CN108490091A - 一种发酵虫草菌粉及其制剂中多糖含量的检测方法 - Google Patents

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CN108490091A CN201810236763.4A CN201810236763A CN108490091A CN 108490091 A CN108490091 A CN 108490091A CN 201810236763 A CN201810236763 A CN 201810236763A CN 108490091 A CN108490091 A CN 108490091A
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朱卫丰
杨明
金晨
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Abstract

本发明涉及一种发酵虫草菌粉及其制剂中多糖含量的检测方法，该检测方法具有检测灵敏度高，重现性好等特点。该方法，具体包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备精密称取适量单糖，加入超纯水溶解，衍生，即得混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备称取发酵虫草菌粉适量，通过水提醇沉法得到粗多糖，经酸水解、PMP衍生得供试品溶液；(3)相对较正因子的计算取步骤(1)制备的混合对照品溶液，计算葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子；(4)供试品溶液的含量测定取步骤(2)制备的供试品溶液，通过高效液相色谱检测各单糖峰面积，使用相对校正因子计算有效成分的含量。

Description

一种发酵虫草菌粉及其制剂中多糖含量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药发酵虫草菌粉及其制剂质量控制方法，具体涉及发酵虫草菌粉及其制剂金水宝片和金水宝胶囊一测多评多糖含量测定方法，所述方法包含8种单糖成分的HPLC一测多评含量测定方法。
背景技术
中药成分的复杂性决定了单一成分难以表达中药或中成药的质量，对中药进行多成分同步质量控制是目前广泛认可的中药质量评价模式。“一测多评”法是一种适合中药特点的多指标质量评价的新模式，通过测定一种成分，实现对多个成分的同步检测，该方法操作简单，实用性强，节约成本，是一种行之有效的中药质量控制方法。
发酵虫草菌粉(Cs-4)是由新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角菌科真菌蝙蝠蛾拟青霉菌经液体发酵培养所得菌丝体的干燥粉末。研究表明发酵虫草菌粉中的主要化学成分与天然冬虫夏草相似，具有较高的营养价值。发酵虫草菌粉多糖是发酵虫草菌粉主要活性物质之一，在调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、调节血糖等方面发挥着重要作用。《中国药典》2015年版规定发酵虫草菌粉类产品金水宝片和金水宝胶囊以腺苷和麦角甾醇作为定量测定标准，而发酵虫草菌粉多糖目前尚未作为发酵虫草菌粉产品质量控制的测定目标物。发酵虫草菌粉多糖成分复杂，任何一种单糖成分都不能准确反映虫草多糖的质量。采用外标一点法对多糖中各单糖进行质量控制，但由于部分对照品不易获得且价格昂贵，限制了其在生产和研究中的应用。
中草药杂志，公开《金水宝胶囊中发酵虫草菌粉多糖的指纹图谱研究》，该液相检测条件为梯度洗脱，较为繁琐，且检测的准确性不高。本发明使用的HPLC检测条件操作简单，操作性好。且本发明以较易获得且性质稳定的葡萄糖做为内参物，在缺少其他单糖对照品的情况下对发酵虫草菌粉多糖中各单糖成分进行含量测定，实现对发酵虫草菌粉的质量控制，同时又可以规避由多成分含量测定带来的成本和操作问题，能够为发酵虫草菌粉及其制剂的质量控制提供一种新的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵虫草菌粉及其制剂中多糖含量的检测方法。
本发明的检测方法采用高效液相色谱法，通过“一测多评”多糖含量测定质量控制模式，以葡萄糖为内标物，建立葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子，并计算各单糖成分含量的方法。
本发明的检测方法，具有检测灵敏度高，重现性好，可以客观、全面、准确地评价发酵虫草菌粉及其制剂多糖的质量，可解决因对照品缺乏而无法客观合理地控制药材及其制剂质量的问题，对发酵虫草菌粉及其制剂质量控制具有重要意义。
本发明所述的一种发酵虫草菌粉及其制剂中多糖含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
精密称取适量单糖对照品置于同一容量瓶中，加入超纯水溶解并稀释至刻度，取单糖溶液适量经过PMP衍生，即得混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取发酵虫草菌粉适量，通过水提醇沉法得到粗多糖，再加入Sevage试剂除去蛋白后冷冻干燥，得到发酵虫草菌粉多糖，取多糖适量，经酸水解、PMP衍生后即得供试品溶液；
(3)相对较正因子fkm的计算
取步骤(1)制备的混合对照品溶液，分别进样5、10、15、20、25、30μL，通过高效液相色谱检测峰面积，以葡萄糖为内标物，分别计算葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子fkm；
(4)供试品溶液的含量测定
取步骤(2)制备的供试品溶液，通过高效液相色谱检测各单糖峰面积，使用相对校正因子计算甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的含量，
