CN102464617A - 具有抗癌活性的秃疮花红碱及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗癌活性的秃疮花红碱及其制备方法。该化合物为阿扑菲类生物碱类化合物，具有C₂₀H₂₀NO₅的分子式。通过秃疮花原料采集加工、提取、分离纯化三个步骤制备。经过体外、体内的药理实验表明秃疮花红碱具有较强的抗癌活性。

Description

具有抗癌活性的秃疮花红碱及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有抗癌活性的化合物秃疮花红碱及其制备方法。具体地讲，本发明涉及从罂粟科植物秃疮花中提取分离一种新阿扑菲类生物碱化合物秃疮花红碱及其制备方法。

背景技术

秃疮花[Dicranostigma leptopodum(Maxim)Fedde]，又名红茂草、秃子花、勒马回(陕西)，为罂粟科秃疮花属植物。秃疮花为二年生或多年生草本，高25-80厘米；秃疮花分布于亚洲温带，海拔400-1300米的丘陵、山坡、路边、农田、草地、墙上等处，耐旱、耐瘠薄；我国全产，主要分布在甘肃、陕西、河南、山西、青海、宁夏、四川、云南、西藏等省区；秃疮花在甘肃省主要生长于秦岭南北、渭河流域；该植物春、夏两季均可采挖带根全草，阴干或鲜用。《全国中草药汇编》载：“苦、涩、凉，有毒”；《陕西中草药》载：“味苦、涩，性凉”；全草有清热解毒、消肿止痛、杀虫等功效；治扁桃体炎、牙痛、咽喉痛、***核；外用于秃疮、疥癣、痈疽、瘘管、顽固性口炎、化脓性中耳炎、胃溃疡、外伤、带状疱疹、阴囊癣、***肿痛、霉菌性***炎等疾病。

现代药理研究表明：秃疮花提取物对卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)诱导的小鼠免疫性肝损伤具有一定的保护作用[毛爱红，唐德平，夏小慧.秃疮花提取物对CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤的影响.兰州大学学报(医学版)，2008，34(2)：18-20]；秃疮花可显著降低因CCl₄而引起的血清谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和肝脏丙二醛(MDA)水平的升高，并能维持血清超氧化物歧化酶(SOD)水平，使肝组织病理变化得以改善[张昱，张伟，田玉璋.秃疮花有效成分对小鼠CCl₄肝损伤的保护作用，青海医学院学报，2004，25(1)：7-10]；秃疮花提取物在体内外可分别抑制由H₂O₂和乙酰苯肼引发的鼠红细胞氧化性溶血[赵祁，韩寅，杜宇平.秃疮花提取物对红细胞氧化性溶血的抑制机制.兰州大学学报(医学版)，2006，32(3)：40-45.]。

天然产物化学成分研究表明秃疮花中主要含有阿扑菲类异喹啉生物碱[畅行若，王宏新，周光治.秃疮花化学成分及组织形态研究.药物分析杂志，1982，2(5)：273-277]，该类生物碱大都具有镇痛，镇静及肾上腺能受体样作用，部分化合物具有抗癌活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗癌活性的新化合物秃疮花红碱。

本发明的另一个目的在于提供一种具有抗癌活性的秃疮花红碱的制备方法。

我们首次从罂粟科植物秃疮花中提取分离的新化合物秃疮花红碱，具有抗癌活性。

一种具有抗癌活性的秃疮花红碱，其特征在于该化合物为阿扑菲类生物碱类化合物，具有C₂₀H₂₀NO₅的分子式，化学结构式如式I

式I

本发明提供的化合物秃疮花红碱的化学结构经过UV、IR、¹HNMR、¹³CNMR、DEPT、COSY、HMQC、HMBC、HR-ESIMS等现代光谱及波谱技术的鉴定得到确认并具有以下理化常数和谱学特征：

C₂₀H₂₀NO₅，***粉末状固体，HR-ESIMS：m/z＝354.1335[M]⁺，C₂₀H₂₀NO₅的计算值为354.1336；UV(MeOH)_max(Log)nm 225(3.55)，281(2.78)，328(3.01)nm；IR(KBr) _max cm^-1：1680，1603，1564cm^-1；¹H NMR谱和¹³C NMR谱数据见表1：

表1秃疮花红碱的¹HNMR(400MHz)和¹³CNMR(100MHz)数据(TMS，ppm，JHz)

