CN102008515A - 一种灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱 - Google Patents

Abstract

一种灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，属于中药及其制品和功能食品原料及其制品的指纹图谱技术领域。本发明包括灵芝孢子粉多糖的提取、灵芝多糖的部分水解、灵芝多糖部分水解产物的PMP衍生化反应、反相HPLC指纹分析及其标准指纹图谱的确定。通过对15个不同产地的灵芝孢子粉样品的多糖成分的HPLC分析及其指纹图谱的比较，确定了其共有指纹特征，得到标准指纹图谱。指纹图谱中共有峰19个，共有峰峰面积之和占总峰面积的98%，峰面积超过总峰面积5%的指纹峰4个。本方法稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握灵芝孢子粉多糖质量情况及产地来源，为灵芝孢子粉的质量控制和真伪鉴别提供了一种新的科学方法。

Description

一种灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱

技术领域

本发明涉及一种灵芝孢子粉多糖的HPLC指纹图谱的建立方法，本发明还涉及由此方法所得到的灵芝孢子粉多糖标准指纹图谱。属于中药及其制品和功能食品原料及其制品的指纹图谱技术领域。

背景技术

灵芝是属于真菌门，担子菌纲，多孔菌科，灵芝科，灵芝属的真菌。我国药典规定可入药的灵芝有赤芝[Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.]和紫芝（Ganoderma sinense Zhao， Xu et Zhang）；国家食品药品监督管理局公布的可用于保健食品的灵芝品种有赤芝、紫芝和松衫灵芝（Ganoderma tsugae Murr）。灵芝孢子（Ganoderma lucidum spore）是灵芝(一般为赤芝)成熟期从菌盖弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞，生物学上称孢子，集中起来后呈粉末状，通称灵芝孢子粉。灵芝孢子具有免疫调节、抗肿瘤、调节血脂、降血糖等多种生理功效，故在近年来其市场甚为火热。但因缺乏科学全面的检测方法和质量标准，灵芝孢子粉及其加工产品的质量良莠不齐，难以有效控制和鉴别。目前已有灵芝孢子脂溶性成分指纹图谱分析方法的专利，但尚无水溶性成分的指纹图谱分析方法的报道。已有的灵芝粗多糖含量的测定方法不能表征和鉴别灵芝孢子粉样品中多糖的实际质量优劣。为此，本发明首次针对灵芝孢子粉的主要功效成分多糖类物质，采用超声波辅助热水浸提-部分酸水解-PMP柱前衍生反相HPLC法，对不同灵芝孢子粉样品中多糖进行分析表征和比较，确定共有特征峰，利用色谱指纹图谱专用软件建立灵芝孢子粉多糖的标准指纹图谱。本发明可为我国灵芝孢子粉的质量检测方法和质量标准的提升及完善提供科学依据与参考，从而促进我国灵芝孢子粉类产品的质量提高和稳定，更好地规范灵芝市场，维护消费者权益，造福于国人的身体健康。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法，借此可将灵芝孢子粉多糖指纹图谱作为灵芝孢子粉类产品的质量控制和真伪鉴别的主要指标之一。本发明还同时提供了灵芝孢子粉多糖的标准指纹图谱。

本发明的技术方案：灵芝孢子粉多糖指纹图谱的建立方法包括下列步骤：

1.灵芝孢子粉多糖的提取：对于破壁灵芝孢子粉样品，采用下述方法(1)；对于未破壁灵芝孢子粉，采用下述方法(2)。

(1)准确称取破壁灵芝孢子粉样品0.5~1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60~80℃超声30~60min(功率300瓦)，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析12小时，50~60℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至5mL作为粗多糖水溶液，待测。

或(2)准确称取未破壁灵芝孢子粉样品0.5~1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于90~95℃水浴振荡恒温浸提2~3小时，再于水浴60~80℃超声30~60min(功率300瓦)，以下操作同(1)。

2、灵芝孢子粉多糖部分酸水解：吸取100μL所得的粗多糖水溶液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL 的0.5mol/L三氟乙酸（TFA），充N₂封管，100℃水解1 h；冷却后打开盖，真空干燥或用N₂吹干，以去除TFA，再加200μL超纯水溶解残渣（水解产物），备用。

