CN102495215A - 一种定量检测肿瘤坏死因子α的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了定量检测肿瘤坏死因子α的诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒包含TNF-α磁分离试剂，酶标抗体，增强剂，校准品、控制品，浓缩液以及底物。本发明试剂盒采用免疫磁微粒分离技术与竞争酶联免疫技术结合，具有更高的检测灵敏度和特异性，并且大大缩短了检测时间，可以在10分钟内检测数个生物样本，对于尿液、血清等样本可以不需前处理直接进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及测定一种定量检测肿瘤坏死因子α的诊断试剂盒及其检测方法。
背景技术
肿瘤坏死因子，简称TNF，是由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白。肿瘤坏死因子α(TNF-α)主要由单核一巨噬细胞分泌；TNF-β主要由活化的T淋巴细胞分泌，两者有相似致热性。小剂量呈单峰热，大剂量呈双峰热；TNF在体内外均能刺激IL-1的产生。
人类的TNF-α基因长约2.76kb，小鼠为2.78kb，结构非常相似，均由4个外显子和3个内含子组成，与MHC基因群密切连锁，分别定位于第6对和第17对染色体上。1984年从HL-60、U937等细胞中克隆成功rHu TNF-αcDNA，并在大肠杆菌中获得高表达。人TNF-α前体由233个氨基酸残基组成，含76个氨基酸残基的信号肽，切除信号肽后成熟型TNF-α为157氨基酸残基，非糖基化，第69位和101位两个半胱氨酸形成分子内二硫键。rHu TNF-α分子量为17kDa。成熟的小鼠TNF-α与rMu TNF-α有79％氨基酸组成同源性，TNF-α的生物学作用似无明显的种属特异性。
TNF-α参与了多种体内的生物学过程，能够杀伤或抑制肿瘤细胞，提高中性粒细胞的吞噬能力，抗病毒细菌感染，促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化等。应用TNF-α在***等方面开始临床II期试验，也可与IL-2联合***，目前认为全身用药的疗效不及局部用药，后者如病灶内注射，局部浓度高且副作用也较轻。近年来已采用TNF基因治疗开始对黑素瘤等肿瘤进行临床验证。TNF还与一些临床某些疾病的病变程度有关，例如大骨节病、结肠炎、脑膜炎以及哮喘等等，临床上可通过检测TNF-α等生化指标来分析疾病的发生程度。
过去以放免为代表的检测肿瘤坏死因子的检测试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪80年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。
磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法，抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统ELISA相比具有灵敏度高，检测用时少的优点。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于提供一种定量检测TNF-α的诊断试剂盒及其检测方法，采用该试剂盒进行TNF-α检测具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式。
本发明提供的试剂盒，其包含的试剂有TNF-α磁分离试剂，酶标抗体，增强剂，校准品、控制品，浓缩液以及底物。
所述的磁分离试剂含有标记有TNF-α单克隆抗体的磁性微球。
所述的酶标抗体是含有辣根过氧化物酶标记的TNF-α单克隆抗体。
所述的增强剂是含有Tris的缓冲液。
所述的校准品及控制品是含有一定量的TNF-α抗原的溶液。
所述浓缩液是含有TWEEN-20和Proclin-300的缓冲液。
所述的底物为酶促化学发光底物。
本发明TNF-α的定量检测试剂盒，优选通过如下步骤制备而成：
第一步：磁分离试剂的制备步骤：
1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mgTNF-α单克隆抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；
2、用移液枪吸取步骤1中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
3、将步骤2抗体溶液加入到浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml；
4、取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；
5、每次加入1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤3获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；
6、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟；
7、每次加入1.5ml PH 7.20.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；
8、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方为(均为质量体积比)0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存。
9、将步骤8获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀，即得本发明试剂盒中磁分离试剂；所述磁珠缓冲液为浓度是1mol/L的TRIS-HCl缓冲液。
第二步：酶标抗体制备步骤：
1、2.5mgTNF-α单克隆抗体溶于1.0ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1ml的10mg/ml辣根过氧化物酶水溶液和1.3mg碳化二亚胺，1小时后将1.0ml 20mg/ml的碳化二亚胺加入，混合物不断搅拌，4℃过夜；
2、将步骤1的溶液装入透析袋中，对0.15M的PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；然后加入10ml浓度为15mg/ml的BSA溶液，4℃储存备用；最后将收集到的辣根过氧化物酶与TNF-α单克隆抗体的偶联物用酶标抗体稀释液以1∶1000的体积比混合均匀，即得酶标抗体；所述酶标抗体稀释液为浓度是1mol/L的TRIS-HCl缓冲液。
第三步：增强剂配制步骤：
1、称取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
2、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解调PH，控制PH在7.35-7.45之间；
3、称取Mak330.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤。
第四步：
校准品和控制品的配制：
校准品浓度分别为0.10、0.20、0.40、0.80、1.60ng/ml；控制品浓度分别为0.20、0.80ng/ml。
第五步：
浓缩液配制步骤，配制1L：
1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；
2、称取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；
3、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
4、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
5、调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；
6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得。
第六步：
底物配制步骤，配制1L：
1、称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中；
