微环境是细胞外液。正常生理条件下细胞微环境的各项理化性质处于相对稳定状态，当细胞微环境的稳态被破坏后，就会导致细胞出现各种病理性改变。异常的细胞外微酸性环境的诱导和维持，被认为是肿瘤形成和进展的关键环节。研究发现，肿瘤转移是其最致命的一个方面，肿瘤转移是恶性肿瘤细胞向原发肿瘤以外的部位的生长过程，是肿瘤病人死亡的最主要原因之一。肿瘤转移与其细胞迁移能力呈正相关，而研究人员发现，肿瘤细胞排酸强度与其迁移能力呈正相关，肿瘤细胞外液又显微酸性，因此肿瘤微酸性环境日益成为抗肿瘤领域研究的热点之一。
正常细胞与其周围的组织环境之间为维持正常生理活动时刻保持着动态平衡(如离子分布、蛋白质和酶的合成、气压和pH等)，二者共同作用为细胞增殖、分化、凋亡以及细胞表面各种因子的分泌和表达提供了一个稳定的环境。一旦此动态平衡被破坏，便有疾病发生。而肿瘤组织与正常组织之间显著区别在于前者细胞外酸液过多，pH呈酸性。人体正常组织的细胞外正常生理pH值维持在7.4，细胞内的pH(pHi)值在7.2。这种现象是由多糖分解，Na+反向协同，Cl、碳酸氢盐离子泵，钠离子和钾离子的交换等多种机制共同作用形成的。但在大多数肿瘤组织中，细胞内外pH梯度变化是反向的，也就是pHi>pH。研究发现，通过微电极、磁共振光谱等方法检测肿瘤细胞内外的pH值，肿瘤细胞pH为6.15～6.8之间，呈酸性，而pHi约为7.2，呈中性甚至碱性。这种细胞内外pH值相反的现象主要与肿瘤组织的代谢有关。肿瘤的生长需要大量的营养物质，但由于肿瘤新生血管紊乱及其本身无功能的毛细血管，导致营养物质供给不足，无法满足肿瘤高代谢的氧需求，导致这一部分肿瘤组织缺氧。缺氧的状态阻碍了细胞通过线粒体呼吸链获取能量，此时处于缺氧状态的肿瘤细胞通过激活缺氧诱导因子并由此激活下游的信号级联反应如产生糖酵解相关酶、上调糖酵解代谢，使得肿瘤细胞得以适应缺氧环境而生存。临床发现，大部分恶性肿瘤生长以及发展过程中都存在内部缺氧区域，而且这些区域常常出现坏死，也更容易发生肿瘤转移。即使在有氧环境下肿瘤细胞仍然进行糖酵解，肿瘤细胞这种独特的代谢过程一方面维持了胞内pH的稳态和肿瘤细胞基本的生理功能，另一方面也导致了肿瘤细胞外微酸性环境的形成，这也是肿瘤进化过程中自然选择的结果。研究结果表明，即使是不需要经过糖酵解的突变细胞，其细胞外基质仍然呈酸性。这一发现说明，肿瘤组织的酸性现象或许源自于肿瘤细胞本质。因此，肿瘤微酸性环境的特征可以作为一种靶向目标用于肿瘤细胞医学领域的研究，而寻找对酸性敏感的靶向探针是解决这一问题的关键。
来源于细菌视紫红质的跨膜螺旋蛋白C的低pH***肽(pHLIP，pH low insertionpeptide)正是由于其在酸性微环境中的特殊性质成了近年来的研究热点。pHLIP是一种水溶性的多肽，能够***细胞双层脂膜形成稳定的跨膜α螺旋。肽折叠和膜***是由中性或碱性(pH>7.4)pH下降至弱酸性(pH＝7.0-6.5或者更低)驱动的。pHLIP具有三种主要形态：在中性pH下无结构溶于水的形态I，在中性pH下无结构且结合到细胞膜表面上的状态II，在酸性pH下***并以α螺旋穿过细胞膜的状态III。因此，低pH时肽链与细胞膜的结合力比中性条件下的结合力高几倍，这为pHLIP有针对性的靶向酸性疾病组织提供了有利的基础。研究发现，低pH时，pHLIP的N端是游离于细胞膜表面，而C端嵌入并穿透进入细胞。因此，小分子共价结合到pHLIP的N端，可以在低pH时被pHLIP运送到肿瘤细胞膜表面。Davies等利用pHLIP作为血小板中的成像探针构建了一种稀土元素包裹的金纳米颗粒体系用于细胞成像，该实验关键是在于pHLIP在pH≤6.5时可以将其C端嵌入到细胞内，从而将荧光分子等成像小分子运输到细胞内。
利用pHLIP的酸性环境趋向性开发利于治疗恶性肿瘤的靶向***是未来的研究热点。
发明内容
本发明是基于以下构思完成的：肿瘤具有异质性，即使同一肿瘤组织中的肿瘤细胞表面可能会表达不同的蛋白抗原，针对某一蛋白抗原的药物只能杀伤表达该抗原的肿瘤细胞，但是对不表达该抗原的肿瘤细胞没有杀伤作用，这些肿瘤细胞生存下来形成生长优势，使得该肿瘤患者对该药物产生了耐药性。如果将一种蛋白抗原在所有的肿瘤细胞表面都表达，则会导致针对该蛋白抗原的药物能够彻底杀伤所有的肿瘤细胞。对于不同的肿瘤组织也是如此。本发明将肿瘤表面抗原CD20的部分片段与靶向肿瘤的低pH***肽连接形成融合蛋白，该融合蛋白可以靶向任何实体肿瘤细胞并在肿瘤细胞表面展示，针对CD20药物如GA101，就可以对包括乳腺癌细胞在内的任何癌细胞进行杀伤作用，扩大该肿瘤药物的适用范围。
本发明的目的之一在于提供一种低pH***肽的融合蛋白。
本发明的目的之二在于提供上述融合蛋白形成的抗肿瘤药物。
本发明的目的之三在于提供上述融合蛋白在肿瘤靶向治疗中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种低pH***肽的融合蛋白，所述融合蛋白包括低pH***肽，肿瘤表面抗原或其功能结构域，所述肿瘤表面抗原的功能结构域是抗体识别并结合的结构域。