3、灵芝孢子粉多糖部分酸水解产物的PMP衍生化反应操作：取部分水解后的超纯水溶解的水解产物（或混合单糖标液）100μL，加100μL 0.6M的 NaOH溶液，混匀。取其混合液50μL于5mL具塞试管中，再加50μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，同样在70℃的烘箱中反应30~100 min，取出放置10min冷却至室温；加60μL 0.3mol/L的HCl中和，加超纯水至1mL，再加等体积1mL的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，重复萃取共3次。将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

4、PMP衍生化产物的反相高效液相色谱分析：其条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18, 250mm×4.6 mm i.d., 5μm；流动相：0.1 mol/L磷酸盐 (pH 6.7) 缓冲液-乙腈 (体积比为78~83∶22~17)；柱温：20~35℃；检测波长：245~254 nm；流速：0.8~1 mL /min；进样体积：10~50μL。在此条件下分别进样分析单糖混合标样及样品的PMP衍生化产物，得到混合标样的色谱图和灵芝孢子粉多糖的色谱指纹图谱。以葡萄糖峰为参照，计算标样和样品中各峰的相对保留时间；根据标样和样品的相对保留时间对照定性灵芝孢子多糖样品的相关色谱峰；并以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对峰面积。

5、标准指纹图谱的建立：通过对15个不同产地的灵芝孢子粉样品中多糖成分水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱图进行比较，确定共有特征峰，并将色谱数据导入指纹图谱专用软件得到由其共有特征峰构成的灵芝孢子粉多糖的标准色谱指纹图谱。待测样品指纹图谱可与标准指纹图谱对比，区别其异同。

共有特征峰有19个，它们的相对保留时间RT(以葡萄糖峰为参照)的相对标准偏差RSD均小于2 %；即：

1号峰平均RT为0.468，RSD为 0.40%；

2号峰平均RT为0.490，RSD为 0.10%；

3号峰平均RT为0.508，RSD为 0.31%；

4号峰平均RT为0.523，RSD为 0.23%；

5号峰平均RT为0.544，RSD为 0.10%； 

6号峰平均RT为0.577，RSD为 0.12%；

7号峰平均RT为0.603，RSD为 1.05%； 

8号峰平均RT为0.647，RSD为 0.77%；

9号峰平均RT为0.669，RSD为 0.10%；

10号峰平均RT为0.725，RSD为 0.19%；

11号峰平均RT为0.774，RSD为 0.08%；

12号峰平均RT为0.842，RSD为 0.07%；

13号峰平均RT为0.876，RSD为 0.21%；

14号峰平均RT为0.912，RSD为 0.08%；

15号峰平均RT为1.000，RSD为0；

16号峰平均RT为1.131，RSD为0.06%；

17号峰平均RT为1.215，RSD为0.09%；

18号峰平均RT为1.256，RSD为0.09%；

19号峰平均RT为1.482，RSD为0.07%；

其中超过总峰面积5%的指纹峰有4个，分别为：2号峰甘露糖，相对峰面积5.12%~9.11%；15号峰葡萄糖，相对峰面积20.94%~48.47%；16号峰半乳糖，相对峰面积10.38%~54.41%；19号峰岩藻糖，相对峰面积5.19%~14.31%。

灵芝孢子粉多糖的标准指纹图谱如图3所示。

2号峰、7号峰、8号峰、10号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰分别为甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖；这些糖均依据与灵芝孢子粉样品分析同样的色谱条件下测定的单糖混合标准溶液的PMP衍生物的保留时间对照定性；单糖混合标准溶液的PMP衍生化反应操作同上所述，将“取部分水解后超纯水溶解的水解产物”，改为“取单糖混合标准溶液”，该单糖混合标准溶液中各种单糖浓度均准确配制为4mg/mL左右。

本发明的有益效果：

（1）大量的药理和临床研究结果表明灵芝孢子粉中的多糖类物质是其重要的功效成分，故用灵芝孢子粉的多糖成分作为监控指标具有代表性。而孢子粉中多糖是由多种不同多糖组分构成的混合物，它们的极性较强，结构相近，呈多分散性，故难以像小分子那样可以高分辨、高选择性地进行直接色谱分离分析。本发明将灵芝孢子粉多糖部分水解后在反相HPLC柱上分离，分离度和峰形均较好，因而可以有效地进行指纹图谱分析。可根据各个指纹特征峰的相对保留值、相对峰面积及相似度，从色谱的整体特征面貌上把握灵芝孢子粉多糖的质量情况及产地来源，为灵芝孢子粉的质量控制和真伪鉴别提供一种科学的新方法。

（2）因多糖的活性与其单糖组成、糖苷键连接方式、分枝状况等一级结构特征有关，而在一定条件下，多糖的部分水解产物即单糖和寡糖碎片的种类及相对量均随一级结构的不同而有所差异，故通过检测灵芝孢子粉多糖的部分水解产物的HPLC指纹图谱，能有效地表征不同灵芝孢子粉样品中的多糖的组成结构及其生物活性的差异，因而从一重要方面有效地表征灵芝孢子粉的质量，从而弥补目前灵芝孢子粉产品的质量标准和检测方法中，对于多糖仅测定粗多糖含量而无法鉴别其质量优劣和真伪的严重缺陷。

（3）本发明将灵芝孢子粉多糖的部分水解产物进行PMP衍生化反应后上反相HPLC分析，用紫外检测器检测，灵敏度较高，非糖类物质干扰较小。

本发明具有方法稳定、精密度高、重现性好，易于掌握的特点。作为一种生物大分子的分析方法，避免了传统方法因必须进行多步分离纯化和多种波谱手段分析而带来的耗时、费力、成本高、无法快速检测的缺陷。

附图说明

图1   12种单糖-PMP衍生物的HPLC图谱

图2   15个产地孢子粉多糖的HPLC指纹图谱

图3   灵芝孢子粉多糖的HPLC标准指纹图谱

图4   山东某产地破壁灵芝孢子粉样品的多糖指纹图谱。各峰保留时间（min）分别为：1号峰-15.344；2号峰-16.142；3号峰-16.685；4号峰-17.164；5号峰-17.902；6号峰-18.998；7号峰-20.087；8号峰-21.368；9号峰-22.021；10号峰-23.949； 11号峰-25.485；12号峰-27.751；13号峰-28.994；14号峰-30.008；15号峰-32.962；16号峰-37.295；17号峰-40.049；18号峰-41.387；19号峰-48.868。

图5   吉林某产地未破壁灵芝孢子粉样品的多糖指纹图谱。各峰保留时间（min）分别为：1号峰-15.464；2号峰-16.169；3号峰-16.737；4号峰-17.279；5号峰-17.977；6号峰-19.004；7号峰-19.616；8号峰-21.536；9号峰-22.086；10号峰-23.828； 11号峰-25.534；12号峰-27.779；13号峰-28.979；14号峰-30.092；15号峰-33.013；16号峰-37.369；17号峰-40.149；18号峰-41.407；19号峰-48.927。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例1、灵芝孢子粉多糖标准指纹图谱的建立方法

1、仪器、试剂及样品

1.1 仪器 

安捷伦1100高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器（DAD）和安捷伦色谱工作站。

1.2 试剂及样品

单糖标准品：葡萄糖（Glc，99%）、甘露糖（Man，99％）、半乳糖（Gal, ≥99%）均购于上海化学试剂公司；鼠李糖（Rha，≥99%）、岩藻糖（Fuc，≥99%）、葡萄糖醛酸（GlcUA，≥99%）、半乳糖醛酸（GalUA，≥97%）均为美国Sigma-Aldrich公司产品；木糖（Xyl，98%）、氨基葡萄糖（GlcN，98%）、氨基半乳糖（GalN，99%）均为美国ACROS ORGANICS公司产品；核糖（Rib，＞99.0%）、***糖（Ara，99%）均购于厦门星隆达生化试剂有限公司。衍生化试剂:1-苯基-3-甲基-5-吡唑琳酮(PMP)，纯度99%（美国Acros Organics公司）；乙腈，HPLC级（美国Tedia公司）；三氟乙酸(TFA)，纯度不低于99%（国药集团化学试剂有限公司）。水，超纯级；其它试剂均为分析纯。

灵芝孢子粉样品：15个批号分别采自山东、安徽、福建、吉林、湖北、广东等不同产地。

2、灵芝孢子粉多糖的提取

准确称取破壁灵芝孢子粉样品900mg于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴80℃超声30min(功率300瓦)，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，超纯水透析12小时，50℃真空浓缩后，加超纯水定容至5mL作为粗多糖水溶液，待测。

