CN101320041B - 一种快速定量检测c-反应蛋白的胶体金法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明克服了常规C-反应蛋白(CRP)定量检测方法不适合单人份测试、检测时间较长等缺点，提供了一种快速、简便、准确的快速定量检测C—反应蛋白的胶体金法。反应原理为固相双抗体夹心法的金标免疫斑点渗滤试验，待测样品经40—480倍稀释后与免疫胶体金在液相均质介质中混和均匀，再转加到反应板上，其中所含的、已与免疫胶体金在一起的待测物能为膜上固定的抗待测物另一决定簇的单抗或多抗特异性地捕获，呈红色斑点，斑点色泽与样品中CRP浓度呈正比。

Description

一种快速定量检测C-反应蛋白的胶体金法及其应用

技术领域

本发明属于临床免疫学检测领域，具体涉及一种快速定量检测C—反应蛋白的胶体金法及其在诊断试剂盒制备中的应用。

背景技术

C反应蛋白(CRP)是一种能和肺炎链球菌的荚膜C多糖结合，由Tillett and Francis(1930)发现并由Abernethy and Avery(1941)得到研究，CRP是由5个相同的亚单位(23KD)以非共价链聚集形成的环状五聚体蛋白，分子量为115KD，是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎性刺激时肝细胞合成的急性时相蛋白。在炎症开始数小时CRP就升高，随着组织结构和功能的复原其含量恢复正常。因此，CRP的测定对病程监测、治疗效果判断和预后评价有重大意义。

健康人无感染时的CRP水平还可预测将来心肌梗塞及中风的危险性。健康人CRP参考范围的中位数基本为0.58—1.13mg/L.CRP含量>2.1mg/L的人，比较CRP含量≤1mg/L者，将来发生心肌梗塞的危险性为后者的2.9倍；发生缺血性中风的危险性为后者的1.9倍；发生外周动脉血管性疾病的危险性为后者的4.1倍。CRP与血脂(总胆固醇，总胆固醇：高密度脂蛋白胆固醇的比值)的联合测定，较其他的危险因子更能预示发生心、脑血管疾病的危险性，是目前进行冠心病危险评估的最佳模型。

免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这种方法由于快速、简便、准确和无污染等优点，在检测抗原、抗体中得到了广泛使用。免疫胶体金在医学检验中最常使用的有二个方法：1)免疫胶体金斑点渗滤试验2)免疫胶体金层析试验。免疫胶体金斑点渗滤技术快速又简便，广受欢迎，但要测定结果非常敏感、非常可重复，免疫胶体金与样品中待测物之间的呈色标记反应在均相介质中进行，使反应充分，才能使测定结果更敏感、重复性更好。这在免疫胶体金斑点渗滤定量检测中尤为重要，是发展敏感度和准确性更好的金标法快速斑点渗滤定量检测诊断试剂盒的前提。

C-反应蛋白在人体细菌感染的早期就迅速产生，是细菌感染性疾病诊断的敏感指标，在国外广泛应用于早期的细菌感染性疾病的诊断，但需要昂贵的仪器和配套试剂，测定往往在中心实验室进行，不能立等结果。近年国际上已有商品化免疫胶体金斑点渗滤定量检测试剂盒供应，较有代表性的是挪威Axis-Shield公司生产的NycoCard C反应蛋白定量试剂盒。挪威Axis-Shield公司生产的NycoCard C反应蛋白定量试剂盒将稀释样品直接加在反应小盒中，样品中待测物和膜上致敏配基先起免疫反应，被捕获在膜上的待测物和随后加在膜上的免疫胶体金再起呈色标记反应。这样的反应模式导致免疫胶体金与待测物之间的呈色标记反应只在免疫胶体金试剂流经膜上时瞬间进行，缺点是反应均相性差、反应时间短(NycoCard1114365.Ed.581 July 2001)。

本发明采用样品与胶体金在试管内反应后再加入反应板的新斑点渗滤试验操作方法，由于样品与胶体金在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高反应灵敏度，增加样品稀释倍数，去除样品介质效应，使定量结果有很好的可重复性，而且此方法省略了直接加样步骤，提高了定量结果的精密度和准确度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是克服常规C-反应蛋白检测方法不适合单人份测试、检测时间较长、反应均相性差的缺点，提供了一种快速、简便、准确的快速定量检测C—反应蛋白的胶体金法。

本发明提供的快速定量检测C—反应蛋白的胶体金法，其反应原理为固相双抗体夹心法的金标免疫斑点渗滤法，待测样品经40—480倍稀释后与适当比例的免疫胶体金在液相均质介质中充分混和均匀并起专一性呈色标记反应，在此过程中样品中的待测物能专一性地与胶体金抗此待测物单抗缀合物充分结合，然后再转加到反应板上，流经反应板中的硝基纤维素膜时，其中所含的、已反应结合在一起的待测物—抗待测呈色复合物能为膜上固定的抗待测物另一侧决定簇的单抗或多抗特异性地捕获，呈红色斑点(固定在膜上的抗待测物单抗或多抗与缀合胶体金的抗待测物单抗是二株不同的抗体，有不同的结合位点)，斑点红色强度可用仪器定量测试，它与样品中CRP浓度呈正比。

具体包括如下步骤：

1.从冷藏处取出抗CRP金标液冻干品，室温至少平衡半小时，在抗CRP金标液冻干品中，准确加入标贴或说明书中规定体积的冻干品复溶液摇匀。

2.吸取复溶后的金标液，加入空的反应管；

3.待测样品加入样品稀释液进行40—480倍稀释，充分混匀。

4.将反应板平放于实验台上，于反应孔内滴加2滴封闭液，待完全渗入；

5.吸取稀释样品到反应管金标液中，充分混匀后立刻将反应混合物全部加入到封闭后的反应板孔中；

6.待完全渗入后，加入4滴洗涤液；

7.待洗涤液完全渗入后，于5分钟内在U2金标定量仪CRP项目下测读CRP值。

冷冻干燥抗CRP免疫胶体金和反应板的制备：按吕绳凯等介绍的方法(中华微生物学和免疫学杂志，13(2)：125，1993；上海医学检验杂志，5(1)：62，1990)制备胶体金和抗CRP免疫胶体金缀合物。但包被胶体金的是纯化CRP单抗，0.15mgCRP单抗用于包被10ml胶体金，2500ml胶体金在包被离心洗涤后，最终以pH7.4，0.01mol/L磷酸盐缓冲液恢复到1500ml抗CRP免疫胶体金应用液，缓冲液含1％BSA、0.5mg/ml PEG 20M、0.1％叠氮钠。冷冻干燥预冷温度-38℃，最高升温30℃，抽真空时间20小时，瓶分装量按需设定，但液体厚度不超过1cm(本公司冻干胶体金制备发明专利ZL 2004 1 00180513)。包被反应板上硝基纤维膜的是针对不同反应决定簇的另一纯化CRP单抗，浓度1mg/ml，点样量3ul/点，点样用的稀释CRP单抗稀释液是20mM/L醋酸盐缓冲液，pH4.0，内含3％乙醇，反应板是胶体金定量检测板(本公司中国外观设计专利，专利号：ZL 033435278)。

反应板点样用的稀释CRP单抗或多抗纯化物指定稀释液是20mM/L以下的甘氨酸-HCl或醋酸盐缓冲液，pH2.4—6.0，内含3％乙醇。样品稀释液是甘氨酸一NaOH缓冲液，离子强度20-200mM/L，pH7.0-8.0，确保样品中的CRP与免疫胶体金在混匀后、加入反应板前快速地完全反应。

本发明的液相反应方法与常规金标免疫渗滤法的比较见表1

表1  液相反应操作模式与常规金标免疫渗滤法的比较

根据本发明提供的快速定量检测C—反应蛋白的胶体金法制备成C-反应蛋白快速定量试剂盒(胶体金法)。所制备的试剂盒CRP-DOT在U2仪上测读与同类进口试剂盒NycoCard比较结果见表2：

表2  CRTP-DOT试剂盒与同类进口试剂盒NycoCard比较

所制备的CRP-DOT试剂盒在瑞金医院与国际著名的进口IMMAGE BECKMAN COULTER仪器及配套C-reaction protein reagent定量试剂盒(批号M606025)做平行比较测定的结果如图1所示。

Beckman仪器和配套微颗粒胶乳免疫浊度CRP定量测定试剂盒是很高级的进口仪器和原装试剂盒，价格昂贵，一般只有大医院中心实验室才有配置，其精度和结果公认可靠。由图1显示可知本发明的试剂盒测定结果与Beckman仪器和配套微颗粒胶乳免疫浊度CRP定量测定试剂盒测定的结果相关系数为0.9752，相关性很好。

本发明可以在人体发生疾病时医生当场可获CRP测定结果，能快速判断病人有否细菌感染，是否需抗生素治疗，从而更有针对性地对病人进行有效处理，缩短治愈时间，减低医疗费用。

附图说明

图1CRP-DOT和Beckman CRP定量的结果对比；

图2CRP-DOT在U2上的标准曲线图。Tn是U2仪器原始测定值

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实例1使用二个单抗的CRP金标法快速定量检测试剂的制备

1.冷冻干燥抗CRP免疫胶体金和反应板的制备：按吕绳凯等介绍的方法(中华微生物学和免疫学杂志，13(2)：125，1993；上海医学检验杂志，5(1)：62，1990)制备胶体金和抗CRP免疫胶体金缀合物。但包被胶体金的是纯化CRP单抗，0.15mgCRP单抗用于包被10ml胶体金，2500ml胶体金在包被离心洗涤后，最终以pH7.4，0.01mol/L磷酸盐缓冲液恢复到1500ml抗CRP免疫胶体金应用液，缓冲液含1％BSA、0.5mg/ml PEG 20M、0.1％叠氮钠。冷冻干燥预冷温度-35℃，最高升温30℃，抽真空时间20小时，瓶分装量按需设定，但液体厚度不超过1cm(本公司冻干胶体金制备发明专利ZL 2004 1 00180513)。包被反应板上硝基纤维膜的是针对另一反应决定簇的另一纯化CRP单抗，浓度1mg/ml，点样量3ul/点，点样用的稀释CRP单抗稀释液是20mM/L醋酸盐缓冲液，pH4.0，内含3％乙醇，反应板是胶体金定量检测板(本公司中国外观设计专利，专利号：ZL 033435278)。

2.样品稀释液的制备：样品稀释液按以下配方制备，PH7.4~7.6。

3.冻干胶体金恢复液：含0.5mg NaN3/ml纯净水。

4.洗涤液制备：pH7.6

5.封闭液制备：pH7.4~7.6、50mM PBS、含1％BSA(小牛血清白蛋白)。

纯化CRP单抗购自芬兰Medix Biochemica公司。

测试方法采用本发明所述的稀释样品与胶体金在试管内反应后再加入反应板的斑点渗滤试验液相反应操作模式，测试CRP标准品(参照国际标准CRM470)，U2在出厂前输入各CRP标准品浓度测定值(见图2)，固定贮存于U2仪器，医院立即可用U2做样品的定量测试。

实例2 CRP胶体金法快速定量检测方法

1.从冷藏处取出试剂，室温至少平衡半小时，在抗CRP金标液冻干品中，准确加入CRP冻干品复溶液1.1ml摇匀。

2.使用清洁吸头吸取100μl复溶后的CRP金标液，加入空的反应管，该吸头只吸CRP金标液，防止任何污染。

3.将CRP反应板平放于实验台上，于反应孔内滴加2滴CRP封闭液，待完全渗入

4.新鲜血清样品不需要预处理，冰冻或4~8℃存储多日的血清离心后取上清使用；精确吸取10μl血清加入CRP稀释管(稀释液体积见瓶贴，稀释倍数一般不低于1:160)，充分混匀。

5.吸取100μl稀释样品到反应管100μl CRP金标液中，充分混匀(移液器反覆吸注10次必能混匀)，立刻将混匀物全部加入到封闭后的CRP反应板孔中。

6.待完全渗入后，加入4滴CRP洗涤液

7.待洗涤液完全渗入后，于5分钟内在U2金标定量仪CRP项目下测读CRP值。

8.Upper Gold U-2金标法定量读数仪按该仪器说明书操作。

Claims (3)

1.一种非诊断目的的快速定量检测C－反应蛋白CRP的胶体金法，其特征在于：待测样品经40－480倍稀释后与适当比例的抗C－反应蛋白的免疫胶体金在液相均质介质中充分混和均匀，再转加到反应板上,其中，所述的反应板中包被反应板上硝基纤维膜的是针对与缀合胶体金的抗C－反应蛋白的单抗不同反应决定簇的另一纯化CRP单抗；具体包括下列步骤：

（1）从冷藏处取出抗CRP金标液冻干品，室温至少平衡半小时，在抗CRP金标液冻干品中，准确加入规定体积的冻干品复溶液摇匀；所述复溶液为含0.5mg NaN₃/ml纯净水；所述的抗CRP金标液中包被胶体金的是纯化CRP单抗；

（2）吸取复溶后的金标液，加入空的反应管；

（3）待测样品加入样品稀释液进行40－480倍稀释，充分混匀；所述稀释液为甘氨酸-NaOH缓冲液，离子强度20-200mM/L，pH 7.0-8.0；

（4）将反应板平放于实验台上，于反应孔内滴加封闭液，待完全渗入；所述封闭液为50mMPBS，含1%BSA小牛血清白蛋白，pH7.4－7.6；

（5）吸取稀释样品到反应管金标液中，充分混匀后将反应混合物全部加入到封闭后的反应板孔中；

（6）待完全渗入后，加入洗涤液；所述洗涤液为0.01M PBS溶液1000ml,含Tween-20 1ml，NaN₃ 1.5g，pH7.6；

（7）待洗涤液完全渗入后，测读CRP值。

2.如权利要求1所述的一种非诊断目的的快速定量检测CRP的胶体金法，其特征在于：步骤（3）中的甘氨酸-NaOH缓冲液pH 7.4-7.6。

3.如权利要求1所述的一种非诊断目的的快速定量检测CRP的胶体金法，其特征在于：步骤（3）中待测样品加入样品稀释液进行160倍稀释。