进一步，所述融合蛋白包括低pH***肽，肿瘤表面抗原的功能结构域，所述肿瘤表面抗原的功能结构域是抗体识别并结合的结构域。
可用于构建本发明融合蛋白的肿瘤表面抗原的实例包括但不限于ER、PR、P53、EGFR、IGFR、Her2、CD20、CD25、CD117、CD34、CD138、CD33、VEGFR、BCMA、Mesothelin、CEA、PSCA、MUC1、EpCAM、S100、CD22、CD19、CD70、CD30、ALK、RANK、GPC2、GPC3、HER3、EGFRvIII、GD2、PD-L1、或PD-L2。
可用于构建本发明融合蛋白的低pH***肽包括序列为SEQ ID NO.1所示的多肽或其变体。
序列为SEQ ID NO.1所示的多肽在本发明中简称WT，WT的变体包括Var1-Var16。
WT及其变体的序列如下：
WT:ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT(SEQ ID NO.1)；
Var1:ACEDQNPYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDG(SEQ ID NO.2)；
Var2:ACEDQNPYWRAYADLFTPLTLLDLLALWDG(SEQ ID NO.3)；
Var3:ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO.4)；
Var4:ACEEQNPWRAYLELLFPTETLLLELLW(SEQ ID NO.5)；
Var5:ACDDQNPWARYLDWLFPTDTLLLDL(SEQ ID NO.6)；
Var6:CDNNNPWRAYLDLLFPTDTLLLDW(SEQ ID NO.7)；
Var7:ACEEQNPWARYLEWLFPTETLLLEL(SEQ ID NO.8)；
Var8:CEEQQPWAQYLELLFPTETLLLEW(SEQ ID NO.9)；
Var9:CEEQQPWRAYLELLFPTETLLLEW(SEQ ID NO.10)；
Var10:ACEDQNPWARYADWLFPTTLLLLD(SEQ ID NO.11)；
Var11:ACEEQNPWARYAEWLFPTTLLLLE(SEQ ID NO.12)；
Var12:ACEDQNPWARYADLLFPTTLAW(SEQ ID NO.13)；
Var13:ACEEQNPWARYAELLFPTTLAW(SEQ ID NO.14)；
Var14:TEDADVLLALDLLLLPTTFLWDAYRAWYPNQECA(SEQ ID NO.15)；
Var15:CDDDDDNPNYWARYANWLFTTPLLLLNGALLVEAEET(SEQ ID NO.16)；
Var16:CDDDDDNPNYWARYAPWLFTTPLLLLPGALLVEAEET(SEQ ID NO.17)。
本发明的所述肿瘤表面抗原或其功能结构域通过Linker连接于所述低pH***肽的N端。
所述Linker是本领域常规使用的，序列可以是(GGGS)m，也可以是(GGGGS)m，其中m＝自然数。
优选地，所述Linker序列是GGGS(SEQ ID NO.18)。
在本发明的一个具体实施方案中，使用的肿瘤表面抗原是CD20，与低pH***肽序列连接的是CD20的功能结构域，所述CD20的功能结构域序列如SEQ ID NO.19(NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ)所示，且该功能结构域序列中的第5位Cys与第21位Cys形成了二硫键(如上述序列中下划线标注的两个Cys)。SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.19所示的序列具有相同功能的由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列衍生的多肽也属于CD20的功能结构域，即本发明的CD20的功能结构域包括野生型及其变体。
CD20的功能结构域变体与SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性。
通常，已知的是，一个蛋白质或者多肽中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、***、替换是保守修饰，其中蛋白质多肽的改变产生具有相似功能的蛋白质或多肽。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
CD20的功能结构域变体也包括对SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的多肽仍然能够保留结合抗体的生物学活性即可。
利用CD20的功能结构域与低pH***肽构建的融合蛋白的序列如下：
CD20的功能结构域与野生型低pH***肽构建而成的融合蛋白(CD20-WT)：
NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQGGGSACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEG(SEQID NO.20)，下划线标记的两个Cys之间通过二硫键连接。
CD20的功能结构域与野生型低pH***肽的变体7构建而成的融合蛋白(CD20-var7)：
NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQGGGSASEEQNPWARYLEWLFPTETLLLEL(SEQ ID NO.21)，下划线标记的两个Cys之间通过二硫键连接。
CD20的功能结构域与野生型低pH***肽的变体3构建而成的融合蛋白(CD20-var3)：
NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQGGGSACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ IDNO.22)，下划线标记的两个Cys之间通过二硫键连接。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种药物组合，所述药物组合包括前面所述的融合蛋白。
优选地，所述药物组合还包括以前面所述的肿瘤表面抗原或其功能结构域为靶点的抗肿瘤药物；更优选地，所述抗肿瘤药物包括肿瘤表面抗原的抗体。
虽然在本发明的具体实施方案中，使用的抗体是GA101，但是本领域技术人员知晓，具体实施方案仅仅是以GA101作为一个实例，证明可识别并结合序列如SEQ ID NO.19所示的CD20的结构域的抗体药物可同本发明的融合肽一起发挥抗肿瘤的作用，因此除GA101之外其他识别并结合序列如SEQ ID NO.19所示的CD20的结构域的抗体药物同样可以发挥抗肿瘤的作用。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种肿瘤标记***，所述肿瘤标记***包括前面所述的融合蛋白。
进一步，所述肿瘤标记***还可以包括Cyanine 5.5、Alexa Flour 750、AlexaFluor 647、Alexa Flour 488、Alexa Flour 546、64Cu-DOTA、68Ga-DOTA、18F-O-pyridine、18F-liposomes、liposomal Rhodamine、Nanogold、TAMRA。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种靶向肿瘤治疗***，所述靶向肿瘤治疗***包括前面所述的肿瘤标记***。
进一步，所述靶向肿瘤治疗***还可以包括肿瘤杀伤***，所述肿瘤杀伤***包括针对肿瘤表面抗原的抗体。
本发明的肿瘤杀伤***可以是CAR-T或TCR-T***，通过免疫细胞，如T细胞，表达针对肿瘤表面抗原的抗体或TCR。肿瘤杀伤***也可以是ADC(antibody drug conjugates)***，即抗体偶联毒素(绿脓杆菌外毒素PE38、白喉毒素、倍癌毒素duocarmycin、金黄色葡萄球菌肠毒素A/E-120、志贺毒素、蓖麻毒素、)、化疗药物(伊立替康、依沙替康、阿霉素)、小分子抑制剂(奥利他汀类、刺孢霉素类、美登素类、tubulysin、抗菌药、脲酶)、脂质体、纳米金颗粒等。另外，肿瘤杀伤***也可以是Immunocytokines，即将某些免疫细胞因子与抗体链接，如IL-2、IL-12、TNF-α、IL-10、TGF-β等。也包括双特异性抗体杀伤***，即一个抗体识别融合蛋白链接的抗原或抗原结构域，另一个抗体识别其他抗原。
本发明的靶向肿瘤治疗***的作用原理如下：肿瘤标记***中的融合蛋白在低pH***肽的作用下***到细胞膜上，肿瘤表面抗原或其功能结构域在肿瘤细胞表面，肿瘤杀伤***中的抗体药物识别肿瘤细胞表面抗原或其功能结构域，抗原抗体结合，从而将肿瘤杀伤***聚集在肿瘤组织，彻底的特异性杀伤肿瘤细胞。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述抗肿瘤药物包括前面所述的药物组合物。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的融合蛋白在构建前面所述的肿瘤标记***中的应用。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的融合蛋白在构建前面所述的靶向肿瘤治疗***中的应用。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的肿瘤标记***在构建前面所述的靶向肿瘤治疗***中的应用。
详细来说，靶向肿瘤治疗***可以包括两个分***，一个分***是肿瘤标记***，包括本发明前面所述的融合蛋白，另一个分***是肿瘤杀伤***，包括针对肿瘤表面抗原的抗体。