3、灵芝孢子粉多糖部分酸水解

吸取100μL所得的粗多糖水溶液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL 的0.5mol/L TFA，充N₂封管，100℃水解1 h；冷却后打开盖，加200μL甲醇后用N₂ 吹干，如此重复加甲醇并用N₂ 吹3次，去除TFA，再加200μL超纯水溶解残渣（水解产物），备用。

4、灵芝孢子粉多糖部分酸水解产物的PMP衍生化反应操作

取水解后的样品液（或混合单糖标液）100μL，加100μL 0.6M的 NaOH溶液，混匀。取其混合液50μL于5mL具塞试管中，再加50μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，同样在70℃的烘箱中反应30 min，取出放置冷却至室温；加60μL 0.3mol/L的HCl中和，加超纯水至1mL，再加等体积1mL的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取3次。将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

5、PMP衍生化产物的反相高效液相色谱分析

色谱条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm×4.6 mm i.d.， 5μm；流动相：0.1 mol/L磷酸盐（pH 6.7）缓冲液-乙腈 （体积比为82∶18）；柱温：30℃；检测波长：245 nm；流速：0.8 mL /min；进样体积：20μL。在此条件下分别进样分析单糖混合标样及样品的PMP衍生化产物，得到混合标样色谱图和灵芝孢子粉多糖样品的指纹谱图，见附图2。以葡萄糖峰为参照，计算标样和样品中各峰的相对保留时间；根据标样和样品的相对保留时间对照定性灵芝孢子粉多糖样品的相关色谱峰；并以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对峰面积。

6、标准指纹图谱的建立及共有指纹峰特征 

通过 15个不同产地的灵芝孢子粉样品中的多糖成分水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱测定，比较其色谱图，确定共有特征峰19个，共有峰的相对保留时间RT（以葡萄糖峰为参照）的相对标准偏差RSD均小于2%；其中超过总峰面积5%的指纹特征峰有4个，分别为2号峰（甘露糖，相对峰面积5.12% ~9.11%）、15号峰（葡萄糖，相对峰面积20.94%~48.47%）、16号峰（半乳糖，相对峰面积10.38%~54.41%）及19号峰（岩藻糖，相对峰面积5.19%~14.31%）。

灵芝孢子粉多糖的标准指纹图谱如图3所示。

15个不同产地的灵芝孢子粉样品的共有峰相对保留时间及相对峰面积范围见表1。

表1 灵芝孢子粉多糖部分酸水解产物的PMP衍生物

特征峰的相对保留时间和相对峰面积范围

7、指纹图谱重现性试验  

分别准确称取11号灵芝孢子粉样品5份，按照上述提取、水解和衍生化方法平行处理样品，并在同样的上述色谱条件下进行HPLC分析，分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积（占总峰面积百分比%）进行统计，它们的平均值及相对标准偏差（RSD）见表2。相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%。

表2 重现性实验结果（n=5）

8、指纹图谱精密度试验

以11号灵芝孢子粉样品为供试品，按照上述提取、水解和衍生化方法处理样品，取其一份衍生化处理后的样品液，连续进样5次，在同样的色谱条件下进行HPLC分析，分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积（占总峰面积百分比%）进行统计，RSD均不超过3%。

9、指纹图谱稳定性试验

按照指纹图谱稳定性测定方法操作，将经提取、水解和衍生化处理后的11号灵芝孢子粉样品溶液，每2小时进样一次，考察24小时样品溶液稳定性，分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积（占总峰面积百分比%）进行统计，RSD均小于5%。试样24小时稳定。

以上试验显示，上述指纹图谱测定方法精密、稳定、可靠。

实施例2、山东某产地灵芝孢子粉样品的多糖指纹图谱分析

1、灵芝孢子粉多糖的提取

准确称取破壁灵芝孢子粉样品700mg于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60℃超声60min(功率300瓦)，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，超纯水透析12小时，60℃真空浓缩后，加超纯水定容至5mL作为粗多糖水溶液，待测。

2、灵芝孢子粉多糖部分酸水解

吸取100μL所述的粗多糖水溶液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL 的0.5mol/L TFA，充N₂封管，100℃水解1h；冷却后打开盖，加200μL甲醇后用N₂ 吹干，如此重复加甲醇并用N₂ 吹3次，去除TFA，再加200μL超纯水溶解残渣（水解产物），备用。

