发明内容
在本发明的第一个广义方面中,提供一种优化对生物反应器的含CO底物供应的方法,其中用一种或多种一氧化碳营养微生物的培养物对所述底物进行发酵以产生包含一种或多种醇和/或酸的产物,所述方法包括在第一时间点和第二时间点确定所述生物反应器中的酸水平,其中第一时间点和第二时间点之间的酸水平变化导致底物供应的变化。
在具体实施方案中,所述第一和第二时间点之间酸水平的上升导致底物供应的增加。
在具体实施方案中,所述第一和第二时间点之间酸水平的下降导致底物供应的减少。
在本发明的第二个广义方面中,提供一种增加在生物反应器中由一种或多种一氧化碳营养微生物的培养物对含CO底物进行发酵以产生包含酸和/或醇的产物的效率的方法,其中供应所述底物以使得所述反应器中的酸水平保持在预定阙值浓度之间。
在具体实施方案中,所述底物供应响应酸水平变化而被自动控制。
在具体实施方案中,酸水平保持在1-10g/L发酵液的预定阙值浓度之间。在具体实施方案中,酸水平保持在2-8g/L发酵液的预定阙值浓度之间。在具体实施方案中,酸水平是通过测量所述培养物的pH来确定。
在具体实施方案中,所述发酵是连续的。
在本发明的第三个广义方面中,提供一种确定最佳底物供应水平和/或范围的方法,所述方法包括以这样的水平或基本接近这样的水平向生物反应器中的一种或多种一氧化碳营养微生物的培养物提供底物,即所述水平使得通过对含CO底物进行发酵产生所需的醇:酸产物的比例。
在前述方面的具体实施方案中,所述酸是乙酸。在具体实施方案中,所述醇是乙醇。
在本发明的第四个广义方面中,提供一种提高对底物进行微生物发酵以生产产物的整体效率的方法,所述方法包括以基本接近最佳水平、最佳水平或在最佳范围内向微生物培养物提供底物。
在具体实施方案中,所述底物包含CO。
在具体实施方案中,所述产物是酸和/或醇。在本发明的具体实施方案中,醇(尤其是乙醇)的产生不伴随酸(尤其是乙酸盐)的产生。
在具体实施方案中,所述方法包括提供所述底物以使得发酵培养基的pH保持基本恒定或者在预定范围内。在具体实施方案中,提供所述底物以使得发酵过程中酸浓度基本没有净改变。
在具体实施方案中,提供所述底物以使得pH保持在所需范围内。在具体实施方案中,所需范围是最佳运行pH±0.5。一般地,提供所述底物以使得pH保持在5-6之间;或者5.1-5.9之间,或者5.2-5.8之内;或者5.3-5.7之间;或者5.4-5.6之间;或者基本上为5.5。
在第五个广义方面中,提供一种提高对底物进行微生物发酵以生产产物的整体效率的方法,所述方法包括监测pH并基于pH变化控制底物供应。在具体实施方案中,所述底物包含CO。
在具体实施方案中,控制所述底物供应以使得pH保持基本恒定或者在预定范围内,或者以预定变化速率改变。
在具体实施方案中,所述方法包括响应pH下降而增加底物供应。另外地或者可选地,所述方法包括响应pH增加而减少底物供应。
在本发明的具体实施方案中,所述方法包括通过已知分析方法监测发酵液中的代谢物浓度。
在本发明的第六个广义方面中,提供一种提高对底物进行微生物发酵以生产产物的整体效率的方法,所述方法包括以基本接近最佳水平、最佳水平或在最佳范围之内的水平向微生物培养物提供所述底物。
在具体的实施方案中,所述底物包含CO。
在具体的实施方案中,所述产物是酸和/或醇。在具体的实施方案中,生产产物以使得所述培养物产生的酸∶醇的理想产物比例为至少1∶1、或至少1∶2、或至少1∶3、或至少1∶4、或至少1∶5、或至少1∶10或至少1∶20。在本发明的具体实施方案中,醇(尤其是乙醇)的产生不伴随酸(尤其是乙酸盐)的产生。
在具体的实施方案中,所述方法包括提供所述底物以使得所述微生物培养物产生氢气。在具体的实施方案中,提供所述底物以使得氢气以所述微生物培养物消耗的底物的至少0.5mol%、或至少1.0mol%、或至少1.5mol%、或至少2.0mol%的水平产生。另外地或者可选地,提供所述底物以使得所述微生物培养物的具体CO摄取量保持在每分钟每克生物质消耗的CO为0.6-1.5mmol(mmol/g/min)。在具体的其中所述底物包含CO的实施方案中,随着底物可利用性增加至最佳量以上(或者最佳范围以上),过量的CO抑制氢化酶,从而基本上阻止H2产生。由于氢化酶受到抑制,微生物无法自身除去过量还原力,从而导致培养问题,例如生长抑制和/或微生物死亡。
在本发明的第七个广义方面中,提供一种提高对底物进行微生物发酵以生产产物的整体效率的方法,所述方法包括监测由微生物培养物产生的氢气并且基于氢气的产生控制底物供应。
在具体实施方案中,所述底物包含CO。
在本发明的具体实施方案中,控制所述底物供应以使得所述微生物培养物产生的氢气水平为所述培养物消耗的底物的至少0.5mol%;或至少1.0mol%;或至少1.5mol%;或至少2.0mol%。
在具体的实施方案中,增加所述底物供应以使得氢气产生的水平保持在所述微生物培养物消耗的底物的至少0.5mol%、或至少1.0mol%、或至少1.5mol%或至少2.0mol%。另外地或者可选地,底物供应可减少或保持基本恒定,以使得氢气产生的水平保持在所述微生物培养物消耗的底物的至少0.5mol%、或至少1.0mol%、或至少1.5mol%或至少2.0mol%。
在第八个方面中,提供提高一种对底物进行微生物发酵以生产产物的整体效率的方法,所述方法包括向微生物培养物提供所述含CO底物以使得所述微生物培养物的具体摄取量基本上保持在每分钟每克生物质消耗的CO为0.6-1.5mmol(mmol/g/min)。在具体的实施方案中,提供所述含CO底物以使得具体的摄取量基本上保持在0.8-1.2mmol/g/min。
在所述各方面的具体实施方案中,所述含CO底物是气态的。在具体的实施方案中,所述气态底物包含作为工业过程副产物得到的气体。在一些实施方案中,所述工业过程选自铁金属产品制造、非铁产品制造、石油炼制过程、生物质的气化、煤的气化、电能生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。具有低浓度例如6%的CO的底物也可以是合适的,特别是当还存在H2和CO2时。
在所述各方面的具体实施方案中,所述含CO底物一般会含有较大比例的CO,例如以体积计至少约20%至约100%CO,以体积计约40%至95%CO,以体积计40%至60%CO,以及以体积计45%至55%CO。在具体的实施方案中,所述底物包含以体积计约25%、或约30%、或约35%、或约40%、或约45%、或约50%CO、或约55%CO或约60%CO。
在所述各方面的具体实施方案中,所述发酵过程产生的醇是乙醇。所述发酵反应还可产生乙酸盐。
在所述各方面的具体实施方案中,所述发酵反应由一种或多种产乙酸菌的菌株进行。优选地,所述产乙酸菌选自梭菌属、穆尔氏菌属(Moorella)和氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus),例如Clostridiumautoethanogenum、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)和热醋穆尔氏菌(Morella thermoacetica)。在一个实施方案中,所述产乙酸菌是Clostridiumautoethanogenum。
在本发明的第九个广义方面中,提供一种用于对底物进行微生物发酵以生产产物的***,包括设计用于进行所需发酵的生物反应器、设计用于在所需发酵期间测定发酵液pH的测定器件和适于控制底物供应的控制器件。
在具体实施方案中,所述***被设计用于提供含CO底物。
在具体的实施方案中,所述控制器件被设计用于在pH已偏离预定值或范围时对底物供应进行一种或多种调整。
在具体实施方案中,所述***包括操作器件。在具体实施方案中,所述操作器件与所述控制器件连接,使得底物供应能够响应于pH变化而自动调节。在具体实施方案中,控制所述底物供应以使得当pH下降时底物供应量增加并且/或者当pH下降时底物供应量减少。
在本发明的第十个广义方面中,提供一种用于对底物进行微生物发酵以生产产物的***,包括设计用于进行所需发酵的生物反应器、设计用于在所需发酵期间测定产生的氢气量的测定器件和适于控制底物供应的控制器件。
在具体实施方案中,所述***被设计用于提供含CO底物。在某些实施方案中,所述测定器件还测定发酵期间所消耗的底物量。所述测定器件可任选地连接至操作器件,这样使得可以测定H2产生的/CO消耗的比例。
在具体实施方案中,所述控制器件被设计用于在H2产生的/CO消耗的比例已偏离预定值或范围时对底物供应进行一种或多种调整。
在具体的实施方案中,所述操作器件与所述控制器件连接,使得底物供应能够响应于H2产生和/或H2产生的/CO消耗的比例的变化而自动调节。
在本发明第十一个广义方面中,提供一种用于进行微生物发酵以生产产物的***,包括:
i.设计用于进行含CO底物的发酵的生物反应器
ii.测定器件;和
iii.控制器件;
其中,所述控制器件被设计用于响应于由所述测定器件所作出的测定结果来控制含CO底物的供应。
在具体实施方案中,所述测定器件被设计用于测定发酵中产生的一种或多种酸的量。
在具体实施方案中,所述测定器件被设计用于测定发酵的pH。
在具体的实施方案中,所述测定器件被设计用于测定发酵中产生的H2的量。
尽管本发明广义上如上所限定,但其并不限于此并且还包括由以下说明书提供的实施例的实施方案。
具体实施方式