本发明的针对肿瘤表面抗原的抗体可以是针对肿瘤表面抗原的任何抗体。所述抗体包括单克隆抗体、双特异性抗体。
本发明的针对肿瘤表面抗原的抗体也包括针对肿瘤表面抗原的抗体的抗原结合部分，进一步，所述抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链抗体。
Fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。
Fab’是指包含了部分铰链区的Fab片段。
F(ab’)2指的是Fab’的二聚体。
Fv指的是含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。
单链抗体指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。
本发明的抗体还包括抗体的各种变体，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体。
本发明的针对肿瘤表面抗原的抗体可以在重链和轻链可变区包含一个或多个糖基化位点，如本领域内熟知的，在可变区中存在的一个或多个糖基化位点可以导致增强的抗体免疫原性，或者由于改变了抗原结合而改变抗体的药物动力学。
本发明的针对肿瘤表面抗原的抗体可以被设计为在Fc区域内包含修改，通常是改变抗体的1个或多个功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(如，可以将一个或多个化学基团连接于抗体)，或被修饰以改变其糖基化，从而再改变抗体的一个或多个功能特性。
本发明的针对肿瘤表面抗原的抗体可以被设计的另一个修饰是聚乙二醇化。抗体可被聚乙二醇化从而，例如，增加抗体的生物(如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，该抗体或其片段通常在适合于一个或多个聚乙二醇(PEG)集团连接到该抗体或抗体片段的条件下，与PEG反应，如聚乙二醇的活性酯或醛衍生物。优选地，该聚乙二醇化是通过与活性的PEG分子(或类似的活性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应而实现。
抗体实例包括但不限于：分子靶向单抗药物、靶向抗体偶联药物、双特异性抗体药物、靶向免疫检验点药物等。这样的抗体实例如：利妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥单抗、阿仑单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、奥法木单抗、地诺单抗、伊匹木单抗、本妥昔单抗、帕妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗、阿托珠单抗、雷莫芦单抗、派姆单抗、博纳吐单抗、纳武单抗、达雷木单抗、地努图希单抗、耐昔妥珠单抗、埃罗妥珠单抗、阿特朱单抗、阿维单抗、狄诺塞麦、吉姆单抗、Necitumumab、Atezolizumab。
文中术语“CAR-T”，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。根据肿瘤微环境这一特性，科学家优化了一系列的CART序列，使其在不同的pH值情况下和抗原的亲和力有完全不同的亲和力，从而在不同pH值情况下激活。
如文中所述“肿瘤表面抗原”泛指在肿瘤发生、发展过程中在细胞表面新出现或过度表达的抗原物质。
文中术语“靶向抗体偶联药物”，或称免疫偶联物(immunoconjugate)。免疫偶联物分子由单抗与“弹头”药物两部分构成。可用作“弹头”的物质主要有三类，即放射性核素、药物和毒素；与单抗连接分别构成放射免疫偶联物、化学免疫偶联物和免疫毒素。
文中术语“双特异性抗体药物”是指能同时与两个抗原表位结合的抗体，双抗可以分为两种，即T细胞募集型，包含肿瘤细胞靶点-T细胞募集位点，这占双抗的大部分比例，其中，T细胞募集位点指CD3(T细胞)，CD16靶点(NK细胞)，而靶点通常位于肿瘤细胞；另外，双抗也可能结合双靶点位点(如VEGF-PDGF、VEGF-Ang2)，抑制2条信号通路，从而减少耐药产生的可能性。
本发明的序列都是从N端到C端依次列出。
本发明的优点和有益效果如下：
本发明首次将肿瘤表面抗原CD20的部分结构域与低pH***肽连接，形成了可以标记肿瘤的靶向肿瘤酸性敏感融合蛋白。本发明的研究成果极大的扩展了现有的针对一种癌症或者针对一种癌症特定分型的肿瘤药物的适应症，对于临床***具有非常重要的意义。
附图说明
图1显示本发明的CD20-WT融合蛋白的质谱图；
图2显示本发明的CD20-var7融合蛋白的质谱图；
图3显示本发明的CD20-var3融合蛋白的质谱图；
图4利用cofocal观察乳腺癌细胞上CD20-WT融合蛋白定位的荧光图；
图5利用cofocal观察乳腺癌细胞上CD20-var7融合蛋白定位的荧光图；
图6利用cofocal观察乳腺癌细胞上CD20-var3融合蛋白定位的荧光图；
图7显示CD20-pHLIP联合CD20单抗GA101对肿瘤细胞生长影响的曲线图，
其中，A：CD20-WT，B：CD20-var7；C：CD20-var3。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1 融合蛋白的合成
CD20的功能结构域与野生型pHLIP制备而成的融合蛋白在本发明中表示为CD20-WT，CD20的功能结构域与野生型pHLIP变体7制备而成的融合蛋白在本发明中表示为CD20-var7，CD20的功能结构域与野生型pHLIP变体3制备而成的融合蛋白在本发明中表示为CD20-var3。CD20-WT(SEQ ID NO.20)、CD20-var7(SEQ ID NO.21)、CD20-var3(SEQ IDNO.22)(DMSO溶解，由杭州中肽生化有限公司合成)。融合蛋白的质谱图见图1-3。
实施例2 融合蛋白在体外培养的肿瘤细胞上的定位
1、细胞培养
MBA-MD-231细胞使用含有10％小牛血清、160万单位庆大霉素/ml的DMEM培养基，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。细胞长满后按1:10传代。
2、confocal观察定位
MBA-MD-231细胞(5x105/孔)在coverslip培养皿上培养过夜，弃去培养上清分别加入pH6.3和7.4的PBS，加入实施例1表达的融合肽(60μg/ml)，37℃孵育1小时，弃上清用相应pH的PBS洗涤3次，加入pH6.3和7.4的PBS，加入GA101-PE或IgG-PE(对照抗体)(浓度均为1：400稀释)37℃孵育30分钟，弃上清用相应pH的PBS洗涤3次，加入pH7.4的PBS，confocal观察。分组：(1)pH6.3未处理组；(2)pH6.3融合肽(CD20-pHLIP(WT/var7/var3))+IgG-PE；(3)pH6.3融合肽(CD20-pHLIP(WT/var7/var3))+GA101-PE；(4)pH7.4融合肽(CD20-pHLIP(WT/var7/var3))+GA101-PE。
结果：
结果见图4-图6，MBA-MD-231不表达CD20。在中性溶液环境中，CD20-WT、CD20-var7、CD20-var3不能***细胞膜，不能在细胞膜上展示CD20结构域。在酸性溶液环境中，CD20-WT、CD20-var7、CD20-var3能够***细胞膜，且展示在细胞膜上的CD20结构域能够被GA101识别。上述结果表明，CD20的结构域不影响其低pH***肽***细胞膜的特性，同时CD20的结构域与低pH***肽连接也不影响其构象。
实施例3 融合蛋白联合抗体药物***的效果评价
1、试剂材料
4T1细胞(购自ATCC)；6-8周龄雌性Balb/c小鼠(维通利华)；GA101(Roche)
2、步骤
(1)CD20-WT
4T1细胞接种于小鼠***，2x106个细胞/只，50μl体积。
待肿瘤生长至50mm3，开始治疗。分以下四组：CD20-WT/GA101组(10只)，GA101组(5只)，CD20-WT组(5只)，PBS组(10只)。给药方法：CD20-WT，1mg/kg，静脉注射，隔天给药；GA101，30mg/kg，腹腔注射，一周2次。每隔3天测量肿瘤体积和小鼠体重。
待对照组肿瘤体积长至1000mm3时，终止给药。
(2)CD20-var3
4T1细胞接种于小鼠***，2x106个细胞/只，50μl体积。
待肿瘤生长至50mm3，开始治疗。分以下四组：CD20-var3/GA101组(10只)，GA101组(5只)，CD20-var3(5只)，PBS组(10只)。给药方法：CD20-var3，1mg/kg，静脉注射，隔天给药；GA101，30mg/kg，腹腔注射，一周2次。每隔3天测量肿瘤体积和小鼠体重。
待对照组肿瘤体积长至1000mm3时，终止给药。
(3)CD20-var7
4T1细胞接种于小鼠***，2x106个细胞/只，50μl体积。
待肿瘤生长至50mm3，开始治疗。分以下四组：CD20-var7/GA101组(10只)，GA101组(5只)，CD20-var7组(5只)，PBS组(10只)。给药方法：CD20-var7，1mg/kg，静脉注射，隔天给药；GA101，30mg/kg，腹腔注射，一周2次。每隔3天测量肿瘤体积和小鼠体重。
待对照组肿瘤体积长至1000mm3时，终止给药。
3、结果
结果如图7所示，CD20-WT联合CD20单抗GA101可显著抑制肿瘤细胞生长；CD20-var3联合CD20单抗GA101可显著抑制肿瘤细胞生长；CD20-var7联合CD20单抗GA101可显著抑制肿瘤细胞生长。
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京泽勤生物医药有限公司
<120> 低pH***肽的融合蛋白、药物组合物及应用
<150> 2018114594215
<151> 2018-11-30
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Gly
20 25 30
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Arg Ala Tyr Ala Asp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Pro Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Trp Asp Gly
20 25 30
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Cys Asp Asp Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Leu Leu Trp
20 25
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu Leu Trp
20 25
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Cys Asp Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Leu
20 25
<210> 7
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Cys Asp Asn Asn Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Trp
20
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu
20 25
<210> 9
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Cys Glu Glu Gln Gln Pro Trp Ala Gln Tyr Leu Glu Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Trp
20
<210> 10
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Cys Glu Glu Gln Gln Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Glu Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Trp
20
<210> 11
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Leu Leu Leu Asp
20
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Leu Leu Leu Glu
20
<210> 13
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 14
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 15
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Thr Glu Asp Ala Asp Val Leu Leu Ala Leu Asp Leu Leu Leu Leu Pro
1 5 10 15
Thr Thr Phe Leu Trp Asp Ala Tyr Arg Ala Trp Tyr Pro Asn Gln Glu
20 25 30
Cys Ala
<210> 16
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asn Pro Asn Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asn
1 5 10 15
Trp Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asn Gly Ala Leu Leu Val
20 25 30
Glu Ala Glu Glu Thr
35
<210> 17
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asn Pro Asn Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Pro
1 5 10 15
Trp Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ala Leu Leu Val
20 25 30
Glu Ala Glu Glu Thr
35