3、灵芝孢子粉多糖部分酸水解产物的PMP衍生化反应操作

取水解后的样品液（或混合单糖标液）100μL，加100μL 0.6M NaOH溶液，混匀。取其混合液50μL于5mL具塞试管中，再加50μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，同样在70℃的烘箱中反应30 min，取出放置冷却至室温；加60μL 0.3mol/L的HCl中和，加超纯水至1mL，再加等体积1mL的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取3次。将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

4、PMP衍生化产物的反相高效液相色谱分析

色谱条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm×4.6 mm i.d.，5μm；流动相：0.1 mol/L磷酸盐缓冲液-乙腈（体积比为82∶18）；柱温：30℃；检测波长：245 nm；流速：0.8mL /min；进样体积：20μL。在此条件下分别进样分析单糖混合标样及样品的PMP衍生化产物，得到该灵芝孢子多糖的高效液相色谱指纹图谱,见附图4。以葡萄糖峰为参照，计算标样和样品中各峰的相对保留时间；根据标样和样品的相对保留时间对照定性灵芝孢子多糖样品的相关色谱峰；并以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对峰面积。

5、与标准指纹图谱比较  

对照标准指纹图谱，该指纹图谱中含有19个共有特征峰，其4个主要色谱峰的相对保留时间(以葡萄糖峰为参照)和相对峰面积分别为：2号峰相对保留时间为0.490，相对峰面积6.33%；15号峰相对保留时间为1，相对峰面积26.49%；16号峰相对保留时间为1.131，相对峰面积35.65%；19号峰相对保留时间为1.483，相对峰面积9.08%。该样品的指纹图谱与标准指纹图谱相似，具有标准指纹图谱特征。

实施例3、吉林某产地未破壁灵芝孢子粉样品的指纹图谱分析

1、灵芝孢子粉多糖的提取

准确称取未破壁灵芝孢子粉样品500mg于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于95℃水浴振荡恒温浸提2小时，再于水浴70℃超声50min(功率300瓦)，冷却后离心，以下操作同实施例1的提取步骤。

2、灵芝孢子粉多糖部分酸水解

吸取100μL所述的粗多糖水溶液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL 的0.5mol/L TFA，充N₂封管，100℃水解1h；冷却后打开盖，50℃真空干燥去除TFA，再加200μL超纯水溶解残渣（水解产物），备用。

3、灵芝孢子粉多糖部分酸水解产物的PMP衍生化反应操作

取水解后的样品液（或混合单糖标液）100μL，加100μL 0.6M NaOH溶液，混匀。取其混合液50μL于5mL具塞试管中，再加50μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，同样在70℃烘箱中反应30 min，取出放置冷却至室温；加60μL 0.3mol/L的HCl中和，加超纯水至1mL，再加等体积1mL的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取3次。将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

4、PMP衍生化产物的反相高效液相色谱分析

色谱条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm×4.6 mm i.d.，5μm；流动相：0.1 mol/L磷酸盐（pH 6.7）缓冲液-乙腈 (体积比为82∶18)；柱温：30℃；检测波长：245 nm；流速：0.8 mL /min；进样体积：20μL。在此条件下分别进样分析单糖混合标样及样品的PMP衍生化产物，得到该灵芝孢子粉多糖的高效液相色谱指纹图谱,见附图5。以葡萄糖峰为参照，计算标样和样品中各峰的相对保留时间；根据标样和样品的相对保留时间对照定性灵芝孢子多糖样品的相关色谱峰；并以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对峰面积。

5、与标准指纹图谱比较  

对照标准指纹图谱，该指纹图谱中含有19个共有特征峰，其中4个主要色谱峰的相对保留时间(以葡萄糖峰为参照)和相对峰面积分别为：2号峰相对保留时间为0.490，相对峰面积7.45%；15号峰相对保留时间为1，相对峰面积44.32%；16号峰相对保留时间为1.132，相对峰面积15.78%；19号峰相对保留时间为1.482，相对峰面积8.38%。该样品的指纹图谱与标准指纹图谱相似，具有标准指纹图谱特征，同时Glc、Gal、Xyl、Ara四个峰的相对比例与山东样品（实施例2）有明显差异，具有本地区特征。

Claims (2)

1.一种灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法，其特征在于包括灵芝孢子粉多糖的提取、灵芝孢子粉多糖的部分水解、灵芝孢子粉多糖部分水解产物的1-苯基-3-甲基-5-吡唑琳酮PMP衍生化反应、反相高效液相色谱的指纹分析及其标准指纹图谱的确定；步骤为：