根据本发明的具体方面,提供了提高底物的微生物发酵整体效率的方法,所述方法包括提供基本为最佳水平、接近最佳水平或在最佳范围内的底物。在本发明的具体实施方案中,所述底物包含CO并且被提供给一种或多种一氧化碳营养细菌,例如产乙酸菌。在合适的厌氧条件下,产乙酸菌(例如Clostridium autoethanogenum、扬氏梭菌、Clostridiumragsdalei和Clostridium carboxydivorans)将含CO底物转变为包含酸和醇的产物。
如以引用方式全文纳入本文的PCT/NZ2010/000009中所述,已经认识到以最佳或接近最佳的水平或范围向微生物培养物提供底物(例如含CO底物)能够获得最佳的微生物生长和/或需要的代谢物生产。例如,已认识到以最佳或接近最佳的水平向包含一种或多种一氧化碳营养微生物的微生物培养物提供含CO底物会获得良好的微生物生长和所需产物(例如一种或多种醇)的生产。
为了保持最佳微生物生长和所需产物的生产,必须在发酵过程中以最佳或接近最佳水平将所述底物基本连续地提供给所述微生物培养物。偏离最佳供应可导致生长减缓、产生更少的所需产物,或者在极端情况下可导致微生物生长抑制或微生物死亡。
不希望囿于理论的,本发明人认为至少部分底物(尤其是含CO底物)会被微生物培养物氧化以产生可用于代谢物产生和/或细胞生长的能量(还原当量)。增加底物供应致使可用于代谢物生产和/或生长的还原当量增加。一般地,在底物受限的培养物中,还原当量被用于微生物培养物以生长并且产生例如酸的产物。但是,随着底物供应增加,微生物可使用额外的底物生产额外的还原当量,其可被用于将例如酸的产物还原为例如醇的所需产物。随着底物供应向最佳水平增长,醇的量相对于酸增长,因为所述微生物使用了增加量的还原当量。一般地,在这样的实施方案中,所述微生物培养物会生长并产生醇,例如乙醇。
将底物提供给一种或多种微生物的所述底物供应或水平主要与所述底物向水性发酵液中的质量传递速率有关。气体向液体中的质量传递是三个主要变量的函数:
1.浓度驱动力(Concentration Driving Force):具体气态组分的分压基本上与该组分被溶入溶液的速率成比例。
2.界面表面面积:气相和液相之间的界面表面积越大,质量传递的机会越高。具体地,界面表面积一般是气体滞留和气泡大小的函数。
3.传递系数:***的传递系数受多种因素的影响。但是,从实际来看,一般最大的影响因素是液相和气相之间的相对速度。一般可通过搅拌或其他混合增加扰动从而增加相对速度(并且因而增加质量传递)。
本领域技术人员知晓增加底物向溶液中的质量传递的方法。然而,举例来说,所述底物供应或水平能够通过以下一种或多种方法增加:增加向生物反应器提供底物的速率,增加所述底物的分压;或者通过机械方法,例如增加搅拌釜生物反应器(stirred tank bioreactor)的搅动,或者增加具体生物反应器的质量传递特性。已知很多促进向气态底物发酵中的微生物的质量传递的仪器和设备。
已经认识到将可被微生物培养物利用以转化为产物的底物的量增加接近最佳水平,会导致所产生的醇的量相对于酸增加。在本发明的具体实施方案中,生产产物以使得所述培养物产生理想的酸∶醇产物比例为至少1∶1、或至少1∶2、或至少1∶3、或至少1∶4、或至少1∶5、或至少1∶10或至少1∶20。在具体的实施方案中,对含CO底物的稳定状态连续发酵会产生包含乙酸盐和/或醇的产物。在具体实施方案中,在稳定状态下,当以最佳或接近最佳水平提供所述底物时,在所述发酵液中乙酸盐的浓度保持低于10g/L、或低于9g/L、或低于8g/L、或低于7g/L、或低于6g/l或低于5g/L。
在本发明的其他实施方案中,醇(尤其是乙醇)的产生不伴随酸(尤其是乙酸盐)的产生。但是,底物的可利用性过高(通过过度供给)可导致培养问题,例如生长抑制和/或微生物死亡。
根据具体的方面,本发明提供通过以下方式来优化对底物(尤其是含CO底物)的微生物发酵的方法,即控制底物的供应从而使得以最佳水平、接近最佳水平或在最佳范围内提供所述底物以促进培养物生活力和生长以及所述代谢物(例如乙醇)的生产。已认识到,因微生物种群的大小不同,所述最佳水平(或范围)可随时间改变。例如,在具体的实施方案中,当以最佳或接近最佳水平提供底物时,培养物以少于2g/g生物质/天、或少于1.5g/g/天、或少于1.2g/g/天或少于1g/g/天的具体速率产生酸,例如乙酸盐。
因此,本发明的方法提供了优化底物供应而不必考虑所述微生物培养物大小的方法。例如,在分批或加料分批发酵中,在生长期中微生物培养物呈指数生长。因此,所述底物应当以渐增量提供,这样使得可以连续提供基本最佳量的底物。另外地或者可选地,在连续培养中,必须较长时期内以最佳或接近最佳的水平或范围提供所述底物以维持可持续的微生物生长和所需代谢物生产。已认识到操作条件(例如新鲜培养基供应速率、温度、pH、ORP、培养物生活力)的微小变化能够导致生物质水平改变,从而导致底物需求改变。根据本发明的方法,可以不考虑生物质的变化,以最佳或接近最佳的水平提供底物。
根据具体的方面,所述优化方法包括监测发酵培养基的pH并且基于pH测量结果或pH随时间的变化来控制底物供应。在具体实施方案中,将底物提供给发酵培养基中的微生物培养物,使得所述培养基的pH基本上以预定或接近预定的变化速率或者在预定的变化速率范围内变化。在具体的实施方案中,所述变化速率接近零,使得在一些实施方案中所述培养基的pH基本上保持恒定或者在预定范围内。在本发明的具体方面中,在限制底物供应的时期,产乙酸菌产生包含乙酸的产物。因此,含有底物受限的产乙酸培养物的发酵培养基的pH会下降,除非通过加入碱对pH进行控制。根据以引用方式全文纳入本文的WO2009/113878中描述的发明,当过量提供含CO底物时,乙酸盐会被转变为醇,并且pH会升高,除非通过加入酸对pH进行控制。因此,在最佳生长和/或醇生产条件下,微生物培养物可产生或消耗酸性代谢物。在具体的实施方案中,最佳醇生产率与例如乙酸盐的酸的共产生有关。因此,酸性代谢物(例如乙酸盐)的产生将导致所述发酵液的pH随着时间下降。在本发明的具体实施方案中,生产产物使得所述培养物产生的理想酸∶醇产物比为至少1∶1、或至少1∶2、或至少1∶3、或至少1∶4、或至少1∶5、或至少1∶10或至少1∶20,并且pH会因所述微生物培养物产生酸而改变。
已认识到发酵液体培养基的pH可因多种影响因素而改变,所述影响因素例如一种或多种酸或碱的消耗或产生或其结合。例如,微生物培养物在微生物生长期间进行的氮固定可导致pH下降。在具体实施方案中,一氧化碳营养微生物(例如Clostridium autoethanogenum)可以摄取NH3形式的氮,这可导致发酵液的pH随着时间流逝而下降。所述微生物培养物还可产生和/或消耗其他代谢物(例如磷酸盐和/或乳酸盐),从而影响发酵液体培养基的pH。已认识到乙酸盐一般是产乙酸细菌发酵中的重要产物,并且通常对pH有最大的影响。
因此,在具体的实施方案中,本发明提供一种以最佳或接近最佳水平或范围提供底物的方法,所述方法包括将pH变化基本上维持在预定或接近预定的变化速率上。根据具体的实施方案,对于给定微生物培养物,所需的pH变化速率可通过实验方法确定。例如,可为微生物培养物提供最佳量的底物以实现最佳生长和/或所需代谢物生产,并且可监测pH变化。在发酵期间,所述微生物培养物可产生和/或消耗酸性和/或碱性组分,导致pH随时间变化。之后可使用该(预先)确定的pH变化速率来控制在随后发酵中对微生物培养物的底物供应。
在具体的实施方案中,得到最佳供应的微生物培养物生长并产生包含醇(例如乙醇)和酸(例如乙酸盐)的代谢物。在稳定状态的代谢物产生期间,酸的产生会保持基本恒定,这样使得pH变化速率会基本恒定。如果pH下降快于预定的变化速率,可以确定所述培养物正在产生更多的酸,可将所述底物供应向最佳速率增加。如果pH下降慢于预定的变化速率,可以推断所述培养物以较慢的速率产生酸,可将所述底物供应向最佳速率减少。如果pH增加,可以推断所述培养物消耗酸,可将所述底物供应向最佳速率减少。
在另一个实施方案中,pH变化可通过加入酸或碱来抵消以维持基本恒定的pH。在这样的实施方案中,向所述发酵加入酸/碱的速率可用于确定最佳底物供应。
在具体的实施方案中,出乎意料地认识到可通过供应需要水平的底物(尤其是含CO底物)将pH维持在预定水平或者在预定范围内来优化微生物生长和醇产生。可通过确保没有例如乙酸盐的酸性代谢物净产生或消耗使pH维持在预定水平或预定范围内。在这样的实施方案中,pH的变化速率近似于零。如果在发酵期间pH开始下降,可以推断所述培养物产生酸例如乙酸盐,并且所述培养物的底物受限。因此,根据本发明的方法,应当增加所述底物供应。相反地,如果在发酵期间pH开始升高,可以推断有酸(例如乙酸盐)向醇(例如乙醇)的净转化,并且所述培养物的底物供应过度。因此,根据本发明的方法,应当减少所述底物供应。
这种控制方法在培养微生物培养物中尤其重要,因为所述培养物的底物需求会随时间而改变。例如,如果所述培养物是以分批操作培养的,那么一个时间点的底物最佳水平可能是后一时间点的底物受限量。考虑到在指数生长期间,所需要的底物最佳量被认为也会是基本上指数增长的。在连续操作中,即使在稳定状态,所述培养物的动态状况也意味着可以响应于所述微生物培养物的微小变化而以最佳或接近最佳水平连续提供底物供应。
已认识到底物的最佳供应还依赖于发酵操作要求。例如,在分批发酵(或连续培养的分批起始阶段)中,可能需要提供底物使得没有乙酸盐的净产生或消耗,并且pH没有变化。在连续操作中,可能需要连续产生少量的乙酸,这样可以维持稳定的培养。
