CN102465100A - 一株苯并[a]芘高效降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明筛选出一株降解高浓度苯并[a]芘(BaP)的新菌株-可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)。L.theobromae以BaP作为唯一碳源和能源10d降解率为52.5％。土豆培养基(PDA)在降解初期显著促进BaP的降解。L.theobromae耐受较广的pH范围，pH＝5时降解率最高。水杨酸和琥珀酸钠能够促进L.theobromae对BaP的降解。菲、芘和BaP混合存在时，单个多环芳烃的降解率均降低。染毒土壤中的BaP(50mg/L)35d降解率可达51.4％。污染土壤修复后，多环芳烃降解率从39.0％到～96.7％，能够用于多环芳烃污染土壤的实际修复中。

Description

一株苯并[a]芘高效降解菌及其应用

技术领域

本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一株新型降解高环多环芳烃苯并[a]芘(BaP)的真菌降解特性的筛选及其在污染土壤生物处理和环境污染修复中的应用。

背景技术

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是环境中广泛存在的有机污染物，因为某些PAHs具有“三致”效应，16种PAHs被美国环保局列为环境优先监测污染物，其中五环的PAH-BaP因其高的致癌和致畸作用而被广泛关注，是中国环境主要污染物之一。微生物修复技术是PAHs污染去除最主要的方式。虽然，微生物修复技术具有经济、高效、无二次污染、适用范围广等优点，但是PAHs污染的微生物修复却因高环(四环以上)PAHs的难降解性而受到限制。以往报道中，研究者发现了一系列的菌株能够降解、共代谢氧化或是矿化部分的高环多环芳烃，其中包括红球菌、洋葱伯克氏菌、少动鞘氨醇假单胞菌等，它们能以四环多环芳烃(如芘和屈)为唯一的碳源和能源进行矿化作用，而能够利用BaP作为唯一的碳源和能源进行降解的菌株非常少见。Sudarat等报道了由真菌一微紫青霉菌和细菌-嗜麦芽糖寡养单胞菌组成的复配菌群可以利用BaP作为唯一的碳源和能源进行降解，但两株菌单独使用时都不能利用其作为唯一的碳源和能源，这也增加了实际修复中的难度。Rafin等筛选出一株腐皮镰孢霉菌，能以BaP为唯一的碳源和能源进行降解，但对BaP(100mg/L)的12d降解率仅为4％。因此，筛选一株能单独、高效降解BaP的菌株是非常有科学价值和环境污染修复现实意义的。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有BaP降解技术存在的瓶颈问题，提供一种能高效、快速降解高浓度BaP的菌株，并对其降解特性进行研究。

本发明的另一目的是提供上述菌株进行污染土壤生物处理和环境污染修复中的应用。

本发明提供的BaP高效降解真菌来源于北京焦化厂污染土壤，经人工富集、筛分及纯化所得到。经中国科学院微生物研究所鉴定，该菌株具有以下分类学特征：麦芽汁琼脂培养基(MEA)上菌落生长快，25℃黑暗条件下3天菌落直径65-70mm，初期白色，后期灰黑色，质地絮状，稀疏；菌落背面与正面同色，无水溶性色素。菌丝无色，光滑，多分枝，具分隔，宽2.5-12.1μm。培养后期形成少量黑点，为分生孢子器，发育成熟后分生孢子从孔口挤出。分生孢子深褐色，椭圆形或卵圆形，直，双细胞。此外，进行rRNA基因序列测定：(包括18SrRNA片段，ITS1、5.8rRNA，ITS2的全序列及28S区序列片段)，最终，鉴定为可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)。

与现有技术相比，本发明菌株L.theobromae在无机盐培养基(MSM)中，对BaP(100mg/L)10天降解率达到52.5％，此外在加入营养物质(1mL)土豆培养基(PDA)、调节pH＝5及加入底物水杨酸和琥珀酸钠时，都能促进菌株对于BaP的降解，最高降解率可达58.7％。L.theobromae同样能降解高浓度(200mg/L)的菲(PHE)和芘(PYR)，对三者的降解能力：PHE＞PYR＞BaP。此外L.theobromae在优化条件(1mL PDA，pH＝5，水杨酸(200mg/L))下对于BaP染毒(50mg/L)土壤35天降解率可达到51.4％，对于实际焦化厂污染土壤中16种PAHs 20天的降解率达到39.0％～96.7％，降解率随着苯环数增加而降低。利用这些特点，本发明L.theobromae可用于降解单一高环多环芳烃BaP或PAHs，或者用于PAHs污染土壤的生物修复，并为利用BaP作为唯一碳源和能源进行降解提供了一种新的种质资源。

附图说明

图1L.theobromae对MSM及PDA加入体系中BaP的降解比较图

图2L.theobromae对不同pH下BaP的降解比较图

图3添加不同代谢底物L.theobromae对BaP的降解比较图

图4L.theobromae对PHE、PYR和BaP的降解比较图

图5初始和优化条件下L.theobromae对土壤中BaP的降解比较图

图6L.theobromae对实际焦化厂污染土壤中PAHs的降解图

具体实施方式

下面结合实施对本发明进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例1：BaP降解菌L.theobromae的筛选分离。

45mL无机盐培养基(MSM)中加入5g焦化厂污染土壤和20颗玻璃珠，摇床振荡培养12h后静置。取5mL静置分层后的上清液于含有45mL MSM(BaP浓度25mg/L)的灭菌三角瓶中，30℃、150r/min避光振荡培养。5d后，取5mL菌液转移至BaP浓度为50mg/L的MSM中，重复上述步骤，依次提高BaP浓度为25，50，75，100mg/L。在富集培养过程中，在MSM中加入了少量葡萄糖(每100mL MSM加入0.1g葡萄糖)加快微生物生长。

将最后一周期的培养液涂布于含有BaP(100mg/L)的牛肉膏固体培养基和土豆培养基(PDA)平板(60mg/L青霉素和100μg/mL链霉素)上，30℃恒温培养。菌落生长至大小适中后，经过数次平板划线分离后得到单一BaP降解细菌和真菌。上述所有操作都在无菌条件下进行。

无菌条件下，从斜面上用接种环挑取一环菌，接种于液体营养培养基中，真菌和细菌分别置于30℃，150r/min的摇床上培养24h和72h。培养后的菌液3000r/min离心分离20min，倒掉上清液，加入一定量的灭菌MSM清洗，重复上述步骤清洗三次，MSM定容得到所需浓度的菌悬液。

无菌条件下50mL三角瓶中加入18mL MSM、2mL菌悬液和一定体积的BaP丙酮储备液，使微生物密度分别达到104个(细胞)/mL或0.01g(菌丝湿重)/mL，BaP的浓度达到100mg/L，30℃、150r/min避光振荡培养。分别在1、2、4、7、10d取样测定BaP的残留量。空白对照实验采用高温灭菌(121℃，30min)菌悬液。各实验组中每一处理均为3个重复。

焦化厂污染土壤中共筛出5株降解BaP的活性菌株。其中细菌两株，分别命名为B-1和B-2；真菌三株，分别命名为F-1，F-2和F-3，测定了所有菌株对BaP的降解能力(见表1)。菌株F-1(鉴定结果为L.theobromae)10d降解率最高，这是首次发现L.theobromae对BaP有好的降解特性。

表1筛选菌株的BaP降解率比较

实施例2：L.theobromae对BaP降解的优化条件研究

分别添加1mL的土豆培养基(PDA)，调节MSM的pH值，加入水杨酸和琥珀酸钠(200mg/L)和单独及混合的菲和芘(200mg/L)，讨论对L.theobromae降解BaP的影响。

从附图1可见，在不加额外碳源的单纯MSM中，BaP的降解率慢慢提升，并接近于加入PDA的降解体系，说明L.theobromae能够利用BaP为唯一的碳源和能源进行降解。在降解BaP的初期，加入1mLPDA的培养体系，对于BaP的降解有明显的优势，在第2天的降解率即比不加培养基的体系提高了19.2％，但随着降解时间的延长，降解促进作用逐渐减弱，第4天时差距即减小到4.5％，随后两体系中L.theobromae对BaP的降解趋势慢慢趋于接近，在第10d时，两体系中BaP的降解率趋于相近，后者比前者中BaP降解率提高了5.4％。

说明L.theobromae能够利用BaP为唯一碳源和能源进行高效降解，加入营养物质PDA能够促进对BaP的降解，而且此种加入废弃培养基的修复方法易于在实际微生物修复工程中应用。

从附图2可见，不同pH(2～12)条件下，L.theobromae对BaP均有降解作用，但降解率不同。在pH＝5时，菌株对BaP降解效果最好，2d和7d的降解率分别为15.5％和49.8％。

说明L.theobromae在pH＝5时对于BaP的降解效果最好，但L.theobromae在较宽的pH范围内(2～12)对BaP都有一定的降解效果，可见菌株对于体系pH的耐受范围很广，具有广泛的实际应用价值。

从附图3可见，在加入底物水杨酸和琥珀酸钠(200mg/L)的情况下，第10d，在加入水杨酸和琥珀酸钠的体系中BaP的降解率提高了6.2％和4.2％，两者提高幅度相差不大，水杨酸略优。

说明(水杨酸和琥珀酸钠)加入改变了微生物的碳源和能源的底物结构，从而增大了其对碳源和能源的选择范围，促进了L.theobromae孢子的萌发和降解酶的分泌，进而提高微生物对BaP的降解率。

从附图4可见，L.theobromae对PHE(200mg/L)、PYR(200mg/L)和BaP(100mg/L)单独存在和混合存在时的降解效率。单独存在时，三者在第10d降解率分别为70.0％，59.2％和52.4％；而混合存在时，降解率分别为21.6％，14.5％和11.9％。

说明L.theobromae能够降解不同的PAHs，对PHE、PYR和BaP的降解效率：PHE＞PYR＞BaP，与三者的苯环数呈相反规律。说明L.theobromae对土壤中多环芳烃的降解受PAHs环数影响很大，PAHs分子越大降解速率越小，最终降解率越低，这与本身的毒性，及溶解度等因素有关。

实施例3：L.theobromae对染毒土壤中BaP降解及实际多环芳烃污染土壤修复

实验前称取一定量的无背景值土壤样品于三角瓶中，在无菌条件下向三角瓶中加入一定体积的5g·L^-1的BaP丙酮储备液，使土壤染毒浓度达到50mg·kg^-1土壤干重，混匀，盖上棉塞，以120r/min的速度在(28±1)℃下恒温避光振荡24h，使BaP在土壤中混匀，即得到新鲜染毒的土壤样品。

生物修复：准确称取10g染毒土壤放入60mm培养皿中，加入适量降解菌的菌悬液，使浓度达到0.02g(湿重)/mL(真菌)。加入适量灭菌MSM，使土壤含水量为60％。加盖后置于30℃恒温箱中，通风避光培养，每天以无菌水补足因蒸发损失的水分，分别在0、7、14、21、28、35d将培养皿中全部土样取出，测定其中BaP的残留量。以高温灭菌(121℃，30min)菌悬液替代不灭菌的菌悬液，其它处理同上，空白对照同实施例2。

从附图5可见，对照体系中L.theobromae对于BaP的降解在前21天都很迅速，降解率能达到37.0％，而在其后的培养过程中，降解速率趋于停止。优化条件(添加PDA和水杨酸、pH＝5)下，L.theobromae对于土壤中BaP的降解有所提高，降解35天后，降解率提高了14.4％。

说明L.theobromae同样能高效降解土壤中的BaP，但降解率低于液体体系，优化条件可以促进土壤中BaP的降解。

北京焦化厂实际土壤的修复采用相同的方法，在20d进行采样，用GC-MS法进行样品测定。从附图6可见，L.theobromae在对实际污染土壤20d降解后，16种多环芳烃(NaP、Acy、Ace、Fl、PHE、Ant、Flu、Pyr、BaA、Chr、BbF、BaP、InP、DBA和BgP)的降解率分别为：94.2％、94.8％、73.4％、83.9％、96.7％、92.7％、77.5％、87.8％、93.6％、78.6％、77.3％、65.8％、59.5％、39.0％、65.8％。

说明L.theobromae能够很好的修复实际的多环芳烃污染土壤，降解率随多环芳烃苯环数增加而减少，能够在实际的多环芳烃污染土壤的修复中发挥重要作用。

Claims (3)

1.筛选出一株苯并[a]芘(BaP)高效降解菌，其特征在于：该菌为可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)，并具有降解BaP和多环芳烃混合物(PAHs)的能力。

2.权利1中的L.theobromae对BaP的降解特征：

在无机盐培养基(MSM)中能够利用BaP为唯一的碳源和能源对其进行降解，降解率达到50％以上；

MSM中加入土豆培养基(PDA)在降解初期显著促进BaP的降解速率，提高总体降解率；

L.theobromae可耐受较广的pH范围，在pH＝5时对BaP的降解率最高；

添加代谢底物琥珀酸钠和水杨酸能促进L.theobromae对BaP的降解；

L.theobromae能够修复单独BaP染毒土壤和实际中多环芳烃污染的土壤。

3.权利要求1或2所述L.theobromae降解单一高环多环芳烃BaP污染物或PAHs污染物，或者在PAHs污染土壤生物修复中的应用。

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