CN101643707B - 多环芳烃降解微生物菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种多环芳烃降解微生物菌剂，其由浅黄分枝杆菌W52、浅黄分枝杆菌M16等2种菌株组成。本发明的菌剂具有降解土壤中多种多环芳烃的能力，适合南方水稻土、菜园土、红壤，以及北方的潮土等土壤类型，具有修复多环芳烃污染土壤的显著效果。同时，能够促进作物生长、提高作物产量，其在土壤中降解三环(芴、萘、蒽、苊菲)多环芳烃的能力为98％以上，降解四环芘的能力达90％以上。

Description

多环芳烃降解微生物菌剂

技术领域

本发明属于微生物菌剂领域，具体地，涉及一种含有浅黄分枝杆菌的多环芳烃降解微生物菌剂。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是指分子中含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物，可分为芳香稠环型及芳香非稠环型。芳香稠环型是指分子中相邻的苯环至少有两个共用碳原子的碳氢化合物，如萘、蒽、菲和芘等。

多环芳烃是一类致癌性很强的环境污染物，是环境污染中最重要的监测项目之一。随着煤、石油在工农业生产、交通运输以及生活中的广泛应用，由此而产生的多环芳烃已成为世界各国共同关注的有机污染物，多环芳烃的积累已经越来越严重地威胁着人类健康。

随着国内工业的迅猛发展和化石燃料的广泛使用，国内许多地区已遭受多环芳烃的严重污染(葛成军等，2005)。由于PAHs普遍具有三致性、生物蓄积性、长距离迁移性和半挥发性并能在环境中持久存在，而被列入典型持久性有机污染物(POPs)行列，而受到广泛关注(Bairdet al.，2005；王佩华，2006；Erickson et al.，1999)。芘是典型难降解的具有四个苯环的高分子量PAHs，普遍存在于环境中，而且芘的一些衍生物具有更强的毒性。

微生物降解PAHs由于具有廉价、彻底和无二次污染的优点而倍受科研工作者的重视和关注(Wilson and Jones，1993；程国玲等2003)。早在1928年，Tausson就从巴库油田的油浸土壤样品中分离得到了三环PAHs蒽和菲的同化细菌，之后，科研人员又陆续发现许多能降解低分量PAHs的微生物。由于四环PAHs分子量大不易被微生物降解，四环PAHs降解菌的获取难度也随之增大。近二十几年来，能降解四环PAHs芘和荧蒽、甚至五环PAHs苯并[a]芘的菌株被不断报道。其中，分株杆菌是一类非常重要的降解细菌。Mycobacteriumvanbaalenii PYR-1是第一株降解芘的分枝杆菌(Hetikamp，1988；Heitkamp et al.，1988)。之后，研究人员又发现许多不同的分枝杆菌，如Mycobacterium sp.strain BB1(Boldrin et al，1993)、Mycobacterium sp.strain RJGII-135(Schneider et al.，1996)、Mycobaterium sp.strain KR20(Rehmann et al，1998)、Mycobaterium sp.strain AP1(Vila et al.，2001)及Mycobaterium sp.strain JLS(Miller et al，2004)、Mycobacteriumflavescens(Dean-Ross，1996)等。美国Cerniglia实验室对Mycobacterium vanbaalenii PYR-1的研究最为深入，已经完成全基因组的测序工作(http://img·jgi.doe.gov)；通过***生物学方法，率先破解了芘和荧蒽的完整代谢途径(Kim et al，2006；Kweon et al.，2007)。

自然界的微生物对多环芳烃污染土壤修复过程一般较慢，难于实际应用，因而在人为促进条件下，利用接种外源微生物的降解作用，去除土壤中多环芳烃类的微生物修复技术，提高降解多环芳烃的速率，以及植物与微生物联合修复已成为土壤修复领域的研究热点。