2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH，控制其范围在7.95-8.05之间；
3、加入250ml Lumi-Phos 530后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。
本发明的主要创新之处在于：
1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。
2、本发明公开了一种新的专用增强剂以及浓缩液，使得反应过程更加稳定可靠，实验数据灵敏有效，可精确到0.01ng，在提高产品性能的同时，并且大大降低了产品成本；
3、本试剂盒中的TNF-α磁分离试剂，酶标抗体，增强剂，校准品、控制品，浓缩液以及底物均是该反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
4、本试剂盒采用免疫磁微粒分离技术与竞争酶联免疫技术结合，与现有技术的试剂盒相比，大大缩短了检测时间，可以在10分钟内检测数个生物样本，对于尿液、血清等样本可以不需前处理直接进行检测。
具体实施方式
实施例1、
一、TNF-α磁分离试剂制备步骤：
1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mgTNF-α单克隆抗体(Santa Cruz公司产品)溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；
2、用移液枪吸取步骤1中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
3、将步骤2的溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml；
4、取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；磁珠为本领域常用磁珠，优选浓度25mg/mL，直径为800nm。
5、每次加入1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤4获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；
6、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟；
7、每次加入1.5ml PH 7.20.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；
8、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方为0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇(均为质量体积比)，4℃保存。
9、将步骤8获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀，即得本发明试剂盒中磁分离试剂；所述磁珠缓冲液为浓度是1mol/L的TRIS-HCl缓冲液。
实施例2
一、酶标抗体的制备步骤：
1、2.5mgTNF-α单克隆抗体溶于1.0ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1ml的10mg/ml辣根过氧化物酶水溶液和1.3mg碳化二亚胺，1小时后将1.0ml 20mg/ml的碳化二亚胺加入，混合物不断搅拌，4℃过夜；
2、将步骤1的溶液装入透析袋中，对0.15M的PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；然后加入10ml浓度为15mg/ml的BSA溶液，4℃储存备用；最后将收集到的辣根过氧化物酶与TNF-α单克隆抗体的偶联物用酶标抗体稀释液以1∶1000的体积比混合均匀，即得酶标抗体；所述酶标抗体稀释液为浓度是1mol/L的TRIS-HCl缓冲液。
实施例3
增强剂配制步骤：
1、称取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
2、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解调PH，控制PH在7.35-7.45之间；
3、称取Mak330.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤。Mak33是罗氏公司的商品化的试剂。
实施例4
校准品和控制品的配制步骤：
1、最高点：最高浓度点为X，目标点浓度为A，B，C，D，E，F，配制V体积的溶液时，需加入原料的体积为分别为：表1
| 浓度 | 加入校准品稀释液体积 | 加入X体积 |
| A | V-A*V/X | A*V/X |
| B | V-B*V/X | B*V/X |
| C | V-C*V/X | C*V/X |
| D | V-D*V/X | D*V/X |
| E | V-E*V/X | E*V/X |
| F | V-F*V/X | F*V/X |
2、TNF-α定量检测试剂盒TNF-α校准品原料(购于Santa Cruz公司)用纯化水配制成浓度点为0.10、0.20、0.40、0.80、1.60ng/ml；控制品用纯化水配制的浓度点为0.20、0.80ng/ml。
3、完全溶解后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。
实施例5：
浓缩液配制步骤：
1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；
2、称取5g Tween-20于100ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
3、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
4、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
5、用HCL或NaOH调PH，测量其范围在7.35-7.45之间；
6、最后定容1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，完全溶解后用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月；
实施例6
底物配制操作步骤：
1、称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中；
2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用HCl或NaOH调PH，测量其范围在7.95-8.05之间；
3、加入250ml Lumi-Phos 530后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。
本发明试剂盒的使用方法如下：
1、加15μl TNF-α校准品、质控品、待测标本至对应试管底部。
2、加25μl酶标抗体至每一试管中。
3、加25μl增强剂至每一试管中。
4、加25μl磁分离试剂至每一试管中。
5、多管混匀器轻轻振荡放有试管的试管架30s后，置37℃水浴30分钟。
6、试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟，然后缓慢的倒转分离器倒出上清液。
7、浓缩液用纯化水稀释10倍后，加100μl稀释后的浓缩液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。
8、加100μl底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
临床试验：
病例：市人民医院临床确诊的支气管哮喘患者56例，男29例，女27例，年龄46-67岁，依据中华医学会呼吸病学分会哮喘组2003年制定的哮喘诊断标准(中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南.中华结核和呼吸杂志，2003年)。
急性发作组(急性期条件：反复发作、喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽病史，支气管舒张实验阳性，符合哮喘急性期的诊断标准)：38例。病情缓解组(缓解期标准：经过治疗或未经治疗症状、体征消失，呼吸道功能恢复到急性发作前水平并维持10天以上)：18例。对照组：均经病史调查、胸部x线摄片、肺功能测定排除忠有肺部疾病可能，所有病例均排除恶性肿瘤、活动性肺结核、风湿性疾病，实验室检查，确认无心血管、呼吸及肝、肾、代谢和内分泌疾病，近近2个月无感染史的健康人群)：18例，男10例，女8例；年龄48-72岁。