（1）灵芝孢子粉多糖的提取：

(a)对于破壁灵芝孢子粉：准确称取破壁灵芝孢子粉样品0.5~1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60~80℃功率300瓦超声30~60min，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析12小时，50~60℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至5mL作为粗多糖水溶液，待测；

或(b) 对于未破壁灵芝孢子粉：准确称取未破壁灵芝孢子粉样品0.5~1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于90~95℃水浴振荡恒温浸提2~3小时，再于水浴60~80℃功率300瓦超声30~60min，以下操作同(a)；

（2）灵芝孢子粉多糖的部分水解：

吸取100μL步骤（1）所得的粗多糖水溶液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL 的0.5mol/L 三氟乙酸TFA，充N₂封管，100℃水解1 h；冷却后打开盖，真空干燥或用N₂吹干，以去除TFA，再加200μL超纯水溶解水解产物，备用；

（3）灵芝孢子粉多糖部分水解产物的PMP衍生化反应：

取步骤（2）部分水解后超纯水溶解的水解产物100μL，加100μL 0.6M NaOH溶液，混匀；取其混合液50μL于5mL具塞试管中，再加等体积50μL的0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，在70℃的烘箱中反应30~100 min，取出放置10min冷却至室温；加60μL 0.3mol/L的HCl中和，加超纯水至1mL，再加等体积1mL的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，重复萃取共3次；将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析；

（4）反相高效液相色谱的指纹分析：

反相高效液相色谱分析条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm×4.6 mm i.d., 5μm；流动相：pH 6.7的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液-乙腈，磷酸盐缓冲液∶乙腈体积比为78~83∶22~17；柱温：20~35℃；检测波长：245~254 nm；流速：0.8~1 mL /min；进样体积：10~50μL；在此条件下进样分析步骤（3）过滤后的PMP衍生化产物，得到灵芝孢子粉多糖的高效液相色谱指纹图谱；

（5）标准指纹图谱的确定：

通过15个不同产地的灵芝孢子粉样品中的多糖水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱测定，比较其色谱图，确定共有特征峰为 19个；所述的19个共有特征峰以葡萄糖峰为参照的相对保留时间RT的相对标准偏差RSD均小于2 %；即：

1号峰平均RT为0.468，RSD为 0.40%；

2号峰平均RT为0.490，RSD为 0.10%；

3号峰平均RT为0.508，RSD为 0.31%；

4号峰平均RT为0.523，RSD为 0.23%；

5号峰平均RT为0.544，RSD为 0.10%； 

6号峰平均RT为0.577，RSD为 0.12%；

7号峰平均RT为0.603，RSD为 1.05%； 

8号峰平均RT为0.647，RSD为 0.77%；

9号峰平均RT为0.669，RSD为 0.10%；

10号峰平均RT为0.725，RSD为 0.19%；

11号峰平均RT为0.774，RSD为 0.08%；

12号峰平均RT为0.842，RSD为 0.07%；

13号峰平均RT为0.876，RSD为 0.21%；

14号峰平均RT为0.912，RSD为 0.08%；

15号峰平均RT为1.000，RSD为0；

16号峰平均RT为1.131，RSD为0.06%；

17号峰平均RT为1.215，RSD为0.09%；

18号峰平均RT为1.256，RSD为0.09%；

19号峰平均RT为1.482，RSD为0.07%；

其中超过总峰面积5%的指纹峰有4个，分别为：2号峰甘露糖，相对峰面积5.12%~9.11%；15号峰葡萄糖，相对峰面积20.94%~48.47%；16号峰半乳糖，相对峰面积10.38%~54.41%；19号峰岩藻糖，相对峰面积5.19%~14.31%。

2.根据权利要求1所述的灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法，其特征在于2号峰、7号峰、8号峰、10号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰分别对应为甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖；这些糖均依据如权利要求1步骤（4）所述与灵芝孢子粉样品分析同样的色谱条件测定的单糖混合标准溶液的PMP衍生物的保留时间对照定性；单糖混合标准溶液的PMP衍生化反应操作同权利要求1步骤（3）所述，将“取步骤（2）部分水解后超纯水溶解的水解产物”改为“取单糖混合标准溶液”，该单糖混合标准溶液中各种单糖浓度均配制为4mg/mL。

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