相对校正因子计算公式为：Wm＝Wk×Am/fkm×Ak，Ak为葡萄糖内标物峰面积，Wk为葡萄糖内标物质量；Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量，fkm为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的校正因子。
其中，步骤(3)和步骤(4)所述的高效液相色谱测定的条件为：
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲盐溶液(17∶83)；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
检测波长：250nm；
进样量：20μL。
其中，步骤(3)、(4)所述的高效液相色谱使用的仪器型号为:Agilent—1100，Agilent—1260及Waters2695高效液相色谱仪中任意一种；
色谱柱型号为：Phenomenex C18柱，Kromasil C18柱，Agilent C18柱中任意一种；
色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm。
其中，步骤(3)和步骤(4)所述的对照品和供试品溶液中内标物葡萄糖的含量测定采用外标一点法计算葡萄糖的含量；通过相对校正因子计算各单糖的含量。
其中，流动相磷酸盐缓冲溶液配制方法为：称取0.05mol磷酸二氢钾加水定容至1000ml，加入2mol/L氢氧化钾溶液调节pH至6.9。
优选的，本发明的检测方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
精密称取适量单糖对照品置同一容量瓶中，加入超纯水溶解并稀释至刻度，取单糖溶液适量经过PMP衍生，即得混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取金水宝片适量，研磨成细粉，通过“水提醇沉”法得到粗多糖，再加入Sevage试剂除去蛋白后冷冻干燥，得到发酵虫草菌粉多糖，取多糖适量，经酸水解、PMP衍生后即得供试品溶液；
(3)相对校正因子计算
取步骤1制备的混合对照品单糖衍生溶液，分别进样5、10、15、20、25、30μL，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，选择葡萄糖为内标物，分别计算葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子fkm，结果葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子f4/1、f4/2、f4/3、f4/5、f4/6、f4/7、f4/8分别为1.326、0.998、0.883、1.021、1.191、1.27、1.86；
(4)供试品溶液的含量测定
取步骤2制备的供试品单糖衍生溶液，用高效液相色谱测定色谱图，使用相对校正因子计算甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的含量，相对校正因子计算公式为：Wm＝Wk×Am/fkm×Ak，Ak为葡萄糖内标物峰面积，Wk为葡萄糖内标物质量；Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量，fkm为葡萄糖对甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的校正因子；
其中，高效液相色谱条件为：
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲盐溶液(17∶83)；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
检测波长：250nm；
进样量：20μL；
优选的，本发明的检测方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
精密称取适量单糖对照品置同一容量瓶中，加入超纯水溶解并稀释至刻度，取单糖溶液适量经过PMP衍生，即得混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取金水宝胶囊适量，通过水提醇沉法得到粗多糖，再加入Sevage试剂除去蛋白后冷冻干燥，得到发酵虫草菌粉多糖，取多糖适量，经酸水解、PMP衍生后即得供试品溶液；
(3)相对校正因子计算
取步骤1制备的混合对照品溶液，分别进样5、10、15、20、25、30μL，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，选择葡萄糖为内标物，分别计算葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子fkm，结果葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子f4/1、f4/2、f4/3、f4/5、f4/6、f4/7、f4/8分别为1.326、0.998、0.883、1.021、1.191、1.27、1.86；
(4)供试品溶液的含量测定
取步骤2制备的供试品溶液，用高效液相色谱测定色谱图，使用相对校正因子计算甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的含量，相对校正因子计算公式为：Wm＝Wk×Am/fkm×Ak，Ak为葡萄糖内标物峰面积，Wk为葡萄糖内标物质量；Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量，fkm为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的校正因子；
其中，高效液相色谱条件为：
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲盐溶液(17∶83)；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
检测波长：250nm；
进样量：20μL。
