发明内容
本发明的目的是提供一种疏血通制剂的质量检测方法。
为了实现本发明目的,本发明提供一种疏血通制剂的质量检测方法,其特征在于,该方法包括含量测定及指纹图谱鉴定,其中,含量测定包括氨基酸含量测定和糖含量测定;指纹图谱鉴定包括氨基酸指纹图谱鉴定、糖指纹图谱鉴定和小分子物质指纹图谱鉴定;
所述疏血通制剂用如下方法制得:将水蛭和地龙分别用2~4倍体积的生理盐水浸提15~30小时,过滤,以体积百分书计,将33%~84%水蛭生理盐水提取液与16%~67%地龙生理盐水提取液的比例混合。
本发明的质量检测方法,其中所述所述氨基酸含量测定包括如下步骤:
1)对照品溶液的制备
分别精密称取10mg或15mg氨基酸标准品,用0.1N盐酸定容至5ml,制得17种氨基酸储备液;所述氨基酸标准品选自天门冬氨酸标准品、甘氨酸标准品、苏氨酸标准品、丙氨酸标准品、酪氨酸标准品、胱氨酸标准品、苯丙氨酸标准品、异亮氨酸标准品、亮氨酸标准品、脯氨酸标准品、谷氨酸标准品、丝氨酸标准品、组氨酸标准品、精氨酸标准品、缬氨酸标准品、蛋氨酸标准品和赖氨酸标准品;
然后分别精密吸取0.5mL、1mL或2mL上述17种氨基酸储备液,混合后用0.1N盐酸定容至25mL,制得1号混合对照品溶液;
2)标准曲线的制备
精密量取2mL、3mL、4mL上述1号混合对照品溶液,分别用0.1N盐酸定容至5mL,得2号、3号、4号混合对照品溶液;取2mL 3号混合对照品溶液,用0.1N盐酸定容至5mL,得5号混合对照品溶液;取2mL 4号混合对照品溶液,用0.1N盐酸定容至5mL,得6号混合对照品溶液;取1mL 3号混合对照品溶液,用0.1N盐酸定容至10mL刻度,得7号混合对照品溶液;
分别将上述1-7号混合对照品溶液注入液相色谱仪测定峰面积,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;其中,色谱条件与***适用性试验为:
色谱柱:4.6×150mm,3.5μm Zorbax Eclipse-AAA柱;流速:2mL/min,流动相组成:A相pH7.8的40mmol/L Na2HPO4溶液、B相乙腈∶甲醇∶水=40~50∶40~50∶10,优选为乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10,以A相与B相的体积比为0~100∶100~0进行梯度洗脱;检测波长:338nm、262nm;柱温为40℃;进样量:1μL;理论板数按丙氨酸峰计算应不低于10000;
3)游离氨基酸含量测定
取1mL待测样品,用0.1N盐酸定容至5mL,制得未水解样品;按照步骤2)的色谱条件测定峰面积,从标准曲线上读出供试品溶液中氨基酸的含量,计算得出;
4)总氨基酸含量测定
精密量取0.5mL待测样品,加入2mL含1%苯酚的6N盐酸,冲氩气10秒后,密封于110℃水解22h后,冷却至室温;然后加入1mL40%NaOH溶液,混匀,用0.1N盐酸定容至5mL,制得水解样品;按照步骤2)的色谱条件测定峰面积,从标准曲线上读出供试品溶液中氨基酸的含量,计算得出。
具体地,上述色谱条件中所述梯度洗脱的洗脱程序为:0~1.9min:A:100%、B:0%;1.9~18.1min:A:100%~43%、B:0%~57%;18.1~18.6min:A:43%~0%、B:57%~100%;18.6~22.3min:A:0%、B:100%;22.3~23.2min:A:0%~100%、B:100%~0%;23.2~26min:A:100%,B:0%。
将总氨基酸含量与游离氨基酸含量相减,即得多肽的含量。
对于疏血通注射液(规格:2mL/支),以总氨基酸含量高于7.0mg/支、多肽含量高于2.0mg/支、游离氨基酸高于5.0mg/支作为疏血通注射液合格的限量。
所述糖含量测定包括如下步骤:
1)对照品溶液的制备
精密称取甘露糖对照品、半乳糖对照品各10mg,分别加水定容至5mL,制得甘露糖对照品溶液和半乳糖对照品溶液,备用;