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro
1 5 10 15
Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln
20 25
<210> 20
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro
1 5 10 15
Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Gly Gly Gly Ser Ala Cys Glu
20 25 30
Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe Thr Thr
35 40 45
Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp Glu Gly
50 55 60
<210> 21
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro
1 5 10 15
Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Gly Gly Gly Ser Ala Ser Glu
20 25 30
Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Glu Trp Leu Phe Pro Thr Glu
35 40 45
Thr Leu Leu Leu Glu Leu
50
<210> 22
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro
1 5 10 15
Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Gly Gly Gly Ser Ala Cys Asp
20 25 30
Asp Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe Pro Thr Asp
35 40 45
Thr Leu Leu Leu Asp Leu Leu Trp
50 55

Claims (10)

1.一种低pH***肽的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由低pH***肽和肿瘤表面抗原的功能结构域连接而成，所述肿瘤表面抗原的功能结构域是针对所述肿瘤表面抗原的抗体识别并结合的结构域；所述肿瘤表面抗原的功能结构域通过Linker连接于所述低pH***肽的N端；
所述低pH***肽序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8所示；
所述肿瘤表面抗原的功能结构域是CD20的功能结构域，其序列为SEQ ID NO.19所示，SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列第5位Cys与第21位Cys形成二硫键。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Linker序列是（GGGS）m或（GGGGS）m，其中m=自然数。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述Linker序列是GGGS。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO.20-22所示；SEQ ID NO.20-22所示的氨基酸序列第5位Cys与第21位Cys形成二硫键。
5.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白以及CD20单抗GA101。
6.一种肿瘤标记***，所述肿瘤标记***包括权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白。
7.一种靶向肿瘤治疗***，所述靶向肿瘤治疗***包括权利要求6所述的肿瘤标记***以及CD20单抗GA101。
8.权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白的应用，其特征在于，所述应用包括以下任一项所述的应用：
（1）在制备抗乳腺癌的药物中的应用；
（2）在制备权利要求6所述的肿瘤标记***的应用；
（3）在制备权利要求7所述的靶向肿瘤治疗***中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗乳腺癌的药物包括权利要求5所述的药物组合物。
10.权利要求6所述的肿瘤标记***在制备权利要求7所述的靶向肿瘤治疗***中的应用。
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