用SPSSl0.0统计软件对数据进行处理，所测数据用均数±标准差(X±s)表示，各组血清TNF-a水平，组间比较用t检验；P≤0.05时为差异有统计学意义。
| 组别 | 对照组(ng/ml) | 急性发作组(ng/ml) | 缓解组(ng/ml) |
| TNF-α含量 | 0.178±0.011 | 0.872±0.167 | 0.235±0.049 |
由此证明细胞因子TNF-a在哮喘的病理生理过程中起着十分重要的调节作用。本实验对支气管哮喘患者血清中的TNF-a水平变化较正常对照组和缓解组有了显著性变化，P≤0.05。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种定量检测TNF-α的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含TNF-α磁分离试剂，酶标抗体，增强剂，校准品、控制品，浓缩液以及底物；所述试剂盒按照如下方法制备而成：第一步：TNF-α磁分离试剂的制备步骤：
1)将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mgTNF-α单克隆抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；
2)用移液枪吸取步骤1中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
3)将步骤2获得的溶液加入到浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml；
4)取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；
5)加入步骤3获得的抗体溶液，混匀后室温反应4小时；
6)加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟；
7)加入1.5ml PH 7.20.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清；
8)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方为0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存；
9)将步骤8获得的溶液用磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀，即得试剂盒中磁分离试剂；所述磁珠缓冲液为浓度是1mol/L的TRIS-HCl缓冲液。
第二步：酶标抗体制备步骤：
1)2.5mgTNF-α单克隆抗体溶于1.0ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1ml的10mg/ml辣根过氧化物酶水溶液和1.3mg碳化二亚胺，1小时后将1.0ml 20mg/ml的碳化二亚胺加入，混合物不断搅拌，4℃过夜；
2)将步骤1的溶液装入透析袋中，对0.15M的PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；然后加入10ml浓度为15mg/ml的BSA溶液，4℃储存备用；最后将上述溶液用酶标抗体稀释液以1∶1000的体积比混合均匀，即得酶标抗体；所述酶标抗体稀释液为浓度是1mol/L的TRIS-HCl缓冲液。
第三步：增强剂配制步骤：
1)称取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
2)用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH在7.35-7.45之间；
3)称取Mak330.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤。
第四步：
校准品和控制品的配制：
将TNF-α配制浓度分别为0.10、0.20、0.40、0.80、1.60ng/ml的校准品；将TNF-α配制成浓度分别为0.20、0.80ng/ml的控制品。
第五步：
浓缩液配制步骤，配制1L：
1)称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；
2)称取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；
3)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
4)用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
5)调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；
6)最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得。
第六步：
底物配制步骤，配制1L：
1)称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中；
2)用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH在7.95-8.05之间；
3)加入250ml Lumi-Phos 530后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下：
1)、加15μl TNF-α校准品、TNF-α控制品、待测标本至对应试管底部；
2)、加25μl酶标抗体至每一试管中；
3)、加25μl增强剂至每一试管中；
4)、加25μl磁分离试剂至每一试管中；
5)、用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37℃水浴30分钟；
6)、然后放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟，倒转分离器倒出上清液；
7)、浓缩液用纯化水稀释10倍后，加100μl稀释后的浓缩液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s；
8)、加100μl底物溶液至试管中混匀3秒，发光检测仪检测。
3.如权利要求1或者2所述的试剂盒在诊断疾病中的应用。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102998457A (zh) * | 2012-07-12 | 2013-03-27 | 电子科技大学 | 草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法 |
| CN103823064A (zh) * | 2014-03-03 | 2014-05-28 | 中华人民共和国张家港出入境检验检疫局 | 一种呕吐毒素定量检测试剂盒及其使用方法 |
| CN104198721A (zh) * | 2014-07-28 | 2014-12-10 | 北京润诺思医疗科技有限公司 | 一种高尔基体蛋白73(gp73)抗原硅基磁珠结合物的制备及应用 |
| CN105467137A (zh) * | 2015-11-26 | 2016-04-06 | 北京豪迈生物工程有限公司 | 游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒及其测试方法 |
| CN106918633A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-07-04 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 基于适体和金磁纳米颗粒的细胞因子TNF‑α的检测方法 |
| CN110672857A (zh) * | 2019-10-10 | 2020-01-10 | 四川大学华西第二医院 | 一种TNF-α的高敏Elisa检测试剂盒及其使用方法与应用 |