20世纪70年代研究人员开展了利用微生物修复多环芳烃污染土壤的尝试(Ahmed and Focht，1973)，80年代科学家认识到微生物是多环芳烃污染环境修复的最有良好前景的技术(Atlas，1981)、20世纪90年代，石油与多环芳烃污染污染环境的生物修复发展迅速，利用不同类型的菌株，调控最适合的生长条件，取得了世人瞩目的修复效果。无色菌Achromobacter sp.和分枝杆菌Mycobacterium sp.降解多环芳烃的研究结果表明，营养供应影响降解效果，Achromobacter sp.在磷酸盐供应时降解效果最高，而分枝杆菌Mycobacterium sp在含氯化合物供应时获得最好的效果(Cutright and Lee，1994)。加拿大研究人员采用接种微生物与机械翻动进行污染土壤的修复，土壤接种菌株达到10⁹cfu/g土壤，固体状态修复效果好，总PAHs由1000μg/g土壤下降至100μg/g土壤，苯并芘由100μg/g下降为小于10μg/g土壤(Hyzy andSchepart，1995)。Bewley(1991)首先应用基因工程菌对汽油污染地进行修复，并对生物强化修复潜在相关问题进行了测定，为其优越性利用的必需条件予以探索。一般认为白腐真菌降解多环芳烃能力强，但是有研究显示，丝状真菌同样具有高效降解土壤多环芳烃污染作用，自然土壤的原位修复试验结果表明，接种菌丝体降解土壤多环芳烃的效果最好，但不同菌株效果差异较大(Potin and Rafin，2004)。

随着科研人员对污染土壤进行生物修复的深入研究，发现有些植物能促进微生物对污染土壤中的修复作用。植物在修复过程中，会释放促进化学反应的根际分泌物和酶，根际作用增加了微生物降解菌的数量，另一方面是因为植物分泌有机物为微生物共代谢提供了共代谢的基质底物(Alley and Brown，2000)。

综上所述，利用多环芳烃降解微生物进行污染土壤的生物修复具有巨大的应用潜力。分枝杆菌是一个重要的具有四环及以上环PAHs较强降解能力的微生物类群，分枝杆菌降解PAHs的菌株筛选已有报道，但是分支杆菌的微生物菌剂及其对多环芳烃污染土壤的修复效果未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种多环芳烃降解微生物菌剂。

为了实现本发明的目的，本发明的多环芳烃降解微生物菌剂，其有效成分包括：

浅黄分枝杆菌W52；

浅黄分枝杆菌M16。

其中，本发明的浅黄分枝杆菌W52菌株，编号为CGMCC NO.2274，其分类命名为Mycobacterium gilvum，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.2274，保藏日期2007年11月30日。

本发明的浅黄分枝杆菌M16菌株，编号为CGMCC NO.2273，其分类命名为Mycobacterium gilvum，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.2273，保藏日期2007年11月30。

本发明的多环芳烃降解微生物菌剂，其包括如下重量份的组分：

浅黄分枝杆菌W52    1-5份；

浅黄分枝杆菌M16    1-5份；

添加剂             10-15份。

优选的为：

浅黄分枝杆菌W52    1份；

浅黄分枝杆菌M16    1份；

添加剂             12份。

所述的添加剂为草炭或硅藻土，同时可加入适量的微量元素。

上述微量元素中通过添加H₃BO₃、MnSO₄·7H₂O、ZnSO₄·7H₂O、Cu SO₄·5H₂O、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、Co(NO₃)·6H₂O来提供。

本发明的多环芳烃降解微生物菌剂在降解有机芳香化合物中的应用，其中所述的有机芳香化合物为多环芳烃，其包括芘、菲、荧蒽、芴、萘、蒽、苊。

本发明的浅黄分枝杆菌W52菌株分离自江苏徐州卧牛山焦化厂附近的污泥，本发明的浅黄分枝杆菌M16菌株分离自湖南邵阳焦化厂附近污泥。

本发明的浅黄分枝杆菌W52的形态学特征为：W52在30℃恒温培养5d后肉眼才可看到清晰的单菌落。菌落在营养肉汁平板上起初为乳白色，随着菌龄的增加，颜色越来越深，最后W52菌株呈橘黄色。菌落呈规则圆型，中间略凸起，表面光滑，边缘整齐，质地粘稠。在显微镜下观察，菌体都为杆状略有弯曲，不产生孢子，不运动，无芽孢，无荚膜。革兰氏染色弱阳性，抗酸染色为阳性。