本发明的秃疮花红碱的制备方法，其特征在于通过秃疮花原料采集加工、提取、分离纯化三个步骤：

A、原料采集加工：采集秃疮花、干燥、粉碎；

B、浸膏提取步骤：采用70-95％(V/V)乙醇或5％的质子酸水对原料冷浸或回流热提得总浸膏；

C、分离纯化步骤：总浸膏用碱化水混悬，依次用石油醚，氯仿，正丁醇进行液液分配萃取得到F_A、F_B、F_C三个组分；F_B组分用石油醚和丙酮体系或氯仿和甲醇体系以不同体积比例混和组成的混合溶剂，按极性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱分离，收集极性在4∶1到6∶1的组分F_B2；F_B2以石油醚和丙酮按体积比4∶1混和溶剂重新进行柱色谱分离得秃疮花红碱粗品，以氯仿和甲醇按体积比2∶1组成的混和溶剂重结晶得到秃疮花红碱。

本发明通过体外、体内的药理实验表明秃疮花红碱具有较强的抗癌活性。

本发明的优点在于：

1、从秃疮花中提取分离到具有抗癌活性的化合物秃疮花红碱；

2、按本发明提供的制备方法，提取分离制备秃疮花红碱，工艺简单，方法可靠，产率高，化合物纯度好。

附图说明

图1为式I化合物秃疮花红碱的红外光谱(IR)图。

图2为式I化合物秃疮花红碱的高分辨质谱(HR-ESIMS)图。

具体实施方式

为了更清楚的理解本发明，以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1：秃疮花中秃疮花红碱的提取分离

A、原料采集加工步骤：采集秃疮花适量，阴干，适当粉碎。

B、浸膏提取步骤：取秃疮花5Kg，加入8倍量95％乙醇，冷浸(7d×3)，过滤，减压回收溶剂得总浸膏180g。

C、分离步骤：将180g浸膏浑悬于1000mL水中，用300mL石油醚(60-90℃)萃取3次，回收溶剂的浸膏F_A20g，剩余物用300mL氯仿萃取3次，回收溶剂得浸膏F_B30g，剩余物用300mL正丁醇萃取3次得浸膏F_C30g。将氯仿F_B部分浸膏用30g硅胶(100-200目)拌样，600g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60-90℃)∶丙酮(10∶1-2∶1)进行梯度洗脱，500mL为一流份，回收溶剂，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以碘-碘化铋钾生物碱试液，检视并相同组分，得F_B1(5g，10∶1)、F_B2(4g，4∶1)、F_B3(4g，2∶1)、三个组分。组分F_B2用5g硅胶(100-200目)拌样，40g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60-90℃)∶丙酮(4∶1)洗脱，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以碘-碘化铋钾生物碱试液，显色后合并相同组分得秃疮花红碱5mg。

实施例2：秃疮花中秃疮花红碱的提取分离

A、原料采集加工步骤：采集秃疮花适量，阴干，适当粉碎。

B、浸膏提取步骤：取秃疮花5Kg，加入8倍量5％硫酸水溶液，加热回流(1.5h×3)，过滤，碱水碱化提取液，减压回收溶剂得总浸膏300g。

C、分离步骤：将300g浸膏浑悬于1000mL碱化水中，用300mL石油醚(60-90℃)萃取3次，回收溶剂的浸膏F_A15g，剩余物用300mL氯仿萃取3次，回收溶剂得浸膏F_B20g，剩余物用300mL正丁醇萃取3次得浸膏F_C80g。将氯仿F_B部分浸膏用20g硅胶(100-200目)拌样，400g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，氯仿∶甲醇(10∶1-2∶1)进行梯度洗脱，500mL为一流份，回收溶剂，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以碘-碘化铋钾生物碱试液，检视并相同组分，得F_B1(2g，10∶1)、F_B2(2g，6∶1)、F_B3(3g，2∶1)、三个组分。组分F_B2用2g硅胶(100-200目)拌样，30g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60-90℃)∶丙酮(4∶1)洗脱，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以碘-碘化铋钾生物碱试液，显色后合并相同组分得秃疮花红碱5mg。

实施例3：秃疮花中秃疮花红碱的提取分离

A、原料采集加工步骤：采集秃疮花适量，阴干，适当粉碎。

B、浸膏提取步骤：取秃疮花5Kg，加入10倍量95％乙醇，回流热提(2h×3)，过滤，减压回收溶剂得总浸膏250g。

C、分离步骤：将200g浸膏浑悬于1000mL碱水中，用300mL石油醚(60-90℃)萃取3次，回收溶剂的浸膏F_A15g，剩余物用300mL氯仿萃取3次，回收溶剂得浸膏F_B20g，剩余物用300mL正丁醇萃取3次得浸膏F_C80g。将氯仿F_B部分浸膏用20g硅胶(100-200目)拌样，400g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60-90℃)∶丙酮(10∶1-2∶1)进行梯度洗脱，500mL为一流份，回收溶剂，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以碘-碘化铋钾生物碱试液，显色后合并相同组分，得F_B1(5g，10∶1)、、F_B2(2g，4∶1)、F_B3(6g，2∶1)四个组分。组分F_B2用2g硅胶(100-200目)拌样，20g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60-90℃)∶丙酮(6∶1)洗脱，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以碘-碘化铋钾生物碱试液，显色后合并相同组分得秃疮花红碱4.5mg。