其中，步骤(2)中所述的水提醇沉法得到粗多糖，具体步骤为：称取发酵虫草菌粉适量，沸水回流提取，提取液离心后取上清液。上清液中加入无水乙醇混合均匀后静置，静置完成后离心收集沉淀，即为粗多糖。
本发明的检测方法是经过大量实验筛选后得到：
1.对照品溶液的制备
精密称取适量单糖对照品置同一容量瓶中，加入超纯水溶解并稀释至刻度，取单糖溶液适量经过PMP衍生，即得混合对照品溶液。
2.供试品溶液的制备
称取发酵虫草菌粉适量，通过“水提醇沉”法得到粗多糖，再加入Sevage试剂除去蛋白后冷冻干燥，得到发酵虫草菌粉多糖。取多糖适量，经酸水解、PMP衍生后即得供试品溶液。
3.色谱条件
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲盐溶液(17∶83)；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
检测波长：250nm；
进样量：20μL；
4.相对校正因子重现性考察
4.1不同进样体积的相对因子考察
根据步骤3项下色谱条件，考察不同进样体积对f4/m的影响，其中f4/1、f4/2、f4/3、f4/5、f4/6、f4/7、f4/8分别为葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子。结果表明相对校正因子在不同进样体积下无显著性差异。
表1相对校正因子f4/m的测定结果
4.2不同仪器和不同色谱柱的相对校正因子考察
按步骤3项下色谱条件，分别考察Agilent—1100，Agilent—1260及Waters2695高效液相色谱及Kromasil C18、Phenomenex C18及Agilent C18色谱柱对相对校正因子f4/m的影响。结果表明相对校正因子在不同仪器和色谱柱下具有良好的适应性。
4.3水解多糖待测组分色谱峰定位
利用相对保留时间对各单糖色谱峰定位，再根据加入相对应的对照品响应值也随之增加，能够准确判断出目标峰的位置。结果表明葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的相对保留时间在Agilent—1100，Agilent—1260及Waters2695高效液相色谱及Kromasil C18、Phenomenex C18及Agilent C18色谱柱的相对保留时间RSD小于5％，结果表明该定位方式是可行的。
5.相对校正因子及相对保留时间的确定
葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子为不同进样体积和不同仪器及色谱柱相对校正因子的平均值，即f4/1、f4/2、f4/3、f4/5、f4/6、f4/7、f4/8分别为1.326、0.998、0.883、1.021、1.191、1.27、1.86。相对保留时间为2.084，1.512，1.214，0.923，0.894，0.868，0.777。
6.供试品溶液的含量测定
取发酵虫草菌粉及其制剂金水宝片和金水宝胶囊制备供试品溶液，使用高效液相色谱记录峰面积，使用相对校正因子计算甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的含量。
相对校正因子计算公式为：Wm＝Wk×Am/fkm×Ak，Ak为葡萄糖内标物峰面积，Wk为葡萄糖内标物质量；Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量，fkm为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的校正因子。
本发明根据发酵虫草菌粉多糖成分和结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳流动相组成，洗脱程序，检测波长，流速等分析条件，经过多次试验验证表明为最佳实验分析条件。
目前，尚未有针对中药发酵虫草菌粉多糖一测多评多指标含量测定方法的报告，本发明开发了准确可靠、简单易行的含量测定方法，采用“一测多评”多指标质量控制模式，以性质稳定且廉价易得的葡萄糖作为内标物，建立其与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的相对校正因子，该方法灵敏度高，重现性好，解决了因部分对照品缺乏而无法客观合理地控制发酵虫草菌粉及其制剂的质量的问题，可以客观、全面、准确地评价发酵虫草菌粉及其制剂的质量，对其质量控制和保证临床疗效具有重要意义。
附图说明
图1为发酵虫草菌粉多糖样品图。
1.甘露糖(Man)；2.葡萄糖醛酸(GlcUA)；3.半乳糖醛酸(GalUA)；4.葡萄糖(Glu)；5.半乳糖(Gal)；6.木糖(Xyl)；7.***糖(Ara)；8.岩藻糖(FUC)
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进一步详细说明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的修改均属于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
金水宝片发酵虫草菌粉多糖“一测多评”法含量测定
1.对照品溶液的制备
精密称取适量单糖对照品置同一容量瓶中，加入超纯水溶解并稀释至刻度，取单糖溶液适量经过PMP衍生，即得混合对照品溶液。
2.供试品溶液的制备
称取金水宝片适量，研磨成细粉，通过“水提醇沉”法得到粗多糖，再加入Sevage试剂除去蛋白后冷冻干燥，得到发酵虫草菌粉多糖。取多糖适量，经酸水解、PMP衍生后即得供试品溶液。
3.色谱条件
色谱柱：Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲盐溶液(17∶83)；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
检测波长：250nm；
进样量：20μL；
4.相对校正因子计算