本发明的浅黄分枝杆菌W52的生理生化特征为：菌株W52能以5％NaCl生长，能还原硝酸盐、亚碲酸盐，吐温水解(10d)、过氧化氢酶为阳性，脲酶阳性，不能发酵葡萄糖产酸，能从***糖、海藻糖、果糖、半乳糖、鼠李糖产酸，45℃不能生长，暗产色素，W52能以苹果酸和琥珀酸为唯一碳源生长，据此初步确定W52为分枝杆菌属的快速生长群的暗产色菌。

本发明的浅黄分枝杆菌M16的形态学特征为：M16在30℃恒温培养5d后肉眼才可看到清晰的单菌落。菌落在营养肉汁平板上起初为乳白色，随着菌龄的增加，颜色越来越深，M16最终呈黄色。菌落均呈规则圆型，表面光滑，边缘整齐。革兰氏染色后，不易着色，抗酸染色都为阳性。细胞为杆状，不产生孢子，不运动，无芽孢。

本发明的浅黄分枝杆菌M16的生理生化特征为：M16也能以5％NaCl生长，能还原硝酸盐，吐温水解(5d)、过氧化氢酶为阳性，但脲酶实验为阳性。不能发酵葡萄糖产酸，不能从甘露糖醇产酸，但能从***糖、鼠李糖、山梨醇、卫茅醇、海藻糖、肌醇、果糖、半乳糖产酸。M16只能以苹果酸为唯一碳源生长。据此初步确定M16为分枝杆菌属的快速生长群的暗产色菌。

本发明的浅黄分枝杆菌W52菌株的培养方法：

将菌株加入到营养肉汁培养基中30℃，170r·min^-1振荡培养3d。

营养肉汁培养基，成分及用量(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，琼脂20，调整pH7.0-7.2。

本发明的浅黄分枝杆菌M16菌株的培养方法：

将菌株加入到营养肉汁培养基，30℃，170r·min^-1振荡培养3d。

营养肉汁培养基，成分及用量(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，琼脂20，调整pH7.0-7.2。

由本发明的微生物菌剂由降解多种三环PAHs和四环PAHs的安全的浅黄分枝杆菌W52、浅黄分枝杆菌M16等2个菌种组成。具有溶解土壤中多种多环芳烃的能力，适合南方水稻土、菜园土、红壤，以及北方的潮土等土壤类型，具有修复多环芳烃污染土壤的显著效果。同时，能够促进作物生长、提高作物产量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 多环芳烃降解微生物菌剂的制备

发酵罐培养液配方为：牛肉汁0.5％，蛋白胨0.5％，NaCl 0.5％，豆油0.5％，葡萄糖0.5％，硫酸镁0.08％，磷酸二氢钾0.04％，碳酸钙0.5％，800μM的Cu、Zn、Mn、Fe，搅拌。灭菌前pH值7.6，灭菌后pH值为7.4。

将W52和M16菌株分别划线接种于牛肉汁蛋白胨培养基上，28-30℃培养48h，然后分别接入500mL三角瓶，在30℃，180r/min下，培养18h。然后按1％接种量接入到15L种子罐中，在180r/min，pH7.5，通气量0.5vvm下，培养24h后，再按5％的接种量装入到100L的发酵罐中，在200r/min，pH7.5，通气量0.6vvm下，培养3d。