| CN113552368A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-10-26 | 苏州立禾生物医学工程有限公司 | 肿瘤坏死因子α检测试剂盒及其检测方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101377490A (zh) * | 2007-08-30 | 2009-03-04 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 用于检测疾病相关标志物的磁微粒分离化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
| WO2009117791A2 (en) * | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Katholieke Universiteit Leuven | Mucosal gene signatures |
| CN102016552A (zh) * | 2008-03-05 | 2011-04-13 | 神谷来克斯公司 | 用于分子的高灵敏性检测的方法和组合物 |
-
2011
- 2011-12-06 CN CN201110399728.2A patent/CN102495215B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101377490A (zh) * | 2007-08-30 | 2009-03-04 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 用于检测疾病相关标志物的磁微粒分离化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
| CN102016552A (zh) * | 2008-03-05 | 2011-04-13 | 神谷来克斯公司 | 用于分子的高灵敏性检测的方法和组合物 |
| WO2009117791A2 (en) * | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Katholieke Universiteit Leuven | Mucosal gene signatures |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102998457A (zh) * | 2012-07-12 | 2013-03-27 | 电子科技大学 | 草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法 |
| CN102998457B (zh) * | 2012-07-12 | 2015-08-26 | 电子科技大学 | 草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法 |
| CN103823064A (zh) * | 2014-03-03 | 2014-05-28 | 中华人民共和国张家港出入境检验检疫局 | 一种呕吐毒素定量检测试剂盒及其使用方法 |
| CN103823064B (zh) * | 2014-03-03 | 2016-05-25 | 中华人民共和国张家港出入境检验检疫局 | 一种呕吐毒素定量检测试剂盒及其使用方法 |
| CN104198721A (zh) * | 2014-07-28 | 2014-12-10 | 北京润诺思医疗科技有限公司 | 一种高尔基体蛋白73(gp73)抗原硅基磁珠结合物的制备及应用 |
| CN105467137A (zh) * | 2015-11-26 | 2016-04-06 | 北京豪迈生物工程有限公司 | 游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒及其测试方法 |
| CN106918633A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-07-04 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 基于适体和金磁纳米颗粒的细胞因子TNF‑α的检测方法 |
| CN106918633B (zh) * | 2017-04-24 | 2019-06-25 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 基于适体和金磁纳米颗粒的细胞因子TNF-α的检测方法 |
| CN110672857A (zh) * | 2019-10-10 | 2020-01-10 | 四川大学华西第二医院 | 一种TNF-α的高敏Elisa检测试剂盒及其使用方法与应用 |
| CN113552368A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-10-26 | 苏州立禾生物医学工程有限公司 | 肿瘤坏死因子α检测试剂盒及其检测方法 |
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| GR01 | Patent grant | ||
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Free format text: FORMER OWNER: LI SHOUWEI Effective date: 20150227 Owner name: WUHAN ANNA NANO BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: REN QINGYUAN Effective date: 20150227 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 273400 LINYI, SHANDONG PROVINCE TO: 430000 WUHAN, HUBEI PROVINCE |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150227 Address after: 430000 East Lake Hubei New Technology Development Zone, Wuhan high tech Avenue, No. 666 Wuhan national biological industry base project B, C, D District R & D building B1 Patentee after: An Wuhan nano Biological Technology Co., Ltd. Address before: 273400 Department of clinical laboratory, Feixian County people's Hospital, 71 health Road, Shandong, Linyi, Feixian County Patentee before: Ren Qingyuan Patentee before: Li Shouwei |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20181221 Address after: 430000 East Lake New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province Patentee after: Wuhan Kersi Biotechnology Co., Ltd. Address before: 430000 Development Building B1 of Wuhan National Biological Industrial Base Project B, C and D, 666 High-tech Avenue, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province Patentee before: An Wuhan nano Biological Technology Co., Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140122 Termination date: 20201206 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |