CN102482690A - 生物产物生产的集成***和方法 - Google Patents

Abstract

提供用于诸如生物燃料的生物产物的生产的方法和***。生物产物生产方法和***利用含碳水化合物的进料的预处理来产生可溶性糖分子而且通过固定的发酵微生物使预处理的进料向生物产物连续转化。

Description

生物产物生产的集成***和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年6月26日提交的美国临时申请第61/221,007号、2009年6月29日提交的美国临时申请第61/221,474号和2009年10月13日提交的美国临时申请第61/278,932号的权益，所有这些通过引用其全文并入本文。

发明领域

本发明涉及以连续微生物发酵方法生产诸如生物丁醇的生物产物。

背景

丁醇是高质量的燃料和燃料添加剂。丁醇能够与汽油一起被混合、储存并且运输。每加仑丁醇比乙醇具有更高的能量，对消费者来说使用丁醇掺合物带来更好的燃料经济性，并且具有比乙醇更低的蒸汽压，其带来更低的地面污染。丁醇的低蒸汽压使其成为用于遵守严格的蒸汽压规范使用的精炼机的引人注意的低挥发性、氧化的、掺合成分。丁醇能够在可能的较低成本下提供乙醇的氧化效果而没有过度的蒸发排放，该排放是空气污染的显著来源。丁醇也比乙醇更疏水，即其具有更高的排斥水的趋势，且更适于与汽油掺合。照此，丁醇应该作为氧化混调型精制汽油(Reformulated Gasoline Blendstock for Oxygenate Blending，RBOB)和加利福尼亚(CARBOB)燃料掺合料的高度期望的成分。丁醇也被预期具有缩短的生命周期CO₂排放。丁醇掺合物应该对现代燃料***弹性体不具有有害作用，并且具有预期与汽油相似的腐蚀性和电导率。

丁醇也能够以超过20％的浓度与柴油燃料掺合。向柴油燃料中添加充氧剂的益处包括减少烟尘形成、CO、未燃烧的碳氢化合物的排放。重要的是，向柴油燃料添加足够浓度以实现这些益处的丁醇，保留了无充氧剂的柴油燃料的可燃性等级(闪点)。这对调配和实施有显著的益处。

丁醇也被广泛地用作工业化学品。丁醇在油漆、增塑剂和杀虫剂的生产中使用，作为配料在隐形眼镜清洁剂、胶合剂和织物中以及作为香料在糖果和冰淇淋中使用。2006年正丁醇(n-butanol)的全球市场近10亿加仑；美国市场近3亿加仑，并且预期以每年近2％增长。

目前丁醇主要由石油制成。生产成本高而利润低，并且价格趋势一般跟随油价并严重受到全球经济增长的影响。

存在对改进丁醇生产方法的需求。尤其，令人期待的是用于环境相容地、节约成本地、以及节约能源地生产丁醇的方法。

发明概述

提供用于生物产物生产的方法和***。

一方面，提供用于生产生物产物的方法，包括在含碳水化合物材料的水解进料存在下连续发酵微生物。微生物被固定在生物反应器中的支持物上。水解进料通过进料的水解产生，其产生用作微生物发酵碳源的碳水化合物分子。微生物使水解进料连续地转化为生物产物。在一些实施方案中，进料在生物反应器上游连续地水解并且生成的水解进料在发酵持续期间被连续地供给到生物反应器。在一种实施方案中，生物产物是生物燃料(如，丁醇、丙酮、乙醇)。在其它实施方案中，生物产物是生化产物或生化进料，即可如经由化学合成被衍生化或转化为另一产物的生化产物。在一些实施方案中，生物产物是溶剂、生物分子、有机酸、醇、维生素、脂肪酸、醛、脂、长链有机分子或糖醇。

在一些实施方案中，水解进料被连续供给到平行或串联布置的多个生物反应器，发酵连续发生在多个生物反应器中，并且多个生物反应器包含相同的或不同的微生物。在一种实施方案中，水解进料被连续供给到平行布置的多个生物反应器，发酵连续发生在多个生物反应器中，并且多个生物反应器包含相同的或不同的微生物。在另一实施方案中，发酵连续发生在串联布置的多个生物反应器中，水解进料被连续供给到该串联中的第一生物反应器，并且来自每个生物反应器的流出物被供给到该串联中下游的下一个生物反应器。在一些实施方案中，逸出的气体可在生物反应器的操作期间在串联节点之间去除。

在一种实施方案中，生物反应器以混合串联/平行布置的平行列布置。例如，发酵可在组合布置以优化生产率的多个生物反应器中进行，诸如初级反应器与平行反应器列串联布置，并且水解进料被连续地供给到该串联中的第一生物反应器并且来自每个生物反应器的流出物被供给到该串联中下游的下一个生物反应器。

在一种实施方案中，发酵的持续时间为至少约300小时。在另一实施方案中，发酵的持续时间为至少约1000小时。

在一些实施方案中，进料是纤维素材料，例如，木质纤维素材料。在一些实施方案中，进料包含纤维素和半纤维素，如木质纤维素材料或木浆。在一些实施方案中，进料是选自软木、硬木或其组合的木材。在一些实施方案中，进料是木片、锯屑、锯木厂废料或其组合形式的木质纤维素材料。在一些实施方案中，木质纤维素材料(如木片、锯屑、锯木厂废料或其组合)来自在生长和/或收获生产期中已遭受一些形式的病害或感染的进料来源。在一种实施方案中，进料来源是感染山松甲虫(mountain pine beetle)的松木。在另一实施方案中，进料来源是感染突发性橡树死亡综合征(sudden oak death syndrome)的橡木，如禾叶栎(coastal live oak)、鞣皮栎(tanoak)等。在另一实施方案中，进料来源是感染荷兰榆树病(Dutchelm disease)的榆木。在其它实施方案中，进料来源是已被干旱或火灾损坏的木质纤维素材料。

在一些实施方案中，木质纤维素进料材料在水解之前解构。解构可包括选自预汽蒸、机械碾磨和机械***(mechanical explosion)的一种或多种工艺。在一些实施方案中，进料材料在收获之前通过天然或非天然环境条件，例如干旱、感染、火灾和/或除草剂暴露来解构。在一些实施方案中，进料材料可被病害生物体解构，例如山松甲虫解构松木、突发性橡树死亡综合征解构橡木、或者荷兰榆树病解构榆木。在一些实施方案中，木质纤维素进料材料被预处理以去除提取物(extractives)。提取物去除预处理可包括压缩(compression)、水提取、溶剂提取、碱提取、酶处理、真菌处理、氧处理或空气干燥。在一些实施方案中，用以去除提取物的预处理可发生在解构之前，或者连同解构一起发生。

在一些实施方案中，诸如木质纤维素进料的进料的水解，通过用酸处理施行。在一些实施方案中，该酸包括硝酸、甲酸、醋酸、磷酸、盐酸、或硫酸、或其组合。在一种实施方案中，水解用硝酸施行。在另一实施方案中，水解用硝酸和醋酸的组合施行。在一些实施方案中，进料包含乙酰基并释放醋酸，致使半纤维素自动水解，其可继而释放更多醋酸。该自动水解可通过矿物酸的添加来补充，或者进料水解所需要的矿物酸的量可通过“平衡(leveraging)”进料中天然乙酰基的含量而减少。

在一些实施方案中，木质纤维素进料的水解在包括第一阶段和第二阶段的工艺中用硝酸施行，并且第二阶段水解在高于第一阶段的温度施行。在一些实施方案中，在第二阶段中以更高的温度施行水解降低或阻止期望的中间产物(如，单体的糖分子)的降解。在一些实施方案中，选择第一阶段的条件以达到进料中至少约70％的半纤维素水解，并且选择第二阶段条件以达到进料中至少约40％的纤维素水解。在一些实施方案中，该进料为硬木，第一阶段水解产物包括至少约60％的5-碳糖和至少约25％的6-碳糖，并且第二阶段水解产物包括至少80％的6-碳糖。在一些实施方案中，进料为软木，第一阶段水解产物包括至少约20％的5-碳糖和至少约70％的6-碳糖，并且第二阶段水解产物包括至少90％的6-碳糖。

在一些实施方案中，木质素在木质纤维素进料的水解的如第二阶段的最终阶段的残留物中回收。在一种实施方案中，含木质素的残留物被干燥到液体含量为约15％或更低。在一些实施方案中，含木质素的残留物被干燥到液体含量为约35％至约15％，如，约35％、30％、25％、20％、或15％、或约35％至约30％、约30％至约25％、约25％至约20％、或约20％至约15％的任一种。在一种实施方案中，含木质素的残留物被用作所述方法的能量来源。在一种实施方案中，含木质素的残留物被用作发电的燃料来源。在一些实施方案中，含木质素的残留物被用作诸如酚醛树脂的有用的产物生产的化学前体。在一些实施方案中，含木质素的残留物被用作厌氧消化器的供料，该厌氧消化器用于诸如甲烷或合成气(CO+CH₄)的有用的气体产物的生产。在一些实施方案中，含木质素的残留物被用作土壤改良剂。

在一些实施方案中，如木质纤维素进料的进料的水解用如硝酸的酸以包括第一和第二阶段的多个阶段施行，并且如第一和第二阶段水解产物的多个阶段水解产物在引入到生物反应器中之前合并。在其它实施方案中，如第一和第二阶段水解产物的多个阶段水解产物作为单独的水解进料流被引入到单独的生物反应器中。例如，第一阶段水解产物被引入到第一生物反应器中且第二阶段水解产物被引入到第二生物反应器中，其中第一和第二的生物反应器包含相同的或不同的微生物。在一种实施方案中，第一生物反应器包括第一微生物而第二生物反应器包括第二微生物，第一和第二微生物是不同的，第一微生物被优化以在第一阶段水解产物上生长和/或生产生物产物，第二微生物被优化以在第二阶段水解产物上生长和/或生产生物产物。在一些实施方案中，该方法包括串联的多个第一生物反应器和/或串联的多个第二生物反应器。

在一些实施方案中，如木质纤维素进料的进料的水解用如硝酸的酸以包括第一阶段和第二阶段的多个阶段施行，第一阶段水解发生在第一水解模块中且第二阶段水解发生在第二水解模块中，生成的第二阶段水解产物被再次引入到第一水解模块中以产生第三水解产物，并且第三水解产物中可溶性糖分子的量大于第二阶段水解产物中可溶性糖分子的量。

在一些实施方案中，如木质纤维素进料的进料的水解用如硝酸的酸以包括第一阶段和第二阶段的多个阶段施行，闪蒸蒸汽在第一阶段水解中生成，并且闪蒸蒸汽被用于在水解之前解构进料。在一些实施方案中，闪蒸蒸汽在第二阶段水解中生成，闪蒸蒸汽被用于在水解之前解构所述进料和/或为第一阶段水解提供能量。在一些实施方案中，闪蒸蒸汽在第二阶段水解中生成，闪蒸蒸汽被再压缩，再压缩的蒸汽被用于为第一阶段水解和/或其它应用提供能量，其它应用诸如，例如，用于产物纯化的下游蒸馏工艺，诸如汽提蒸馏。在一些实施方案中，闪蒸蒸汽在第二阶段水解中生成，闪蒸蒸汽被用于为第三阶段水解提供能量，第三阶段水解的温度低于第二阶段水解的温度，并且较低的温度比在较高温度下施行的水解允许较少降解的剩余的寡聚糖分子的水解。

在一些实施方案中，在水解进料被引入到生物反应器之前，调节水解进料以去除微生物生长和/或如生物燃料例如丁醇的生物产物生产的抑制剂，并且调节工艺在发酵持续期间连续发生。在一些实施方案中，抑制剂的去除包括选自石灰过中和(overliming)、吸附、沉淀和离子交换的一种或多种工艺。在一种实施方案中，抑制剂的去除是通过在使得抑制剂保持在树脂上的条件下使水解进料接触离子交换树脂施行的。在一种实施方案中，离子交换树脂是阴离子交换树脂。在一种实施方案中，抑制剂的去除是通过用诸如铝盐或铁盐的例如硫酸铝或氯化铁的金属盐沉淀施行的。在一些实施方案中，抑制剂包括有机酸、呋喃、酚，可溶性木质纤维素材料、提取物、和/或酮。

在一些实施方案中，固定微生物的发酵是在厌氧条件下实施的。在一种实施方案中，该微生物是梭菌属(Clostridium)菌株。在一些实施方案中，该梭菌属菌株来自于选自糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的物种。在一些实施方案中，梭菌属菌株是环境分离株或者来自环境分离株。在一些实施方案中，梭菌属菌株相对于在同样条件下生长的该梭菌属菌株所来自的野生型菌株或亲本菌株，或糖丁酸梭菌B643、糖丁酸梭菌P262、糖乙酸多丁醇梭菌N1-4、丙酮丁醇梭菌824或拜氏梭菌8524具有选自以下的一种或多种表型特征：丁醇耐受性、对发酵抑制剂的耐受性、低酸积累、连续发酵中的稳定性、高丁醇滴度、以高的丁醇丙酮比生产生物燃料、增加的每单位进料的丁醇产量、增加的每单位细胞生物质的丁醇产量、增加的氧耐受性、增加的粘附于固体支持物的能力和降低的产孢能力。

在一些实施方案中，在其上固定微生物的支持物材料选自骨炭、聚丙烯、钢、硅藻土、沸石、陶瓷、工程热塑料、粘土砖、混凝土、熔岩、木片、聚酯纤维、玻璃珠、特氟龙(Teflon)、聚醚醚酮和聚乙烯。

在一些实施方案中，固定的微生物包括生物膜(biofilm)。

在一些实施方案中，固定的微生物在其中生长的生物反应器是填充床、膨胀床或流化床的形式。

在一些实施方案中，在方法中生产的生物产物包括生物燃料，诸如丁醇、丙酮、乙醇或其组合。在一种实施方案中，生物燃料包括丁醇。在一种实施方案中，丁醇由梭菌属菌株产生。

在一些实施方案中，该方法还包括从发酵培养基回收诸如生物燃料的生物产物。在一些实施方案中，该回收工艺在发酵持续期间连续运行。在一些实施方案中，该回收工艺包括生物产物的浓缩。在一种实施方案中，生物产物的浓缩包括机械蒸汽再压缩。

在一些实施方案中，该方法还包括蒸馏以使如生物燃料诸如丁醇的生物产物与发酵培养基的其它成分分离。在一种实施方案中，在进料水解期间生成的闪蒸蒸汽为蒸馏提供能量。在一种实施方案中，在蒸馏中回收丁酸，该丁酸被添加到生物反应器中的发酵培养基，并且生物反应器中的微生物使丁酸转换为丁醇。在一种实施方案中，该生物产物是丁醇，在蒸馏中回收丁酸，丁酸再循环回到生物反应器中的发酵培养基，并且生物反应器中的微生物使丁酸转化为丁醇。

在一些实施方案中，如木质纤维素进料的进料的水解用如硝酸的酸以包括第一阶段和第二阶段的多个阶段施行，第二阶段水解在比第一阶段高的温度下施行，闪蒸蒸汽在第二阶段水解中生成，闪蒸蒸汽被再压缩，并且再压缩的蒸汽被用于为蒸馏提供能量。在一些实施方案中，闪蒸蒸汽在第二阶段水解中生成，任选地被再压缩，并且用于为预热至蒸馏的供给流提供能量。在一些实施方案中，闪蒸蒸汽在第二阶段水解中产生，被再压缩，并且用于为蒸馏中分离的产物的干燥和/或脱水提供能量。

另一方面，提供用于生物产物生产的***。该***包括进料水解单元和生物反应器。含碳的进料在水解单元中被水解。水解进料被连续地供给到生物反应器中的微生物生长培养基，生物反应器包含被固定在支持物上的发酵微生物。在一些实施方案中，进料水解单元和生物反应器流体连通，水解单元在生物反应器的上游，并且在发酵持续期间进料连续地水解和连续地供给到生物反应器。进料的水解产生用作发酵的碳源的碳水化合物分子，并且微生物使水解进料连续地转化为生物产物。在一种实施方案中，生物产物是生物燃料(如，丁醇、丙酮、乙醇)。在其它实施方案中，生物产物是生化产物或生化进料，即，可如经由化学合成被衍生化或转化成另一产物的生化产物。在一些实施方案中，生物产物是溶剂、生物分子、有机酸、醇、维生素、脂肪酸、醛、脂、长链有机分子或糖醇。

在一些实施方案中，***包含平行布置的多个生物反应器，多个生物反应器与水解单元流体连通，水解进料被连续地供给到生物反应器，微生物的发酵在生物反应器中连续地发生，并且多个生物反应器包含相同的或不同的微生物。

在一些实施方案中，***包含串联布置的多个生物反应器，串联中的第一生物反应器与水解单元并与下游生物反应器流体连通，第一生物反应器下游的串联中的每个随后的生物反应器与串联中上游的上一个生物反应器流体连通，水解进料被连续地供给到串联中的第一生物反应器，并且来自每个生物反应器的流出物被供给到串联中下游的下一个生物反应器。在一些实施方案中，逸出的气体可在生物反应器的操作期间在串联节点之间去除。

在一种实施方案中，生物反应器以混合串联/平行布置中的平行列布置。例如，发酵可在组合布置以优化生产率的多个生物反应器中进行，诸如初级反应器与平行反应器列一起串联布置，并且水解进料被连续地供给到该串联中的第一生物反应器并且来自每个生物反应器的流出物被供给到该串联中下游的下一个生物反应器。

在一种实施方案中，连续的水解和发酵以及任选地调节和/或产物回收，在***中连续地操作至少约300小时。在另一实施方案中，连续的水解和发酵在***中连续地操作至少约1000小时。

在一些实施方案中，进料是纤维素材料，例如，木质纤维素材料。在一些实施方案中，进料是选自软木、硬木或其组合的木材。在一些实施方案中，进料是木片、锯屑、锯木厂废料或其组合形式的木质纤维素材料。在一些实施方案中，木质纤维素材料(如木片、锯屑、锯木厂废料或其组合)来自在生长和/或收获生产期中已遭受一些形式的病害的进料来源。在一种实施方案中，进料来源是感染山松甲虫的松木。在另一实施方案中，进料来源是感染突发性橡树死亡综合征的橡木，如禾叶栎、鞣皮栎等。在另一实施方案中，进料来源是感染荷兰榆树病的榆木。在其它实施方案中，进料来源是已被干旱或火灾损坏的木质纤维素材料。

在一些实施方案中，木质纤维素进料材料在水解之前解构。解构可包括选自预汽蒸、机械碾磨和机械***的一种或多种工艺。在一些实施方案中，进料材料在收获之前通过例如干旱、感染、火灾和/或除草剂暴露的天然或非天然环境条件来解构。在一些实施方案中，进料材料可被病害生物体解构，例如山松甲虫解构松木。

在一些实施方案中，木质纤维素进料材料被预处理以去除提取物。提取物去除预处理可包括压缩、水提取、溶剂提取、碱提取、酶处理、真菌处理、氧处理或空气干燥。在一些实施方案中，用以去除提取物的预处理可发生在解构之前，或者连同解构一起发生。

在一些实施方案中，诸如木质纤维素进料的进料的水解，通过用酸处理施行。在一些实施方案中，该酸包括硝酸、甲酸、醋酸、磷酸、盐酸或硫酸、或其组合。在一种实施方案中，水解用硝酸施行。在另一实施方案中，水解用硝酸和醋酸的组合施行。在一种实施方案中，水解用硝酸施行，并且水解反应器包含不锈钢。在一些实施方案中，水解反应器包含哈斯特合金(hastelloy)或锆。在一些实施方案中，水解以多个阶段在相同的或不同的水解反应器模块中施行。

在一些实施方案中，水解单元包含第一水解模块和第二水解模块，如木质纤维素进料的进料的如硝酸的酸水解以多个阶段施行，该多个阶段包括在第一水解模块中的第一阶段和在第二水解模块中的第二阶段，并且第一水解模块中的硝酸的温度高于第二水解模块中硝酸的温度。

在一些实施方案中，来自第二水解模块的水解产物流被再次引入到第一水解模块中以产生第三水解产物，在第三水解产物中产生的可溶性糖分子的量大于在第二阶段水解产物中的可溶性糖分子的量。

在一些实施方案中，来自如第一和第二水解模块的多个水解模块的水解产物流在引入到生物反应器中之前合并。

在其它实施方案中，来自如第一和第二水解模块的多个水解模块的水解产物流作为单独的水解进料流被引入到单独的生物反应器中，例如第一阶段水解产物被引入到第一生物反应器中且第二阶段水解产物被引入到第二生物反应器中，并且第一和第二的生物反应器包含相同的或不同的微生物。在一种实施方案中，第一生物反应器包含第一微生物而第二生物反应器包含第二微生物，第一和第二微生物是不同的，并且第一微生物被优化以在第一阶段水解产物上生长且第二微生物被优化以在第二阶段水解产物上生长。

在一些实施方案中，***包含串联的多个第一生物反应器和/或串联的多个第二生物反应器。

在一些实施方案中，如木质纤维素进料的进料的水解用如硝酸的酸以包括第一阶段和第二阶段的多个阶段施行，闪蒸蒸汽在第一阶段水解中生成，并且向进料提供闪蒸蒸汽以在水解之前解构进料。在一些实施方案中，闪蒸蒸汽在第二阶段水解中生成，并且向进料提供闪蒸蒸汽以在水解之前解构进料和/或向第一水解模块提供闪蒸蒸汽以为第一阶段水解提供能量。在一些实施方案中，闪蒸蒸汽在第二阶段水解中生成，闪蒸蒸汽被再压缩，向第一水解模块提供再压缩的蒸汽以为第一阶段水解和/或其它应用提供能量，其它应用诸如，例如，汽提蒸馏。在一些实施方案中，闪蒸蒸汽在第二阶段水解中生成，向第三水解模块提供闪蒸蒸汽以为第三阶段水解提供能量，第三水解模块中的温度低于第二水解模块中的温度，并且较低的温度比在较高温度下施行的水解允许较少降解的剩余的寡聚糖分子的水解。

在一些实施方案中，***还包括与水解单元和生物反应器二者流体连通的调节单元，该调节单元在水解单元下游和生物反应器上游。在一些实施方案中，水解和调节工艺在发酵持续期间连续地发生。在一种实施方案中，在水解进料被引入到生物反应器之前，在调节单元中调节水解进料以去除微生物生长和/或如诸如丁醇的生物燃料的生物产物生产的抑制剂，且调节工艺在发酵持续期间连续地发生。在一些实施方案中，抑制剂的去除包括选自石灰过中和、吸附、沉淀和离子交换的一种或多种工艺。在一种实施方案中，调节单元包括离子交换树脂，抑制剂的去除是通过在使得抑制剂保持在树脂上的条件下使水解进料接触离子交换树脂施行的。在一种实施方案中，离子交换树脂是阴离子交换树脂。在一种实施方案中，抑制剂的去除是通过用诸如铝盐或铁盐的例如硫酸铝或氯化铁的金属盐沉淀施行的。在一些实施方案中，抑制剂包括有机酸、呋喃、酚类、可溶性木质纤维素材料、提取物和/或酮。

在一些实施方案中，发酵是在厌氧条件下进行的。在一种实施方案中，微生物是梭菌属菌株。

在一些实施方案中，在其上固定微生物的支持物材料选自骨炭、聚丙烯、钢、硅藻土、沸石、陶瓷、工程热塑料、粘土砖、混凝土、熔岩、木片、聚酯纤维、玻璃珠、特氟龙、聚醚醚酮和聚乙烯。

在一些实施方案中，固定的微生物包括生物膜。

在一些实施方案中，固定的微生物在其中生长的生物反应器是填充床、膨胀床或流化床的形式。

在一些实施方案中，生物产物是包括丁醇、丙酮、乙醇或其组合的生物燃料。在一种实施方案中，生物燃料包括丁醇。

在一些实施方案中，***还包括用于从发酵培养基回收生物产物的回收单元。在一些实施方案中，回收单元与生物反应器流体连通且在生物反应器的下游，并且回收工艺在发酵持续期间连续地操作。

在一些实施方案中，回收单元包括用于浓缩生物产物的浓缩模块。在一种实施方案中，生物产物的浓缩包括机械蒸汽再压缩。

在一些实施方案中，回收单元包括使生物产物与发酵培养基的其它成分分离的蒸馏模块，其与浓缩模块流体连通且在浓缩模块下游。在一些实施方案中，在进料的水解期间生成的闪蒸蒸汽为蒸馏提供能量。在一种实施方案中，生物产物是丁醇，并且***包含用于从发酵培养基回收丁醇的回收单元。丁醇的回收可包括使丁醇与发酵培养基的其它成分分离的蒸馏。在一种实施方案中，在蒸馏中回收丁酸，丁酸再循环回到生物反应器且被加入到生物反应器中的发酵培养基，并且生物反应器中的微生物使丁酸转化为丁醇。

在一种实施方案中，蒸馏模块包括与浓缩模块流体连通且在浓缩模块下游的第一蒸馏柱，从第一蒸馏柱的顶部排出的馏分包含丙酮和乙醇，来自第一蒸馏柱底部的馏分包含丁醇，蒸馏模块还包括与第一蒸馏柱流体连通且在第一蒸馏柱下游的倾析器(decanter)，倾析器包括顶部相和底部相，来自倾析器中的顶部相的丁醇和水被供给到与倾析器流体连通且在倾析器下游的第二蒸馏柱，且来自第二蒸馏柱底部的馏分包含丁醇。在一种实施方案中，蒸馏模块还包括与第一蒸馏柱流体连通且在第一蒸馏柱下游的第三蒸馏柱，从第三蒸馏柱的顶部排出的馏分包含丙酮且从该柱的底部排出的馏分包含乙醇，并且第三蒸馏柱的温度低于第一蒸馏柱的温度。在一种实施方案中，来自第二蒸馏柱底部的馏分包含丁醇和丁酸二者，并且蒸馏模块还包括用于分离丁醇和丁酸的蒸馏柱，该蒸馏柱与第二蒸馏柱流体连通且在第二蒸馏柱下游，从用于分离丁醇和丁酸的柱的顶部排出的馏分包含丁醇且从该柱底部排出的馏分包含丁酸，丁酸在蒸馏中回收，丁酸被提供到生物反应器中的发酵培养基，并且微生物使所述丁酸转化成丁醇。

在一些实施方案中，木质素在木质纤维素进料的水解的如第二阶段的最终阶段的残留物中回收。在一种实施方案中，含木质素的残留物被干燥到液体含量为约35％至约15％，如，约35％、30％、25％、20％、或15％、或约35％至约30％、约30％至约25％、约25％至约20％、或约20％至约15％或更少的任一种。在一种实施方案中，含木质素的残留物被用作所述方法的能量来源。在一种实施方案中，含木质素的残留物被用作发电的燃料来源。在一些实施方案中，含木质素的残留物被用作诸如酚醛树脂的有用的产物生产的化学前体。在一些实施方案中，含木质素的残留物被用作厌氧消化器的供料，该厌氧消化器用于诸如甲烷或合成气的有用的气体产物的生产。在一些实施方案中，含木质素的残留物被用作土壤改良剂。

在一些实施方案中，如木质纤维素进料的进料的水解用如硝酸的酸以包括第一和第二阶段的多个阶段施行，水解单元包括第一水解模块和第二水解模块，硝酸水解包括在第一水解模块中的第一阶段和在第二水解模块中的第二阶段，第一水解模块中的硝酸的温度高于第二水解模块中硝酸的温度，闪蒸蒸汽在第二阶段水解中生成，闪蒸蒸汽被再压缩，并且再压缩的蒸汽被用于为所述蒸馏提供能量。在一些实施方案中，闪蒸蒸汽在第二阶段水解中生成，任选地被再压缩，并且用于为预热至所述蒸馏的供给流提供能量。在一些实施方案中，闪蒸蒸汽在第二阶段水解中生成，闪蒸蒸汽被再压缩，并且再压缩的蒸汽被用于为蒸馏中分离的产物的干燥和/或脱水提供能量。

在一些实施方案中，为了回收另外的有价值的产物，诸如萜类、甾醇、甾醇酯、树脂酸、脂肪酸、蜡酯、甘油二酯、甘油三酯、和/或甲醇，在进料水解之前或期间去除的提取物流和/或在进料水解期间产生的闪蒸蒸汽与产物回收***流体连通。在一些实施方案中，进料水解期间生成的闪蒸蒸汽与产物回收***流体连通，该产物回收***作为蒸馏辅助使用，用于预热供料混合物和/或用于在汽提蒸馏中使用。

在一些实施方案中，从主要产物回收柱回收的材料被再次引入到生物产物生产***中，已从该材料去除如溶剂的生物产物。例如，该材料可作为初级稀释水或冲洗水(例如，使糖从生物质冲洗掉)，或者其它水添加流。这样做时，发酵养分可被再次引入到该方法中，降低成本和/或增加性能，糖可被再次引入到该方法中，提高工艺产量和/或可使水被再利用。

在本文的生物产物生产方法和***的一些实施方案中，在压力下操作生物反应器以在生物反应器中压缩气体，例如在发酵期间由微生物生成的CO₂。

附图简述

图1示出在其中可利用本文描述的生物丁醇生产方法和***的集成生物燃料工厂的实施方案的示意图。

图2示出在其中生物丁醇生产方法和***在本文中描述的集成生物燃料工厂的实施方案的示意图。

图3示出在其中可利用本文描述的生物燃料生产方法和***的集成生物燃料工厂的实施方案的工艺流程图。

图4示出两阶段进料水解工艺的实施方案的示意图。

图5示出如实施例4中描述的来自在调节的和未调节的水解进料上微生物发酵的流出物的HPLC分析的结果。

图6示出如实施例1中描述的运行号2008065(4％葡萄糖上的菌株Co-7449)的固定的梭菌的连续培养的结果。

图7示出如实施例1中描述的运行号2009012(5％蔗糖上的菌株Co-5673)的固定的梭菌的连续培养的结果。

图8示出如实施例1中描述的运行号2009021(4％木糖上的菌株Co-7449)的固定的梭菌的连续培养的结果。

图9示出如实施例1中描述的运行号2009023(4％木糖上的菌株Co-5673)的固定的梭菌的连续培养的结果。

图10示出如实施例1中描述的运行号2009057(4％混合糖模拟水解产物上的菌株Co-5673)的固定的梭菌的连续培养的结果。

图11示出如实施例1中描述的运行号2008137(4％混合糖模拟水解产物上的菌株Co-5673)的固定的梭菌的连续培养的结果。

图12示出如实施例1中描述的运行号2009060(4％蔗糖上的菌株Co-7449)的固定的梭菌的连续培养的结果。

图13示出在用酸(右图)或水(左图)施行实施例7中描述的半纤维素提取方案之后剩余的残留的材料。

详细描述

本发明提供用于经由微生物发酵连续生产如生物燃料的生物产物的方法和***。在本文描述的方法和***中，微生物发酵被利用以转化从含碳水化合物的进料提取的糖来生产生物产物，诸如生物燃料，例如生物丁醇和任选地其它副产物。

除非在本文另外定义，否则本文使用的所有技术的和科学的术语具有与本发明属于的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。Singleton等人的Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(微生物学和分子 生物学词典)第二版，John Wiley and Sons，纽约(1994)，以及Hale和Markham的The Harper Collins Dictionary of Biology(哈帕柯林斯生物学 词典)，Harper Perennial，纽约(1991)，为技术人员提供本发明中使用的很多术语的通用词典。在本发明的实践或测试中能够使用相似或等同于本文描述的方法和材料的任何方法和材料。

本文提供的数字范围包括界定该范围的数字。

定义

除非上下文另外明确指示，否则“一个(A)”、“一种(an)”、“该(the)”包括复数形式。

“生物产物(bioproduct)”指由微生物生物地即经由代谢途径，如以微生物发酵工艺，产生的任何感兴趣的物质。生物产物包括但不限于生物燃料(如，丁醇、丙酮、乙醇)、溶剂、生物分子(如，蛋白质(例如，酶)、多糖)、有机酸(如，甲酸、醋酸、丁酸、丙酸、琥珀酸、乳酸、己二酸、氨基酸)、醇(如，甲醇、丙醇、异丙醇、戊醇、己醇、2-丁醇、异丁醇、甘油)、脂肪酸、醛(如，乙醛、丁醛)、酮(如，丁酮)、脂、长链有机分子(例如，用于在表面活性剂生产中使用)、维生素和糖醇(如，木糖醇)。

“生物燃料”指如以微生物发酵工艺由微生物生物地产生的燃料分子(如，丁醇、丙酮和/或乙醇)。

“生物丁醇”指如以微生物发酵工艺由微生物生物地产生的丁醇(即，正丁醇)。

“副产物”指在本文描述的任何工艺期间产生和/或纯化和/或分离的物质，其可具有经济或环境价值，但是并非首要工艺目标。本文描述的方法的副产物的非限制性实例包括木质素化合物和衍生物、碳水化合物和碳水化合物降解产物(如，糠醛、羟甲基糠醛、甲酸)，以及提取物(下文描述的)。

“进料(feedstock)”指在发酵工艺中支持微生物生长的用作糖分子来源的物质。在一些实施方案中，必须预处理进料以释放糖分子。在一种实施方案中，包含碳水化合物聚合物的进料被水解以释放单体和/或可溶性寡聚体形式的包含5碳和/或6碳的碳水化合物分子。

“解构(deconstruction)”指生物质的机械的、化学的和/或生物的降解以使个体成分(如，纤维素、半纤维素)更适合于进一步的预处理工艺，例如，释放单体和寡聚体糖分子的工艺，诸如酸水解。

“调节”指微生物生长和/或如生物燃料的生物产物生产的抑制剂从进料或预处理的进料(如，通过进料水解产生的水解产物)的去除，和/或进料或预处理的进料的物理性质的调整以改进支持微生物生长和产物生产的条件。

“滴度”指在微生物发酵工艺中每单位体积由微生物产生的物质的量。例如，生物丁醇的滴度能够以每升溶液产生的丁醇的克数表示。

“产量”指相对于如果所有供给物质被转化为产物将会生产的物质的总量，从供给材料(例如，糖)产生的产物的量。例如生物丁醇的产量能够以相对于如果100％的供给物质(例如，糖)被转化为生物丁醇的理论产量，产生的生物丁醇的％表示。

“生产率”指在微生物发酵工艺中每单位体积每单位时间由微生物生产的物质的量。例如，生物丁醇的生产率能够以每升溶液每小时生产的丁醇的克数表示。

“野生型”指自然中存在的微生物。

“生物质”指含纤维素和/或含淀粉的原料，包括但不限于木片、谷物秸秆、水稻、草、饲料、佩里埃草(perrie-grass)、马铃薯、块茎、块根、全粉碎谷物(whole ground com)、葡萄渣、穗轴、谷粒、小麦、大麦、黑麦、高粱、糠麸、谷类、含糖原料(如，糖蜜、果料、甘蔗或甜菜)、木材和植物残体。

“淀粉”指任何含淀粉的材料。尤其是，该术语指各种植物源材料，包括但不限于小麦、大麦、马铃薯、甘薯、树薯、谷物(corn)、玉蜀黍(maize)、木薯、高粱、黑麦和糠麸。一般来说，该术语指包括植物的复杂的多糖碳水化合物的任何材料，该多糖碳水化合物包括直链淀粉和支链淀粉，具有式(C₆H₁₀O₅)_x，其中“x”可以是任何数字。

“ABE发酵”指通过发酵微生物生产丙酮、丁醇和/或乙醇。

“先进的生物燃料”指来自于低养分输入/高每英亩产量的作物、农业或林业废料、或包括藻类的其它可持续的生物质进料的高能量液体运输燃料。

“木质纤维素的”生物质指包含纤维素、半纤维素和木质素的植物生物质。碳水化合物聚合物(纤维素和半纤维素)紧密地结合到木质素。

“木质素”是包含在不同位点连接的苯丙酚骨架单元的木料的大分子成分。

正丁醇(1-丁醇)在本文中也被称为“丁醇”。

“ATCC”指美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108。

进料

进料是提供基础材料的物质，从该基础材料生成糖分子用于包含在微生物生长培养基中支持微生物的生长。在一些实施方案中，进料是纤维素生物质。在一些实施方案中，进料包含纤维素和半纤维素，例如木质纤维素生物质或木浆。在一些实施方案中，进料是多糖，从该多糖可产生能够支持微生物生长的可溶性糖分子，例如多糖废料产品诸如蟹、虾或龙虾的壳、几丁质、壳聚糖、果胶或蔗糖。

在一些实施方案中，进料是木质生物质。在一种实施方案中，进料是软木，例如，松木，如黑松(Lodgepole)或火炬松(Loblolly pine)。在一种实施方案中，进料包含例如，垂死的(“红色阶段”)或者死亡的(“灰色”阶段)的山松甲虫感染的松木。在另一实施方案中，进料是硬木，例如，枫木、桦木或梣木(ash)。在另一实施方案中，进料是混合的硬木和软木。在另一实施方案中，进料是混合的硬木。在一些实施方案中，木质生物质是以木片、锯屑、锯木厂废料、木材粉末或其组合的形式。

在一些实施方案中，进料作为工艺流从例如纸浆厂的生物质加工设施得到。在纸浆厂工艺流的不同的实施方案中，工艺流可包括废品纸浆、木料结或含木质下脚料(shives)、纸浆筛选室废品(如，基本上是在水中的纤维素)、预水解提取流、和/或造纸厂废液。在其它实施方案中，进料可包括蔗渣、玉米穗轴(corn cob)、甜菜糖蜜、纸浆和/或纸、甜高粱糖浆或大麦谷壳。

木质纤维素包含碳水化合物聚合物和非碳水化合物化合物的混合物。碳水化合物聚合物包含纤维素和半纤维素，并且非碳水化合物级分包含木质素。非碳水化合物级分也可包含灰份、提取物和/或其它成分。纤维素、半纤维素和木质素的具体的量取决于生物质的来源。例如，市政固体废弃物可能主要包含纤维素，而来自造纸和纸浆厂的提取流可能主要包含半纤维素。木质纤维素的其余组成也可包含其它化合物，诸如蛋白。

纤维素，是由β(1，4)-糖苷键连接的D-葡萄糖单元组成的β-葡聚糖，是植物细胞壁的主要结构成分并且通常构成按重量(％w/w)约35-60％的木质纤维素材料。

半纤维素指植物组织中与纤维素缔合的非纤维素多糖。半纤维素通常构成约20-35％w/w的木质纤维素材料，并且多数半纤维素由基于戊糖(五碳)糖单元诸如D-木糖和D-***糖单元、己糖(六碳)糖单元诸如D-葡萄糖和D-甘露糖单元、和糖醛酸诸如D-葡萄糖醛酸的聚合物组成。

木质素，是基于不同地取代的对羟基苯丙烷单元的复杂的、交联的聚合物，典型地构成约10-30％w/w的木质纤维素材料。

任何包含纤维素和/或半纤维素或纤维素和/或半纤维素寡聚体和/或单体化合物(如，糖单体、二聚体(如，纤维二糖)、三聚体(如，纤维三糖))的材料，可被用作进料。材料可包含纤维素和/或半纤维素而没有木质素。

木质纤维素生物质可来自于纤维性生物材料诸如木材或纤维性植物。适合类型的木材的实例包括但不限于云杉、松木、铁杉、冷杉、桦木、山杨、枫木、杨木、桤木、柳属、棉白杨、橡胶树、梅兰蒂木(marantii)、桉木、柳杉和埃克斯木(acase)。适合的纤维性植物的实例包括但不限于玉米秸秆和纤维、亚麻、***纤维、***、剑麻、蔗渣、稻草、谷物秸秆、芦苇、竹、芒、红麻、草芦、虉草(Phalaris arundinacea)、和草。可使用其它木质纤维素材料，诸如草本材料、农作物或植物残留物、林业残留物、市政固体废弃物、纸浆或造纸厂残留物、废纸、回收纸或建筑碎片。适合的植物残体的实例包括但不限于茎、叶、谷壳、果壳、穗轴、枝、蔗渣、木片、木浆、木浆和锯屑。适合的废纸的实例包括但不限于废弃的任何类型纸(例如，复印纸、电脑打印机纸、笔记本纸、记事本纸、打字机纸)、报纸、杂志、纸板、以及基于纸的包装材料。有高矿物质含量的材料也许可能需要额外的pH调整(例如，另外量的化学品用于pH调整)用于有效加工。

在木材被用作进料的实施方案中，如生物燃料的生物产物生产工厂可包括卸载、洗涤和筛选进来的木片以去除任何污垢和碎片的设施。该木片能够被碾磨到用于水解的最佳尺寸并输送到供给料斗用于引入到水解单元中。数据能够从进料供应方收集并且按尺寸使用和确定用于特定工厂的木材处理设备。

可被用在本文描述的生物产物(如，生物燃料，例如生物丁醇)生产方法中的其它进料包括来自木材、甜菜提取物、甜菜糖蜜、高粱糖浆、大麦谷壳、马铃薯加工废料、和酿酒醪的半纤维素提取物。

在一些实施方案中，可使用包含约40％的伐木残料、约20％的可再生的圆木、约20％的木质能源作物、和约20％的草本能源作物的进料混合物。该掺合物能够考虑区域变化并为选择设施的位置和获得进料供应合同提供显著的灵活性。

进料灵活性可容许以下地理位置的进料的组合的利用，在该地理位置个别地获取的进料的可用供应不足以使工业规模的如生物丁醇的生物产物生产工厂合理化，或者在该地理位置协同价值能够由组合进料实现，该组合进料允许相对于潜在的土地(如，改进的作物轮作)或根据更经济的收获、处理和储存物流的更好的实践被执行。进料灵活性也可提供机会使工厂坐落于小生境位置(niche site)，在那里最终用途市场紧密接近本来不可利用的进料。

在一些实施方案中，多种的进料可被通用菌株利用，该菌株能够使5-碳和6-碳糖分子(包括多聚体形式)转化成如生物燃料例如正丁醇的生物产物。在一些实施方案中，进料可被水解以提供富含5-碳和6-碳糖的水解产物，并且微生物菌株被用于以单独或组合的发酵生产生物产物，该微生物已经被优化以在5-碳或6-碳糖上生长和产生如生物燃料的生物产物。在一些实施方案中，已被优化以在特定的进料上或在从特定的进料产生的水解产物上生长的微生物菌株被用于如生物燃料的生物产物的生产。

进料的预处理

诸如本文描述的那些的进料能够使用多种方法和***在生物转化之前预处理。进料的制备能够包括进料的化学或物理改变。例如，进料可被切碎、切片、削片、切削、加热、燃烧、干燥、分离、提取、水解、和/或降解。这些改变能够通过生物的、非生物的、化学的、或者非化学的工艺施行。

在使用如木质纤维素进料的纤维素进料的一些实施方案中，可使用工艺使纤维素和/或半纤维素分解为可更容易地被微生物加工的糖分子。可使用的工艺包括酸水解、酶水解、气化、热解和由微生物的纤维素降解。

解构

在一些实施方案中，诸如木质纤维素进料例如木片、锯屑和/或锯屑残渣的进料在诸如水解的下游预处理工艺之前被解构。解构可包括但不限于预汽蒸以使材料膨胀和松散、机械碾磨、机械***(如，汽蒸或其它化学处理随后快速减压)、真空处理、酸-进料接触(使酸扩散到进料中)或其组合。在一些实施方案中，解构使进料中的纤维素和/或半纤维素更易于水解。

提取物的去除

在一些实施方案中，诸如木质纤维素进料例如木片、锯屑和/或锯屑残渣的进料被预处理以去除提取物。提取物是通过诸如压缩、水或溶剂提取或空气干燥的工艺从进料提取的材料。提取物的非限制性实例包括萜、树脂酸、脂肪酸、甾醇、酚类化合物和甘油三酯。提取物可包括但不限于对香豆酸、阿魏酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香醛、香兰素、糠醛、羟甲基糠醛和葡萄糖醛酸。提取物可被取出用于其它用途，诸如甾醇的生产、或被燃烧而为如本文描述的如生物燃料的生物产物的生产方法提供能量。

在一些实施方案中，提取物在进料的解构之前或者连同进料的解构一起被去除。

水解

通常，进料包含寡聚体形式如聚合体形式的糖分子，并且必须被水解以提取和释放可溶性的单体和/或多聚体糖分子，其可在如本文描述的微生物发酵中被转化为生物产物，如生物燃料。在一些实施方案中，糖分子以纤维素和/或半纤维素存在在进料中。在一种实施方案中，进料是木质纤维素生物质并且糖分子以纤维素和半纤维素存在在进料中。

在一些实施方案中，进料用酸水解工艺预处理。可被用于水解的酸包括但不限于硝酸、甲酸、醋酸、磷酸、盐酸和硫酸或者其组合。在一种实施方案中，酸水解以单一阶段施行。在一些实施方案中，酸水解以两个或多个阶段施行，每个阶段在不同条件下施行，以在每个阶段中水解进料的不同成分。以多阶段施行的酸水解可起到限制动力学控制的碳水化合物降解机制的影响的作用。两阶段酸水解工艺的实施方案的示意图被描绘在图4中。

可设计酸水解***以在水解反应器中如在水解反应器的垂直段中用酸溶液浸没和淹没原料，以保证均匀的酸浸渍。均匀的热分布可通过使用直接蒸汽注入和连同机械螺旋钻(screw auger)的夹套容器得到。变速驱动器可与温度感应仪器一起使用以控制反应器停留时间和温度，允许在线调整反应器强度。也可利用具有功能上相似的性能的可选的反应器构造。例如可使用水平消化器构造。在该类型的反应器中，材料仅被部分地浸没。相似地，在一些实施方案中，为了达到较高的可溶性糖浓度，进料材料并不完全地浸没在含酸溶液中，从而产生包含增加的糖浓度的水解产物(即，在开始加入较少的稀释水)。在一些实施方案中，使用多阶段稀硝酸水解工艺。在一种实施方案中，使用两阶段稀硝酸工艺。在一种实施方案中，选择第一阶段的条件以达到进料中约70％至约90％的半纤维素水解，并且选择第二阶段的条件以达到进料中约40％至约70％的纤维素水解。第一阶段主要目标是半纤维素的水解，产生富含甘露糖和/或木糖的水解产物，而第二阶段使用来自第一阶段的剩余固体并且目标是纤维素，产生富含葡萄糖的水解产物。通常，第一阶段水解产物液包含如主要从半纤维素和非顽拗(non-recalcitrant)的纤维素生物质成分提取的5-碳糖和6-碳糖的混合物，且第二阶段水解产物主要包含如从纤维素纤维提取的6-碳糖，所述糖在两种情况中均为可溶性的单体和/或多聚体形式。6-碳单糖可包括但不限于葡萄糖、甘露糖和半乳糖。6-碳双糖可包括但不限于纤维二糖、甘露二糖、葡萄甘露糖(glucomannose)、和半乳甘露糖(galactomannose)。其它多聚体形式可包括但不限于纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖。5-碳单糖可包括但不限于木糖和***糖。5-碳双糖和其它多聚体形式可包括但不限于木二糖、木三糖和***木糖(arabinoxylose)。

在硬木被用作进料的一些实施方案中，第一阶段水解产物包含按重量约60％至约75％的5-碳糖和按重量约25％至约40％的6-碳糖，并且第二阶段水解产物包含按重量约80％至约95％的6-碳糖。在软木被用作进料的一些实施方案中，第一阶段水解产物包含按重量约20％至约30％的5-碳糖和按重量约70％至约80％的6-碳糖，并且第二阶段水解产物包含按重量约90％至约100％的6-碳糖，其中第二阶段在比第一阶段更高的温度施行。

第一阶段水解模块可偶联到第二阶段水解模块，且与第一阶段水解产生的液体水解产物分离的固体残留物用作第二阶段水解工艺的底物。为了增加从生物质分离的可溶性糖的分离和回收产量，残留的固体可被冲洗/洗涤。

在一些实施方案中，第二阶段水解在比第一阶段水解更高的温度施行。

在一些实施方案中，水解在两水解阶段以约0.05至约0.1％、约0.1％至约0.5％、约0.5％至约1％、约1％至约4％、约1.3％至约3.5％、或者约1.3％(w/w的干燥进料)的硝酸浓度，在第一阶段以温度约170℃至约175℃且在第二阶段以温度约210℃至约230℃，以对每个水解阶段的反应器温度下的蒸汽饱和的压力施行。

在一些实施方案中，用于水解的液体(酸)与固体(进料)的比是约10∶1至约5∶1或约7.5∶1至约5∶1。在循环反应器中，液体与固体的比可以是约5∶1至约3∶1或者约3.5∶1至约3∶1。在连续挤压反应器中，液体与固体的比可以是约4∶1至约0.5∶1。

在一些实施方案中，第一阶段水解中来自进料的可溶性糖提取产量为约或至少约6％、10％、15％、20％、30％、34％、40％、50％或60％来自纤维素且约或至少约1％、3％、6％、10％、20％、40％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％来自半纤维素。在一些实施方案中，在第二阶段水解中来自第一阶段水解产物之后剩余的固体残留物的可溶性糖提取产量是约或至少约25％、35％、45％、55％、65％、75％、85％或95％来自纤维素且约或至少约1％、3％、6％或10％来自半纤维素。在一些实施方案中，选择条件使得可利用短停留时间，提供高生产率(较小的反应器)和最小的糖降解产物。最小化降解产物使预处理步骤与下游发酵工艺更相容。例如，在一些实施方案中，在水解反应器中的停留时间，对于1/4英寸木片的第一阶段硝酸水解可以是约5至约8分钟，对更大的供给材料用约3至约15或者长达约30分钟的更长的停留时间，对于1/4英寸木片的第二阶段硝酸水解的停留时间可以是约3至约6分钟或者约3至约20分钟，对更大的供给材料有更长的停留时间。停留时间可受材料解构的程度和/或应用的酸条件影响。

稀硝酸预处理比其它类型的酸预处理具有若干优势。在木质纤维素预处理条件下硝酸的钝化特性容许使用不锈钢而不是诸如稀硫酸处理的其它预处理工艺需要的更奇异和昂贵的材料。这赋予了可观的资金成本优势。而且，水解以及中和工艺富含能够在发酵中利用的氮。在一些实施方案中，水解产物流用氨中和产生硝酸铵。硝酸铵是下游发酵工艺中的微生物的养分。

进料硝酸水解的参数也在美国专利第4,384,897号、第4,706,903号、第5,221,357号、第5,366,558号、第5,536,325号、第5,628,830号和第6,019,900号中描述。

在本文描述的多阶段水解工艺中，每阶段的水解反应器可以是相同的或不同的。例如，第二阶段反应器可具有比第一阶段反应器更高或更低的容量。在一些实施方案中，水解反应器可具有约或至少约1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2500、5000、10,000、50,000、100,000、150,000或200,000加仑的内体积。在一些实施方案中，硝酸水解反应器可能小于具有可比较的容量的硫酸水解反应器。

在诸如两阶段硝酸水解工艺的本文描述的多阶段水解工艺中，一种或多种加工操作可在阶段之间诸如在第一和第二硝酸水解阶段之间使用，包括机械降解、干燥、振动、混合、削片、拉紧(straining)、固体-液体、液体-液体、或气体液体分离相分离、倾析和剪切。这样的操作可被用于输入材料的分离、降解、磨损或剪切。

在一些实施方案中，水解***可包括蒸汽压缩机来压缩低压的闪蒸蒸汽。在一些实施方案中，可压缩来自第一和/或第二阶段硝酸水解工艺的低压闪蒸蒸汽。通过提升压力，低压闪蒸蒸汽能够在下游产物浓缩和/或产物蒸馏操作中再次使用，并且显著地降低整个方法的能量需求。在其它实施方案中，闪蒸蒸汽可在汽提蒸馏中有成效地使用，容许包含在闪蒸蒸汽中的有用的产物的回收。

在本文描述的方法中使用的水解***可被优化以在每进料量、所需的能量、排放的温室气体、或其任何组合下产生产物的最大产量。优化参数包括在水解反应器之外施行的分离或反应的类型，和水解反应器的条件。在一些实施方案中，进料材料的降解和/或水解可由于对能量消耗或产物产量的影响而降低或增加。

在本文描述的如生物燃料的生物产物的生产方法和***中，如本文描述的进料水解工艺和发酵工艺被偶联来以连续方式加工进料。可设计连续的操作以便避免水解单元和发酵罐之间的材料的积累。在一些实施方案中，水解单元可连续操作约或至少约50、100、200、300、400、600、800、1000、1350、1600、2000、2500、3000、4000、5000、6000或8500小时。

在木质纤维素进料水解之后剩余的含木质素的残留物可被用作本文描述的如生物燃料的生物产物生产方法的能量来源和/或发电的燃料来源。在一些实施方案中，含木质素的残留物被干燥到液体含量为约35％至约15％，如约35％、30％、25％、20％、或15％、或约35％至约30％、约30％至约25％、约25％至约20％、或约20％至约15％或更少的任一种，并且干燥的残留物可燃烧作为产能或发电的燃料来源，被气化用于随后的燃烧或向其它化学产物的转化，或者被转化为其它化学产物。

在一种实施方案中，提供用于解构包含纤维素和半纤维素的生物质以从生物质中提取糖分子的方法。该方法包括：(a)在水的存在下和在压力下机械地崩解生物质，从而产生液体和/或蒸汽和固体崩解的生物质；(b)从生物质分离液体和/或蒸汽，其中步骤(b)可在步骤(a)之后或连同步骤(a)一起施行；(c)使崩解的生物质与酸接触，该酸的量足以解聚生物质的聚合碳水化合物成分，从而产生酸浸渍崩解的生物质；(d)通过压力改变装置使酸浸渍崩解的生物质供给到消化器中，其中酸浸渍崩解的生物质在消化器中被加热到一定温度并且持续足以容许解聚反应发生的时间量，以及(e)将液体与固体分离以产生液体水解产物和残留的固体，其中水解产物包含可溶性半纤维素糖分子并且残留的固体包含纤维素纤维，例如长度至少约0.35或0.37mm的纤维。在一些实施方案中，酸是浓度约0.1％(w/w)至约0.5％(w/w)的硝酸。在一些实施方案中，消化器以约90至约110psig的压力，约167℃至约176℃的温度，以及约3至约20、约8至约20、或约5至约10分钟的停留时间操作。在一些实施方案中，在酸浸渍之前生物质与蒸汽接触，其可帮助生物质的崩解和提取物的去除。在一些实施方案中，残留的固体进一步水解，例如通过酸水解，以从纤维素纤维释放可溶性糖分子，从而产生可用于支持本文描述的方法和***中的微生物发酵的进一步的水解产物。

在另一实施方案中，用于解构包含纤维素和半纤维素的生物质以从生物质中提取糖分子的以上描述的方法，以步骤(c)中的酸浓度、步骤(d)中的停留时间、和步骤(d)中的温度施行，足以产生包含半纤维素糖和残留的固体的水解产物，该残留的固体包含长度小于约0.35、0.30或0.28mm的纤维素纤维。在一种实施方案中，残留的固体不包含可见的纤维素纤维。在一些实施方案中，步骤(c)中的酸浓度是约1％(w/w)至约1.5％(w/w)，步骤(d)中的停留时间为约5分钟至约10分钟，并且步骤(d)中的温度为约160℃至约180℃。在一些实施方案中，酸是浓度约0.05％(w/w)至约4％(w/w)的硝酸。在一些实施方案中，消化器以约90至约110psig的压力、约160℃至约180℃的温度，以及约4至约15min的停留时间操作。在一些实施方案中，在酸浸渍之前生物质与蒸汽接触，其可帮助生物质的崩解和提取物的去除。在一些实施方案中，残留的固体进一步水解，例如通过酸或酶水解，从而产生可用于支持本文描述的方法和***中的微生物发酵的进一步的水解产物。

在另一实施方案中，提供用于解构包含纤维素和半纤维素的生物质以从生物质提取糖分子的方法，该方法包括：(a)使生物质与酸接触，该酸的量足以解聚生物质的聚合的碳水化合物成分，从而产生酸浸渍崩解的生物质；(b)通过压力改变装置使酸浸渍崩解的生物质供给到消化器，其中酸浸渍崩解的生物质在所述消化器中被加热到一定温度并且持续足以容许解聚反应发生的时间量；和(c)将液体与固体分离来产生液体水解产物和残留的固体，其中水解产物包括半纤维素糖分子并且残留的固体包含长度小于约0.35、0.30或0.28mm的纤维。一种实施方案中，残留的固体不包含可见的纤维素纤维。在一些实施方案中，步骤(a)中的酸是约0.1％(w/w)至约5％(w/w)、或约1％(w/w)至约3％(w/w)的浓度的硝酸，步骤(b)中的停留时间为约8分钟至约20分钟，并且步骤(b)中的温度为约160℃至约180℃。在一些实施方案中，在酸浸渍之前生物质与蒸汽接触，其可帮助生物质的崩解和提取物的去除。在一些实施方案中，残留的固体进一步水解，例如通过酸或酶水解，从而产生可用于支持本文描述的方法和***中的微生物发酵的进一步的水解产物。

水解进料的调节

在一些实施方案中，水解进料被“调节”以在向微生物生长培养基添加水解进料之前去除微生物生长和/或如生物燃料的生物产物生产的抑制剂。这样的抑制剂可包括但不限于有机酸、呋喃、酚、可溶性木质纤维素材料、提取物和酮。木材水解产物中存在的抑制剂可包括但不限于5-羟甲基-2-糠醛(HMF)、糠醛、脂肪酸、乙酰丙酸、醋酸、甲酸、酚类化合物、香兰素、双氢松柏醇、松柏醛、香草酸、氢醌、儿茶酚、乙酰愈创木酮、高香草酸、4-羟基苯甲酸、希伯特酮(Hibbert′s ketone)、硝酸铵和/或其它盐、对香豆酸、阿魏酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香醛、和葡萄糖醛酸。

调节工艺的非限制性实例包括真空蒸发或热蒸发、石灰过中和、沉淀、吸附、酶调节(如，过氧化物酶、漆酶)、化学转化、蒸馏和离子交换。在一种实施方案中，调节包括水解进料与诸如阴离子或阳离子交换树脂的离子交换树脂的接触。抑制剂可被保持在树脂上。在一种实施方案中，离子交换树脂是阴离子交换树脂。离子交换树脂可用腐蚀性的一些溶剂或其它已知的工业材料再生，溶剂可能包括在本文描述的如生物燃料的生物产物生产方法中生成的那些。在其它实施方案中，抑制剂可被金属盐(例如，三价的金属盐，例如，铝盐或铁盐，诸如硫酸铝或氯化铁)和/或诸如聚环氧乙烯的絮凝剂或者其它低密度、高分子质量聚合物沉淀。

在一种实施方案中，水解产物在离子交换树脂上以酸性pH调节，离子交换树脂诸如阴离子交换树脂，如Duolite A7，酸性pH例如pH约2.5至约5.5、约3.5至约4.5、或者约2.5、3、3.5、4、4.5、5或5.5。

在一种实施方案中，水解产物用金属盐调节，例如三价金属盐，诸如铝盐或铁盐，如硫酸铝或氯化铁。在一些实施方案中，金属盐以约1g/L至约6g/L、或约3g/L至约5g/L的浓度添加。在一些实施方案中，pH用碱调整到碱性pH，诸如约9.5至约11、或者约9.5、10、10.5或11，例如，用氢氧化铵或者氨气。

在一些实施方案中，与没有经历调节工艺的相同的水解进料相比，在使用调节的水解进料时微生物生长和/或如生物燃料的生物产物的滴度、产量和/或生产率增加。

在一些实施方案中，使用耐受水解进料中的抑制剂的微生物，或者用于生物产物生产的微生物随着时间的推移如通过重复传代发展出对抑制剂增加的耐受性，使调节步骤成为不必要的或不经济的。

在一种实施方案中，使用如之前描述的提取物去除工艺替代调节工艺以改进微生物生长和/或如生物燃料的生物产物的滴度、产量和/或生产率。在一种实施方案中，除了调节工艺以外还使用如之前描述的提取物去除工艺以改进微生物生长和/或如生物燃料的生物产物的滴度、产量和/或生产率。在一些实施方案中，提取物去除工艺也可被用于生成另外的流以提供具有商业价值的产物(如，甾醇)和/或改进去除发酵和/或如生物燃料的生物产物的生产抑制剂所需的操作参数(如，更少的树脂和再生树脂(如，腐蚀性的)的再生剂)。

发酵

本文的生物产物生产方法包括微生物的发酵，该微生物在固定的细胞生物反应器(即，包含被固定到如固体支持物的支持物上的细胞的生物反应器)中产生如生物燃料的生物产物。在一些实施方案中，由于与搅拌罐(悬浮细胞)生物反应器相比在固定的细胞生物反应器内增加的生产性细胞团的积累，固定的细胞生物反应器提供更高的生产率。在一些实施方案中，微生物细胞在生长培养基中的支持物上和/或在支持物颗粒之间形成生物膜。

本文的如生物燃料的生物产物的生产方法包括微生物的连续发酵(连续添加进料(如，水解进料)和产物流的收回)。连续发酵使发酵循环的诸如延迟、生长和周转时间的非生产性部分最小化，从而降低资金成本并且降低接种事件的次数，因此使操作成本以及与人为误差和工艺误差相关的风险最小化。

取决于产生生物产物的微生物的需求，发酵可以是需氧的或厌氧的。

在一些实施方案中，固定的产生丁醇的梭菌属菌株以本文描述的连续方法厌氧地发酵。在一种实施方案中，支持物是骨炭。在另一实施方案中，支持物是熔岩。在另一实施方案中，支持物是陶瓷的/钢的支持物材料。在一些实施方案中，与在同样条件下生长时的相应的亲本或野生型菌株相比，和/或相比于糖丁酸梭菌B643、糖丁酸梭菌P262、糖乙酸多丁醇梭菌N1-4、丙酮丁醇梭菌824、和/或拜氏梭菌8524，该梭菌属菌株具有增加的对丁醇的耐受性、和/或增加的在支持物上生长的能力。

在一些实施方案中，反应器支持物材料和其实现按使反应器的生产率最大化来设计。这可包括如使发酵气体去除效率最大化、使液体-微生物接触时间最大化、使压力降最小化、或为在适当位置清洁而优化这样的特点。

在一些实施方案中，诸如梭菌属菌株的细菌菌株，被周期性地替换或轮换以阻止或减少噬菌体感染的发生。

在本文描述的如生物燃料的生物产物的***和方法中可使用一个或多个生物反应器。当使用多个生物反应器时，它们能够以串联和/或平行布置。多个生物反应器超越一个大的生物反应器的优势包括更低的制造和安装成本、容易扩大生产、更强的控制反应的能力和更大的生产灵活度。例如单个的生物反应器可被取出生产线以维修、清洁、灭菌、诸如此类，而不会明显影响整个工厂生产计划。在使用多个生物反应器的实施方案中，生物反应器可在相同的或不同的条件下运行。

在平行的生物反应器布置中，水解进料被供给到多个生物反应器并且来自生物反应器的流出物被去除。来自多个生物反应器的流出物可合并用于如生物燃料的生物产物的回收，或者来自每个生物反应器的流出物可被单独地收集并且用于生物产物的回收。

在串联的生物反应器布置中，水解进料被供给到串联中的第一生物反应器，来自第一生物反应器的流出物被供给到第二下游生物反应器，并且来自串联中的每个生物反应器的流出物被供给到串联中的下一个随后的生物反应器。来自串联中最终生物反应器的流出物被收集并且可用于如生物燃料的生物产物的回收。流出物可在阶段之间(初级到次级生物反应器)被处理以增加***的总体生产率。用于这样的处理的工艺的非限制性实例包括不凝性气体的去除和用于溶剂去除的全蒸发。

在多个生物反应器布置中的每个生物反应器相比于串联中的其它生物反应器能够具有相同的微生物的物种、菌株或者物种或菌株的混合，或者不同的微生物的物种、菌株或者物种或菌株的混合。发酵流出物继而被移出并且送去分离和回收。

在一些实施方案中，进料在本文描述的多阶段方法中水解，并且来自每个阶段的水解产物被供给到单独的生物反应器。不同的水解产物被供给到的生物反应器可包含相同的或不同的微生物的物种或菌株。在一种实施方案中，不同的水解产物被供给到的生物反应器包含已各自被优化以在被供给到该生物反应器的特定的水解产物上生长的不同的微生物的物种或菌株。在一些实施方案中，串联中不同组的多个生物反应器被供给来自进料水解的不同阶段的水解产物。

在一些实施方案中，流出物在如生物燃料的生物产物收获之后可再循环，并且用于制成初始发酵培养基或制成用于进一步发酵的供给流，从而允许未同化的和回收的养分和矿物质的最大利用。在一些实施方案中，产物从流出物分离并且减少了产物的流出物继而用作串联中下一个生物反应器的进料。

串联中生物反应器的次序能够被调整以阻止或去除由于过度的微生物生长的阻塞。例如在串联中的第一发酵罐达到细胞团的高水平时，它能够被替代地放置到序列中的第二位置立即接收流出物，该流出物具有可能抑制进一步的细胞生长的高产物浓度或降低的养分水平。发酵罐的次序的适时的变化可阻止细胞过度生长和生物反应器的阻塞，其可提高***的总体生产率和/或减少操作成本和负担。

在连续方法中，有可能得到比分批或分批供给方法更高的生产率，因为细胞浓度和流出物流速能够相互独立地变化。在连续发酵中，体积生产率通过产物浓度(在本文中可交换地称为“滴度”)乘以养分稀释率(即，生物反应器的体积的转换率、或生物反应器停留时间的倒数)计算。最大的可达到的稀释率由在生物反应器中能够稳定的维持的细胞团的浓度决定。在恒定的稀释率(即，养分消耗率)下，随着提高能够保持的发酵滴度，生产率按比例增加。然而，可能有期望相对于发酵的总持续时间短时间暂时地升高稀释率的时候，以去除气体、阻塞或“表现不佳的”细胞。

固定的细胞生物反应器允许较高浓度的生产性的细胞团积累，并且因此生物反应器能够在高稀释率下运行，导致体积生产率相对于悬浮细胞培养物显著提高。因为高密度、稳态培养物可通过连续培养以及伴随地去除包含产物的发酵培养液来维持，所以可使用更小容量的生物反应器。用于丙酮丁醇梭菌连续发酵的生物反应器在本领域中是已知的(美国专利第4,424,275号和第4,568,643号)。

在本文的如生物燃料的生物产物生产方法和***中使用的生物反应器被设计用于连续操作至少约100、250、300、500、750、1,000、1250、1,500、2,000、2,250、2,500、3,000、4,000、5,000、6,000或8,500小时。

预期在本文的如生物燃料的生物产物生产***中使用的生物反应器容量具有约或至少约100L、1000L、6,000L、10,000L、46,000L、50,000L、100,000L、250,000L、270,000L、500,000L或1,000,000L的容量(总的标称体积)。

发酵罐接种的众多方法是可能的，包括向生物反应器的底部或顶部添加液体种子培养物并且再循环培养基以促进遍及床的生长。其它方式包括经由位于沿着反应器壁的端口添加液体种子培养物或浸渍固体支持物，或者用固体支持物材料集成和装载。生物反应器流出物也可被用于接种另外的生物反应器，并且在该情况下任何残留的可发酵材料可在次级反应器中转化，提高产量/回收率。

以相似的方式，支持物材料可通过底部、顶部或者侧面装载被添加到反应器以补充从生物反应器变得降解或失去的支持物材料。

生物反应器内容物的混合能够通过充入如二氧化碳或N₂的无菌气体达到，其也可用于通过在发酵罐内维持正压而阻止培养物的污染。来自发酵的逸出气体(CO₂、H₂)也可被回收和压缩用于在气举或其它类型反应器中使用以维持厌氧的、加压的、充分混合的条件。

混合培养内容物的其它技术包括搅拌器的使用或者发酵培养液的再循环，特别是在发酵产物去除之后返回到生物反应器的培养液。在一些实施方案中，生物反应器的内容物不被混合，但是可依靠逸出气的产生和运动来混合内容物。

在发酵条件旺盛时，产生的气体能够足以阻止氧气进入到反应器。例如没有温度控制、包含发酵培养基和发酵微生物，并且对环境(如，装运物(tote))开放的未搅拌的反应器(如，1000L反应器)，可连续消耗供给材料并且产生生物产物(如，生物燃料)。

在本文的如生物燃料的生物产物的生产方法和***的一些实施方案中，固定的微生物在也称为活塞流生物反应器(plug-flow bioreactor)的填充床生物反应器中培养。在其它实施方案中，微生物在膨胀床生物反应器中培养。在其它实施方案中，微生物在流化床生物反应器中培养。在又另外的实施方案中，微生物在被设计以“双重模式”操作的生物反应器中培养，即，生物反应器能如在相同的操作时期以填充床或膨胀/流化床模式操作以增加总体生产率(如，去除腐质、去除“表现不佳”的细胞)。固定的细胞生物反应器使用相对小尺寸的提供相对于颗粒体积的大表面积的固体或半固体支持物，允许在颗粒上固定的微生物来处理大体积的流体。

在“填充床”生物反应器中，细胞被固定到结构化的填料(如，拉西环、钢/陶瓷棉)或者半固体或固体颗粒之上或之中，因为颗粒的尺寸、机械约束和/或低流体流速不导致或允许支持物材料的明显轴向运动。

相对地，流化床和膨胀床反应器使用半固体或固体支持物，该支持物基本上不被机械地约束，因此伴随经常是向上流动流的足够的流体流动，颗粒在该流中成为悬浮的或“流化”，即，表现得好像它们是流体流的一部分。初始的种子支持物颗粒随着时间的推移可变得被生物膜覆盖并且能够变得被生物膜完全封装。在一些情况下，细胞团的结块可导致悬浮的生物膜颗粒，在该颗粒中没有被故意引入的“种子”。颗粒上的流体阻力是主要的悬浮机制，但是浮力也能够有助于颗粒的悬浮。通常，生物反应器使用垂直的流体运动悬浮颗粒，但是其它流体运动也是可能的，包括在垂直于生物反应器的纵轴的方向上的流体流。流体速度应该足以悬浮颗粒，但是没有足够大到将它们带出容器。床的流化允许固体颗粒围绕生物反应器移动，造成生物反应器内的流体彻底地混合。混合的幅度取决于生物反应器中达到的颗粒流化的程度。因为流体的体积必须被循环以保持颗粒悬浮，流化床和膨胀床生物反应器比填充床需要相对更大量的能量来操作。

“流化床”生物反应器包含与遍及生物反应器全部体积的被流化的固定的微生物一起的支持物材料。颗粒通过流出来离开生物反应器而且必须从流出物液体分离并回到生物反应器。支持物材料能够被去除、任选地被清洁以及通过沉降罐、溶解的空气浮选(DAF)***、离心机、水力旋流器、过滤器(如，转鼓)、助滤器、干燥器或蒸馏器械的使用从流出物流回收。

“膨胀床”生物反应器包含与在生物反应器中被流化的固定的微生物一起的支持物材料，但是生物反应器被设计使得颗粒被保持在生物反应器中并且不通过流出来离开。膨胀床生物反应器包含使流化的颗粒从流体分离的颗粒脱离区域，从而保持颗粒处在生物反应器内。在一些实施方案中，颗粒从流体的分离包括使流体的速度减慢。在一些实施方案中，这通过增加生物反应器的横截面面积完成。随着流体速度减慢，颗粒开始从流体中沉下。颗粒脱离区域的顶部段没有颗粒。出口可位于该顶部部分以去除流出物。在一些实施方案中，颗粒通过在生物反应器之内包括过滤器或筛网来保留。

双重模式，填充床-流化或膨胀床生物反应器允许在整个发酵运行进程中选择任一模式实施发酵。可选地，发酵可在单次发酵过程期间在模式之间交替变化。双重模式生物反应器与常规的流化或膨胀床生物反应器相比可具有降低的能量使用，因为具有必需的增加的能量需求的流化只需要在例如相对高的细胞密度、高产物浓度、或者在发展出pH或养分不均匀性时施行，该不均匀性能够通过增加生物反应器内容物混合而修正。

在不同的实施方案中，生物反应器可被构造为垂直的、水平的或倾斜的构造以使气体/液体分离最大化和/或改进逸出发酵气体的洗脱来改进生产方法的总体操作和度量，如，如生物燃料的生物产物生产的滴度、生产率、和/或产量。在一种实施方案中，生物反应器可被构造为“滴流床反应器(trickle bed reactor)”，在其中待反应的材料通过缓慢的流被供给到床。

在一些实施方案中，根据特定的反应化学计量，供给到生物反应器的每糖量产生的诸如生物燃料如生物丁醇的生物产物的量可以是每克转化的糖约或至少约0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.33、0.35、0.4、0.45或0.5克。在一些实施方案中，发酵可利用约或至少约40、50、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％的可用的糖。在一些实施方案中，取决于使用的进料，每吨进料产生约或至少约20、30、40、50、60、70、80、90或95加仑的生物燃料如生物丁醇、或者接近理论极限的量。

在一些实施方案中，诸如生物燃料如生物丁醇的生物产物以约或至少约1、2、3、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50g/L/h的生产率生产。

在一些实施方案中，生物反应器的体积生产率和如生物燃料例如丁醇的生物产物的滴度可通过降低固定支持物的颗粒尺寸来改进，其能够增加用于细胞生长的可用的表面积，导致较高的生物反应器生产率。通过以流化或膨胀床模式流化固体支持物，和通过使用具有更大尺寸均匀度的更小的颗粒，能够大大地改进混合，容许养分和pH的优化，进一步改进发酵性能。

一些梭菌属菌株使糖转化为以质量比6∶3∶1的丁醇、丙酮和乙醇。在一些实施方案中，本文描述的***和方法中使用的菌株产生相对于丙酮较大比例的丁醇，例如，近75％-25％，以及非常少的乙醇(约2％)。在其它实施方案中，丁醇∶丙酮∶乙醇的比可以是约或至少约58∶12∶1。在一些实施方案中，丁醇∶丙酮∶乙醇的比大于约58∶12∶1。在一些实施方案中，由梭菌属菌株产生的产物的分布能够使得丁醇的量为至少约70％、丙酮的量为至少约25％，并且乙醇的量为不足约5％。这一较高的丁醇选择性导致每单位重量的进料的较高丁醇产量。而且，选择在固定环境中具有较高丁醇耐受性和较高丁醇选择性的菌株能够导致离开反应器的发酵培养液中的丁醇的较高浓度，从而在产物分离相中需要较少的能量，并且降低操作成本、冷却水的使用、和生命周期GHG排放。

发酵培养基

用于产生如生物燃料产物的生物产物的发酵培养基包含本文描述的进料如水解进料，作为可发酵的碳水化合物分子的来源。

如本领域中已知的，除了适当的碳源以外，发酵培养基必须包含适合的氮源、矿物盐、辅因子、缓冲剂以及其它适于培养物生长和促进期望靶标(如生物燃料，诸如丁醇)的产生必需的酶途径的成分。在一些实施方案中，盐和/或维生素B12或其前体被包括在发酵培养基中。在一些情况下，水解进料可包含生长所需的一些或全部养分，使对另外补充材料的需求最小化或者排除对另外补充材料的需求。

氮源可以是任何适合的氮源，包括但不限于铵盐、酵母提取物、玉米浆(CSL)和其它蛋白来源，该蛋白来源包括但不限于从发酵培养液蒸馏回收的变性蛋白或来自于发酵之后回收的残留的分离的微生物细胞团的提取物(梭菌提取物)。磷可以诸如磷酸钠、磷酸钾或磷酸铵的磷酸盐的形式存在于培养基中。硫可以诸如硫酸钠或硫酸铵的硫酸盐的形式存在于培养基中。另外的盐包括但不限于硫酸镁、硫酸锰、硫酸铁、氯化镁、氯化钙、氯化锰、氯化铁、氯化亚铁、氯化锌、氯化铜、氯化钴和钼酸钠。生长培养基也可包含维生素，诸如盐酸硫胺、生物素、对氨基苯甲酸(PABA)。生长培养基中也可包含一种或多种缓冲剂(如，MES)、一种或多种还原剂(如，半胱氨酸HCl)，和/或乳酸钠，其可用作碳源和pH缓冲剂。

培养条件

用于不同的工业上重要微生物的最佳培养条件在本领域是已知的。按需要，培养条件可以是厌氧的、微耐氧的或需氧的。需氧条件是包含溶解在培养基中的氧，使得需氧培养物不能辨别氧转移与另外的溶解氧的区别的那些条件，而微耐氧条件是其中一些溶解氧以低于空气或空气饱和溶液中发现的水平存在并且通常低于标准溶解氧探针的检测限值如小于1ppm的那些条件。培养物能够被搅拌或不被扰动。通常，随着在微生物数量增加、消耗进料和排出有机酸，培养基的pH随着时间的推移发生变化。发酵期间产生的或培养基中存在的CO₂的溶解度也能够影响pH。能够通过向生物反应器中的初始发酵培养基添加缓冲化合物或者通过向生长培养基主动添加酸或碱以保持pH处于期望的范围中来调节培养基的pH。培养物的生长可通过通常在600nm波长测量光密度或通过本领域中已知的其它方法监测。

对于使用酿酒酵母(S.cerevisiae)使糖转化为乙醇，一般温度是约25℃至约35℃。用于转化培养基的有用的pH范围包括约4.0至约6.0、约4.5至约6.0，和约5.5至约5.8。培养物在厌氧条件下生长，不伴随搅拌。

梭菌发酵一般在厌氧条件下实施。例如，通过丙酮丁醇梭菌的ABE发酵通常在厌氧条件下以约25℃至约40℃范围中的温度实施。在历史上，悬浮培养不使用搅拌器，而依靠逸出的或充入的气体混合生物反应器的内容物。然而，能够搅拌培养物以保证生物反应器内容物的更均匀的混合。对于固定的培养物，生物反应器可无搅拌地以固定的床(活塞流)或者流化/膨胀床(充分混合的)模式运行。嗜热细菌发酵能够达到约50℃至约80℃范围中的温度。在一些实施方案中，温度范围是约55℃至约70℃。在一些实施方案中，温度范围是约60℃至约65℃。例如，诸如热纤梭菌(C.thermocellum)或热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)的梭菌属物种可在约60℃至约65℃下生长。梭菌生长培养基的pH能够通过向生物反应器中的初始发酵培养基添加缓冲化合物或者通过向生长培养物主动添加酸或碱以保持pH处于期望的范围中来调节。例如，在用于梭菌生长的培养基中可保持pH处于约3.5至约7.5、或约5至约7的范围。

在固体支持物上的微生物固定

从孢子或营养细胞固定微生物能够采用任何已知的方法。在一种实施方案中，在支持物中的捕获或包含通过聚合或固化含孢子或营养细胞的溶液达到。有用的可聚合或可固化溶液包括但不限于藻酸盐、κ-角叉菜聚糖、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺-酰肼、琼脂糖、聚丙烯、聚乙二醇、二甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯二乙烯基苯、聚乙烯苯、聚乙烯醇、环氧载体、纤维素、醋酸纤维素、可光交联的树脂、预聚物、氨基甲酸酯(urethane)和明胶。

在另一实施方案中，微生物与支持物一起在生长培养基中培养。有用的支持物包括但不限于骨炭、软木塞(cork)、粘土、树脂、砂、多孔氧化铝珠、多孔砖、多孔硅石、赛力特(硅藻土)、聚丙烯、聚酯纤维、陶瓷(如，多孔陶瓷，诸如多孔硅石/氧化铝复合材料)、熔岩、蛭石、离子交换树脂、焦炭、天然的多孔石、大孔烧结玻璃、钢、沸石、工程热塑料、混凝土、玻璃珠、特氟龙、聚醚醚酮、聚乙烯、木片、锯屑、纤维素纤维(纸浆)、或其它的自然的、工程的或制成的产物。微生物可能粘附于支持物并且形成团聚体，如生物膜。

在另一实施方案中，微生物使用化学试剂共价偶联到支持物，该化学试剂像戊二醛、邻联茴香胺(美国专利第3,983,000号)、聚异氰酸酯(美国专利第4,071,409号)、硅烷(美国专利第3,519,538号和第3,652,761号)、羟乙基丙烯酸酯、过渡金属活化的支持物、氰尿酰氯、高碘酸钠、甲苯或类似物。还参见美国专利第3,930,951号和第3,933,589号。

在一种实施方案中，固定的孢子，诸如如丙酮丁醇梭菌的梭菌属的那些，通过热激活化并且继而在接着发生营养生长的生长培养基中在适当的条件下培养。这些细胞被封闭在固体支持物之中或之上。在微生物达到适合的密度和生理状态之后，培养条件能够被改变用于产生如生物燃料的生物产物。如果固定细胞失去如生物燃料的生物产物产生，它们可通过首先允许细胞产孢然后重复热激和培养顺序而被再次活化。

营养细胞能够在其生长的不同阶段中被固定。对于展现两相培养的微生物，诸如具有其产酸相和产溶剂相的丙酮丁醇梭菌，为了使期望的产物产生最大化，能够在细胞进入期望培养相之后固定，其中就丙酮丁醇梭菌而言，产酸相中的是有机酸醋酸和丁酸而产溶剂相中的是溶剂丙酮、丁醇和乙醇。可选地，两相细胞能够在产酸相中被固定并且继而适合于溶剂产生。

在一些实施方案中，生物反应器中待固定的微生物通过细胞悬浮的方式被引入。一般来说，这些微生物以单独细胞或者小的细胞团聚体在培养基中分散。在其它实施方案中，微生物通过被微生物定殖的悬浮颗粒的使用被引入到生物反应器中。这些悬浮颗粒能够被吸收在固体支持物上并且通常具有足够小的尺寸使能够进入并变得固定于固体支持物的孔结构中。通常，无论悬浮颗粒的尺寸如何，微生物能够通过与固体支持物接触而转移。引入的颗粒上的生物膜能够转移到并且定殖到这些新的表面。在一些实施方案中，微生物的期望的特性只能通过在固体支持物上培养维持，从而使得使用小的定殖颗粒悬浮液来在生物反应器中接种固体支持物成为必需。

用于固定微生物生长的支持物

在一些实施方案中，产生如生物燃料的生物产物的微生物，以在固体或半固体支持物材料上固定的形式在如本文描述的生物反应器中生长。在一些实施方案中，支持物包括多孔材料。适合的支持物材料的非限制性实例包括骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料和有机材料。

天然聚合物包括有机材料，诸如纤维素、木质纤维素、半纤维素和淀粉。有机材料包括进料，诸如植物残留物和纸。也可使用两种或多种材料的复合材料，诸如合成聚合物与天然植物聚合物的混合物。

半固体培养基的实例包括藻酸盐、κ-角叉菜聚糖和壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺-酰肼、琼脂糖、聚丙烯、聚乙二醇、二甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯二乙烯基苯、聚乙烯苯、聚乙烯醇、环氧载体、纤维素、醋酸纤维素、可光交联的树脂、预聚物、氨基甲酸酯和明胶。固体支持物的实例包括软木塞、粘土、树脂、砂、多孔氧化铝珠、多孔砖、多孔硅胶、赛力特、木片或活性炭。

适合的无机固体支持物材料包括具有可用表面羟基或氧化物基团的无机材料。这样的材料能够按照化学组成分类为硅质的或非硅质的金属氧化物。硅质的支持物包括，尤其是，玻璃、硅胶、硅灰石、堇青石、干硅胶、膨润土和类似物。代表性的非硅质的金属氧化物包括氧化铝、羟磷灰石和氧化镍。

在一些实施方案中，支持物材料选自骨炭、聚丙烯、钢、硅藻土、沸石、陶瓷(如多孔陶瓷，诸如多孔硅石/氧化铝复合材料)、工程热塑料、粘土砖、混凝土、熔岩、木片、聚酯纤维、玻璃珠、特氟龙、聚醚醚酮、聚乙烯、蛭石、离子交换树脂、软木塞、树脂、砂、多孔氧化铝珠、焦炭、天然的多孔石、大孔烧结玻璃、或其组合。在一种实施方案中，支持物材料是骨炭。有用的支持物材料具有高的表面积体积比，使得大量的活化的、生产性的细胞能够在生物反应器中积累。有用的支持物可包含一种或多种大型结构组件，该大型结构组件包含一种或多种有用的支持物材料，该支持物材料促进良好流体机械性，例如，用于传统的蒸馏塔包装的金属丝网/纱布包装材料(wire mesh/gauze packing material)。

在一些实施方案中，支持物材料包括至少约100m²/m³的表面积。在一些实施方案中，支持物材料包括至少约0.15g/cm³的堆密度。在一些实施方案中，支持物材料包括至少约60的球盘硬度数。在一些实施方案中，支持物材料包括至少约20MPa的屈服强度。

支持物材料的颗粒尺寸根据生物反应器的构造和操作参数会不同。在一些实施方案中，支持物材料通过筛分按大小分类。在一些实施方案中，颗粒通过它们能够通过的筛网的筛目分类。在一些实施方案中，颗粒用具有

4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60或70的美国筛目的筛网筛分。在一些实施方案中，颗粒至少筛分两次，首先使用具有较大开口的筛网随后通过具有较小开口的筛网，以产生在限定的颗粒尺寸分布范围内的颗粒。在一些实施方案中，颗粒的直径是至少约100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm、1,100μm、1,200μm、1,300μm、1,400μm、1,500μm、1,600μm、1,700μm、1,800μm、1,900μm、2,000μm、3,000μm、4,000μm、5,000μm、6,000μm、7,000μm、8000μm、9,000μm、10,000μm、12,500μm、15,000μm、17,500μm、20,000μm、22,500μm或25,000μm。在一些实施方案中，颗粒的直径是小于约100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm、1,100μm、1,200μm、1,300μm、1,400μm、1,500μm、1,600μm、1,700μm、1,800μm、1,900μm、2,000μm。在又一些实施方案中，至少约80％、85％、90％、95％或100％的颗粒具有在约100-400μm、100-600μm、100-800μm、200-500μm、200-800μm、200-1000μm、400-800μm、400-1000μm、500-1000μm、600-1,200μm、800-1,400μm、1,000-1,500μm、1,000-2,000μm、2,000-4,000μm、4,000-6,000μm、5,000-12,000μm、3,000-15,000μm或6,000-25,000μm范围中的直径。在一些实施方案中，颗粒直径是等效直径，是考虑个体颗粒不规则形状的参数。

理想地，半固体或固体支持物材料应该具有高的表面积。这能够通过小尺寸颗粒、具有高多孔性的颗粒、或者其组合的使用达到。在一些实施方案中，颗粒的表面积是至少约0.003m²/g、0.01m²/g、0.02m²/g、0.05m²/g、0.1m²/g、0.5m²/g、1m²/g、5m²/g、10m²/g、25m²/g、50m²/g、75m²/g、100m²/g、125m²/g、150m²/g、175m²/g、200m²/g、225m²/g、250m²/g、275m²/g、300m²/g、325m²/g、350m²/g、375m²/g、400m²/g、425m²/g、450m²/g、500m²/g、600m²/g、700m²/g、800m²/g、900m²/g、1000m²/g或2000m²/g。此外，堆密度应该足够高以使得最小的颗粒从柱膨胀区域和/或颗粒脱离区域中的流体流中沉下并且因此保留在生物反应器中。在一些实施方案中，支持物的堆密度是至少约0.1g/cm³、0.2g/cm³、0.3g/cm³、0.4g/cm³、0.5g/cm³、0.6g/cm³、0.7g/cm³、0.8g/cm³、0.9g/cm³、1.0g/cm³、1.1g/cm³、1.2g/cm³或1.3g/cm³。支持物材料应该具有足够的硬度以抵抗磨损并且因此避免在支持物颗粒彼此接触或碰撞时的明显灰尘形成。在一些实施方案中，支持物具有至少约20、40、60、80、100、120、140、160或200的球盘硬度数。支持物材料还应该具有足够的拉伸强度以抵抗由于内部应力的碎裂，其可能由支持物材料孔内生物膜的生长导致。在一些实施方案中，支持物具有至少约20MPa、40MPa、60MPa、80MPa、100MPa、120MPa、140MPa、160MPa、180MPa、200MPa、300MPa或400MPa的屈服强度。支持物材料还应该具有抵抗被它之上积累的材料重量压碎的能力。压碎强度是支持物机械强度的另一个量度并且通常是材料的组成、形状、尺寸和多孔性的函数(孔体积的提高可负影响颗粒强度)。在一些实施方案中，压碎强度是至少约8kg。

在一些实施方案中，选择支持物材料以支持作为生物膜的产生如生物燃料的生物产物的发酵微生物的生长。生物膜可在支持物颗粒的外表面上、支持物颗粒之间的液体空间中和/或支持物材料的孔内部中的表面上生长。

微生物

本文描述的***和方法包括一种或多种能够产生如生物燃料的生物产物的微生物。在使用两种或多种微生物的实施方案中，微生物可以是相同的或不同的微生物物种和/或相同物种的不同菌株。

在一些实施方案中，微生物包括细菌或真菌。在一些实施方案中，微生物包括单一物种。在一些实施方案中，微生物包括来自相同物种的菌株的混合培养物。在一些实施方案中，微生物包括不同物种的混合培养物。在一些实施方案中，微生物包括环境分离株或来自其的菌株。

在本文描述的方法和***的一些实施方案中，不同物种或菌株、或者两个或多个物种或菌株的不同组合，在以不同的水解进料作为碳水化合物来源的不同的生物反应器中使用。

在一些实施方案中，使用诸如酵母的真菌微生物。酵母的实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、贝酵母(S.bayanus)、卡氏酵母(S.carlsbergensis)、摩纳酵母(S.Monacensis)、巴斯德酵母(S.Pastorianus)、葡萄汁酵母(S.uvarum)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)物种。厌氧或耐氧的真菌的其它实例包括但不限于Neocallimastix、Caecomyces、Piromyces属和其它瘤胃来源的厌氧真菌。

在一些实施方案中，使用细菌微生物，包括革兰氏阴性和***。***的非限制性实例包括在葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)的属中发现的细菌。具体的物种的非限制性实例包括屎肠球菌(Enterococcus faecium)和鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)。革兰氏阴性细菌的非限制性实例包括在假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、螺旋体属(Spirochaeta)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)，泛菌属(Pantoea)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)和欧文氏菌属(Erwinia)的属中发现的细菌。

在一种实施方案中，细菌为梭菌属物种，包括但不限于糖丁酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌(Clostridium puniceum)和梭菌属的环境分离株。

预期在本发明中使用的梭菌属的物种的又一些实例可选自金黄丁酸梭菌(C.aurantibutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、解纤维梭菌(C.cellulolyticum)、土壤栖梭菌(C.phytofermentans)、解糖梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、假破伤风梭菌(C.tetanomorphum)、热丁酸梭菌(C.thermobutyricurn)、热纤梭菌(C.thermocellum)、紫色梭菌、热解糖梭菌(C.thermosaccharolyticum)和巴斯德梭菌(C.pasterianum)。

预期在本文的方法和***中使用的其它细菌包括诸如白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)的棒状杆菌属(Corynebacteria)、诸如肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)的肺炎球菌(Pneumococci)、诸如酿脓链球菌(S.pyogenes)和唾液链球菌(S.salivarus)的链球菌属(Streptococci)、诸如金黄色葡萄球菌(S.aureus)和白色葡萄球菌(S.albus)的葡萄球菌属(Staphylococci)、肌病毒科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、需氧的芽孢形成杆菌(Aerobic Spore-forming Bacilli)、诸如炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)的芽孢杆菌属(Bacilli)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、厌氧的芽孢形成杆菌、诸如人结核分支杆菌(M.tuberculosis hominis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)的分枝杆菌(Mycobacteria)、诸如衣氏放线菌(A.israelii)、牛型放线菌(A.bovis)、内氏放线菌(A.naeslundii)的放线菌(Actinomycetes)(类真菌细菌)、星状诺卡菌(Nocardia asteroids)、巴西诺卡菌(Nocardia brasiliensis)、螺旋体(Spirochetes)、苍白密螺旋体(Treponema pallidium)、极细密螺旋体(Treponema pertenue)、斑点病密螺旋体(Treponema carateum)、回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)、出血黄疸性钩端螺旋体(Leptospiraicterohemorrhagiae)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、小螺菌(Spirillum minus)、念珠状链杆菌(Streptobacillus monitiformis)、锥虫属(Trypanosoma)、支原体属(Mycoplasmas)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、单核增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix thusiopathiae)、念珠状链杆菌(Streptobacillusmonilformis)、肉芽多诺万氏菌(Donvania granulomatis)、杆状巴尔通体(Bartonella bacilliformis)、立克次氏体属(Rickettsiae)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、穆氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsiae)和康氏立克次氏体(Rickettsia conori)。其它适合的细菌可包括大肠杆菌(Escherichia coli)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)和植生克雷伯菌(Klebsiella planticola)。

在一些实施方案中，微生物包括梭菌属、肠球菌属、克雷伯菌属(Klebsiella)、乳杆菌属或芽孢杆菌属。在一些实施方案中，微生物包括丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌、糖丁酸梭菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、金黄丁酸梭菌、金黄丁酸梭菌、假破伤风梭菌或热解糖梭菌。

在一些实施方案中，微生物是专性厌氧菌。专性厌氧菌的非限制性实例包括溶纤维丁酸弧菌和梭菌属物种。

在其它实施方案中，微生物是微耐氧菌并且能够在小浓度的氧存在下存活。在一些实施方案中，微需氧条件包括但不限于通过用至少约0.01％至至少5％或更多O₂(如，0.01％、0.05％、0.10％、0.50％、0.60％、0.70％、0.80％、1.00％、1.20％、1.50％、1.75％、2.0％、3％、4％、5％或更多O₂)的气体充入液体培养基所产生的发酵条件。在另一方面，微需氧条件包括但不限于具有至少约0.05ppm溶解氧或更多(如0.05、0.075、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、8.0、10.0ppm或更多)的培养条件。

微生物菌株可为了期望的特性优化、突变或以其它方式选择。例如细菌和真菌的亲本菌株可被用于较高产物耐受性突变体的开发。例如，参见PCT/US09/40050。这样的亲本菌株的来源包括已建立的培养物保藏中心和大学、政府机构或公司的研究者。

可选地，亲本菌株能够从诸如来自包括市政设施的废水处理设施和化工厂或石油化工工厂的废水处理设施的废水污泥的环境样品分离。后者特别有吸引力，因为预期分离的微生物在高产物浓度存在下经许多代的进程中进化并且从而已经取得可进一步改进的期望的产物耐受性水平。

亲本菌株也可从天然存在的进料和化合物的天然降解的位置分离(如，木料堆、锯木场、倒下的树之下、填埋场)。这样的分离株可以是有优势的，因为分离的微生物可随着时间的推移在进料的存在下进化并且从而已经取得可进一步改进的某些水平的转化和对这些材料的耐受性。

个别物种或混合的物种群能够从环境样品中分离。

在一些实施方案中，环境分离株和/或微生物聚生体被用于产生具有增加的产物耐受性的微生物聚生体。包括微生物聚生体的分离株能够从包括土壤、河流、湖泊、沉积物、河口、沼泽、工业设施等的无数环境小生境收集。在一些实施方案中，微生物聚生体是严格的厌氧菌。在其它实施方案中，微生物聚生体是专性厌氧菌。在一些实施方案中，微生物聚生体是兼性厌氧菌。在又其它实施方案中，微生物聚生体不包含肠球菌属或乳杆菌属的物种。

在使用具体的物种或属的混合群时，非期望的物种或属的选择性的生长抑制剂能够被用于阻止或抑制这些非期望的微生物的生长。

在一些实施方案中，使用共培养物。例如一种微生物可向培养基中分泌酶，使进料分解为能够被另一微生物利用的组成化合物。例如，乙醇可从热纤梭菌和热硫化氢梭菌的共培养物产生(Eng等人(1981)Applied andEnvironmental Microbiology 41(6)：1337-1343)。

在一些实施方案中，微生物包括一种或多种异源基因，其表达增加微生物的产物耐受性。在一些实施方案中，一种或多种异源基因在固体支持物上的适应或产物耐受性的选择之前被引入到微生物之中，然而在其它实施方案中，一种或多种异源基因在适应或产物耐受性的选择之后被引入到微生物中。

在一些实施方案中，微生物被工程化以过表达增加微生物产物耐受性的内源基因。在一些实施方案中，微生物包括增加对产物的耐受性的内源基因的额外的拷贝数。在特定的实施方案中，产物耐受的微生物不是大肠杆菌，并且异源的或过表达的基因不是yfdE、yhhL、yhhM和csrC。在其它实施方案中，微生物不是具有增加的热激蛋白表达的重组微生物。在又其它实施方案中，微生物不是包括编码从微生物输出丁醇的多肽的异源基因的重组微生物。

在一些实施方案中，相对于野生型的或亲本的梭菌属菌株和/或相对于糖丁酸梭菌B643(Contag等人(1990)Applied EnvironmentalMicrobiology 56：3760-65)、糖丁酸梭菌P262(ATCC BAA-11)、糖乙酸多丁醇梭菌N1-4 ATCC 27021、丙酮丁醇梭菌ATCC 824和/或拜氏梭菌ATCC 51743，该微生物是具有选自以下的一种或多种表型特征的梭菌属菌株：增加的丁醇耐受性、增加的对发酵抑制剂的耐受性、低丁酸和/或醋酸积累、增加的连续发酵中的稳定性、增加的丁醇滴度、以增加的丁醇丙酮比生产生物燃料、增加的每单位进料的丁醇产量、增加的每单位细胞生物质的丁醇产量、增加的氧耐受性、增加的粘附于固体支持物的能力以及降低的产孢能力。

在一些实施方案中，微生物是例如梭菌属菌株，如丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌或拜氏梭菌，具有对生长培养基中按重量至少约2％、2.5％、5％、10％、12％或15％的生物燃料的耐受性，例如对生长培养基中按重量至少约2％、2.5％、5％、10％、12％或15％的丁醇的耐受性的菌株。

在一些实施方案中，微生物是突变菌株，在同样的条件下生长时与例如相应的亲本或野生型微生物的相应的非突变微生物相比较，具有对生长培养基中的生物燃料至少约125％、150％、200％、250％、500％或1,000％的增加的耐受性，例如对生长培养基中的丁醇至少约125％、150％、200％、250％、500％或1,000％增加的耐受性，该耐受性通过微生物的生长测量。在一些实施方案中，突变菌株是在同样条件下生长时，与糖丁酸梭菌B643、糖丁酸梭菌P262、糖乙酸多丁醇梭菌N1-4 ATCC 27021、丙酮丁醇梭菌ATCC 824和/或拜氏梭菌ATCC 51743相比，具有对生长培养基中的如丁醇的生物燃料至少约125％、150％、200％、250％、500％或1,000％的增加的耐受性的梭菌属菌株，如丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌或拜氏梭菌。

在一些实施方案中，从诸如木糖的戊糖和在半纤维素水解产物中发现的其它糖有效地产生如生物燃料诸如丁醇的生物产物的菌株，可通过环境分离或者亲本菌株的突变得到。一些菌株可能利用诸如木聚糖酶和/或淀粉酶的内源酶活性代谢如木聚糖的不可溶的底物。其它菌株可能降解菊粉和/或果胶而不需要外源酶的添加。其它菌株可能代谢多种糖并且使其转化成产物。这样的菌株可被用作菌株工程化或诱变的基础。多样菌株文库能够允许发酵中的菌株轮作，阻止噬菌体污染并为不同的供给水解产物的代谢提供多样性。

回收工艺

包含生物产物的发酵流出物可被浓缩和/或纯化。在一些实施方案中，产物在进一步纯化之前使用本领域已知的任何适合的浓缩技术浓缩，该浓缩技术包括但不限于蒸馏、汽提蒸馏、机械蒸汽再压缩(MVR)蒸馏、真空蒸馏、全蒸发和液液萃取。

在一种实施方案中，生物产物为生物燃料，例如，丁醇、乙醇和/或丙酮。在一些实施方案中，发酵流出物的主要成分是丁醇、丙酮、乙醇、丁酸和醋酸，所有这些可被回收并用作下游化学合成的起始材料来产生衍生物和/或进一步的化学产物。发酵流出物的次要成分包括但不限于蛋白和其它代谢途径产物，也可被用作产生衍生物或进一步化学产物的起始材料。次要成分包括但不限于溶剂、生物分子(如，蛋白(如，酶)、多糖)、有机酸(如，甲酸、醋酸、丁酸、丙酸、琥珀酸)、醇(如，甲醇、丙醇、异丙醇、己醇)、维生素、糖醇(如，木糖醇)。而且，进料酸水解期间生成的化学化合物包括但不限于糠醛、甲酸、乙酰丙酸和HMF，也可从发酵流出物分离并用作产生衍生物或进一步化学产物的起始材料。

在一些实施方案中，来自多个生物反应器或串联的生物反应器的发酵产物流在进一步纯化之前合并。在一些实施方案中，来自多个生物反应器或串联的生物反应器的发酵产物流被供给到单独的纯化单元。例如，来自加工C5糖的第一生物反应器的发酵产物流能够与来自加工C5和C6糖的第二生物反应器的发酵产物合并。可选地，来自第一和第二生物反应器的产物流可被分别地加工。

在其它构造中，发酵培养液可通过任何的多种方法(如，LLE(液液萃取)、真空蒸馏、汽提、全蒸发)与产物原位分离(即，提取发酵)以提高整个转化工艺的总生产率。例如，丁醇和其它产物可通过充入和自然产生的气体的冷凝从生物反应器回收。

在其它构造中，一个或多个加工步骤能够在发酵阶段之间(如，在串联中的初级和次级反应器之间)进行以从经济、可操作性、维护、能源和/或水的使用的角度加强整个***。

在一些实施方案中，MVR蒸馏被用于从微生物发酵培养基浓缩诸如生物燃料的生物产物。在该方法中，作为蒸馏工艺一部分生成的在上方的蒸汽被机械压缩，并且产生的从冷凝工艺释放的潜热被供给到蒸发工艺。在一些实施方案中，MVR与常规蒸馏相比降低至少约80％的分离能量需求。

在一些实施方案中，常规蒸馏工艺被用于剩余的产物的分离，任选地使用热级联的热集成。之前，由于次要化合物对分离工艺的影响，阻碍从发酵培养基分离生物丁醇。因为表面化学不是分离的基础所以蒸馏避免了这一问题。

在一些实施方案中，选择加工设备以优化能量、水和/或其它感兴趣的度量。在能量使用的情况下，这可包括添加热交换器，以为了有用目的回收流焓或者避免供给流和/或在上方的流的完全冷凝或蒸发。

在丁醇回收工艺的一种实施方案中，发酵培养液(流出物)从发酵模块被传送到产物回收模块，在产物回收模块中溶剂(如，丁醇、丙酮、乙醇)和其它挥发性化合物与水和诸如生物质残留物、碳水化合物和水解生成的糖的较低挥发性的化合物分离。在产物回收模块的上方，一些水伴随着溶剂和其它挥发物。挥发物-水流可被传送到或者可不被传送到倾析操作来增加剩余产物分离的效力和效率。产物回收的顶流被传送到高-低挥发性分流器模块，在其中生成两个(或多个)流——轻馏分、重馏分和潜在地混合溶剂侧馏分(side draw)。混合溶剂侧馏分可主要包含丙酮、乙醇和水。轻馏分主要包含丙酮、乙醇和水。任选地，轻馏分被送到丙酮柱，在其中丙酮与供给流中的其它成分(如，乙醇和水)分离。离开高-低挥发性分流器的较低挥发性的流(重馏分)被传送到倾析器，在那里发生相分离。上相是被传送到丁醇柱的富含有机物的相。例如，上相可包含约80％的丁醇和约20％的水。操作温度和压力影响相中化合物的分配。相分离单元可与丁醇柱和水柱流体接触。丁醇柱将主要包括丁醇-水共沸流的顶流与丁醇分离。共沸流回到倾析器(相分离操作)用于进一步分离。倾析器的水相，可包含接近或约9％的丁醇和约89％的水，被传送到水柱，在其中水与大部分的丁醇-水共沸物分离。丁醇-水共沸物回到倾析器用于进一步加工。

在一些实施方案中，丁酸从在蒸馏工艺中形成的丁醇产物流去除。在一种实施方案中，丁酸从丁醇产物流吸附。例如，叔胺离子交换树脂可被用于丁酸的吸附。在另一实施方案中，丁醇和丁酸通过蒸馏分离。在又一实施方案中，丁醇和丁酸通过全蒸发分离。在一种实施方案中，丁酸被去除并且可作为化学产品出售。在另一实施方案中，丁酸回到工艺的产溶剂部分，并且可作为可被发酵微生物转化为丁醇的进料被添加到生物反应器中的发酵培养基。

在一些实施方案中，糠醛从在蒸馏工艺中形成的丁醇产物流去除。在一种实施方案中，糠醛从丁醇产物流吸附。例如，叔胺离子交换树脂或活性炭可被用于糠醛的吸附。在另一实施方案中，丁醇和糠醛通过全蒸发分离。在又一实施方案中，丁醇和糠醛通过诸如三正辛基氧膦(TOPO)的溶剂的使用与彼此分离。在一种实施方案中，糠醛被去除并且可作为化学产品出售。

在一些实施方案中，其它产物从丁醇产物流去除以去除来自丁醇产物流的杂质并且被回收为有用的产物，例如醋酸、丁酸、HMF、提取物。

根据本文描述的方法生产的生物丁醇也可用作其它化合物生产的平台分子。例如，丁醇可转化为丙烯，各种各样的塑料和其它化合物可从其生产。特定比例的丁醇、二丁醚(丁醇的衍生物)和植物油的混合物可构成全性能(full performance)的柴油燃料。此外，通过包括丁醇的脱水而后通过使用催化剂的寡聚的充分了解的化学反应，丁醇可被转化成为全性能的喷气机燃料。

根据本文描述的方法生产的生物丁醇也可被用作生产其它化学产物的中间化学物，该化学产物包括但不限于丙烯酸丁酯、醋酸正丁酯和乙二醇醚。它也可被脱水以产生1-丁烯，1-丁烯可被寡聚生产包括但不限于喷气机燃料、柴油燃料、润滑剂或α烯烃的其它产物。丁醇也可被直接用于生产丁烯衍生物。丁醇的任何这些衍生物都可使用本领域众所周知的化学工艺生产。

连续方法

提供用于如生物燃料的生物产物生产的连续方法。在本文的连续生产方法中，含碳水化合物的进料被连续地预处理来产生可溶性糖分子，含可溶性糖分子的预处理的进料被连续地供给到一个或多个生物反应器用于如生物燃料的生物产物的微生物生产，在发酵持续期间，生物产物由一个或多个生物反应器中的固定的微生物连续地产生，并且含生物产物的流出物，即发酵培养液，被连续地从一个或多个反应器收回。在一些实施方案中，进料被连续地水解以释放可溶性糖分子。在一种实施方案中，进料是木质纤维素进料，并且如之前描述的，用硝酸水解从纤维素和半纤维素释放可溶性糖分子。

在一些实施方案中，连续方法还可包括下游连续浓缩和/或纯化工艺，用于回收如生物燃料产物的生物产物，其中连续收回的流出物在一种或多种浓缩和/或纯化工艺中被连续地加工以生产生物产物。

在一些实施方案中，该方法还可包括调节工艺以去除如本文描述的微生物生长或如生物燃料的生物产物生产的抑制剂。调节工艺可在进料水解工艺的下游和生物反应器的上游连续操作，并且已调节的水解进料能够在发酵持续期间连续地供给到生物反应器。

在一些实施方案中，该方法还可包括如本文描述的进料的解构和/或从进料去除提取物。解构和/或提取物的去除可以是连续的，或可在连续方法之前或者贯穿连续方法周期性地发生。

在一些实施方案中，该方法连续操作至少约50、100、200、300、400、600、800、1000、1350、1600、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000或8400小时。

本文描述的“连续的”方法可包括周期性的或间歇的部分或完全地关闭如生物燃料的生物产物的生产***的一个或多个部分，用于诸如维护、修理、树脂再生等工艺。

具有恒定的水解进料的供给和含产物微生物培养液的收回的连续发酵，能够使发酵循环的诸如延迟、生长和周转时间的非生产性部分最小化，从而降低资金成本，并且降低接种事件的次数，因此使操作成本以及与人为误差和工艺误差相关的风险最小化。

本文描述的连续的方法和***能够利用如一个、两个或者三个或更多的一个或多个生物反应器。在使用多个(两个或更多)生物反应器时，它们可以平行、串联或者其组合布置。生物反应器中可生长着相同或不同的微生物菌株。该菌株基于其代谢的糖的类型可以是不同的，以使如生物燃料的生物产物的生产最大化。例如，以平行、串联或其组合布置的第一生物反应器或多个生物反应器中可生长着被选择来代谢C5糖的菌株，而以平行、串联或其组合布置的第二生物反应器或多个生物反应器中可生长着被选择来代谢C5和C6糖的另一菌株。生物反应器被偶联到上游进料水解单元，并且也可被偶联到下游回收/分离单元。在一些实施方案中，该连接可以是互相交叉的，使得一些产物分离可在串联的初级和/或次级和/或另外的反应器之间发生。

具有代谢C5糖的菌株的以平行、串联或其组合布置的第一生物反应器或多个生物反应器能够被偶联到用于木质纤维素进料的水解的硝酸水解单元的上游第一阶段水解模块。具有代谢C5和C6糖的菌株的以平行、串联或其组合布置的第二组生物反应器或多个生物反应器能够被偶联到用于木质纤维素进料的水解的硝酸水解单元的上游第二阶段水解模块。可选地，以平行、串联或其组合布置的相同的生物反应器或多个生物反应器能够被用于C5和C6糖向如生物燃料的生物产物的转化。例如，木质纤维素进料的第一和第二阶段硝酸水解产物可被单独地或作为合并的混合物添加到生物反应器。

在本文描述的连续生物燃料生产方法和***的一些实施方案中，丁醇可由诸如梭菌属菌株的微生物菌株，以每升约或至少约5、6、7、8、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80或90g的丁醇、或每升约5至约90、约5至约10、约8至约20、约15至约30、约25至约50、约40至约80、或约60至约90g的丁醇的滴度生产。滴度可受周围条件(如，压力/温度)和组成(丙酮、盐，等)影响。在本文描述的连续生物燃料生产方法和***的一些实施方案中，丁醇可由诸如梭菌属菌株的微生物菌株生产，并具有约或至少约30％、35％、40％、50％或60％、或者约30％至60％、约40％至60％、或约50％至约60％的产量。在本文描述的连续生物燃料生产方法和***的一些实施方案中，丁醇可由诸如梭菌属菌株的微生物菌株生产，并具有每升每小时约或至少约1、3、5、10、15或20g的丁醇、或每升每小时约1至约20、约3至约10、约5至约15、或约10至约20g的丁醇的生产率。

在一些实施方案中，水饱和丁醇可从液体的顶部撇去或者通过本领域中已知用于分离生物反应器中两液体相的设备分离，用于进一步加工/产物回收操作。

生物产物生产的***

本发明提供用于连续生产如生物燃料的生物产物，即，用于进行如本文描述的连续生物产物生产方法的***。该***包含在一个或多个生物反应器上游并且与其流体连通的进料水解单元。含碳的进料在水解单元中被连续地水解生成可溶性糖分子，并且水解产物作为支持微生物生长的碳源被连续地供给到生物反应器。一种或多种固定的微生物在生物反应器中使水解产物连续地转化成如生物燃料的生物产物，并且含生物产物的流出物被连续地从***收回。

在一些实施方案中，***包含以平行、串联或其组合布置的多个生物反应器。在一种实施方案中，平行的多个生物反应器都与单一水解单元流体连通，或者平行的多个生物反应器各自与不同的水解单元流体连通，其中水解单元平行布置并且各自供给不同的生物反应器，并且水解进料被连续供给到每个生物反应器，且流出物被连续地从每个生物反应器收回。在一种实施方案中，***包含以串联布置的多个生物反应器，串联中的第一生物反应器与水解单元流体连通，并且水解进料被连续地供给到串联中的第一生物反应器，且流出物被连续地从每个生物反应器收回并供给到串联中的每个随后的下游生物反应器，并且来自串联中的最后的生物反应器的流出物被连续地从***收回。

在一些实施方案中，用于如生物燃料的生物产物生产的***以生物反应器在压力下操作来压缩生物反应器中的气体，该气体包括发酵期间由微生物生成的CO₂。发酵期间生成的CO₂有效地降低了生物反应器中的液体体积，从而减少液体水解进料的停留时间。生物反应器中气体的压缩具有增加反应器中水解进料的停留时间的作用，其提高进料中糖分子的利用和糖向如生物燃料例如丁醇的生物产物的转化。在压力下操作影响气体物质(CO₂和H₂)的溶解度，并且例如通过影响氧化还原电位、pH或其它参数可影响感兴趣的发酵参数，诸如产物产量、选择性和/或生产率。水解进料可在压力下连续地添加到生物反应器。生物反应器中的压力可以是约1至约30atm，或者约或至少约1、2、3、5、10、15、20、25或30atm。可选地，CO₂可从生物反应器周期性地、间歇地或连续地去除，例如，在沿着生物反应器长度的点处。发酵气体也可在反应器阶段之间(如，串联的初级和/或次级和/或另外的反应器)被去除。在又一实施方案中，水解进料的停留时间可通过固体支持物的使用来增加，该固体支持物具有吸湿性增加持液量，并从而增加停留时间。生产率(每小时每升g如生物燃料的生物产物)和滴度(每升g如生物燃料的生物产物)都可因为增加生物反应器中水解进料的停留时间而被增加。

在一些实施方案中，***还可包括用于回收如生物燃料产物的生物产物的下游连续的浓缩和/或纯化模块，用于加工连续收回的流出物以生产生物产物。在一些实施方案中，***包括用于含生物产物的流出物的浓缩模块，其与生物反应器流体连通并在生物反应器下游。在一种实施方案中，浓缩包括蒸馏。在一种实施方案中，蒸馏包括MVR。在又一实施方案中，***包括用于从浓缩的含生物产物的流出物纯化如生物燃料的生物产物的模块，其与浓缩模块流体连通并在浓缩模块下游。在一种实施方案中，纯化包括蒸馏。

在一种实施方案中，***还可包括用于本文描述的去除微生物生长或如生物燃料的生物产物生产的抑制剂的调节单元。调节单元可在进料水解工艺的下游连续操作并与进料水解工艺流体连通，而且可在生物反应器的上游连续操作并与生物反应器流体连通，并且在发酵持续期间调节的水解进料可被连续地供给到生物反应器。在一种实施方案中，调节单元包括离子交换树脂，并且抑制剂被保持在树脂上。在另一实施方案中，调节单元包括沉淀单元并且抑制剂使用分别的沉淀物去除。在又一实施方案中，抑制性化合物在汽提操作中从水解产物分离。

在一些实施方案中，***还可包括如本文描述的用于进料的解构和/或从进料去除提取物的单元。解构和/或提取物的去除可在水解单元的上游连续操作并且与水解单元流体连通，或者可在连续方法之前或者贯穿连续方法周期地发生。

能量集成

本文描述的如生物燃料的生物产物的生产方法和***可包括一种或多种能量集成***，用于捕获和再循环生物产物生产方法的一部分中生成的能量，并且使用捕获的能量驱动该方法的另一部分。本文描述的能量集成方案包括工艺区域之间的集成并且造成整个工厂能源使用的全局变化。

能量交换的方法是本领域熟知的，例如用于蒸馏塔的料液-塔底液换热器(feed bottoms exchanger)。热交换方法也可在***中的多点使用。

在如之前描述的其中两阶段硝酸水解工艺用于水解木质纤维素进料的一种实施方案中，在第一阶段和/或第二阶段水解工艺中生成的闪蒸蒸汽能够被捕获并用于在水解之前解构进料。

在如之前描述的其中两阶段硝酸水解工艺用于水解木质纤维素进料的一种实施方案中，在第二阶段水解工艺中生成的闪蒸蒸汽可被再压缩并且再压缩的蒸汽用于为第一阶段水解提供能量。在一种实施方案中，闪蒸蒸汽未被压缩。

在如之前描述的其中两阶段硝酸水解工艺用于水解木质纤维素进料的一种实施方案中，作为水解工艺的一部分生成的闪蒸蒸汽可被用于为汽提操作提供新蒸汽(lie steam)以预热流，去除来自水解产物的抑制性化合物，和/或促进产物分离以及回收操作。

在如之前描述的其中两阶段硝酸水解工艺最初用于水解木质纤维素进料的一种实施方案中，闪蒸蒸汽在第二阶段水解工艺中生成，可被用于为第三阶段水解提供能量，同时第三阶段的温度低于第二阶段的温度，并且第二阶段的温度和/或停留时间与没有第三阶段的工艺相比是降低的，因此比在高于第三阶段的温度的温度下施行的水解容许具有较少降解的剩余的寡聚糖分子水解。该方法也能够扩展到水解的四个或更多的阶段并伴随级联作用中逐步降低的温度。在一种具有三个水解阶段的实施方案中，第二阶段中生成的闪蒸蒸汽用于为第一阶段提供能量，并且第一阶段中生成的闪蒸蒸汽用于为第三阶段提供能量。

在如之前描述的其中两阶段硝酸水解工艺用于水解木质纤维素进料的一种实施方案中，在第一和/或第二阶段水解工艺中生成的闪蒸蒸汽可被再压缩并且再压缩的蒸汽被用于为蒸馏工艺提供能量，该蒸馏工艺用于如之前描述的从含生物产物的来自连续微生物发酵的流出物中纯化如生物燃料的生物产物。

在如之前描述的其中两阶段硝酸水解工艺用于水解木质纤维素进料的一种实施方案中，在第一和/或第二阶段水解工艺中生成的闪蒸蒸汽可被用于为预热至蒸馏工艺的供给流提供能量，该蒸馏工艺用于如之前描述的从含生物产物的来自连续微生物发酵的流出物纯化如生物燃料的生物产物。闪蒸蒸汽可在用于预热供给流之前被任选地再压缩。

在如之前描述的其中两阶段硝酸水解工艺用于水解木质纤维素进料的一种实施方案中，在第一和/或第二阶段水解工艺中生成的闪蒸蒸汽可被再压缩，并且再压缩的蒸汽可被用于为如之前描述的蒸馏工艺中分离的产物的干燥和/或脱水提供能量。例如，再压缩的蒸汽可被用于为来自发酵工艺的生物质的干燥和/或脱水提供能量。

在一些实施方案中，木质素在如之前描述的木质纤维素进料水解之后剩余的含固体的残留物中回收，例如，在两阶段硝酸水解工艺的第二阶段之后剩余的含固体的残留物中回收。含木质素的残留物可作为如生物燃料的生物产物的生产方法的能量来源，作为发电的燃料来源，作为例如酚醛树脂的生产的化学生产的进料和/或作为土壤改良剂使用。

集成的生物产物生产工厂

提供能够生产诸如生物燃料的生物产物的集成的工厂。例如，生物丁醇可从多种多样的进料在资金和能量有效的工艺中生产，具有低温室气体(GHG)排放并且具有为降低油的进口、达成先进的生物燃料目标、开发国内生物工业、创造工作、促进经济发展做出显著贡献的可能性。这样的集成的如生物丁醇的生物燃料的工厂的实施方案被示意性地描绘在图1-3中，其利用本文描述的连续生物燃料生产的方法和***。

本文描述的生物炼制厂可提供经济效益，与石油化学衍生的对应物相比以降低的碳强度(排放、足迹)生产生物产物。这一碳强度的降低的主要的驱动力是与石油为基础的化学进料相比进料中碳的相对快速的利用。作为降低碳强度的一个实例，正丁醇是生物产物，且该生物产物被用于取代汽油使用。汽油的碳强度取决于生产的进料来源、生产能量、产物运输和产物使用，并且是近0.095kg CO₂e/MJ汽油。相似地，在本文描述的这样的生物炼制厂中生产的丁醇具有近0.010kg CO₂e/MJ丁醇的碳强度。生物炼制厂的碳强度也取决于生产的进料来源、生产能量、产物运输和产物使用。在强度的降低主要归因于进料的情况下，由于生物质生成在收获之前而产生了CO₂摄取额度(uptake credit)。

通过诸如芝加哥期货交易所(Chicago Board of Trade)的期货机构评估碳强度的避免。价格目标以市场需求为准并且被相应地定价。例如，在$10/MT CO₂e或$0.01/kg CO₂e的避免下，生产设施生成被用于取代汽油的1e9MJ的丁醇会造成价值$0.85MM的8.5e7kg CO₂e避免。

集成的如生物燃料的生物产物工厂能够被建成为多种容量的。在一些实施方案中，中试工厂具有每天加工一至五干吨进料的容量。用于工厂的进料可以是纤维素生物质，例如，木质纤维素生物质，诸如木质生物质，其可在本地获得并且在本国的很多地区是可利用的。生物质的预处理可通过酸水解工艺完成，该酸水解工艺诸如从半纤维素和纤维素提取可溶性糖的两阶段稀酸工艺。

在一些实施方案中，这些糖能够使用梭菌属菌株发酵成如生物丁醇的生物燃料。在一些实施方案中，梭菌属菌株可从单体和多聚体形式的C5和C6糖生产正丁醇。发酵可在运行连续方法的固定床生物反应器中发生，其能够输送高达或者高于十倍的同等尺寸分批发酵罐的生产率。产物回收和蒸馏(例如，高效机械蒸汽压缩)技术和来自相邻工艺流和区域的热流的先进的集成以低的总体能量使用生产高纯度生物燃料如生物丁醇。

集成的如生物燃料的生物产物工厂可以是完全集成的独立设施。除了包含在集成工厂中的操作，该设施能够包括进料储存和处理、产物储存和载出，以及现场(on-site)设备。集成的工厂能够具有一个或多个流来回收热和/或材料。例如，再循环的流可被用于改进分离工艺或生物转化工艺的效率。其它流可被用于从一个工艺单元到另一个的或者在工艺单元内的热交换。

在一些实施方案中，集成的如生物燃料的生物产物工厂可以是共址的(co-location)，以利用诸如来自纸浆厂的半纤维素的废物流，达到通过设备的共址和共利用、供料处理、供料物流、排出处、化学品生产等得到经济优势。

在不同实施方案中，如生物燃料的生物产物生产工厂能够利用用于进料制备的一个或多个水解阶段、使水解产物准备用于生物转化的一种或多种调节工艺、用于生长能够生产诸如丁醇的生物产物和任选的其它感兴趣的产物的一种或多种菌株的一个或多个发酵罐、以及分离期望的产物的一种或多种分离工艺。不同的加工单元可被设计和协调使得工厂的完整操作是连续方式的。工艺操作之间产物或者供给材料的积累可避免。被供给到下游操作之前的加工材料的停留时间可被降低以避免不期望的材料降解或改性。基于下游加工单元的性能能够控制上游加工单元的加工速率(rates of processing)，并且反之亦然。例如，如果观察到由微生物菌株的生物转化的降低，则进料水解速率(rate of hydrolysis)能够被降低，使得产物的积累被避免。

在一些实施方案中，工业工厂输出能够包括作为主要产物的丁醇、丙酮、包含丙酮、乙醇和糖降解产物的混合溶剂、以及木质素。对于每吨特定的进料，工厂能够产生约或至少约53.5加仑的丁醇、4.1加仑的丙酮、0.039吨的混合溶剂和0.419吨的木质素。丁醇和丙酮能够分别到燃料和化学品市场销售。混合溶剂(可包括丙酮、乙醇、丁醇、降解产物、木质生物质化合物、发酵副产物、发酵生成的生物质和/或水)和大部分木质素能够在现场共生产单元中使用以生产操作工厂所需的所有蒸汽和电，并且剩余的木质素可被干燥去除水，例如至约15％的含水量，并且作为锅炉燃料销售。从木质素去除水对增加木质素流的价值是重要的，因为每单位重量的贮能量通过去除水和水的成比例潜热而增加。干燥技术是本领域熟知的。

集成的生物丁醇工厂能够以多种规模生产丁醇。丁醇能够在每年约13,000加仑的中试规模，在每年约200至250万加仑的示范规模(每天消耗约150吨进料)，以及在每年约5000万加仑的工业规模生产。

生产每加仑生物丁醇，工厂能够生产约或至少约0.08加仑的丙酮和约或至少约2.7kg的木质素。基于每吨进料53加仑生物丁醇的产量，预计的工业工厂的进料消耗能够为每天约2,700干吨(112,500干kg/hr)。

每吨进料能够生产的丁醇的量可以是约、高达约或至少约10、20、30、40、50、60、70或80加仑。石油分析表明每个设施每年5000万加仑代替270万相当的桶石油。工厂可位于全国的许多地区，在那里这样量的林业废料是本地可用的，其具有足够的余量以避免市场压力。工厂能够包括进料生物转化的所有单元操作，加上进料处理和产物分配以及载出操作。此外，该工业设施能够现场具有自己的生物质火电厂，其能够使用进料水解之后剩余的含固体的残留物中的木质素、发酵工艺中生产的在蒸馏***中回收的少量的乙醇和部分丙酮、加上从进料提取的糠醛和HMF，以提供方法所需的所有蒸汽和电，并且把过剩的木质素销售到装置外的电力设施。取决于工艺构造，该设施可能需要每加仑丁醇约或至少约20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000或500,000BTU的热能，每加仑约或者至少约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5或10千瓦时，以及每加仑生产的生物丁醇约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、10、20或30加仑的水。这些数字可降低，包括预计水的使用的进一步的降低。例如，能够使用空气冷却器，尽可能减少冷却塔的蒸发损失和使淡水足迹最小化。

如本文描述的集成的生物产物生产工厂的设备可从工业加工设备的商业制造商处购买。能够基于抗腐蚀性和抗侵蚀性选择设备材料。尤其是，设备材料能够被评估用于水解工艺，其可能在酸性条件下在升高的温度和压力下实行。在一些实施方案中，设备的设计并不需要使用奇异的材料或来自单一或有限数量的供应商的专门设备。值得注意的是，在使用硝酸水解工艺的实施方案中，预处理容器能够由不锈钢(如，Duplex 2205)而不是在其它工艺中经常需要的昂贵的合金制成。备件能被保留在工厂以保证连续的加工而不需要漫长的中断或周转。

包括接种、生长寿命、pH控制和灭菌的发酵罐的操作参数和行为能够在以工业规模实现之前以实验台或中试规模确定。在一些实施方案中，能够通过使C5和C6发酵罐体积隔离到例如每单元操作两个、三个或多个容器的多个容器中来解决多变性。该设计概念能够允许最大的灵活性，因为能够使容器增多(manifold)以允许培养基按单独反应器分离或回流。该操作灵活性可允许通过转动列内单独发酵罐的位置延长运行时间，同时优化如梭菌的微生物的性能。在其余的容器在线的同时，个别的反应器可被隔离、灭菌和接种。生物反应器的设计和操作构造，能够包括串联的多个反应器，能够被选择以使例如生物燃料如生物丁醇的感兴趣的生物产物的生产最大化，从而降低资金成本并改进操作物流。

集成的例如生物燃料如生物丁醇的生物产物的生产工厂可包括使用监督控制和数据采集(SCADA)***和/或分布式控制***(DCS)的高度的仪器化和控制。这些***采集广泛的性能参数的实时数据，并且数据可被用于优化工艺控制参数、设定值和条件。例如，定制设计的SCADA***可采集多重参数，包括由在线MS测量的发酵罐废气的浓度数据，其能够是生产诸如生物丁醇的溶剂的实施方案中的代谢和任选地溶剂生产的有效的实时指标。

多种产物能够使用本文描述的***和方法生产。这些产物包括丁醇、丙酮、乙醇、绿色汽油和混合醇。其它产物包括木质素、纤维素、半纤维素、糖、酸、或本文中描述的任何其它产物。天然产物，诸如木糖醇、维生素B12、和其它化合物，可在生产方法中分离以提高工厂的经济性。能够作为燃料使用的有机产物可与彼此掺合，或与另外的材料掺合。例如，丁醇能够与汽油或任何其它可燃燃料掺合。

通过本文描述的***和方法包括发酵和分离来生产的丁醇，能够是约或至少约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或99.99％的纯度。通过本文描述的***和方法包括发酵和分离来生产的丙酮，能够是约或至少约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或99.99％的纯度。通过本文描述的***和方法包括发酵和分离来生产的乙醇，能够是约、高达约或大于约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或99.99％的纯度。

通过本文描述的***和方法生产的丁醇，在发酵或分离之后，能够是丁醇、丙酮和乙醇的掺合物。在一种实施方案中，掺合物能够是70份的丁醇对30份的丙酮。这能够以有机溶剂为基础决定，不包括水。在其它实施方案中，掺合物能够包括33∶12∶1、58∶12∶1或90∶9∶1比率的丁醇∶丙酮∶乙醇。

工业工厂的丁醇生产量能够是每年约5000万加仑的丁醇。在一些实施方案中，工厂可被设计为生产少于每年约100万加仑的丁醇，或者每年约100万至约200万、约200万至约500万、约500万至约1000万、约1000万至约5000万、约2000万至约5000万、约3000万至约5000万、约4000万至约5000万、约4500万至约5000万加仑的丁醇。

在如本文描述的集成的生物产物生产工厂中被分离的木质素，以在木质纤维素进料水解之后剩余的含木质素的残留物的形式，能够被木质素处理和储存单元储存或加工。例如该单元操作能够加工来自如之前描述的木质纤维素进料的第二阶段酸水解的含木质素的残留材料，该含木质素的残留材料包括未转化的纤维素和半纤维素材料。木质素产物流能够被干燥，例如，使用水解闪蒸蒸汽。在约35wt％的湿度，材料会具有可用的热价值。材料能够被进一步干燥以提高产物价值，例如，干燥到约15wt％的湿度，随后成颗粒状，并且被储存作为燃料出售，例如用于发电，或在干燥时被燃烧以提供热能。干燥的、成颗粒状的木质素也可用于生成高压蒸汽，提供如之前描述的木质纤维素进料的水解的第一和第二阶段的硝酸水解工艺中使用的能量。

在一些实施方案中，生物质能够在产物分离和蒸馏阶段期间从发酵培养液中去除。回收的材料能够被干燥和燃烧用于工艺用热或者能够被消化产生甲烷并且去除细胞团而不向环境释放。

来自硝酸预处理工艺的流出物流能够包含显著水平的氮。在硝酸中和期间产生的硝酸铵能够被转化为氮和水。包含硝酸铵的溶液也可被用作随后微生物水处理池的进料。

以下实施例旨在说明但不限制本发明。

实施例

实施例1.连续填充床生物反应器中的丁醇生产

梭菌属菌株在100mL或1L的连续填充床生物反应器中生长如表1中所示的时间长度。Co-7449是糖丁酸梭菌的一种菌株，该菌株在连续培养中非常稳定，与野生型相比具有增加的酸再循环能力，并且充分利用软木水解产物中的混合糖。梭菌的环境分离株Co-5673，在连续培养中也是稳定的，并且具有增加的酸耐受性。微生物细胞在骨炭上使用糖底物厌氧生长。表1中包括使用每个发酵的最佳持续性能(100小时或更多)计算的丁醇的滴度、产量和性能。表中的底物浓度以每体积液体的底物重量表示。来自代表性发酵运行的数据在图6-12中呈现。

表1

^*EFT＝经过的发酵时间

^**混合糖模拟水解产物＝5份甘露糖(31％)、4份木糖(27％)、3份葡萄糖(16.5％)、2份半乳糖(12％)、2份***糖(11％)。

实施例2.连续生物丁醇生产和回收

以下描述连续生物丁醇生产和回收工艺，所有描述的组成工艺(如，进料水解、发酵、产物回收)在集成的生物丁醇生产工厂中同时地和连续地操作。

木质纤维素进料的水解

C5和C6糖在两阶段稀硝酸水解工艺中从木片的半纤维素和纤维素成分生产。两阶段方法包括两个不同温度下的两个反应阶段，使热降解产物最小化并使从进料的半纤维素和纤维素成分的糖的回收最大化。

第一阶段水解

将木片与硝酸和水混合，并且使用渐进式减少的螺旋钻压送到第一阶段水解反应器中。第一阶段水解反应器在175℃或大约175℃、使用115psig蒸汽操作，并且被定制为提供5至9分钟停留时间的尺寸。卸料螺旋(discharge auger)和卸渣阀(blow valve)使反应器流出物输送到回收用于方法中的再使用的低压蒸汽的闪蒸罐。蒸汽能够通过从其它操作回收的蒸汽被增加。

将C5水解产物与未转化的生物质在螺旋压力机中的分离，使用氮汽提以去除氧，并且被泵送到生物丁醇生产工厂的C5发酵段。(尽管包含C5和C6糖，阶段1水解产物液体几乎全部包含C5糖，并且在本文中按照命名法已经被称为“C5水解产物”。)C5水解产物用氢氧化铵调至约pH3.5，并且经过发酵上游的阴离子交换树脂床。螺旋压力机可包括固体洗涤步骤以使可发酵的糖的回收最大化。

第二阶段水解

将来自第一阶段水解的残留的未转化的生物质与硝酸和水混合，并且使用渐进式减少的螺旋钻压送到第二阶段水解反应器中。第二阶段水解利用高于第一阶段水解的温度以分解顽固的纤维素成分。

第二阶段反应器通过在215℃(温度和压力之间的关系对本领域的技术人员是熟知的)注入饱和的新蒸汽来操作，并且被定制为提供3-8分钟停留时间的尺寸。使用卸料螺旋使反应器流出物输送到回收额外的低压蒸汽的闪蒸罐。

将C6水解产物与包含未转化的纤维素和木质素的固体在螺旋压力机中分离，使用氮汽提以去除氧，蒸发以去除水和一些醋酸，用氢氧化铵调至约pH 3.5，经过阴离子交换树脂床(如，Duolite A7)，并被泵送到生物丁醇生产工厂的C6发酵段。螺旋压力机也包含固体洗涤步骤以使可发酵的糖的回收最大化。残留的纤维素/木质素被中和并丢弃，或者被蒸汽干燥并作为用于工艺蒸汽和/或发电的锅炉燃料被利用。

C5发酵

中和的来自第一阶段水解单元操作的C5水解产物被冷却到发酵温度，经由以上讨论的阴离子交换被处理以去除发酵抑制剂，与养分混合并被装填到生物反应器或串联生物反应器中的第一生物反应器。在生物反应器中使用固定的梭菌属菌株使C5水解产物发酵为生物丁醇，该梭菌属菌株已被选择以使C5水解产物的滴度、产量和丁醇选择性最大化。

发酵工艺也产生发酵废气，主要是二氧化碳和氢气，其从生物反应器除去一些溶剂。所有三个反应器在接近大气压下操作并且包括加热/冷却夹套使温度维持在32℃。每个反应器包括被吹扫到蒸汽空间中的受控制的氮，其被取样并伴随发酵废气被排放到排出气处理单元操作。

在向水解产物补充用于微生物生长的养分之后，发酵在温度被控制的生物反应器中在厌氧条件下实施。在达成生物反应器被微生物定殖之后，开始连续供给补充的水解产物，同时连续收回相同量的发酵培养液。

C6发酵

中和的来自第二阶段水解单元操作的C6水解产物被冷却到发酵温度，经由以上讨论的阴离子交换被处理以去除发酵抑制剂，与养分混合并被装填到单独的生物反应器或串联生物反应器。C6发酵单元操作与以上讨论的C5发酵几乎相同，除了梭菌的具体菌株已经为了C6水解产物的滴度、产量和丁醇选择性最大化而优化。可选地，相同的菌株用于相同或分别的生物反应器中的C5和C6发酵。

产物浓缩

在被供给到产物回收蒸馏柱供给罐之前，来自C5和C6发酵的反应器流出物被合并到产物回收供给罐(或者“收获罐”)，在那里发酵继续。发酵罐流出物从供给罐被泵送到蒸馏柱，在那里稀的产物流被浓缩，例如，从供料中约2.5wt％的总有机物至上方液体产物中的约50wt％，或从约1wt％的总有机物至上方液体产物中的约35wt％。

来自蒸馏柱的上方蒸汽在上方冷凝器中冷凝。回收的底部流经过热交换器，在那里能量与柱供给流交换以回收能量。上方流被泵送到另外分离仪器用于例如丙酮、丁醇和乙醇的分离的生物燃料产物的进一步纯化。

产物蒸馏

有机产物通过蒸馏从浓缩物中进一步纯化。例如高纯度丁醇和丙酮可经由侧馏分产生，伴随一些乙醇被去除。

实施例3.分批反应器中木质纤维素进料的两阶段硝酸水解

木质纤维素进料的硝酸水解以两阶段实施。进料是通过Fort Lupton，CO的Renewable Fiber得到的甲虫杀死的黑松木(lodgepole pine)。3/4英寸的木片被碾碎经过1/4英寸的筛网。

基于干木料的近1.3％的硝酸在1.9L反应器中与进料反应。碾碎的1/4英寸木片被装载到5加仑桶中并用水和硝酸装填。硝酸浓度是基于干木料的近1.3％，且向桶中加入水以完全浸没木片。混合物的总固体装载是近12wt％，这对应近7.5的液体固体比。桶继而被密封并且被放置在滚轴上，在那里桶中的内容物被混合近30分钟。进行该步骤以使酸浸渍木片。桶中的内容物继而被转移到在那里发生水解反应的1.9L反应器。为了达到175℃的反应温度，反应器被密封并且用蒸汽装填。反应物的内容物在该温度下的时间是近7分钟，这之后反应器中的内容物在大气压下被闪蒸到容器中，并伴随另外的冷却过程以使材料快速冷却并且终止水解反应。在反应期间溶液的pH接近2。

使用真空过滤单元使反应混合物分离为第一阶段水解产物和固体残留物。第一阶段水解产物中纤维素和半纤维素向可溶性糖分子的转化使用高效液相色谱(HPLC)分析。基于纤维素和半纤维素的转化的可溶性糖的产量通过测量从起始材料中纤维素和半纤维素浓度的完全水解产生的糖计算。浓酸被用于水解木料的纤维素和半纤维素级分。然后糖的理论最大量根据纤维素和半纤维素向糖的转化计算。来自稀硝酸水解的产量继而与理论最大值相比较。在第一阶段硝酸水解反应中，15.8％的水解的纤维素被检测为可溶性糖(葡萄糖和寡聚体)而在第一阶段水解反应中71.1％的水解的半纤维素被检测为可溶性糖(木糖、甘露糖和其它寡聚体)。

来自第一阶段水解的固体残留物用水冲洗以去除来自固体的残留的可溶性糖，并且使第二阶段水解反应中的糖降解量最小化。基于干固体的近1.3wt％浓度的硝酸被用于固体残留物的水解。如以上描述的，残留的固体与酸在滚动的桶中接触近30分钟。固体装载近14wt％，或者约6.5的液体固体比。酸浸渍的残留材料继而转移到1.9L反应器并注入蒸汽。第二阶段水解反应的操作温度是近220℃。反应器中的内容物被加热到220℃近4.5分钟并且继而被闪蒸到闪蒸容器中以使反应物快速冷却并且终止反应。在反应期间溶液的pH接近2。

反应混合物使用真空过滤工艺分离为第二阶段水解产物和残留的生物质。第二阶段水解产物中纤维素和半纤维素向可溶性糖分子的转化如以上描述地被分析。在第二阶段水解反应中，23％的水解的纤维素被检测为可溶性糖(葡萄糖和寡聚体)而0％的水解的半纤维素被检测为可溶性糖(木糖、甘露糖和其它寡聚体)。

实施例4.用离子交换树脂调节水解进料

来自甲虫杀死的黑松木的第一阶段硝酸水解产物，如实施例3中描述的制备，通过经过阴离子交换柱被调节以去除微生物生长的抑制剂。Duolite A7树脂被用于第一阶段水解产物的调节。阴离子交换树脂使用1M氢氧化钠溶液制备，并继而用蒸馏水冲洗。

第一阶段水解产物，具有近50g/L的糖浓度，被调至室温并继而使用氢氧化铵调至pH 5.5，并继而被应用到制备的离子交换柱。经过柱的水解产物被用作微生物发酵的供料，并且与没有经过柱的水解产物相比较来评估微生物的生长。15毫升级分从离子交换柱中洗脱并收集，其中10ml继而用作发酵供料以检测微生物的生长。每种级分中的剩余的5ml用来分析糖浓度和酚类化合物的存在。

养分被添加到木料水解产物级分，并且用0.2μm过滤器过滤以在接种前使培养基灭菌。过滤的培养基继而用梭菌属菌株Co-7449接种。在72小时的时间框架检查发酵的生长。存在细菌停止生长的清晰点，并且该点代表离子交换柱中未鉴定的化合物的突破。

来自调节的和未调节的水解产物的发酵的流出物用HPLC分析。基于HPLC分析，未鉴定的峰的增加与微生物中观察到的抑制的生长充分相关。因此，该峰可能在水解产物的毒性中起作用。基于HPLC柱中的停留时间，该峰被认为包含与毒性密切相关的酚类化合物。Duolite A7是以酚为基础的阴离子交换树脂，因此，由于与树脂上的酚基团的疏水相互作用，所推测的酚类抑制剂化合物有可能被保留在树脂上。也注意到离子交换工艺导致水解产物中的糖的损失。糖损失量近似小于初始浓度的10％。

使用Duolite A7树脂的更大批次浆料工艺被用于评价调节的水解产物对丁醇滴度和产量的影响。调节的水解产物上丁醇的滴度和产量分别是7.7g/L和0.17g/g转化的糖。微生物不在未调节的水解产物上生长。HPLC分析的结果在图5中示出。

实施例5.110升填充床生物反应器中固定的梭菌连续发酵350小时

糖丁酸梭菌Co-7449(PCT/US09/40050)在具有110L标称体积和63.7L工作体积的填充床生物反应器中厌氧生长。该生物反应器的L/D比是8。

梭菌被固定在骨炭上。骨炭颗粒具有3000至5000微米的尺寸，并有约0.72/ml的堆密度。约100磅的骨炭被装载到反应器中。通过首先用具有4％蔗糖的40L的CP3培养基填充反应器，继而向反应器添加在600nm处具有约1的OD的20L梭菌培养液实现固定，并重新计算反应器的内容物持续24小时。

生长培养基基本上与P2培养基相同，如Jesse等(2002)Journal ofIndustrial Microbiology and Biotechnology 29：117-123中描述的，用4％的蔗糖作为碳水化合物供给。

在生物反应器已接种之后，通过以恒定的速率把生长培养基泵送到生物反应器的底部，并连续地从生物反应器的顶部去除培养液，以在生物反应器中维持恒定液位，实现连续培养。连续发酵持续350小时。

运行供给的速率最初为800g/min，在约60小时降低至400g/min，并在约143小时增加至500g/min。平均pH为约4.95且平均压力为约3.24psi。在发酵持续期间N₂以0.7L/min的速率添加。平均的丁醇滴度、生产率和产量分别为3.44g丁醇/L、1.55g丁醇/L/小时、0.172g丁醇/g蔗糖。

实施例6.用金属盐调节水解进料

使用硝酸作为水解反应的催化剂从甲虫杀死的黑松木制备水解产物。下列条件用于水解：基于干木材的硝酸浓度为0.4-0.5％、pH近1.9-2.2、温度170℃、时间7分钟、供料中近25-30％固体。

使用移液器将50ml体积的未加工的水解产物量出到100ml玻璃瓶中。水解产物样品的pH继而用15％的氢氧化铵溶液调到5.5至10的范围中的pH值。

硫酸铝和氯化铁以浓度在3g/L至5g/L的范围中的浓度被添加，并且在20℃至40℃的范围中的温度下孵育溶液约30分钟。该溶液在孵育期间使用磁力搅拌板混合。该溶液继而过滤通过0.2微米的过滤器以将沉淀与液体水解产物分离。

如果尚未处于室温，则使溶液冷却到室温。随后用硝酸或氢氧化铵使溶液的pH调至7.2。在调整pH之后，10ml的每种溶液继而通过具有0.2微米孔尺寸的帕尔无菌注射过滤器(Pall sterile syringe filter)过滤到15mlfalcon试管中。溶液继而放置在厌氧通风橱中过夜脱氧。

培养基成分按支持微生物生长的规定的浓度添加到脱氧的水解产物溶液(即，生长培养基成分和微量元素)。试管继而以近5×10⁷CFU的浓度接种产生丁醇的梭菌属菌株。用于发酵的条件如下：体积10ml、接种前pH近6.8、温度30℃。

硫酸铝和氯化铁都成功地用于本来不可发酵的水解产物向支持微生物生长和丁醇产生的可发酵进料的转化。在用于发酵的条件下，硫酸铝产生的进料导致比氯化铁更高的丁醇产生以及最终产物中更少的沉淀。以硫酸铝和氯化铁处理未加工的水解产物的最佳结果在以下条件产生：金属盐浓度3g/L、pH 9.5、室温(约20℃)。微生物发酵72小时后的丁醇浓度对硫酸铝和氯化铁分别为8.64g/L和7.69g/L。

发现金属盐添加之前的水解产物pH的调整是重要的。例如，金属盐添加之前调至pH 9的溶液最终不支持微生物的生长。然而，调整溶液至pH 9.5得到微生物在其中生长并产生丁醇的调节的水解产物。

较低的温度也引起较低的糖损失。在室温下，糖损失只有6％。

实施例7.从木片的半纤维素的提取以及残留的纤维素的解构

为了保证(1)用于半纤维素糖的解离的遍及木片的充分的酸浸渍和(2)去除一些木料提取物，含水量近24.9％的灰色阶段的黑松木片被用于碎片筛选并经过热机械粉碎机。

粉碎机是Bauer/Andritz RT Impressifiner，在以下条件下使用。添加一些稀释水使木片饱和，以1.38bar的输送压力添加蒸汽，停留时间为20秒，并且RT Impressifiner出口处的流动限制设定为1英寸。

初步压料(pressate)的样品被收集。向RT Impressifiner出口处的固体材料添加1.42％(w/w)的硝酸并产生32-37％(w/w)的固体流。材料在鼓中收集，储存在约10℃用于12-18小时后的加工。粉碎机出口处的材料的温度为60℃，并在约15-20℃冷却15小时。

酸浸渍材料继而被添加到用于消化器供给***的供给料斗。消化器是连续供给的、压力额定的螺旋输送机容器，其按标称在对应于167-176℃的蒸汽饱和温度的7.92-6.13bar(90-110psig)下操作。材料以11ODMT/天的平均速率通过塞螺旋给料机(PSF)***以近8∶1压缩率或转阀供给到～1000L消化器。供应消化器的液体与固体比是2.1∶1。消化器内的停留时间为300-480秒。

来自PSF的液体压料被测量为具有近2加仑每分钟(gpm)(7.6升/分钟)的速率，并且包含游离的硝酸(pH 1.3)以及松节油/塔尔油(tall oil)类型的成分(按气味)。在一些情况下，所有的液体压料添加回消化器。在其它情况下，液体压料的一部分添加回消化器，而每分钟2加仑的余量由自来水供应。在其它情况下，PSF压料被丢弃并向消化器添加每分钟2加仑的水。

在具有6英寸球型卸渣阀的消化器中维持压力。水解产物和残留的固体通过旋流器被扩展到大气压以使蒸汽与液体和固体分离。一些挥发物从排气流中去除。残留的固体按重量为近32％。

560螺旋压力机被用来试图将液体与固体分离。实现很少的脱水。平均的供给固体被测量为约36％，而由于小的平均纤维规格，从螺旋压力机离开的残留的固体被测量为36-37％。

惊人的是，残留的材料具有很小的纤维品质或结构。残留的材料的显微成像显示出几乎不可辨别的纤维素纤维。纤维具有以下特征：

纤维分类

^*％表示保留在所指示的筛网上的重量分数。

水解产物液体主要包含显著浓度的半纤维素糖(～75g/L)，其有典型的软木稀酸水解比：甘露糖、木糖、葡萄糖、***糖和半乳糖。

在后续实验中，已在不添加酸或添加1.42％(w/w)的硝酸的条件下经过粉碎机的材料在7.6升帕尔弹型反应器(Parr bomb type reactor)中反应。为了尽可能接近地复制消化器中的条件(5分钟、166℃)，不添加额外的水。在该运行中添加750g湿润的供料(按重量36.8％的固体)。还向反应器添加450g的水。添加新蒸汽直到反应器达到温度设定值，在该值卸渣阀被释放(5分钟)且材料被吹入泄料罐，在那里压力被容许与环境平衡。

结果在图13中示出。来自无酸条件的残留的固体在图片的左侧示出，而以1.42％硝酸产生的残留的固体在图片的右侧示出。在无酸样品而不是硝酸样品中观察到可见的纤维素纤维。

实施例8.来自木片的半纤维素提取物

如实施例1中描述的，含水量近31.6％的灰色阶段的黑松木片经过热机械粉碎机，除了木片未进行碎片筛选，并且粉碎机出口处的流动限制为0.5英寸。

0.44％(w/w)的硝酸在RT Impressifiner的出口处被加入到固体材料，并导致33.0％(w/w)的固体排放。如实施例1描述的，在加工之前储存1至12小时的材料被供给到消化器。消化器条件如实施例1中所描述，除了停留时间为360秒。该工艺中不保留PSF压料，但是向平行于PSF的旋转料斗(～1.9gpm)、机械精制机(在消化器之后，消化器和卸渣阀之间)(～3gpm)、和位于卸渣阀之后的排放旋流器添加水。

产生的可见纤维的质量大于实施例1中描述的产物，并且在螺旋压力机中有效地脱水。残留的固体按重量为57.7％。

纤维具有以下特征：

纤维分类

^*％表示保留在所指示的筛网上的重量分数。

水解产物液体包含具有典型的软木稀酸水解比的显著浓度的半纤维素糖(～43.5g/L)：甘露糖、木糖、葡萄糖、***糖和半乳糖。

实施例9.在1升填充床生物反应器中固定的梭菌与调节的水解产物 连续发酵422小时

产生丁醇的梭菌属菌株在具有1L标称体积和670mL工作体积的填充床生物反应器中厌氧生长。该生物反应器的L/D比是3。

梭菌被固定在骨炭上。骨炭颗粒具有3000至5000微米的尺寸，并有约0.72/ml的堆密度。约1.5磅的骨炭被装载到反应器中。通过首先用具有6％w/v软木糖合成混合物(20.04％w/w D-葡萄糖、31.32％w/w D-木糖、12.88％w/w L-***糖、35.76％w/w D-甘露糖)的约670mL的CP3培养基填充反应器，继而向反应器添加在600nm处具有约0.8的OD的60mL梭菌培养液实现固定，并重新循环反应器的内容物24小时。

初始生长培养基以及在发酵的连续部分期间使用的培养基，包含具有约45g/L糖的调节的甲虫杀死的黑松木的酸水解产物，补充以P2培养基的成分和微量元素，此外使用硫酸铵代替醋酸铵作为铵添加。水解产物如实施例7中描述的制备，并且在酸性pH的Duolite A7树脂上调节。

在接种大约21小时之后，通过以恒定的速率把生长培养基泵送到生物反应器的底部，并连续从生物反应器的顶部去除培养液以在生物反应器中维持恒定液位，来开始连续培养。连续发酵持续422小时。

在发酵持续期间运行的供给速率为8g/min并且以0.1L/min的速率添加N₂。在164和422小时之间的发酵期期间，平均的pH为约5.1。平均的丁醇滴度、生产率和产量分别为7.6g丁醇/L、5.5g丁醇/L/小时和0.26g丁醇/g碳水化合物。

实施例10.连续的固定微生物发酵中的多重生物产物的生产

梭菌在具有111.3L标称体积和65.7L工作体积的填充床生物反应器中厌氧生长。该生物反应器的L/D比是5.7。

梭菌被固定在最初用5×8筛网筛选的有约45lb/ft3的堆密度的骨炭上。约100磅的骨炭被装载到反应器中。通过首先用具有按重量4％的如实施例8中描述地制备并在酸性pH的Duolite A7树脂上调节的软木水解产物的约100L的发酵培养基填充反应器，排出约15L的供给培养基，并且继而向反应器添加具有约1的A600吸光度的15L梭菌培养液，实现固定。发酵培养液循环约24h，随后使反应器安装到连续操作中。

在生物反应器已接种之后，通过以恒定的速率把生长培养基泵送到生物反应器的底部，并连续从生物反应器的顶部去除培养液以在生物反应器中维持恒定液位，来实现连续培养。

运行的供给速率为约540g/min。平均pH为约5.5且平均压力为约3.4psi。在发酵持续期间N₂以1.0L/min的速率添加。在经过106小时的发酵时间之后，丁醇、丙酮、乙醇、醋酸和丁酸的产量分别为0.220、0.050、0.020、0.015和0.111g/g的转化糖。反应器中的糖转化在运行的过程中变化并且为近50-80％。

实施例11.从发酵培养液纯化生物丁醇

从生物反应器收集来自固定梭菌的连续培养的发酵培养液，该梭菌在具有111.3L标称体积和73.4L工作体积或填充床体积且L/D比(填料段)是5.7的填充床生物反应器中生长，并且发酵培养液被泵送到500加仑收获罐中。收获罐中的停留时间是约60h，取决于生物反应器的收获速率。在已经收集充足的材料时，施行微滤步骤(2″×3′微滤膜单元，0.1um截断值)以去除细胞团和其它碎片。

材料继而被转移到75加仑蒸汽加热分批蒸馏容器，并且用隔热的、填充的上方4″柱来提供一些回流。该容器用蒸汽间接加热，并且顶流被冷凝并通过接收器收集。容器压被维持为环境压。在从接收器排放时，材料被倾析并且富含丁醇的有机相(按重量60-80％丁醇)在较小的电加热5-阶段斯奈德蒸馏仪器(Snyder distillation apparatus)中进一步蒸馏。含丁醇的水相(按重量7-9％丁醇)被舍弃而非继续分离。回收产量为12％。

来自本实施例中描述的简单糖(5％硬木合成混合物(9.0g/l葡萄糖、32.8g/l木糖、5.8g/l***糖、3.3g/l甘露糖)+1g/L酵母提取物、2.2g/L醋酸铵、1g/L K₂HPO₄、0.1g/L KH₂PO₄))的生物丁醇的初步分析结果在表2中呈现。

表2

纯化的生物丁醇的组成

丁醇(v/v％)	水(w/w％)	醋酸(v/v％)	丁酸(v/v％)
				98.2	0.67	0.03	0.03

虽然出于清晰地理解的目的已通过说明和实例详细地描述了前述的发明，显然本领域的技术人员可以进行某些改变和修改而不背离本发明的精神和范围。因此说明书和权利要求书不应被解读为对本发明范围的限制。

为所有目的本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用全部并入，并且以如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示这样地通过引用并入的相同程度。

Claims (85)

1.一种用于生产生物产物的方法，所述方法包括在水解进料的存在下连续地发酵微生物，其中所述微生物被固定在生物反应器中的支持物上，其中所述进料是含碳水化合物的材料，其中所述水解进料通过所述进料的水解产生，其中所述水解产生用作所述发酵的碳源的碳水化合物分子，其中所述水解进料在所述发酵持续期间被连续地供给到所述生物反应器，并且其中所述微生物连续地使所述水解进料转化为生物产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述进料在所述生物反应器的上游被连续地水解并且产生的水解进料在所述发酵持续期间被连续地供给到所述生物反应器中的微生物生长培养基。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述水解进料被连续地供给到平行和/或串联布置的多个生物反应器，其中所述发酵在所述多个生物反应器中连续地发生，并且其中所述多个生物反应器包括相同或不同的微生物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述进料是纤维素材料。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述进料包括纤维素和半纤维素。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述进料是木质纤维素材料。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述木质纤维素材料是选自软木、硬木或其组合的木料。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述木质纤维素材料包括木片、锯屑、锯木厂废料或其组合。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述木质纤维素材料来自遭受病害或感染的进料来源。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述木质纤维素材料在水解之前被解构，其中所述解构包括选自预汽蒸、机械碾磨和机械***的一种或多种工艺。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述木质纤维素材料在收获之前被解构，其中由于包括干旱、感染、火灾或除草剂的一种或多种天然的或有意的原因发生所述解构。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述木质纤维素材料被预处理以去除提取物，其中所述预处理包括压缩、水提取、溶剂提取、碱提取、酶处理、真菌处理、氧处理或空气干燥，其中所述预处理发生在所述解构之前或者连同所述解构一起发生。

13.根据权利要求6所述的方法，其中所述水解通过用一种或多种酸处理来施行。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述酸包括硝酸、甲酸、醋酸、磷酸、盐酸或硫酸。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述水解用硝酸施行。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述硝酸水解包括第一阶段和第二阶段，并且其中所述第二阶段水解在高于所述第一阶段的温度下施行。

17.根据权利要求16所述的方法，其中选择所述第一阶段的条件以达到所述进料中至少约70％的半纤维素水解，并且其中选择所述第二阶段的条件以达到所述进料中至少约40％的纤维素水解。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一阶段和第二阶段的水解产物在引入到所述生物反应器中之前被合并。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一阶段和第二阶段的水解产物作为单独的水解进料流被引入到单独的生物反应器中，其中所述第一阶段水解产物被引入到第一生物反应器中且所述第二阶段水解产物被引入到第二生物反应器中，其中所述第一生物反应器和第二生物反应器包括相同或不同的微生物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一生物反应器包括第一微生物且所述第二生物反应器包括第二微生物，其中所述第一微生物和第二微生物是不同的，并且其中所述第一微生物被优化以在所述第一阶段水解产物上生长和/或产生期望的产物且所述第二微生物被优化以在所述第二阶段水解产物上生长和/或产生期望的产物。

21.根据权利要求16所述的方法，其中闪蒸蒸汽在所述第一阶段水解中生成，并且其中所述闪蒸蒸汽被用于在水解之前解构所述进料。

22.根据权利要求16所述的方法，其中闪蒸蒸汽在所述第二阶段水解中生成，并且其中所述闪蒸蒸汽被用于在水解之前解构所述进料和/或为所述第一阶段水解提供能量。

23.根据权利要求16所述的方法，其中闪蒸蒸汽在所述第二阶段水解中生成，其中所述闪蒸蒸汽被再压缩，并且其中所述再压缩的蒸汽被用于为所述第一阶段水解和/或用于产物纯化的下游蒸馏工艺提供能量。

24.根据权利要求16所述的方法，其中闪蒸蒸汽在所述第二阶段水解中生成，其中所述闪蒸蒸汽被用于为第三阶段水解提供能量，其中所述第三阶段水解的温度低于所述第二阶段水解的温度，并且其中所述较低温度比在较高温度下施行的水解容许较少降解的剩余的寡聚糖分子的水解。

25.根据权利要求16所述的方法，其中木质素在所述第二阶段水解的固相残留物中回收，其中所述含木质素的残留物被干燥至液体含量为约35％或更少并且其中所述含木质素的残留物被用作所述方法和/或发电的能量来源。

26.根据权利要求1所述的方法，其中在使所述水解进料被引入到所述生物反应器中之前，所述水解进料被调节以去除微生物生长和/或生物产物生产的抑制剂。

27.根据权利要求26所述的方法，其中抑制剂的去除包括选自石灰过中和、吸附、沉淀和离子交换的一种或多种工艺。

28.根据权利要求27所述的方法，其中抑制剂的去除通过使水解进料与离子交换树脂在其中所述抑制剂被保持在所述树脂上的条件下接触来施行。

29.根据权利要求27所述的方法，其中抑制剂的去除通过用铝盐或铁盐沉淀来施行。

30.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是梭菌属(Clostridium)菌株。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述梭菌属菌株来自选自糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的物种。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述梭菌属菌株是环境分离株或来自环境分离株。

33.根据权利要求1所述的方法，其中在其上固定所述微生物的所述支持物材料选自骨炭、聚丙烯、钢、硅藻土、沸石、陶瓷、工程热塑料、粘土砖、混凝土、熔岩、木片、聚酯纤维、玻璃珠、特氟龙、聚醚醚酮和聚乙烯。

34.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定的微生物包括生物膜。

35.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物反应器是填充床、膨胀床或流化床的形式。

36.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物产物包括选自丁醇、丙酮、乙醇或其组合的生物燃料。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述生物燃料包括丁醇。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述微生物是梭菌属菌株。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述梭菌属菌株相对于同样条件下生长的所述梭菌属菌株所来自的野生型菌株或亲本菌株、糖丁酸梭菌B643、糖丁酸梭菌P262、糖乙酸多丁醇梭菌N1-4、丙酮丁醇梭菌824或拜氏梭菌8524具有选自以下的一种或多种表型特征：丁醇耐受性、对发酵抑制剂的耐受性、低酸积累、连续发酵中的稳定性、高丁醇滴度、以高的丁醇丙酮比生产生物燃料、增加的每单位进料的丁醇产量、增加的每单位细胞生物质的丁醇产量、增加的氧耐受性、增加的粘附于固体支持物的能力以及降低的产孢能力。

40.根据权利要求1所述的方法，还包括从所述发酵培养基回收所述生物产物。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述回收工艺在所述发酵持续期间连续地操作。

42.根据权利要求37所述的方法，还包括从所述发酵培养基回收丁醇，其中所述回收包括蒸馏以使丁醇与所述发酵培养基的其它成分分离。

43.根据权利要求42所述的方法，其中在所述蒸馏中回收丁酸，并且其中所述丁酸被添加到所述生物反应器中的所述发酵培养基中，其中所述微生物使所述丁酸转化成丁醇。

44.根据权利要求42所述的方法，其中闪蒸蒸汽在所述进料的水解期间生成并且所述闪蒸蒸汽为所述蒸馏提供能量。

45.一种生产生物产物的***，所述***包括进料水解单元和生物反应器，其中含碳的进料在所述水解单元中被水解并且所述水解进料被连续地供给到所述生物反应器，其中所述生物反应器包括固定在支持物上的发酵微生物，其中所述进料的水解产生用作所述发酵的碳源的碳水化合物分子，并且其中所述微生物使所述水解进料连续地转化为生物产物。

46.根据权利要求45所述的***，其中所述进料水解单元和所述生物反应器流体连通，其中所述水解单元在所述生物反应器的上游，并且其中所述进料在所述发酵持续期间被连续地水解并被连续地供给到所述生物反应器。

47.根据权利要求46所述的***，所述***包括平行布置的多个生物反应器，其中所述多个生物反应器与所述水解单元流体连通，其中所述水解进料被连续地供给到所述生物反应器，其中所述微生物的发酵在所述生物反应器中连续地发生，并且其中所述多个生物反应器包括相同或不同的微生物。

48.根据权利要求46所述的***，所述***包括串联布置的多个生物反应器，其中串联中的第一生物反应器与所述水解单元以及下游生物反应器流体连通，其中在所述第一生物反应器下游的串联中的每个随后的生物反应器都与串联中上游的上一个生物反应器流体连通，其中所述水解进料被连续地供给到串联中的所述第一生物反应器，并且其中来自每个生物反应器的流出物被供给到串联中下游的下一个生物反应器。

49.根据权利要求45所述的***，其中所述进料是纤维素材料。

50.根据权利要求49所述的***，其中所述进料是木质纤维素材料。

51.根据权利要求50所述的***，其中所述木质纤维素材料包括木片、锯屑、锯木厂废料或其组合。

52.根据权利要求51所述的***，其中所述木质纤维素材料在水解之前被解构，其中所述解构工艺包括选自预汽蒸、机械碾磨、机械***或其组合的一种或多种工艺。

53.根据权利要求52所述的***，其中所述木质纤维素材料被预处理以去除提取物，其中所述预处理包括压缩、水提取、溶剂提取、碱提取、酶处理、真菌处理、氧处理或空气干燥，其中所述预处理发生在所述解构之前或者连同所述解构一起发生。

54.根据权利要求45所述的***，其中所述水解通过用一种或多种酸处理来施行。

55.根据权利要求54所述的***，其中所述酸包括硝酸、甲酸、醋酸、磷酸、盐酸或硫酸。

56.根据权利要求55所述的***，其中所述水解用硝酸施行。

57.根据权利要求56所述的***，其中所述水解单元包括第一水解模块和第二水解模块，其中硝酸水解包括所述第一水解模块中的第一阶段和所述第二水解模块中的第二阶段，并且其中所述第一水解模块中的硝酸的温度高于所述第二水解模块中的硝酸的温度。

58.根据权利要求57所述的***，其中来自所述第一水解模块和第二水解模块的所述水解产物流在被引入到所述生物反应器中之前被合并。

59.根据权利要求57所述的***，其中来自所述第一水解模块和第二水解模块的水解产物流作为单独的水解进料流被引入到单独的生物反应器中，其中所述第一阶段水解产物被引入到第一生物反应器中且所述第二阶段水解产物被引入到第二生物反应器中，其中所述第一生物反应器和第二生物反应器包括相同或不同的微生物。

60.根据权利要求59所述的***，其中所述第一生物反应器包括第一微生物且所述第二生物反应器包括第二微生物，其中所述第一微生物和第二微生物是不同的，并且其中所述第一微生物被优化以在所述第一阶段水解产物上生长和/或生产生物产物且所述第二微生物被优化以在所述第二阶段水解产物上生长和/或生产生物产物。

61.根据权利要求57所述的***，其中闪蒸蒸汽在所述第一阶段水解中生成，并且其中向所述进料提供所述闪蒸蒸汽以在所述水解之前解构所述进料。

62.根据权利要求57所述的***，其中闪蒸蒸汽在所述第二阶段水解中生成，并且其中向所述进料提供所述闪蒸蒸汽以在水解之前解构所述进料和/或向所述第一水解模块提供所述闪蒸蒸汽以为所述第一阶段水解提供能量。

63.根据权利要求57所述的***，其中闪蒸蒸汽在所述第二阶段水解中生成，其中所述闪蒸蒸汽被再压缩，并且其中向所述第一水解模块提供所述再压缩的蒸汽以为所述第一阶段水解和/或用于产物纯化的下游蒸馏工艺提供能量。

64.根据权利要求57所述的***，其中闪蒸蒸汽在所述第二阶段水解中生成，其中向第三水解模块提供所述闪蒸蒸汽以为第三阶段水解提供能量，其中所述第三水解模块中的温度低于所述第二水解模块中的温度，并且其中所述较低温度比在较高温度下施行的水解容许较少降解的剩余的寡聚糖分子的水解。

65.根据权利要求57所述的***，其中木质素在所述第二阶段水解的固相残留物中回收，其中所述含木质素的残留物被干燥至液体含量为约35％或更少并且其中所述含木质素的残留物被用作所述方法和/或发电的能量来源。

66.根据权利要求57所述的***，所述***还包括调节单元，其中所述调节单元与所述水解单元和所述生物反应器都流体连通，其中所述调节单元在所述水解单元的下游并在所述生物反应器的上游，其中在所述水解进料被引入到所述生物反应器中之前，所述水解进料在所述调节单元中被调节以去除微生物生长和/或生物产物生产的抑制剂。

67.根据权利要求66所述的***，其中所述水解工艺和调节工艺在所述发酵持续期间连续地发生。

68.根据权利要求66所述的***，其中抑制剂的去除包括选自石灰过中和、吸附和离子交换的一种或多种工艺。

69.根据权利要求68所述的***，其中所述调节单元包括离子交换树脂，其中抑制剂的去除通过使所述水解进料与所述离子交换树脂在其中所述抑制剂被保持在所述树脂上的条件下接触来施行。

70.根据权利要求68所述的***，其中抑制剂的去除通过用铝盐或铁盐沉淀来施行。

71.根据权利要求45所述的***，其中所述发酵在厌氧条件下实施。

72.根据权利要求71所述的***，其中所述微生物是梭菌属菌株。

73.根据权利要求45所述的***，其中在支持物上固定所述微生物的所述支持物材料选自骨炭、聚丙烯、钢、硅藻土、沸石、陶瓷、工程热塑料、粘土砖、混凝土、熔岩、木片、聚酯纤维、玻璃珠、特氟龙、聚醚醚酮和聚乙烯。

74.根据权利要求45所述的***，其中所述固定的微生物包括生物膜。

75.根据权利要求45所述的***，其中所述生物反应器包括填充床、膨胀床或流化床。

76.根据权利要求45所述的***，其中所述生物产物包括选自丁醇、丙酮、乙醇或其组合的生物燃料。

77.根据权利要求76所述的***，其中所述生物燃料包括丁醇。

78.根据权利要求45所述的***，所述***还包括用于从所述发酵培养基回收所述生物产物的回收单元。

79.根据权利要求78所述的***，其中所述回收单元与所述生物反应器流体连通并在所述生物反应器的下游，其中所述回收工艺在所述发酵持续期间连续地操作。

80.根据权利要求78所述的***，其中所述回收单元包括用于浓缩所述生物产物的浓缩模块。

81.根据权利要求80所述的***，其中所述回收单元包括使所述生物产物与所述发酵培养基的其它成分分离的蒸馏模块，其中所述蒸馏模块与所述浓缩模块流体连通并在所述浓缩模块的下游。

82.根据权利要求77所述的***，所述***还包括用于从所述发酵培养基回收丁醇的回收单元，其中所述回收包括蒸馏以使所述丁醇与所述发酵培养基的其它成分分离。

83.根据权利要求82所述的***，其中在所述蒸馏中回收丁酸，并且其中所述丁酸被添加到所述生物反应器中的所述发酵培养基，其中所述微生物使所述丁酸转化成丁醇。

84.根据权利要求82所述的***，其中闪蒸蒸汽在所述进料的水解期间生成并且所述闪蒸蒸汽为所述蒸馏提供能量。

85.根据权利要求45所述的***，其中所述生物反应器在使所述生物反应器中的气体压缩的压力下操作。

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