另外地或者可选地,可以通过任何本领域中已知的方法监测代谢物(例如乙酸盐和其他酸如乳酸以及碱例如NH3)的积累和/或消耗,并且可以响应于代谢物水平来控制底物供应。例如,可通过本领域技术人员所熟悉的多种分析技术例如GC、HPLC、GCIR、GCMS、LCMS、NIR,借助一种或多种选择性探针例如amperomic探针或其他合适的测定法,定期或者基本连续地检测发酵罐中的乙酸盐和/或乳酸浓度。可监测所述生物反应器中的发酵培养基和/或排出所述生物反应器的培养基(例如来自连续发酵的产物流)中的代谢物浓度,并且根据所测量的所述培养基中的代谢物来优化底物水平。例如,如果乙酸盐开始在所述培养基中累积超过预定阙值,可根据本发明的方法增加底物供应。类似地,如果乙酸盐浓度下降至预定的或预设的阙值之下,可减少底物供应。在具体的实施方案中,在稳定状态下,当以最佳或接近最佳水平提供所述底物时,乙酸盐会保持在约1-10g/L、或约2-8g/L、或约3-7g/L或约4-6g/L的预定浓度范围内。
在具体的实施方案中,在稳定状态下,当以最佳或接近最佳水平提供所述底物时,乙酸盐在所述发酵液中会保持在约10g/L、或约9g/L、或约8g/L、或约7g/L、或约6g/L或约5g/L的浓度。在具体实施方案中,当底物是以最佳水平或接近最佳水平被提供时,所述培养物以少于2g/g生物质/天、或少于1.5g/g/天、或少于1.2g/g/天或少于1g/g/天的具体速率产生酸例如乙酸盐。
因此,根据本发明的方法,培养基pH可被用作所述培养物得到基本最佳量,或者至少是最佳范围内的底物供应的指示。此外,通过将所述培养基保持在所需pH或者保持在预定pH范围内,可以优化底物供应,尤其是含CO底物的供应。
根据本发明的具体方面,改善微生物发酵的方法包括监测微生物培养物的氢气(H2)产生和根据H2产生来控制底物供应。在具体的实施方案中,当以最佳或者接近最佳的水平或范围提供含CO底物并且提供极少或者不提供H2时,一种或多种一氧化碳营养微生物产生H2。在本发明的具体实施方案中,在有限底物供应期间,一氧化碳营养细菌(例如Clostridium autoethanogenum)将一部分底物转化为产物例如酸和少量醇,另一部分用于细胞物质的合成代谢生产(生长)。在这样的有限底物供应期间,基本上不产生H2。已出乎意料地认识到当底物供应向最佳水平增加时,一氧化碳营养细菌(例如C.autoethanogenum)将一部分底物转变为例如酸和醇的产物,另一部分转变为细胞物质,还有一部分转变为H2。在具体的实施方案中,当以最佳或接近最佳水平或者在最佳范围内提供底物(尤其是含CO底物)时,除产生例如乙醇的所需代谢物之外,还产生H2。还认识到过量供应含CO底物能够导致对氢化酶的抑制,从而减少所述培养物产生的H2的量。因此,根据本发明,可通过监测由所述培养物产生的H2而以最佳或接近最佳水平或者在最佳范围内提供所述底物。
在其中所述底物包含CO的具体实施方案中,随着底物可利用性增加至最佳量以上(或者最佳范围以上),过量的CO抑制氢化酶,从而基本上阻止H2产生。因为氢化酶受到抑制,所述微生物自身不能消除过量的还原力,从而导致培养问题,例如生长抑制和/或微生物死亡。
因此,根据本发明的方法,微生物培养物产生的氢气可被用作所述培养基得到基本上最佳量或者至少是最佳范围内的底物供应的指示。此外,微生物培养物的氢气产生可被用于控制对所述微生物培养物的底物供应。例如,可增加对底物限制培养物的底物供应,直到观察到氢气产生。氢气产生开始后,可调节底物供应以随时间维持氢气产生。随着微生物培养物生长,可增加底物供应以保持氢气产生。
该控制方法在正在生长的微生物培养物中尤其重要,因为所述培养物的底物需求会随时间而变化。例如,如果所述培养物生长,则一个时间点的底物最佳水平可能是后一时间点的底物限制量。在指数生长期间,需要的底物最佳量被认为也将基本上呈指数增长。
已认识到氢化酶是可逆的,因此微生物培养物可将含氢气的底物流的氢气组分用作能量来源。因此,在具体的实施方案中,所述优化方法使用的含CO底物包含极少量的氢气,或者基本不含氢气。
定义
除非另有说明,以下本说明书通篇使用的术语定义如下:
当术语“提高效率”、“提高的效率”等用于发酵过程时,包括但不限于提高以下一方面或多方面:催化所述发酵的微生物的生长速率、消耗每体积底物(例如一氧化碳)所产生的所需产物(例如醇)的体积、所需产物的产生速率或产生水平以及与所述发酵的其他副产物相比的所需产物的相对比例。类似地,术语“优化”等包括在给定的一组发酵条件下将效率向最大效率提高。
术语“含一氧化碳底物”和类似的术语应被理解为包括,例如,其中的一氧化碳可被一种或多种细菌菌株用于生长和/或发酵的任何底物。
术语“包含一氧化碳的气态底物”包括任意包含一氧化碳的气体。所述气态底物一般包含较大比例的CO,优选以体积计至少约5%至约100%CO。
在有关发酵产物的上下文中,本文使用的术语“酸”包括羧酸及相关的羧酸阴离子,例如存在于本文描述的发酵液中的游离乙酸和乙酸盐的混合物。所述发酵液中分子酸与羧酸盐的比例依赖于所述***的pH。术语“乙酸盐(acetate)”包括单独的乙酸盐,以及分子乙酸或游离乙酸与乙酸盐的混合物,例如如本文描述的存在于发酵液中的乙酸盐和游离乙酸的混合物。所述发酵液中分子乙酸与乙酸盐的比例依赖于所述***的pH。
术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或者管道装置组成的发酵设备,其包括连续搅拌釜反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、移动床生物膜反应器(MBBR)、泡罩塔、气升发酵罐、例如中空纤维膜生物反应器(HFMBR)的膜反应器、静态混合器或适合气-液接触的其他容器或其他设备。
本文使用的术语“质量传递”是指原子或分子(尤其是底物原子或分子)从气相向水性溶液中的传递。
除非上下文另有说明,本文使用的术语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等意欲包括所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段。正如本文将进一步描述的,在一些实施方案中,所述生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此,向发酵反应加入金属或组合物应当理解为包括向所述反应器之一或两者加入。
尽管以下说明重点在于本发明的具体实施方案,即使用CO作为主要底物生产乙醇和/或乙酸盐,然而应理解本发明可用于生产其他醇和/或酸以及使用本发明所属技术领域普通技术人员知晓的其他底物。例如,可以使用含一氧化碳和氢气的气态底物。此外,本发明可用于生产丁酸、丙酸、己酸、乙醇、丙醇和丁醇的发酵。所述方法还可用于生产氢气。举例来说,这些产物可通过使用来自以下属的微生物发酵来产生:穆尔氏菌属、梭菌属(Clostridia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、丁酸杆菌属(Butyribacterium)、产醋杆菌属(Oxobacter)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷八叠球菌属和脱硫杆菌属(Desulfotomaculum)。
本发明的一些实施方案适合使用由一种或多种工业过程产生的气体流。这样的过程包括炼钢过程,尤其是产生具有高CO含量或高于预定水平(即5%)的CO含量的气体流的过程。根据这样的实施方案,优选地在一个或多个生物反应器中,使用产乙酸细菌产生酸和/或醇,尤其是乙醇或丁醇。本领域技术人员会在考虑本公开内容的情况下意识到,本发明可被应用于各种工业或废气流,包括具有内燃机的车辆的废气流。同样,本领域技术人员会在考虑本公开内容的情况下意识到,本发明可被应用于其他发酵反应,包括使用相同或不同微生物的发酵反应。因此,本发明的范围不意欲限于所描述的具体实施方案和/或应用,而应以更广义的含义理解;例如,对所述气流来源没有限制,只要其至少一个组分可用于向发酵反应进料。本发明尤其可用于提高整体碳捕获和/或从气态底物(例如机动车废气和高CO体积含量工业燃料气体)中产生乙醇和其他醇。
发酵
从气态底物中产生乙醇和其他醇的方法是已知的。示例性方法包括例如在WO2007/117157、WO2008/115080、US 6,340,581、US 6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722和US 5,821,111中描述的那些方法,上述文献各自都以引用的方式纳入本文。
已知很多一氧化碳营养厌氧细菌能够将CO发酵为醇(包括正丁醇和乙醇)和乙酸,并且适用于本发明的方法。适合在本发明中使用的这种细菌的实例包括梭菌属的细菌,例如扬氏梭菌菌株(包括在WO00/68407,EP 117309,美国专利5,173,429、5,593,886和6,368,819,WO98/00558和WO 02/08438中所描述的菌株),Clostridium carboxydivorans菌株(Liou et al.,International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology 33:pp 2085-2091),Clostridium ragsdalei菌株(WO/2008/028055)和Clostridium autoethanogenum菌株(Abrini et al,Archives of Microbiology 161:pp 345-351)。其他合适的细菌包括穆尔氏菌属的细菌,包括Moorella sp HUC22-1(Sakai et al,Biotechnology Letters29:pp 1607-1612),以及氧化碳嗜热菌属的细菌(Svetlichny,V.A.,Sokolova,T.G.et al(1991),Systematic and Applied Microbiology 14:254-260)。其他实例包括热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌(Moorellathermoautotrophica)、产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、Butyribacterium methylotrophicum、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、库氏脱硫杆菌(Desulfotomaculumkuznetsovii)(Simpa et.al.Critical Reviews in Biotechnology,2006 Vol.26.Pp 41-65)。此外,如同本领域技术人员会理解的,应理解其他一氧化碳营养和/或产乙酸厌氧细菌也可能被用于本发明。还应理解本发明可适用于两种或多种细菌的混合培养物。
适用于本发明的一种示例性微生物是Clostridium autoethanogenum。在一个实施方案中,所述Clostridium autoethanogenum是具有以标识保藏号19630保藏于德国生物材料资源中心(German Resource Centre forBiological Material,DSMZ)的菌株的鉴定特征的Clostridiumautoethanogenum。在另一个实施方案中,所述Clostridiumautoethanogenum是具有DSMZ保藏号DSMZ 10061的鉴定特征的Clostridium autoethanogenum。
本发明的方法中使用的细菌培养可使用任意数目的本领域知晓的方法进行,所述方法使用厌氧细菌来培养和发酵底物。示例性技术在下文“实施例”部分提供。举例来说,这些方法一般在以下使用发酵气态底物的文章中描述:(i)K.T.Klasson,et al.(1991).Bioreactors for synthesisgas fermentations resources.Conservation and Recycling,5;145-165;(ii)K.T.Klasson,et al.(1991).Bioreactor design for synthesis gasfermentations.Fuel.70.605-614;(iii)K.T.Klasson,et al.(1992).Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels.Enzyme andMicrobial Technology.14;602-608;(iv)J.L.Vega,et al.(1989).Study ofGaseous Substrate Fermentation:Carbon Monoxide Conversion to Acetate.2.Continuous Culture.Biotech.Bioeng.34.6.785-793;(v)J.L.Vega,et al.(1989).Study of gaseous substrate fermentations:Carbon monoxideconversion to acetate.1.Batch culture.Biotechnology and Bioengineering.34.6.774-784;(vi)J.L.Vega,et al.(1990).Design of Bioreactors for CoalSynthesis Gas Fermentations.Resources,Conservation and Recycling.3.149-160;所有这些文章均以引用的方式纳入本文。
所述发酵可在任意合适的生物反应器中进行,例如连续搅拌釜反应器(CSTR)、固定化细胞反应器、气升反应器、泡罩塔、例如中空纤维膜生物反应器(HFMBR)的膜反应器或滴流床反应器(TBR)。同样地,在一些实施方案中,所述生物反应器可包含其中培养所述微生物的第一生长反应器和第二发酵反应器,其中将来自所述生长反应器的发酵液进料给第二发酵反应器,并且在第二发酵反应器中产生大部分发酵产物(例如,乙醇和乙酸盐)。
根据本发明的各个实施方案,所述发酵反应的碳源是含CO气态底物。所述底物可以是作为工业过程副产物得到的,或是从其他来源(例如从机动车废气)得到的含CO废气。在一些实施方案中,所述工业过程选自例如钢铁厂的铁金属产品制造、非铁产品制造、石油炼制过程、煤的气化、电能生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施方案中,可使用任意合适的方法,在所述含CO底物被释放到大气中之前将其从所述工业工程中捕获。根据所述含CO底物的组成,还可能需要在将其引入所述发酵之前对其进行处理以除去任何不需要的杂质,例如尘粒。例如,可使用已知方法过滤或洗涤所述气态底物。
或者,所述含CO底物可来自生物质的气化。所述气化过程涉及生物质在空气或氧气的有限供应下的部分燃烧。所得到的气体一般主要包含CO和H2,还有少量体积的CO2、甲烷、乙烯和乙烷。例如,可将在食物的提取和加工过程(例如,从甘蔗中得到糖,或从玉米或谷物中得到淀粉)中得到的生物质副产物或者由林业工业产生的非食物生物质废物气化,产生适合用于本发明的含CO气体。
所述含CO底物一般包含较大比例的CO,例如以体积计至少约20%至约100%CO、以体积计40%至95%CO、以体积计40%至70%CO、和以体积计40%至65%CO。在具体的实施方案中,所述底物包含以体积计25%、或30%、或35%、或40%、或45%或50%CO。含有较低浓度(例如6%)的CO的底物也是合适的,尤其是当还存在H2和CO2时。
尽管底物不必须包含任何氢气,然而根据本发明的方法H2的存在不应对产物形成有害。在具体的实施方案中,所述底物流包含低浓度的H2,例如少于5%、或少于4%、或少于3%、或少于2%、或少于1%或基本不含氢气。所述底物还包含一些CO2,例如,以体积计约1%至约80%CO2,或者以体积计1%至约30%CO2。
在其中使用pH来控制底物供应的具体实施方案中,所述底物可包含较大量的H2。在具体的实施方案中,氢气的存在使得醇生产的整体效率提高。例如,在具体的实施方案中,所述底物包含的H2∶CO比例可为约2∶1、或1∶1、或1∶2。
一般一氧化碳会以气态加入至所述发酵反应。但是,本发明的方法不限于以该状态加入所述底物。例如,一氧化碳可以以液体形式提供。例如,可用含一氧化碳的气体来饱和液体,并将所述液体加入至所述生物反应器中。这可以使用标准方法实现。举例来说,微泡分布发生器(microbubble dispersion generator)(Hensirisak et.al.Scale-up ofmicrobubble dispersion generator for aerobic fermentation;Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101,Number 3/October,2002)可用于此目的。
一般将气态底物供给包含一种或多种微生物的水性发酵液以使得通过所述气体/液体表面发生有效的质量传递。已知很多提高含CO底物向水性发酵液中的质量传递的效率的方法,全部这些方法均纳入本文,纳入程度如同分别说明。在具体实施方案中,根据本发明的方法,控制所述含CO底物的质量传递速率使得以最佳或接近最佳速率提供所述底物。
应理解,为使所述细菌的生长和CO转化为醇的发酵发生,除了所述含CO底物气体外,还需要向所述生物反应器加入合适的液体营养培养基。营养培养基包含足以使所用微生物生长的维生素和矿物质。本领域中知晓适于使用CO作为唯一碳源的乙醇发酵的厌氧培养基。例如,在上文提到的美国专利5,173,429和5,593,886以及WO 02/08438、WO2007/115157、WO2008/115080和WO2009/022925中描述了合适的培养基。
所述发酵应理想地在发生所需发酵(例如,CO转化为乙醇)的合适条件下进行。应当考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌釜反应器)、接种物水平、确保所述液相中的CO不会变为有限的最大气体底物浓度和避免产物抑制的最大产物浓度。在WO02/08438、WO07/117157,WO2008/115080和WO2009/022925中描述了合适的条件。
所述最佳反应条件部分取决于使用的具体微生物。但是,在具体实施方案中,所述发酵在高于环境压力的压力下进行。在提高的压力下运行可使CO从气相向液相的传递速度显著提高,CO在所述液相中可被微生物摄取作为乙醇生产的碳源。这相应地意味着当生物反应器保持在提高的压力而非大气压力下时保留时间(定义为所述生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)可减少。
已认识到CO向水性培养基中的质量传递速率与含CO气态底物的分压成比例。因此,所述质量传递速率可通过增加气流中CO的比例(通过富集CO或除去不需要的组分,例如惰性组分)来增加。此外,CO的分压能够增加气态底物流的压力。
在他处也已经描述了在提高的压力下进行气体向乙醇的发酵的益处。例如,WO 02/08438描述了在30psig和75psig的压力下进行气体向乙醇的发酵,分别得到150g/l/天和369g/l/天的乙醇产率。但是,在大气压下使用相似的培养基和输入气体组成进行的示例性发酵被发现产生的乙醇少10至20倍(每天每升)。
还需要的是,所述含CO气态底物的引入速率能够确保液相中CO的浓度不会变得有限。这是因为CO受限的条件可能导致所述培养物消耗乙醇产物。
产物回收
可使用已知方法回收所述发酵反应的产物。示例性方法包括在WO07/117157、WO08/115080、US 6,340,581、US 6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722和US 5,821,111中描述的那些。但是,简要地且举例来说,仅乙醇可使用例如分级分馏或蒸发以及萃取发酵的方法来从所述发酵液中回收。
从发酵液蒸馏乙醇会产生乙醇和水(即,95%乙醇和5%水)的共沸点混合物。随后还可通过使用本领域中熟知的分子筛乙醇脱水技术得到无水乙醇。
萃取发酵方法涉及到使用对所述发酵生物具有低毒性风险的水混溶性溶剂,以从稀释的发酵液体培养基中回收乙醇。例如,油醇是可用于此类型萃取方法的溶剂。将油醇持续引入到发酵罐中,于是该溶剂上升并在所述发酵罐的顶部形成一层溶剂,其被连续地萃取并通过离心机进料。因此水和细胞被很容易地从所述油醇中分离出来并返回到所述发酵罐中,而溶有乙醇的溶剂被进料至闪蒸装置中。大部分乙醇被蒸发并凝结,而油醇不易挥发,并被回收以在所述发酵中再利用。
乙酸盐是在所述发酵反应中产生的副产物,也可使用本领域中已知的方法从所述发酵液中回收。
例如,可使用包含活性炭过滤器的吸附***。在这种情况下,优选地首先使用合适的分离装置将微生物细胞从所述发酵液中除去。本领域中已知多种产生用于进行产物回收的无细胞发酵液的基于过滤的方法。然后使含乙醇——和乙酸盐——的无细胞过滤液通过含有活性炭的柱以吸附所述乙酸。酸形式(乙酸)比盐形式(乙酸盐)的乙酸盐更容易被活性炭吸附。因此优选地在所述发酵液通过所述活性炭柱之前将其pH降低至约3以下,以使大部分乙酸盐转变为乙酸形式。
可使用本领域中已知方法通过洗脱回收吸附至所述活性炭的乙酸。例如,可使用乙醇洗脱结合的乙酸盐。在一些实施方案中,所述发酵过程本身产生的乙醇可被用于洗脱所述乙酸盐。因为乙醇的沸点是78.8℃,而乙酸的沸点是107℃,使用基于挥发性的方法(例如蒸馏)可容易地将乙醇和乙酸盐相互分离。
本领域中还已知用于从发酵液中回收乙酸盐的其他方法,并且可用在本发明的方法中。例如,美国专利6,368,819和6,753,170中描述了可用于从发酵液中提取乙酸的溶剂和共溶剂***。如同针对乙醇萃取发酵所描述的基于油醇的***实例一样,美国专利No 6,368,819和6,753,170中描述的***描述了在所述发酵微生物存在或不存在的情况下可与所述发酵液相混合以提取所述乙酸产物的水不混溶溶剂/共溶剂***。然后通过蒸馏将含有乙酸产物的所述溶剂/共溶剂从所述发酵液中分离出来。然后可使用第二个蒸馏步骤以从所述溶剂/共溶剂***中纯化所述乙酸。
可通过以下方式从所述发酵液中回收所述发酵反应的产物(例如乙醇和乙酸盐):将一部分所述发酵液从所述发酵生物反应器中连续移出,(便利地通过过滤)将微生物细胞从所述发酵液中分离,并同时或顺序地从所述发酵液中回收一种或多种产物。对于乙醇的情况,使用上文描述的方法,乙醇可通过蒸馏被方便地回收,而乙酸盐可通过活性炭吸附来回收。所述分离的微生物细胞可被送回到所述发酵生物反应器中。已除去乙醇和乙酸盐后的余下无细胞过滤液也优选地被送回到所述发酵生物反应器中。可将另外的营养物(例如B维生素类)加入到所述无细胞过滤液中以补充所述营养培养基,之后使其返回到所述生物反应器中。同样,如果如上文所述的对所述发酵液的pH进行调节以增加乙酸对活性炭的吸附,那么应将所述pH重新调节至与所述发酵生物反应器中发酵液pH相近的pH,之后再将其返回所述生物反应器中。
控制底物供应
根据本发明的一些方面,提供了提高底物的微生物发酵的整体效率的方法,所述方法包括以基本上最佳水平、接近最佳水平或在最佳范围内提供所述底物。在本发明的具体实施方案中,所述底物包含CO,并且被提供给一种或多种一氧化碳营养细菌,例如产乙酸细菌。在合适的厌氧条件下,产乙酸细菌(例如Clostridium autoethanogenum、扬氏梭菌、Clostridium ragsdalei和Clostridium carboxydivorans)将含CO底物转变为包括酸和醇的产物。根据具体实施方案,本发明提供通过以下方式优化对底物(尤其是含CO底物)的微生物发酵的方法,即控制所述底物的供应使得以最佳水平、接近最佳水平或在最佳范围内提供所述底物以促进培养物的生活力和所需代谢物(例如乙醇)的生产。
已经认识到将所述微生物培养物可利用以转化成产物的底物的量向最佳水平或范围增加,会导致微生物生长速率、代谢物生产速率和/或产生的乙醇相对于酸的量增加。在本发明具体实施方案中,产生产物使得所述培养物产生的理想的酸∶醇产物比例为至少1∶1、或至少1∶2、或至少1∶3、或至少1∶4、或至少1∶5、或至少1∶10或至少1∶20。在本发明的具体实施方案中,醇(尤其是乙醇)的产生不伴随酸(尤其是乙酸盐)的产生。
在具体实施方案中,所述微生物培养物不能调节底物摄取。因此,过度供给底物会导致培养问题,例如生长抑制和/或微生物死亡。
含CO底物一般以气态形式提供,并且CO的微生物培养物可利用性依赖于所述发酵***的质量传递特性。例如,CO的微生物培养物(悬浮于发酵液中)可利用性依赖于本领域技术人员知晓的因素,包括温度、发酵液组成、气体供应速率、气体组成、CO蒸汽压和混合情况。因此,增加CO的微生物发酵可利用性需要提高所述***的质量传递特性,例如增加底物供应速率并且/或者增加机械搅拌生物反应器的搅动。
为了维持培养物生活力、微生物生长和/或所需产物(例如乙醇)的产生,应当以最佳水平、接近最佳水平或在最佳范围内使所述底物可被所述培养物所利用。CO供应不充足(未达到最佳)的微生物培养物可能生长不良,生存力较差并且/或者主要产生不太合乎需要的产物,例如酸,尤其是乙酸盐。此外,其生长速率和代谢物产生速率也可大大低于供应有充足或最佳量底物的微生物培养物。在具体的实施方案中,所述微生物培养物不能调节底物摄取。因此,过度供给底物会导致培养问题,例如生长抑制和/或微生物死亡。
已经认识到将所述微生物培养物可利用以转化为产物的底物的量向最佳水平增加,会导致产生的醇的量相对于酸增加。在具体的实施方案中,醇(尤其是乙醇)的产生不伴随酸(尤其是乙酸盐)的产生。
本发明提供控制底物(尤其是含CO底物)的供应,使得以最佳水平、接近最佳水平或在最佳范围内基本连续地提供底物的方法。根据具体的实施方案,通过将所述发酵培养基的pH维持在恒定水平或在恒定范围内或在预定变化速率内而以最佳水平或在最佳范围内提供底物。
已经认识到将所述微生物培养物可利用以转化为产物的底物的量向最佳水平增加,会导致产生的醇的量相对于酸增加。
在其他实施方案中,微生物培养物可能产生或消耗一种或多种酸性和/或碱性组分,使得pH在最佳运转期间变化。因此,根据本发明,提供底物使得pH基本以预定或接近预定的变化速率变化。在这样的实施方案中,可持续的微生物生长和所需的代谢物生产伴随一种或多种酸和/或碱的产生和/或消耗,使得pH会随时间流逝产生净改变。在具体实施方案中,一氧化碳营养微生物(例如Clostridium autoethanogenum)同时产生醇(例如乙醇)和酸(例如乙酸盐)。在本发明的具体实施方案中,产生产物以使得所述培养物产生的理想的酸∶醇产物比例为至少1∶1、或至少1∶2、或至少1∶3、或至少1∶4、或至少1∶5、或至少1∶10或至少1∶20。此外,还可能有与碱性组分(例如NH3)的消耗相关的pH变化。因此,在具体实施方案中,在稳定状态的连续发酵期间,pH会有净下降,除非通过加入碱或者连续加入新鲜培养基(pH适合保持恒定pH)来控制所述pH。
发酵***的pH一般受到酸化合物(例如乙酸盐和/或乳酸盐)的产生所影响,并且较低程度地受到碱性或酸性组分(例如NH3、磷酸等)的消耗影响。pH变化的速率依赖于酸性/碱性化合物的这类产生和/或消耗发生的速率。在具体实施方案中,产乙酸微生物产生作为代谢物的乙酸盐,这导致pH随时间流逝的最大变化。
对于给定的发酵***,当以最佳速率供应底物时pH变化速率可通过实验方法测定。例如,当以最佳或接近最佳水平向一种或多种一氧化碳营养微生物的培养物提供底物时,可以以特定速率产生乙醇和乙酸盐。所述发酵液的pH将根据所存在的乙酸盐的量,并且较低程度地根据所存在的其他酸性或碱性组分(例如NH3)的量而变化。已认识到pH的变化速率将取决于所述发酵液的缓冲能力和pH起点。例如,在缓冲良好的发酵液中的乙酸盐积累将导致pH小的和/或缓慢的变化。相反地,在缓冲较差的发酵液中的乙酸积累将导致pH大的和/或迅速的变化。因此,对于任何给定的发酵***应预先确定最佳底物供应时的pH变化速率。
还认识到pH的微小变化可对发酵有不利影响。因此,酸产生引起的pH变化能够通过加入碱(例如NH4OH)来抵消。因此,连续运转的发酵***的pH能够维持在最佳pH运行参数内。例如,Clostridiumautoethanogenum的最佳运行pH已经实验方法确定为约5-5.5。在具体实施方案中,需要的范围是所述最佳运行pH±0.5单位。在Henstra et al.Current Opinion in Biotechnology,2007,18:200-206中描述了各种一氧化碳营养细菌的最佳运行pH。
因此,能够使用一些可选机制维持对底物供应的控制。例如,通过测定pH变化速率,通过测定抵消pH变化所需要的酸/碱的量,或者通过测定所述培养物产生的乙酸盐的量。
因此,在稳定状态条件下,酸以基本恒定的速率产生,导致形成在所述发酵液中基本稳定的浓度。在具体实施方案中,提供一种优化含CO底物向生物反应器的供应的方法,其中通过一种或多种一氧化碳营养微生物的培养物对所述底物进行发酵以产生包含一种或多种醇和/或酸的产物,所述方法包括在第一时间点和第二时间点测定所述生物反应器中的酸水平,其中第一时间点和第二时间点之间的酸水平变化导致底物供应变化。因此,如果所述酸(乙酸盐)的水平随时间增加,那么可增加底物供应以使得酸产生变慢,使酸随时间流逝回到需要的水平或范围。相反地,如果酸的水平下降,那么可减少底物供应,从而促进酸产生。在具体实施方案中,乙酸盐保持在约10g/L、或约9g/L、或约8g/L、或约7g/L或约6g/L、或约5g/L发酵液的基本恒定浓度上。在具体实施方案中,所述乙酸盐保持在预定的浓度范围内,例如约1-10g/L、或约2-8g/L、或约3-7g/L、或约4-6g/L发酵液。
在具体实施方案中,还认识到一种或多种酸(例如乙酸盐)的产生速率取决于所述发酵液中的微生物密度。在具体实施方案中,乙酸盐的具体生产率保持在少于2g/g生物质/天、或少于1.5g/g/天、或少于1.2g/g/天或少于1g/g/天。
在本发明的另一个具体实施方案中,醇(尤其是乙醇)的产生不伴随酸(尤其是乙酸盐)的同时产生。因此,当以最佳水平或在最佳范围内提供底物(尤其是含CO底物)时,所述培养基中酸浓度不发生净改变,并且所述培养基的pH保持基本恒定。在这样的实施方案中,pH的变化速率大约为0。
如以引用方式全文纳入本文的Gaddy US 7,285,402中所述,已认识到产物比还部分地与培养基组成有关。因此已认识到理想的产物比例会随不同的发酵***而改变。因此与最佳底物水平的供应相关的pH变化速率也会改变。
如果在所述发酵的任意阶段所述培养物变得底物受限,那么所述培养物产生酸(例如乙酸盐),导致发酵液的pH下降。因此,根据本发明的方法,可增加所述底物供应使净乙酸积累停止且pH稳定。
另外地或者可选地,如果底物过度供应,那么因为乙酸盐转变为乙醇会有净酸消耗,并且pH升高。因此,应当减少底物供应以使得净酸消耗停止且pH稳定。发现长时间的底物过度供应可导致培养问题,例如生长抑制和/或微生物死亡。
在具体实施方案中,提供底物以使得pH保持在所需要的范围内。本领域技术人员应了解进行特定发酵的合适pH或pH范围。在具体实施方案中,例如在其中使用Clostridium autoethanogenum来产生产物的实施方案中,提供底物以使得pH保持在5-6之间、或5.1-5.9之间、或5.2-5.8之内、或5.3-5.7之间、或5.4-5.6之间或基本为5.5。
可通过任意已知方法测定pH。但是,举例来说,一般使用电极探针来测量发酵期间的pH,这类探针的实例是本领域技术人员所知晓的。
作为非限制性实例,考虑处于以下条件下的微生物培养物:
1.受限的底物:
所述培养物有足够的底物来生长并产生产物(主要是酸)但不能产生较大量的所需产物(例如醇)。pH下降比预定的变化速率快。因此向最佳水平增加底物供应。
2.最佳底物供应
所述培养物有足够的底物来生长并以高速率(以最佳或至少接近最佳生产率)产生产物(尤其是需要的产物,例如醇)。pH以预定变化速率变化。因此将底物供应保持在最佳水平。
3.底物过度供应
酸(例如乙酸盐)转变为醇(例如乙醇)。可出现生长抑制和微生物死亡。pH下降或上升比预定变化速率慢。因此减少至最佳水平。
因此,应当向情况1(上文)的微生物培养物提供增加量的底物直到pH稳定,或者回到预定水平。这样的培养物被认为是被提供了如情况2中所述的最佳底物量。在分批条件下,这样的培养物被认为会生长直到变得再次受限,因此应当随时间流逝向所述生长中的培养物提供增加量的底物,这样使得pH基本保持稳定或者在预定范围内。如果在任意时间底物被过度供应(情况3),pH升高,所述底物供应必须向恢复有效生长和代谢物生产的最佳水平下降。
已认识到微生物培养物可产生其他酸性代谢物,例如乳酸,尤其是在底物过度供应期间。因此,在具体实施方案中,所述方法除了监测pH之外,还包括监测发酵培养基中的代谢物浓度。本领域技术人员会理解监测发酵培养基中的代谢物浓度的方法。然而,举例来说,可以使用分析方法,例如GC、GCIR、GCMS、LCMS、HPLC、NIR。
根据本发明的一些方面,提供了提高对底物的微生物发酵的整体效率的方法,所述方法包括基本以最佳水平、接近最佳水平或在最佳范围内提供底物。在本发明的具体实施方案中,所述底物含CO并且被提供给一种或多种一氧化碳营养细菌,例如产乙酸细菌。在合适的厌氧条件下,产乙酸细菌(例如Clostridium autoethanogenum、扬氏梭菌、Clostridium ragsdalei和Clostridium carboxydivorans)将含CO底物转化为包括酸和醇的产物。根据具体实施方案,本发明提供了通过以下方式优化对底物(尤其是含CO底物)的微生物发酵的方法,即控制所述底物的供应,使得以最佳水平、接近最佳水平或在最佳范围内提供所述底物以促进培养物生活力和所需代谢物(例如乙醇)的产生。在具体实施方案中,所述气体的CO含量含有极少或不含H2,例如少于5%、或少于4%、或少于3%、或少于2%、或少于1%或0%H2。
含CO底物一般以气体形式提供,CO的微生物培养物可利用性将依赖于所述发酵***的质量传递特性。例如,CO的微生物培养物(悬浮于发酵液中)可利用性依赖于本领域技术人员知晓的因素,包括温度、发酵液组成、气体供应速率、气体组成、CO蒸汽压和混合情况。因此,增加CO的微生物发酵可利用性需要提高所述***的质量传递特性,例如增加底物供应速率并且/或者增加机械搅拌生物反应器的搅动。
为了维持培养物生活力、微生物生长和/或所需产物(例如乙醇)的产生,应当以最佳水平、接近最佳水平或在最佳范围内向所述培养物提供所述底物。CO供应不充足(未达到最佳)的微生物培养物可能生长不良,生存力较差并且/或者主要产生不太需要的产物,例如酸,尤其是乙酸盐。此外,所述生长速率和代谢物产生速率也大大低于供应有充足或最佳底物量的微生物培养物。
本发明提供了一种控制底物(尤其是含CO底物)供应以使得以最佳水平、接近最佳水平或在最佳范围内基本上连续地提供所述底物的方法。根据本发明的具体方面,所述提高微生物发酵的方法包括监测微生物培养物的氢气产生并且基于氢气产生控制底物供应。
在具体实施方案中,供给最佳量底物(或最佳范围内的底物)的微生物培养物将生长并以最佳速率产生需要的产物,例如醇。除了所需要的代谢物产生比例,所述微生物培养物还产生氢气。一般会产生少量的氢气,例如微生物培养物消耗的底物的约0.5-5mol%。在具体实施方案中,当微生物培养物被提供了最佳量的底物时,所产生的氢气量保持在所述培养物消耗的底物的约1-3%。
作为非限制性实例,考虑处于以下条件下的微生物培养物:
1.受限的底物:
所述培养物有足够的底物来生长并产生产物(主要是酸)但不能产生较大量的所需产物(例如醇)。产生少量的氢气或不产生氢气。
2.最佳底物供应
所述培养物有足够的底物来生长并以高速率(以最佳或接近最佳生产率)产生产物,尤其是需要的产物,例如醇。产生氢气。
3.底物过度供应
可能会出现生长抑制和微生物死亡。不产生氢气。
根据本发明,微生物培养物产生的氢气可被用作所述培养物被提供了基本最佳量,或者至少是最佳范围内的底物的指示。此外,微生物培养物的氢气产生可被用于控制对所述微生物培养物的底物供应。例如,可增加向底物限制的培养物的底物供应直到观察到氢气产生。氢气产生开始后,可调节底物供应以保持氢气随时间的产生。
因此,应当向情况1(上文)中的微生物培养物提供增加量的底物直到所述培养物产生氢气。这样的培养物被认为是被提供了如情况2中所述的最佳底物量。在分批条件下,这样的培养物被认为会生长直到变得再次受限,因此应当随时间向所述生长中的培养物提供增加量的底物,从而使得保持H2产生。如果在任意时间底物被过度供应(情况3),H2产生停止,所述底物供应必须向恢复有效生长和代谢物生产的最佳水平降低。
已认识到在具体实施方案中,在情况1和3期间可产生少量的氢气。但是,根据本发明的方法,所述培养物产生的氢气的量会随着所述培养基可利用的底物向最佳水平(或向最佳范围)的增加或减少而增加。
在其中所述微生物培养物包含Clostridium autoethanogenum的具体实施方案中,底物限制期间的具体CO摄取一般是每分钟每克生物质消耗0.3-0.6mmol的CO(mmol/g/min)。在这些底物限制条件下,包含C.autoethanogenum的微生物培养物不产生或者产生极少量的H2(少于所消耗的底物的0.5mol%)。随着底物可利用性增加,所述培养物产生的H2增加至所述培养物消耗的CO的至少0.5mol%、或至少1.0mol%、或至少1.5mol%或至少2.0mol%。一般地,所述培养物的具体摄取增加至高于约0.6mmol/g/min。在本文描述的条件下,当可将所述具体摄取保持在至少0.6mmol/g/min但少于1.2mmol/g/min时,包含C.autoethanogenum的微生物培养物具有最佳底物供应。当所述具体摄取增加至高于1.2mmol/g/min时,所述底物过度供应,H2产生下降,应当减少所述底物供应。如果不减少所述底物供应,将出现生长抑制和细胞死亡。