精密称取50mg葡萄糖对照品,加入1mL所述半乳糖对照品溶液和2mL所述甘露糖对照品溶液,然后加水定容至5mL,得1号混合对照品溶液;
2)标准曲线的制备
分别精密吸取0.75mL、0.5mL、0.2mL、0.2mL 1号混合对照品溶液,分别精密加入0.25mL、0.5mL、0.8mL、1.8mL水,混匀,即得2号、3号、4号、5号混合对照品溶液;取0.5mL 5号混合对照品溶液,精密加入0.5mL水,混匀,即得6号混合对照品溶液;取0.2mL 5号混合对照品溶液,精密加入0.8mL水,混匀,即得7号混合对照品溶液;
分别精密吸取100μl上述1-7号混合对照品溶液置于离心管中,加入0.3N NaOH溶液100μL和0.5mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液200μL,用0.3N NaOH溶液调pH至7.2~8.5;于70℃水浴反应45min,冷却至室温后,加入与上述0.3N NaOH溶液使用量相当的0.3N盐酸,混匀;再加入12.5%的磷酸盐缓冲液,稀释反应溶液至1.0mL,混匀后加入5mL氯仿,涡旋30s,4500rpm离心5min,取上层水层,10000rpm高速离心5min,取上清液;
分别将上述制得的上清液进行HPLC检测注入液相色谱仪测定峰面积,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;其中,色谱条件与***适用性试验为:
色谱柱:4.6×250mm,5μm Phenomenex C18柱;流速:1.2mL/min;流动相:A相为20mmol/L醋酸铵、B相为乙腈,以A相与B相的体积比为60~85∶15~40进行梯度洗脱;柱温为25℃;进样量:5μL;检测波长:245nm;理论塔板数以葡萄糖峰计算,不低于3000;
3)游离糖含量测定
取100μl待测样品,按步骤2)中的处理方法制得上清液,在步骤2)的色谱条件下测定峰面积,从标准曲线上读出供试品溶液中的糖含量,计算得出;
4)总糖含量测定
精密吸取1mL待测样品,加入2mL 6%的三氟醋酸溶液,充氩气后封口,110℃水解3h;然后减压蒸至无三氟醋酸味,加入1mL水溶解残渣,得多糖水解液;精密量取100μL多糖水解液,按步骤2)中的处理方法制得上清液,在步骤2)的色谱条件下测定峰面积,从标准曲线上读出供试品溶液中的糖含量,计算得出。
具体地,上述色谱条件中所述梯度洗脱的洗脱程序为:0~25min:A:85%~72.5%,B:15%~27.5%;25~30min,A:72.5%~60%,B:27.5%~40%。
将总糖含量与游离糖含量相减,即得多元糖的含量。
对于疏血通注射液(规格:2mL/支),建议采用总糖含量高于8.0mg/支、游离糖含量高于7.0mg/支、多元糖含量高于0.5mg/支,作为疏血通注射液合格的限量。
本发明中,所述氨基酸指纹图谱用如下方法建立:
1)精密量取1mL疏血通制剂样品,用0.1N盐酸定容至5mL,制得未水解样品;吸取1μL该未水解样品注入液相色谱仪,制定未水解样品的氨基酸对照指纹图谱;其中,色谱条件与***适用性试验与氨基酸含量测定中的相同;
2)精密量取0.5mL疏血通制剂样品,按氨基酸含量测定中步骤4)的方法制得水解样品;取1μL该水解样品注入液相色谱仪,制定水解样品的氨基酸对照指纹图谱;其中,色谱条件与***适用性试验与氨基酸含量测定中的相同;
3)指纹图谱鉴定
将疏血通制剂产品在相同处理方法及色谱条件下测定未水解样品的氨基酸指纹图谱和水解样品的氨基酸指纹图谱,分别与上述对照指纹图谱相比较,相似度大于0.90的为合格产品。
本发明中,所述糖指纹图谱用如下方法建立:
1)取100μl疏血通制剂样品,按照糖含量测定中步骤3)的处理方法制得上清液,注入液相色谱仪,制定未水解样品的糖对照指纹图谱;其中,色谱条件与***适用性试验与糖含量测定中的相同;