发酵完成后，将W52、M16和草炭分别按照1∶1∶12的比例将菌株加入灭好菌的草炭或者硅藻土，同时加入0.1％的微量元素(H₃BO₃57mg/L，MnSO₄·7H₂O 43mg/L，ZnSO₄·7H₂O 43mg/L，CuSO₄·5H₂O 40mg/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 37mg/L，Co(NO₃)·6H₂O25mg/L)，无菌装袋封口，常温保藏。

实验例1 本发明生物菌剂降解多环芳烃的实验

无机盐基础培养基，成分及用量(g/L)：NH₄Cl 1.1，K₂HPO₄ 1.0，NaCl 0.5，KCl 0.2，MgSO₄·7H₂O 0.2，FeSO₄ 0.001，CaCl₂ 0.01，再加入微量元素混合溶液1ml(H₃BO₃57mg/L、MnSO₄·7H₂O43mg/L、ZnSO₄·7H₂O43mg/L、CuSO₄·5H₂O40mg/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O37mg/L、Co(NO₃)·6H₂O 25mg/L)，固体培养基中加入2％琼脂。

在含有多环芳烃的固体平板上，接种10μL的实施例1的菌液(含菌10⁸cfu/mL)，30℃培养。降解菌W52和M16在第3、7、14和21d的降解圈和菌落直径见表1和表2，根据平板单位面积的PAHs含量，最后得到降解菌对固体PAHs的降解量见表3。

表1降解菌W52在含菲、荧蒽和芘晶膜的琼脂培养基上的降解圈和菌落直径(mm)

表2降解菌M16在含菲、荧蒽和芘晶膜的琼脂培养基上的降解圈和菌落直径(mm)

表3降解菌株W52和M16的降解量(×10^-2mg)

根据每天观察降解圈和菌落的大小，可以看出，在含菲晶膜的平板上，两株菌的降解圈较大，菌落也较大，相对地，在荧蒽和芘的平板上降解圈生长较缓慢，降解圈和菌落均较小，这是因为菲为低分子量的多环芳烃，较易降解；在PAHs含量高的平板上，降解圈较小，长势较慢。

菌株W52在含芘的琼脂固体平板上降解芘能力达与菌株M16，而降解菲和荧蒽的能力则低于菌株M16。培养3d时菌株W52降解芘7.2×10^-2mg，比菌株M16的降解量(3.9×10^-2mg)提高84.5％；培养21d时菌株W52降解芘36.6×10^-2mg，比菌株M16的降解量(20.1×10^-2mg)提高82.1％。表明菌株W52更适合用于芘的降解。

实验例2 本发明生物菌剂对芘污染土壤的修复实验

在灭菌与不灭菌土壤中加入芘200mg/kg土，添加尿素125mg/kg土，氯化钾125mg/kg土，磷酸二氢钾125mg/kg土，种植油菜和小白菜，加入实施例1的菌剂(W52与M16的组合)4g/kg土壤，W52、M16菌株分别使用作为第二级对照，使用量同样为4g/kg土壤，在温室中种植。植物生长2周、4周、6周后，取样测定土壤中芘的残留量，应用SAS软件进行数据处理，结果如表4、表5和表6所示。

表4接种2周后不同处理的土壤中芘残留量(mg/kg)

注：不同字母代表不同处理间的差异达0.05水平。

表5接种4周后不同处理土壤中的芘残留量(mg/kg)

注：不同字母代表不同处理间的差异达0.05水平。

表6接种6周后不同处理土壤中的芘残留量(mg/kg)

表4结果表明：土壤灭菌条件下，种植小白菜2周后，接种菌剂与不接种菌剂有明显差异，不接种菌剂降解率为51.7％，接种菌剂W52后由接种前的土壤芘200mg/kg下降至15.55mg/kg，降解率达92.2％，接种菌剂M16由接种前的土壤芘200mg/kg下降至15.86mg/kg，降解率为92.1％，接种菌剂W52和M16由接种前的土壤芘200mg/kg下降至11.64mg/kg的降解率为94.2％；种植油菜后，接种菌剂土壤芘的降解率大于白菜。接种菌剂W52和M16的组合降解率效果最好，土壤芘200mg/kg下降至7.94mg/kg，降解率达到97.6％。

不灭菌条件下，菌株W52和M16组合接种小白菜降解土壤芘的效果大于灭菌条件，降解率为97.6％，油菜接种W52和M16组合的芘降解率达到96.7％。所有处理中以不灭菌，种植小白菜，接种菌剂W52和M16的组合降解率最高。种植油菜、不使用菌剂对照的土壤芘浓度低于种植白菜，说明油菜自身降解芘的能力较强。

表5结果显示，接种4周后不同处理土壤中的芘残留量都比2周时下降。土壤灭菌种植白菜及土壤不灭菌种植油菜条件下，接种菌剂与不接种菌剂的差异显著。三种菌剂处理之间有显著差异。

土壤灭菌、种植白菜接种W52和M16菌剂芘降解率98.77％，种植油菜芘降解率98.47％；土壤不灭菌种植白菜接种W52和M16菌剂芘的降解率96.67％，种植油菜的芘的降解率98.47％。所有接种W52和M16菌剂的土壤芘降解率都显著高于W52、M16单接种。

表6结果显示，在第6周时，所有接种W52和M16组合菌剂的芘降解率都显著高于W52、M16单接种。

土壤灭菌、种植白菜接种W52和M16菌剂的芘降解率99.83％，种植油菜芘降解率99.85％；土壤不灭菌种植白菜接种W52和M16菌剂芘的降解率99.82％，种植油菜的芘的降解率99.86％。在低含量(2～4mg/kg)时菌株W52和M16菌剂对芘同样能够有效降解。

实验例3本发明生物菌剂对植物生物量的影响

实验例2的植株收获后的生物量数据如表7所示。

表7不同处理的植物生物量(g/盆)

在灭菌土壤中，接种W52、M16、W52与M16组合(实施例1的生物菌剂)三个接菌的白菜、油菜的生物量高于空白对照，W52与M16组合接种的生物量高于单个接种。

不灭菌土壤中，接种W52、M16、W52与M16组合菌剂的油菜和白菜的生物量都高于空白对照。W52与M16组合接种的白菜、油菜的生物量高于W52、M16单接种。不灭菌土壤中植株生物量都高于灭菌土壤中。表明芘降解菌W52和M16在污染土壤中对植物有促进生长的作用。

实验例4植株根和茎叶对芘的吸收

实验例3得到的不同处理的植株根和茎叶的芘含量，如表8所示。

表8不同处理条件下植株根和茎叶的芘含量(ng/g)

结果表明，无论在根还是茎叶部分，接种多环芳烃降解菌剂的作物积累的芘量都低于不接种菌剂的对照。

不灭菌条件下，白菜接入菌剂的茎叶吸收芘量高于灭菌土壤白菜吸芘量，接菌的油菜吸芘量高于不灭菌油菜的吸芘量。接种W52和M16混合菌剂，白菜、油菜的吸芘量显著低于W52、M16单独使用。使用多环芳烃降解菌剂能够减少作物对芘的的吸收量。

Claims (7)

1.一种多环芳烃降解微生物菌剂，其有效成分为：

浅黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)W52，保藏号CGMCC NO.2274；

浅黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)M16，保藏号CGMCC NO.2273。

2.如权利要求1所述的菌剂，其包括如下重量份的组分：

浅黄分枝杆菌W52    1-5份；

浅黄分枝杆菌M16    1-5份；

添加剂             10-15份。

3.如权利要求2所述的菌剂，其特征包括如下重量份的组分：

浅黄分枝杆菌W52    1份；

浅黄分枝杆菌M16    1份；

添加剂             12份。

4.如权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述的添加剂为草炭或硅藻土。

5.权利要求1-4任一所述的菌剂在降解有机芳香化合物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的有机芳香化合物为多环芳烃。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的多环芳烃为芘、菲、荧蒽、芴、萘、蒽或苊。