图1是本发明一个实施方案的***100的示意图。底物流1通过合适的管道3进入生物反应器2。底物流1包含CO,并且在一些实施方案中,所述底物流是来自工业过程(例如钢铁脱碳)中的废气流。底物流1在被持续提供的情况下可以是恒定气流,但是所述气流的内含物可以随时间改变。
生物反应器2被设计用于进行所需要的发酵反应以产生产物。根据一些实施方案,生物反应器2被设计用于将CO转化为包含一种或多种酸和/或醇的产物。生物反应器2可包含多于一个的容器,每个容器被设计用于进行相同的反应和/或具体发酵过程中的不同阶段和/或不同的反应,包括可包含一个或多个共同阶段的不同发酵的不同反应。
可通过本领域中知晓的任何回收方法回收生物反应器2中产生的产物,例如酸和/或醇。
可通过pH测量器件4监测所述发酵培养基的pH。因此,操作者可以任选地使用调节器件5调节生物反应器2中的微生物培养物和/或所述底物流1,以维持所述培养物或者使所述培养物转变,使得响应于pH变化以最佳水平、接近最佳水平或在最佳范围内来提供底物。对向所述培养物提供的CO水平的调节包括以下一种或多种:改变所述发酵液的CO浓度;改变所述底物流的组成;改变所述底物流的压力;改变发酵液搅拌速率。另外地或者可选地,***100包括适于测定所述发酵液pH的可选操作器件6和控制调节器件5,从而使得以最佳水平或在最佳范围内将所述底物提供给所述微生物培养物。此外,调节器件5可被设计用于在必要时做出连续调整或在不连续时间点做出调整。
在另一个实施方案中,4是被设计用于测定生物反应器2中的酸(例如乙酸盐)的浓度的测定器件。如果所述酸的浓度被测定为高于预定阙值,则所述调节器件5可增加对生物反应器2的底物供应。任何已知的测定方法都可被用于测量生物反应器2中的酸浓度。然而,举例来说,可使用HPLC、GCMS、LCMS和/或NIR。
图2是本发明一个实施方案的***101的示意图。底物流1通过合适的管道3进入生物反应器2。底物流1包含CO,并且在一些实施方案中,所述底物流是来自工业过程(例如钢铁脱碳)中的废气流。底物流1在被持续提供的情况下可以是恒定气流,但是所述气流的内含物可以随时间改变。在具体实施方案中,所述底物流包含极少H2或不含H2,例如少于5%、或少于4%、或少于3%、或少于2%、或少于1%或0%H2。
生物反应器2被设计用于进行所需要的发酵反应以产生产物。根据一些实施方案,生物反应器2被设计用于将CO转化为包含一种或多种酸和/或醇的产物。生物反应器2可包含多于一个的容器,每个容器被设计用于进行相同的反应和/或一个具体发酵过程中的不同阶段和/或不同的反应,包括可包含一个或多个共同阶段的不同发酵的不同反应。
可通过本领域知晓的任何回收方法回收生物反应器2中产生的产物,例如酸和/或醇。
所述底物流中在所述发酵反应中未被消耗的组分和所述发酵反应的任何副产物(例如CO2和H2)通过排气出口7排出生物反应器2。在本发明的具体实施方案中,测量器件8适于测量通过排气出口4排出生物反应器2的废气流中H2和任选的CO和CO2的浓度。在具体实施方案中,测定所述微生物培养物产生的氢气的量。因此,操作者可以任选地使用调节器件9调节生物反应器2中的微生物培养物和/或所述底物流1以维持所述微生物培养物或者使所述培养物转变,从而使得以最佳水平、接近最佳水平或在最佳范围内提供底物。维持或转变所述培养物的调节包括以下一种或多种:改变所述发酵液的CO浓度;改变所述底物流的组成;改变所述底物流的压力;改变发酵液搅拌速率。另外地或者可选地,***101包括适于测定所述排出气流的氢气浓度的可选处理器件6和控制调节器件9,从而使得将所述底物以最佳水平或在最佳范围内提供给所述微生物培养物。
在具体实施方案中,可连续地或者在不连续时间点监测排出生物反应器2的氢气。此外,调节器件9可被设计用于在必要时做出连续调整或在不连续时间点做出调整。
可使用任何用于测定所述培养物产生的氢气的器件,然而在具体实施方案中,使用一种或多种气相色谱来测量排出所述生物反应器2的气流和任选的底物气流1中的H2浓度。在一个实施方案中,用于测定排出生物反应器2的气流中的H2浓度的器件是Varian CP-4900micro GC。
实施例
材料和方法:
Na2Sx的制备
向500ml烧瓶加入Na2S(93.7g,0.39mol)和200ml H2O。搅拌所述溶液直到所述盐溶解,并且在恒定N2流下加入硫(25g,0.1mol)。在室温下搅拌2小时后,将现在是清澈淡红棕色液体的“Na2Sx”溶液([Na]大约4M,硫大约5M)转移至N2吹扫的用铝箔包裹的血清瓶中。
Cr(II)溶液的制备
给1L的三颈烧瓶装配气密入口和出口以使得可在惰性气体下工作,并且之后了将所需要的产物转移至合适的储存烧瓶中。向所述烧瓶中装入CrCl3.6H20(40g,0.15mol)、锌颗粒[20目](18.3g,0.28mol)、汞(13.55g,1mL,0.0676mol)和500ml蒸馏水。用N2吹洗1小时,将所述混合物加热至约80℃以起始所述反应。在恒定N2流中搅拌2小时之后,将所述混合物冷却至室温,并且连续搅拌另外48小时,此时所述反应混合物已变成深蓝色溶液。将所述溶液转移至经N2吹扫的血清瓶中并储存在冰箱中备用。
细菌:
使用的Clostridium autoethanogenum是保藏在德国生物材料资源中心(DSMZ)、保藏号为19630的Clostridium autoethanogenum。
取样和分析步骤
在每个发酵的过程中的多个间隔从CSTR反应器中取培养基样本。每次对培养基取样时,小心确保没有气体进入所述反应器或从所述反应器中逸出。
HPLC:
HPLC System Agilent 1100系列。流动相:0.0025N硫酸。流速和压力:0.800mL/min。柱:Alltech IOA;目录#9648,150×6.5mm,颗粒大小5μm。柱温度:60℃。检测器:Index Detector。检测器的温度:45℃。
样品制备方法:
将400μL样本、50μL 0.15M ZnSO4和50μL 0.15M Ba(OH)2加入微量离心管中。将所述管在4℃下以12000rpm离心10分钟。将200μL上清液转移至HPLC小瓶中,并将5μL注射至所述HPLC仪器中。
液上分析:
在带有两个已安装的通道的Varian CP-4900micro GC上进行测量。通道1是在70℃,200kPa氩和4.2s回洗时间的条件下运行的10m Mol-筛柱,而通道2是在90℃,150kPa氦,无回洗的条件下运行的10m PPQ柱。两个通道的注射器温度都是70℃。运行时间被设置为120s,但是所有目的峰一般都在100s之前洗脱出。
细胞密度:
通过对发酵液的确定等分试样中的细菌细胞计数来确定细胞密度。或者,在600nm(分光光度计)下测量所述样本的吸光率,并根据公开的方法通过计算确定干物质。
实施例1分批发酵
将约1400mL的溶液A转移至1.5L发酵罐中并用氮气鼓泡。加入刃天青(1.5mL的2g/L溶液)和H3PO4(85%溶液,2mL),使用浓NH4OH(aq)将pH调节至5.3。加入氯化铬(II),直到所述溶液的ORP下降至约-150mV。加入多硫化钠(4.2mL的4.3M溶液),并将所述溶液用N2鼓泡,然后加入溶液D(1.5mL)、溶液B(15mL)和Na2WO3(1.5mL的0.01M溶液)。加入溶液F(15mL),将pH调节至5.5,并将所述溶液用N2鼓泡,之后换为40mL/min的含CO气体(50%CO;50%N2)。然后用150ml的Clostridium autoethanogenum培养物接种所述反应器。将所述生物反应器保持在37℃,并在300rpm下搅拌。在生长阶段,将所述搅拌逐步增加至800rpm。
代谢物和微生物生长可见图3。在生长阶段(约在第0.5天起始),通过增加搅拌和/或气体流速增加底物供应。在图3中,可见指数生长出现在第0.5天和第1.2天之间。所述底物供应会随着微生物生长而增长,以将所述培养物的氢气产生维持在约1-2.5mol%的水平。第1.2天之后,CO供应增加,但是H2生产显著下降,表明底物稍微过度供应。H2产生和CO消耗可见图4。当在第1.2天后所述培养物持续生长并产生代谢物时,生长速率大幅下降,不再是指数生长。通过控制底物供应使得H2产生,产生乙醇产生但不伴随着酸产生。
表1显示通过保持底物供应使得所述培养物产生氢气,具体CO摄取可保持在至少0.6mmol/g/min并最高达约1.2mmol/g/min的高水平。
表1:作为在实施例1指数生长期间消耗的CO和具体CO摄取的函
数的H2产生。
实施例2
如下所述在pH 5.5下制备培养基。将溶液E中除半胱氨酸-HCl之外的全部成分混合在400ml蒸馏水中。通过将所述溶液加热至沸腾并且使其在95%CO和5%CO2的恒定气流下冷却至室温使该溶液无氧。一旦冷却即加入半胱氨酸-HCl,并将所述溶液的pH调节至5.5,之后将体积加至最高达1000ml;在整个试验中保持无氧。
在N2恒定气流下向1L生物反应器中装入如上所述制备的400ml溶液E培养基。在大气压下将所述气体换为含CO气体(50%CO;50%N2),之后用400ml的Clostridium autoethanogenum培养物接种。在培养开始时所述生物反应器保持在37℃,并在400rpm下搅拌。在生长阶段,所述搅拌增加至400rpm。pH保持在5.5直至可允许其降至pH 5.3。起始增长阶段之后,通过以每天约1反应器体积的稀释速率加入新鲜培养基使所述培养转变为连续生产。依照上文所述制备所述新鲜培养基,但其还含有镍(约0.5mL/L的0.1M溶液)。
初始生长阶段后,通过提供底物将生物质保持在恒定水平,使得H2连续产生(见图5和6)。在该时间段,增加底物供应使得具体摄取增加至约0.8-0.9mmol/g/min(参见表2)。乙醇生产率增加至约9-10g/L/天,而乙酸生产率保持在6-8g/L/天。
表2:作为在实施例2指数生长期间消耗的CO和具体CO摄取的函
数的H2产生。
实施例3
在N2恒定气流下向1L生物反应器中装入200ml如上所述制备的溶液E培养基。在大气压下将所述气体换为含CO气体(50%CO;20%CO2;3%H2;27%N2),之后用800ml的Clostridium autoethanogenum培养物接种。在培养开始时将所述生物反应器保持在37℃,并以200rpm搅拌。在生长阶段,所述搅拌增加至400rpm。将pH调节至5.5并通过自动加入5M NaOH保持。初始始增长阶段之后,通过以每天约1反应器体积的稀释速率加入新鲜培养基使所述培养转变为连续生产。
微生物生长、代谢物生产和气体消耗/生产数据可见图7和8。通过增加搅拌和气流而随时间增加底物供应。在第1.9天,每2小时将搅拌增加100rpm,共8小时。在该时间段,CO消耗增加,H2生产轻微增加,表明CO是以最佳水平或接近最佳水平供应。在该时间段,具体CO摄取从0.6mmol/g/min增加至最高达0.9mmol/g/min。
在第2.9天,逐步增加气流(每2小时增加10mL/min)。气体供应增加后,CO消耗增加,但是H2生产下降。图6显示在该期间生长减缓,导致生物质迅速减少。
实施例4
将约1400mL的溶液A转移至1.5L发酵罐中并用氮气鼓泡。加入刃天青(1.5mL的2g/L溶液)和H3PO4(85%溶液,2mL),并使用浓NH4OH(aq)将pH调节至5.3。加入氯化铬(II),直到所述溶液的ORP下降至约-150mV。加入多硫化钠(4.2mL的4.3M溶液),将所述溶液用N2鼓泡,然后加入溶液B(15mL)、溶液G(1.5mL)和Na2WO3(1.5mL的0.01M溶液)。加入溶液F(15mL),将pH调节至5.5,并将所述溶液用N2鼓泡,之后换为40mL/min的含CO气体(50%CO;50%N2)。然后用150ml的Clostridium autoethanogenum培养物接种所述反应器。将所述生物反应器维持在37℃,并以300rpm搅拌。在生长阶段,将所述搅拌逐步增加至800rpm。
代谢物和微生物生长可见图9。在生长阶段(约在第0.5天起始),通过增加搅拌和/或气体流速增加底物供应。在图9中,可看出指数生长出现在第0.5天和第1.2天之间。如图10所示,所述底物供应会随着微生物生长而增长,以维持所述培养基的pH为约pH 5至5.6。从第0.5天,通过增加搅拌和/或气流来增加所述底物的可利用性。从第0.5到第1.0天,提供所述底物以使得除微生物生长和乙醇生物合成之外,还有乙酸盐至乙醇的净转化。在该时间段,pH缓慢升高至约5.6。从第1.0天至第1.2天,所述底物的可利用性基本上保持恒定。在该时间段,所述微生物培养物继续基本上以指数增长。乙酸盐有净生产,并且所述pH下降至约4.9。在第1.2天之后,CO供应增加;但是pH从4.9迅速增加至约5.6,表明与底物过度供应相关的净乙酸盐消耗。尽管所述培养物在第1.2天后继续生长并且产生代谢物,然而生长速率大幅减缓并且不再是指数增长。
表3显示通过保持底物供应使得pH保持在所需范围内,具体CO摄取能够保持在至少0.6mmol/g/min至最高达约1.2mmol/g/min的高水平。
表3:实施例1指数生长期间的pH和具体CO摄取。
实施例5A:在CSTR中的连续发酵
如下所述制备培养基:将100ml溶液A加入1.7L水中。加入85%H3PO4(30mM),使用前通过在121℃下高压灭菌30分钟或者通过过滤除菌将所述溶液灭菌。将所述培养基溶液在无菌无氧条件下转移至3LCSTR容器中,并且用N2连续鼓泡。
通过加入氢氧化铵增加pH。加入20ml的微量金属溶液H,然后加入2ml的冰乙酸和20ml的溶液B。加入CrII直到所述溶液变得清澈。在接种之前,将所述气体转换为2%H2、33%N2、45%CO和22%CO2。以约12%(v/v)的水平将活跃生长的Clostridium autoethanogenum培养物接种到所述CSTR中。在该实验期间,以约0.4ml/小时的速率加入Na2S溶液(0.2M)。
使所述微生物培养物以分批方式生长约1天。在第1天,使所述发酵转换为连续生产,其中以每天约1.5至1.8个反应器体积的稀释速率提供新鲜培养基。根据本发明响应于所述微生物培养物的需要自动增加底物供应(下文描述)。
所述发酵的结果显示在图11-12中。所述底物供应速率和搅拌速率在所述发酵的时间过程中响应于pH变化而自动增加或减少。开始时,在所述分批生长阶段,通过增加底物供应使所述pH自动保持在约pH 5.5。在所述发酵转变为连续生产时,提供底物以使得达到基本恒定的pH变化速率。如果所述变化速率增加,那么所述底物供应自动增加以使所述pH变化速率回到预定值。相反地,如果所述变化速率下降(或者所述pH开始增加),就减少所述底物供应。所述pH变化速率为每天约3个pH单位。可持续的连续运转形成约3g/L的稳定生物质,约5g/L的基本稳定的乙酸盐浓度和至少10g/L的基本稳定的乙醇浓度。这等同于约2g/g生物质/天的具体乙酸盐生产率和约4g/g生物质/天的乙醇生产率。
实施例5B:在CSTR中的连续发酵
来自实施例5A的所有液体发酵液都被转移至3L CSTR中,其安装有GE Healthcare的亲水Xampler细胞回收膜,孔径:0.1NMWC,纤维内直径:1mm,膜面积:0.011m2。运行所述发酵罐以使得保持恒定体积并且连续提供包含2%H2、33%N2、45%CO和22%CO2的底物流。运行所述细胞回收循环使得每次排出(pass)时约70%的微生物生物质保留在所述发酵罐中。
自动提供底物以使得pH基本维持在约5.3。在发酵期间,如果所述pH开始升高,则减少所述底物供应。相反地,如果所述pH开始下降,则增加所述底物供应。所述发酵的结果显示在图13-14中。随着因细胞滞留和/或微生物生长导致的微生物密度增加,所述底物供应自动增加以维持基本恒定的pH。保持略低于输入的发酵液pH的恒定pH,导致乙酸盐向乙醇的净转化。在发酵期间,不产生乙酸盐,因此所述发酵罐中的净水平下降至低于5g/L,而乙醇积累至至少40g/L。以该方式运转所述发酵罐导致H2的恒定生产。在第6天和第7天之间,由所述培养物产生的H2量为约1mol%。
实施例6:在CSTR中的连续发酵
2L CSTR被设置为处于以下条件:如下所述制备培养基:将85%H3PO4(30mM)加入到1.5L的溶液A中。通过加入NH4OH将所述培养基的pH调节至5.3。使用前通过在121℃下高压灭菌30分钟或者通过过滤除菌将所述培养基溶液灭菌。加入刃天青作为氧化还原指示剂。在无菌和无氧条件下将所述培养基溶液转移至1.5L CSTR容器中,并且用N2连续鼓泡。一旦转移进所述发酵容器中,可通过探针直接测量所转移培养基的还原状态和pH。将所述培养基加热至37℃并且以300rpm搅拌,然后加入微量金属溶液J(1.5mL)和氮川乙酸(nitriloactetic acid)(0.3ml的0.15M溶液),然后加入Na2WO3(1.5mL的0.01M溶液),然后加入溶液K(15mL)。在接种之前,将所述气体转换为50%N2和50%CO。将活跃生长的Clostridium autoethanogenum培养物以约12%(v/v)的水平接种至所述CSTR中。在该实验期间,以约0.3ml/小时的速率加入Na2S(0.2M)溶液。
使所述微生物培养物以分批方式生长约1天。在第1天,将所述发酵转变为其中提供新鲜培养基的连续生产。响应于所述微生物培养物的需要增加底物供应。所述发酵的结果显示在图15-16中。稳定的初始阶段后,运转所述发酵以使得所述生物质稳定在约3g/L,而乙酸盐保持在约5g/L的浓度,乙醇保持在约15-20g/L的浓度。在约1.5的稀释率下,所述具体乙酸盐生产率为约1.2g/g生物质/天,而所述乙醇生产率为约4-6g/g生物质/天。
在整个所述发酵过程中还产生超过1mol%水平的H2。
本文已借助一些优选实施方案描述了本发明,以使得读者无需过多实验即可实践本发明。本领域技术人员会理解可能有未具体说明的改变和修改。应理解本发明包括这样的改变和修改。此外,提供题目、标题等目的是增强读者对该文件的理解,而不应当被理解为限制本发明的范围。如果有的话,上文和下文引用的所有申请、专利和出版物的公开内容均以引用方式纳入本文。
该申请中对任何现有技术的引用不是,也不应被理解为对所述现有技术形成全世界任何国家所涉及领域中公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示。
在整个该说明书以及以下的任何权利要求中,除非上下文另有说明,词语“包含”等应以不同于排除意义的包括意义来解释,也就是说,“包含但不限于”的意思。