2)精密吸取1mL疏血通制剂样品,按照糖含量测定中步骤4)的处理方法制得上清液,注入液相色谱仪,制定水解样品的糖对照指纹图谱;其中,色谱条件与***适用性试验与糖含量测定中的相同;
3)指纹图谱鉴定
将疏血通制剂产品在相同处理方法及色谱条件下测定未水解样品的糖指纹图谱和水解样品的糖指纹图谱,分别与上述对照指纹图谱相比较,相似度大于0.90的为合格产品。
本发明中,所述小分子指纹图谱用如下方法建立:
1)精密量取1mL疏血通制剂样品,过0.45μm的微孔滤膜后,注入液相色谱仪,制定小分子对照指纹图谱;其中,色谱条件与***适用性试验为:色谱柱:3.5μm,4.6×250mm Waters XBridge Amide柱;流速:1.0mL/min;流动相:A相为0.3%的冰醋酸乙腈溶液、B相为0.3%的冰醋酸水溶液,以A相与B相的体积比40~95∶5~60进行梯度洗脱;检测波长:254nm;进样量:5μL;柱温:30℃;理论塔板数以次黄嘌呤峰计算,不低于2000;
2)指纹图谱鉴定
将疏血通制剂产品在相同处理方法及色谱条件下测定小分子指纹图谱,与上述对照指纹图谱相比较,相似度大于0.90的为合格产品。
具体地,上述色谱条件中所述梯度洗脱的洗脱程序为:0~10min,A:95%,B:5%;10~18min,A:95%~90%,B:5%~10%;18~26min,A:90%,B:10%;26~30min,A:90%~85%,B:10%~15%;30~56min,A:85%~40%,B:15%~60%。
通过小分子指纹图谱,对主要共有峰进行了分析和指认,共指认了10个共有峰,分别为胸腺嘧啶(thymine),尿嘧啶(uracil),胸腺嘧啶核苷(thymidine),2’-脱氧尿苷(2’-deoxyuridine),次黄嘌呤(hypoxanthine),黄嘌呤(xanthine),肌苷(inosine),鸟嘌呤(guanine),鸟嘌呤核苷(guanosine),胞嘧啶核苷(cytidine)。
本发明的疏血通制剂的质量检测方法,建立了通过HPLC测定疏血通注射液中氨基酸含量的方法,该方法简便、准确,且能够同时用于疏血通注射液中氨基酸含量的测定及氨基酸指纹图谱分析,适合作为疏血通中游离氨基酸和多肽氨基酸质量控制的方法;建立了柱前PMP衍生化HPLC分析方法测定疏血通注射液中游离糖和多糖含量的方法,该方法简便、准确,且能够同时用于疏血通注射液中游离糖和多糖含量的测定,及糖类指纹图谱分析,可作为疏血通注射液中糖类物质的日常质量控制的方法;建立了疏血通注射液中内源性小分子的HPLC指纹图谱分析方法,能够满足疏血通注射液中内源性小分子的指纹图谱分析的要求,可采用小分子HPLC指纹图谱来控制注射液的质量。另外,通过本发明方法对疏血通制剂的制备工艺进行质量检测,能够明确水蛭和地龙药材提取液、超滤前后、疏血通制剂中氨基酸、糖、内源性小分子这三大类物质有很好的相关性,超滤步骤是工艺中影响产品质量的关键步骤,需要严格控制。
本发明的疏血通制剂的质量检测方法在结合国家对中药注射液相关要求的基础上,结合现有研究,进一步明确了注射液所含水溶性小分子成分的物质基础上,对指纹图谱中共有峰的性质进行了更进一步的研究阐述,对未知成分的峰(即目前指纹图中的未知成分,包括糖\腺苷\嘌呤等)的归属有了更进一步的认识。更有助于提高对产品制备工艺过程中的来源及过程控制,提升了产品本身的质量,从而提高临床用药的安全系数,也为进一步研究其作用机理奠定基础。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。以下实施例中使用的疏血通注射液均购自牡丹江友搏药业有限责任公司,该疏血通注射液的配比及制备方法参见授权公告号CN1192782C的实施例1,共10批次,规格:2mL/支;各氨基酸标准品、D-甘露糖(Man)对照品、D-无水葡萄糖(Glc)对照品、半乳糖(Gal)对照品均购自中国药品生物制品检定所;。
实施例1疏血通注射液样品中氨基酸含量测定
1)对照品溶液的制备
分别精密称取天门冬氨酸标准品、甘氨酸标准品、苏氨酸标准品、丙氨酸标准品、酪氨酸标准品、胱氨酸标准品、苯丙氨酸标准品、异亮氨酸标准品、亮氨酸标准品、脯氨酸标准品各10mg,谷氨酸标准品、丝氨酸标准品、组氨酸标准品、精氨酸标准品、缬氨酸标准品、蛋氨酸标准品和赖氨酸标准品各15mg,分别用0.1N盐酸定容至5ml,制得17种氨基酸储备液;
按表1中的体积分别精密吸取上述制得的氨基酸储备液,混合后用0.1N盐酸定容至25mL,制得1号混合对照品溶液;
表11号混合对照品溶液的配置
2)标准曲线的制备
精密量取2mL、3mL、4mL上述1号混合对照品溶液,分别用0.1N盐酸定容至5mL,得2号、3号、4号混合对照品溶液;取2mL3号混合对照品溶液,用0.1N盐酸定容至5mL,得5号混合对照品溶液;取2mL 4号混合对照品溶液,用0.1N盐酸定容至5mL,得6号混合对照品溶液;取1mL 3号混合对照品溶液,用0.1N盐酸定容至10mL刻度,得7号混合对照品溶液;
分别将上述1-7号混合对照品溶液注入液相色谱仪测定峰面积,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;其中,色谱条件与***适用性试验为:
色谱柱:4.6×150mm,3.5μm Zorbax Eclipse-AAA柱;流速:2mL/min,流动相组成:A相pH7.8的40mmol/L Na2HPO4溶液、B相乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10,采用梯度洗脱,洗脱程序如下:0~1.9min,A:100%,B:0%;1.9~18.1min,A:100%~43%,B:0%~57%;18.1~18.6min,A:43%~0%,B:57%~100%;18.6~22.3min,A:0%,B:100%;22.3~23.2min,A:0%~100%,B:100%~0%;23.2~26min,A:100%,B:0%;检测波长:338nm、262nm;柱温为40℃;进样量:1μL;理论板数按丙氨酸峰计算应不低于10000;
3)游离氨基酸含量测定
取10个不同批次的待测样品各1mL,用0.1N盐酸定容至5mL,在上述色谱条件下测定峰面积,从标准曲线上读出供试品溶液中氨基酸的含量,计算得出,结果如表2所示;
4)总氨基酸含量测定
精密量取10个不同批次的待测样品各0.5mL,加入2mL含1%苯酚的6N盐酸,冲氩气10秒后,密封置110℃恒温干燥箱中水解22h后,冷却至室温;然后加入1mL 40%NaOH溶液,混匀,用0.1N盐酸定容至5mL,制得水解样品;在上述色谱条件下测定峰面积,从标准曲线上读出供试品溶液中氨基酸的含量,计算得出,结果如表3所示。
表210批次疏血通注射液中游离氨基酸含量(mg/支)
-:未检出
表3 10批次疏血通注射液中总氨基酸含量(mg/支)
-:未检出
将总氨基酸含量与游离氨基酸含量相减,即得多肽的含量,结果如表4所示。
表410批次疏血通注射液中总氨基酸和多肽的含量(mg/支)
从表3可以看出,10批疏血通注射液成品中的总氨基酸和游离氨基酸分别不低于7.41mg/支和5.28mg/支。
1号混合对照品溶液、未水解疏血通注射液样品及水解疏血通注射液样品的氨基酸HPLC谱图如图1所示。
此外,本发明人通过对水蛭和地龙药材提取液、超滤前后、成品注射液中总氨基酸和游离氨基酸的分析可以发现,样品中均含有16种天然存在的氨基酸,均以谷氨酸(GLU)的含量最高、丙氨酸(ALA)其次、天门冬氨酸(ASP)、甘氨酸(GLY)、缬氨酸(VAL)、亮氨酸(LEU)再其次。工艺中超滤会使这16种氨基酸的总量和游离氨基酸的量明显降低。
实施例2疏血通注射液样品中糖含量测定
1)对照品溶液的制备
精密称取甘露糖对照品、半乳糖对照品各10mg,分别加水定容至5mL,制得甘露糖对照品溶液和半乳糖对照品溶液,备用;
精密称取50mg葡萄糖对照品,加入1mL所述半乳糖对照品溶液和2mL所述甘露糖对照品溶液,然后加水定容至5mL,得1号混合对照品溶液;
2)标准曲线的制备
分别精密吸取0.75mL、0.5mL、0.2mL、0.2mL 1号混合对照品溶液,分别精密加入0.25mL、0.5mL、0.8mL、1.8mL水,混匀,即得2号、3号、4号、5号混合对照品溶液;取0.5mL 5号混合对照品溶液,精密加入0.5mL水,混匀,即得6号混合对照品溶液;取0.2mL 5号混合对照品溶液,精密加入0.8mL水,混匀,即得7号混合对照品溶液;
分别精密吸取100μl上述1-7号混合对照品溶液置于离心管中,加入0.3N NaOH溶液100μL和0.5mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液200μL,用0.3N NaOH溶液调pH至7.2~8.5;于70℃水浴反应45min,冷却至室温后,加入与上述0.3N NaOH溶液使用量相当的0.3N盐酸,混匀;再加入12.5%的磷酸盐缓冲液,稀释反应溶液至1.0mL,混匀后加入5mL氯仿,涡旋30s,4500rpm离心5min,取上层水层,10000rpm高速离心5min,取上清液;
分别将上述制得的上清液进行HPLC检测注入液相色谱仪测定峰面积,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;其中,色谱条件与***适用性试验为:
色谱柱:4.6×250mm,5μm Phenomenex C18柱;流速:1.2mL/min;流动相:A相为20mmol/L醋酸铵、B相为乙腈,采用梯度洗脱,洗脱程序如下:0-25min,A:85%-72.5%,B:15%-27.5%;25-30min,A:72.5%-60%,B:27.5%-40%;柱温为25℃;进样量:5μL;检测波长:245nm;理论塔板数以葡萄糖峰计算,不低于3000;
3)游离糖含量测定
取10个不同批次的待测样品各100μl,按步骤2)中的处理方法制得上清液,在上述色谱条件下测定峰面积,从标准曲线上读出供试品溶液中的糖含量,计算得出,结果如表5所示;
4)总糖含量测定
精密吸取10个不同批次的待测样品各100μl,加入2mL 6%的三氟醋酸溶液,充氩气后封口,110℃水解3h;然后减压蒸至无三氟醋酸味,加入1mL水溶解残渣,得多糖水解液;精密量取100μL多糖水解液,按步骤2)中的处理方法制得上清液,在上述色谱条件下测定峰面积,从标准曲线上读出供试品溶液中的糖含量,计算得出,结果如表6所示。
表510批次疏血通注射液中游离单糖含量测定
表610批次疏血通注射液中总糖含量测定
将总糖含量与单糖总含量相减,即得多糖的含量,结果如表7所示。
表710批次疏血通注射液中总糖和多糖的含量
从表7可以看出,10批疏血通注射液中的总糖与单糖分别不低于8.13mg/支和7.35mg/支。
1号混合对照品溶液、未水解疏血通注射液游离糖及水解疏血通注射液样品总糖的HPLC谱图如图2所示。
此外,本发明人通过对水蛭和地龙药材提取液、超滤前后、疏血通成品注射液中游离单糖和多糖的分析,结果表明上述样品中游离糖为葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)和半乳糖(Gal),其中主要为葡萄糖,甘露糖和半乳糖的含量较低,超滤步骤使得多糖量和游离糖的含量明显降低;组成多糖的单糖为葡萄糖、甘露糖和半乳糖,其中主要为葡萄糖,甘露糖和半乳糖的含量较低。
实施例3疏血通注射液的氨基酸指纹图谱的建立
1)精密量取10个不同批次的疏血通注射液样品各1mL,分别用0.1N盐酸定容至5mL,制得未水解样品;分别吸取1μL该未水解样品注入液相色谱仪,制定未水解样品的氨基酸对照指纹图谱,该对照指纹图谱如图1所示;其中,色谱条件与***适用性试验与实施例1中的相同;
2)精密量取10个不同批次的疏血通注射液样品各0.5mL,按实施例1步骤4)的方法制得水解样品;分别取1μL该水解样品注入液相色谱仪,制定水解样品的氨基酸对照指纹图谱,该对照指纹图谱如图2所示;其中,色谱条件与***适用性试验与实施例1中的相同。
3)指纹图谱鉴定
对市售疏血通注射液,在相同色谱条件下测定未水解样品的氨基酸指纹图谱和水解样品的氨基酸指纹图谱,分别与上述对照指纹图谱相比较,相似度大于0.90的为合格注射液。
此外,本发明人通过对水蛭和地龙药材提取液、超滤前后、疏血通成品注射液中总氨基酸和游离氨基酸的指纹图谱进行相似度研究表明:不同批次同一工艺流程环节的中间体的相似度较高,均大于0.9,来源于同一批次药材的不同工艺环节的中间体和成品中总氨基酸和游离氨基酸HPLC指纹图谱的相似度存在一定差异,特别是超滤对游离氨基酸HPLC指纹图谱影响较大。
实施例4疏血通注射液的糖指纹图谱的建立
1)取10个不同批次的疏血通注射液样品各100μl,按实施例2步骤3)的处理方法制得上清液,注入液相色谱仪,制定未水解样品的糖对照指纹图谱,该对照指纹图谱如图3所示;其中,色谱条件与***适用性试验与实施例2中的相同;
2)取10个不同批次的疏血通注射液样品各1mL,按实施例2步骤4)的处理方法制得上清液,注入液相色谱仪,制定水解样品的糖对照指纹图谱,该对照指纹图谱如图4所示;其中,色谱条件与***适用性试验与实施例2中的相同。
3)指纹图谱鉴定
对市售疏血通注射液,在相同色谱条件下测定未水解样品的糖指纹图谱和水解样品的糖指纹图谱,分别与上述对照指纹图谱相比较,相似度大于0.90的为合格注射液。
此外,本发明人通过对水蛭和地龙药材提取液、超滤前后、疏血通成品注射液中游离单糖和多糖的指纹图谱进行相似度研究表明:不同批次的同一工艺流程环节的中间体总糖和游离糖指纹图谱相似度均较高,同一批次的不同工艺流程环节的中间体总糖和游离糖的相似度也较高,超滤对中间体相似度的影响不大。
实施例5疏血通注射液的小分子指纹图谱的建立
1)精密量取1mL疏血通制剂样品,过0.45μm的微孔滤膜后,注入液相色谱仪,制定小分子对照指纹图谱,该指纹图谱如图5所示。其中,色谱条件与***适用性试验为:色谱柱:3.5μm,4.6×250mmWaters XBridge Amide柱;流速:1.0mL/min;流动相:A相为0.3%的冰醋酸乙腈溶液、B相为0.3%的冰醋酸水溶液,采用梯度洗脱,洗脱程序如下:0-10min,A:95%,B:5%;10-18min,A:95%-90%,B:5%-10%;18-26min,A:90%,B:10%;26-30min,A:90%-85%,B:10%-15%;30-56min,A:85%-40%,B:15%-60%;检测波长:254nm;进样量:5μL;柱温:30℃;理论塔板数以次黄嘌呤峰计算,不低于2000;
2)指纹图谱鉴定
对市售疏血通注射液,在相同色谱条件下测定样品的小分子指纹图谱,分别与上述对照指纹图谱相比较,相似度大于0.90的为合格注射液。
此外,本发明人通过对水蛭和地龙药材提取液、超滤前后、成品注射液中内源性小分子的HPLC指纹图谱分析,结果表明来源于同一批次药材的不同工艺环节的中间体的相似度较高;不同批次同一工艺环节的中间体及成品的相似度很高,均大于0.9,说明生产工艺稳定,重复性好。采用LC-MS技术对疏血通注射液指纹图谱中的共有峰进行指认分析。通过质谱数据分析及对照品对照,指认了10个共有峰,分别为胸腺嘧啶(thymine),尿嘧啶(uracil),胸腺嘧啶核苷(thymidine),2’-脱氧尿苷(2’-deoxyuridine),次黄嘌呤(hypoxanthine),黄嘌呤(xanthine),肌苷(inosine),鸟嘌呤(guanine),鸟嘌呤核苷(guanosine),胞嘧啶核苷(cytidine)。其中胸腺嘧啶核苷、2’-脱氧尿苷、肌苷为地龙药材特有峰;其余峰为水蛭、地龙药材共有峰。
实施例6精密度试验
1、氨基酸对照品溶液的精密度考察
从实施例1制得的1-7号混合氨基酸对照品溶液中,选择2号、4号、6号混合对照品溶液作为三个浓度的质控样品HQC、MQC、LQC;取上述LQC、MQC、HQC对照品溶液各1mL,过微孔滤膜后,注入高效液相色谱仪进行色谱分析,色谱条件与实施例1相同,每个浓度重复分析6次,记录氨基酸的峰面积响应值,计算浓度及其RSD,作为日内精密度考察结果,结果见表8~表10。
取LQC、MQC、HQC三个浓度的对照品溶液各1mL,过微孔滤膜后,于4℃保存,分别在第1天、第2天和第3天取出,注入高效液相色谱仪进行色谱分析,色谱条件与实施例1相同,每个浓度重复分析6次,记录氨基酸的峰面积响应值,计算浓度及其RSD,作为日间精密度考察结果,结果见表8~表10。
表8 LQC混合对照品溶液的精密度
a:为n份样品平均值±SD值b:准确度(%)=测得浓度的平均值/已知浓度×100%
表9MQC混合对照品溶液的精密度
a:为n份样品平均值±SD值b:准确度(%)=测得浓度的平均值/已知浓度×100%
表10HQC混合对照品溶液的精密度
a:为n份样品平均值±SD值b:准确度(%)=测得浓度的平均值/已知浓度×100%
从表8~表10可以看出,各混合对照品溶液中各氨基酸测定浓度的日内精密度在10.0%以内;表明各混合对照品溶液中各氨基酸测定浓度的日间精密度在10.0%以内。
2、糖对照品溶液的精密度考察
从实施例2制得的1-7号糖混合对照品溶液中,选择2号、4号、6号混合对照品溶液作为三个浓度的质控样品HQC、MQC、LQC;精密吸取LQC、MQC、HQC三个浓度的糖混合对照品溶液各100μL,按实施例2步骤2)中的处理方法制得上清液,进行HPLC分析,色谱条件与实施例2中相同,每个浓度重复分析6次,记录糖的峰面积响应值,计算浓度及其RSD,结果见表11。
精密吸取LQC、MQC、HQC三个浓度的糖混合对照品溶液各100μL,按实施例2步骤2)中的处理方法制得上清液,于4℃保存,分别在第1天、第2天和第3天取出,进行HPLC分析,色谱条件与实施例2中相同,每个浓度重复分析6次,记录糖的峰面积响应值,计算浓度及其RSD,结果见表11。
表11混合对照品溶液的精密度
a:为n份样品平均值±SD值 b:准确度(%)=测得浓度的平均值/已知浓度×100%
从表11可以看出,各混合对照品溶液的日内精密度在2.0%以内,表明各混合对照品溶液的日间精密度在5.0%以内。
实施例5重复性试验
1、疏血通注射液的氨基酸含量测定的重复性
取疏血通注射液1mL,用0.1N盐酸定容至5mL,混匀制得未水解样品,平行制备6份样品,进行色谱分析,色谱条件与实施例1中相同,记录氨基酸的峰面积响应值,计算每支注射液中的含量及其RSD,结果见表12。
取疏血通注射液0.5mL,按实施例1步骤4)的方法进行处理,平行制备6份样品,进行色谱分析,色谱条件与实施例1中相同,记录氨基酸的峰面积响应值,计算每支注射液中各氨基酸测定浓度及其RSD,结果见表12。
表12 疏血通注射液的重复性
a:为6份样品平均含量±SD值 b:未检测到
从表12可以看出,未水解疏血通注射液及水解疏血通注射液中,各氨基酸测定浓度的重复性均在10.0%以内。
2、疏血通注射液的糖含量测定的重复性
精密吸取100μL疏血通注射液,按实施例2步骤3)的制备方法制得上清液,平行制备6份样品,分别进行HPLC分析,记录糖的峰面积响应值,计算每支注射液中的含量及其RSD,结果见表13。
精密吸取1mL疏血通注射液,按实施例2步骤4)的制备方法制得上清液,平行制备6份样品,分别进行HPLC分析,记录糖的峰面积响应值,计算每支注射液中的含量及其RSD,结果见表13。
表13疏血通注射液的重复性
a:为6份样品平均含量±SD值
综上所述,本发明质量检测方法的精密度高、重复性好,因此,本发明的技术方案具有可行性。利用本发明质量检测方法对疏血通制剂进行监控,药效确切,作用稳定。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。