取步骤1制备的混合对照品单糖衍生溶液，分别进样5、10、15、20、25、30μL，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，选择葡萄糖为内标物，分别计算葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子fkm，结果葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子f4/1、f4/2、f4/3、f4/5、f4/6、f4/7、f4/8分别为1.326、0.998、0.883、1.021、1.191、1.27、1.86。
5.供试品溶液的含量测定
取步骤2制备的供试品单糖衍生溶液，用高效液相色谱测定色谱图，使用相对校正因子计算甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的含量。相对校正因子计算公式为：Wm＝Wk×Am/fkm×Ak，Ak为葡萄糖内标物峰面积，Wk为葡萄糖内标物质量；Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量，fkm为葡萄糖对甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的校正因子。
采用“一测多评”法与外标一点法计算发酵虫草菌粉多糖各单糖的含量结果如表3和表4，结果表明外标一点法和一测多评法计算的各单糖含量无显著性差异(相对绝对误差e均小于5)。
表3外标法和一测多评法各单糖含量测定结果比较
表4外标法和一测多评法各单糖含量测定结果比较
实施例2
金水宝胶囊发酵虫草菌粉多糖“一测多评”法含量测定
1.对照品溶液的制备
精密称取适量单糖对照品置同一容量瓶中，加入超纯水溶解并稀释至刻度，取单糖溶液适量经过PMP衍生，即得混合对照品溶液。
2.供试品溶液的制备
称取金水宝胶囊适量，通过“水提醇沉”法得到粗多糖，再加入Sevage试剂除去蛋白后冷冻干燥，得到发酵虫草菌粉多糖。取多糖适量，经酸水解、PMP衍生后即得供试品溶液。
3.色谱条件
色谱柱：Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲盐溶液(17∶83)；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
检测波长：250nm；
进样量：20μL；
4.相对校正因子计算
取步骤1制备的混合对照品单糖衍生溶液，分别进样5、10、15、20、25、30μL，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，选择葡萄糖为内标物，分别计算葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子fkm，结果葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子f4/1、f4/2、f4/3、f4/5、f4/6、f4/7、f4/8分别为1.326、0.998、0.883、1.021、1.191、1.27、1.86。
(5)供试品溶液的含量测定
取步骤2制备的供试品单糖衍生溶液，用高效液相色谱测定色谱图，使用相对校正因子计算甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的含量。相对校正因子计算公式为：Wm＝Wk×Am/fkm×Ak，Ak为葡萄糖内标物峰面积，Wk为葡萄糖内标物质量；Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量，fkm为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的校正因子。
采用“一测多评”法与外标一点法计算发酵虫草菌粉多糖各单糖的含量结果如表5和表6，结果表明外标一点法和一测多评法计算的各单糖含量无显著性差异(相对绝对误差e均小于5)。
表5外标法和一测多评法各单糖含量测定结果比较
表6外标法和一测多评法各单糖含量测定结果比较
实施例3、
本发明的检测方法与中草药杂志，第48卷16期2017年8月公开《金水宝胶囊中发酵虫草菌粉多糖的指纹图谱研究》比较，操作简单，且以较易获得且性质稳定的葡萄糖做为内参物，在缺少其他单糖对照品的情况下对发酵虫草菌粉多糖中各单糖成分进行含量测定，实现对发酵虫草菌粉的质量控制，同时又可以规避由多成分含量测定带来的成本和操作问题，能够为发酵虫草菌粉及其制剂的质量控制提供一种新的方法。

Claims (7)

1.一种发酵虫草菌粉及其制剂中多糖含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
精密称取适量单糖对照品置于同一容量瓶中，加入超纯水溶解并稀释至刻度，取单糖溶液适量经过PMP衍生，即得混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取发酵虫草菌粉适量，通过水提醇沉法得到粗多糖，再加入Sevage试剂除去蛋白后冷冻干燥，得到发酵虫草菌粉多糖，取多糖适量，经酸水解、PMP衍生后即得供试品溶液；
(3)相对较正因子fkm的计算
取步骤(1)制备的混合对照品溶液，分别进样5、10、15、20、25、30μL，通过高效液相色谱检测峰面积，以葡萄糖为内标物，分别计算葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子fkm；
(4)供试品溶液的含量测定
取步骤(2)制备的供试品溶液，通过高效液相色谱检测各单糖峰面积，使用相对校正因子计算甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的含量，
相对校正因子计算公式为：Wm＝Wk×Am/fkm×Ak，Ak为葡萄糖内标物峰面积，Wk为葡萄糖内标物质量；Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量，fkm为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的校正因子。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)所述的高效液相色谱测定的条件为：