实施例4：秃疮花红碱对人肝癌细胞HepG₂和人肺癌细胞A549的体外细胞毒作用

A、制备人肝癌细胞株HepG₂和人肺癌细胞A549的悬液：0.25％胰蛋白酶消化，用培养液配成8×10⁴个细胞/mL细胞悬液；接种细胞：每孔100L接种于96孔板中；

B、预培养：37℃，5％CO₂及饱和湿度下培养24h；

C、将药物秃疮花红碱：按0.2、0.4、0.6、1.2、1.6、2.0mol/mL浓度加药，每孔100L，每个浓度设三个复孔。37℃，5％CO₂及饱和湿度下继续培养24h；

D、24h后，取出培养板，每孔加入50％(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)50L固定细胞，TCA的终浓度为10％，加在每孔液面上，在4℃冰箱中放置1h；培养板各孔用去离子水洗涤5次，去除TCA，在空气中干燥后，每孔加0.4％的SRB100L，室温下放置10～30min，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5次，去除未结合的染料，空气中干燥后用pH为10.5，10mmol/L三羟甲基胺基甲烷溶解，在平板振荡器上振荡5min，在酶联免疫检测仪490nm波长下测定OD值，用空白对照调零，将所获肿瘤细胞生长抑制率定义为药物对肿瘤细胞的体外抑制率。测定药物秃疮花红碱对人肝癌细胞株HepG₂和人肺癌细胞A549的IC₅₀分别为：10mol/mL和12mol/mL。

实施例5：秃疮花红碱对小鼠S180肉瘤体内抑瘤活性

A、S180带瘤动物的移植和接种：取传代接种后9-10d龄S180荷瘤小鼠，无菌抽取小鼠腹腔内瘤细胞，置于冰水浴，用冰冷的生理盐水(含100U/ml青霉素和100mg/L链霉素)将抽取的S180细胞浓度调至1.0×10⁷个/mL。在小鼠右前肢腋窝皮下注射0.2mL冷却的细胞悬液，细胞总数为2.0×10⁶个/只。

B、分组及给药：将接种了S180的小鼠按体重随机分为5组，每组16只，即模型对照组、HT低剂量组、HT中剂量组、HT高剂量组。另设空白对照组，空白对照组不接种肿瘤细胞，每日ip.生理盐水；模型对照组，每日ip.生理盐水；低、中、高剂量组，每日分别以15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg的剂量ip.秃疮花红碱；阳性对照组，每2日i.p.环磷酰胺(CTX)一次，剂量为30mg/kg。连续给药12天，第13天全部小鼠颈椎脱臼处死，取瘤块称重，按下式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(模型对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型对照组平均瘤重×100％。

D、结果经统计分析，秃疮花红碱对S180肉瘤的抑瘤率分别为：高剂量组65.0％，中剂量组50.1％，低剂量组30.1％。该结果表明秃疮花红碱对小鼠S180肉瘤有一定的抑制作用，对S180荷瘤小鼠的体重增长、肝指数、肾指数、胸腺指数、脾脏指数均没有明显影响。

Claims (2)

1.一种具有抗癌活性的秃疮花红碱，其特征在于该化合物为阿扑菲类生物碱类化合物，具有C₂₀H₂₀NO₅的分子式，化学结构式如式I

式I。

2.如权利要求1所述秃疮花红碱的制备方法，其特征在于通过秃疮花原料采集加工、提取、分离纯化三个步骤：

A、原料采集加工：采集秃疮花、干燥、粉碎；

B、浸膏提取步骤：采用70-95％(V/V)乙醇或5％的质子酸水对原料冷浸或回流热提得总浸膏；

C、分离纯化步骤：总浸膏用碱化水混悬，依次用石油醚，氯仿，正丁醇进行液液分配萃取得到F_A、F_B、F_C三个组分；F_B组分用石油醚和丙酮体系或氯仿和甲醇体系以不同体积比例混和组成的混合溶剂，按极性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱分离，收集极性在4∶1到6∶1的组分F_B2；F_B2以石油醚和丙酮按体积比4∶1混和溶剂重新进行柱色谱分离得秃疮花红碱粗品，以氯仿和甲醇按体积比2∶1组成的混和溶剂重结晶得到秃疮花红碱。

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