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲盐溶液(17∶83)；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
检测波长：250nm；
进样量：20μL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)、(4)所述的高效液相色谱使用的仪器型号为：Agilent—1100，Agilent—1260及Waters2695高效液相色谱中任意一种；
色谱柱型号为：Phenomenex C18柱，Kromasil C18柱，Agilent C18柱中任意一种；
色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)所述的对照品和供试品溶液中内标物葡萄糖的含量测定采用外标一点法计算葡萄糖的含量；通过相对校正因子计算各单糖的含量。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相磷酸盐缓冲溶液配制方法为：称取0.05mol磷酸二氢钾加水定容至1000ml，加入2mol/L氢氧化钾溶液调节pH至6.9。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
精密称取适量单糖对照品置同一容量瓶中，加入超纯水溶解并稀释至刻度，取单糖溶液适量经过PMP衍生，即得混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取金水宝片适量，研磨成细粉，通过“水提醇沉”法得到粗多糖，再加入Sevage试剂除去蛋白后冷冻干燥，得到发酵虫草菌粉多糖，取多糖适量，经酸水解、PMP衍生后即得供试品溶液；
(3)相对校正因子计算
取步骤1制备的混合对照品单糖衍生溶液，分别进样5、10、15、20、25、30μL，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，选择葡萄糖为内标物，分别计算葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子fkm，结果葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子f4/1、f4/2、f4/3、f4/5、f4/6、f4/7、f4/8分别为1.326、0.998、0.883、1.021、1.191、1.27、1.86；
(4)供试品溶液的含量测定
取步骤2制备的供试品单糖衍生溶液，用高效液相色谱测定色谱图，使用相对校正因子计算甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的含量，相对校正因子计算公式为：Wm＝Wk×Am/fkm×Ak，Ak为葡萄糖内标物峰面积，Wk为葡萄糖内标物质量；Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量，fkm为葡萄糖对甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的校正因子；
其中，高效液相色谱条件为：
色谱柱：Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲盐溶液(17∶83)；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
检测波长：250nm；
进样量：20μL。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
精密称取适量单糖对照品置同一容量瓶中，加入超纯水溶解并稀释至刻度，取单糖溶液适量经过PMP衍生，即得混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取金水宝胶囊适量，通过水提醇沉法得到粗多糖，再加入Sevage试剂除去蛋白后冷冻干燥，得到发酵虫草菌粉多糖，取多糖适量，经酸水解、PMP衍生后即得供试品溶液；
(3)相对校正因子计算
取步骤1制备的混合对照品溶液，分别进样5、10、15、20、25、30μL，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，选择葡萄糖为内标物，分别计算葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子fkm，结果葡萄糖与甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖间的相对校正因子f4/1、f4/2、f4/3、f4/5、f4/6、f4/7、f4/8分别为1.326、0.998、0.883、1.021、1.191、1.27、1.86；
(4)供试品溶液的含量测定
取步骤2制备的供试品溶液，用高效液相色谱测定色谱图，使用相对校正因子计算甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的含量，相对校正因子计算公式为：Wm＝Wk×Am/fkm×Ak，Ak为葡萄糖内标物峰面积，Wk为葡萄糖内标物质量；Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量，fkm为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖的校正因子；
其中，高效液相色谱条件为：
色谱柱：Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲盐溶液(17∶83)；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
检测波长：250nm；
进样量：20μL。
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