CN104688798B

CN104688798B - 一种霞草提取物的制备方法及应用

Info

Publication number: CN104688798B
Application number: CN201510129709.6A
Authority: CN
Inventors: 孙敬勇; 解龙霄; 汪海洋; 牟艳玲; 谢天封; 张浩超; 邓志鹏; 刘爱芹; 王凤玲; 王燕
Original assignee: INSTITUTE OF MATERIA MEDICA SHANDONG ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF MATERIA MEDICA SHANDONG ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES
Priority date: 2015-03-24
Filing date: 2015-03-24
Publication date: 2018-09-21
Anticipated expiration: 2035-03-24
Also published as: CN104688798A

Abstract

本发明属于天然药物领域，具体涉及一种霞草提取物的制备方法及其应用。本发明霞草提取物的制备方法，包括下述的步骤：（a）霞草干燥根为原料，经乙醇回流提取后上大孔树脂柱，以乙醇‑水***梯度洗脱，合并40‑70%乙醇洗脱液，得到霞草总皂苷；（b）步骤（a）中所得的霞草总皂苷碱水解上大孔树脂柱，即得。本发明通过碱水解将大量存在于霞草根中没有抗肿瘤活性的，或活性较弱的总皂苷转变成具有强抗肿瘤活性的提取物。经药理实验证明，本发明的制备方法制备的霞草提取物具有优异的抗肿瘤活性。

Description

一种霞草提取物的制备方法及应用

技术领域

本发明属于天然药物领域，具体涉及一种霞草提取物的制备方法及其应用。

背景技术

目前,恶性肿瘤(简称癌症)仍然是威胁人类生命和健康的主要疾病。随着工业化、城市化进程的加快和环境污染的加重，全球癌症的发病率呈现持续升高的总体趋势,癌症已成为全球性的公共卫生问题。近年来，尽管抗肿瘤药物的研发与应用取得重要进展，某些类型肿瘤的化疗取得突出的疗效。但是，对于大多数类型肿瘤，特别是发病率较高的实体性肿瘤（如肺癌、肝癌、结肠癌及胰腺癌等）还缺乏有效的药物，不少抗肿瘤药在临床应用过程中产生耐药性，毒副作用大。发现与研究新型有效的抗肿瘤药物具有极其迫切的需要。因此，寻找安全有效的抗肿瘤药物仍然是一个极为重要的课题。

自然界中植物资源丰富，是研究抗肿瘤新药的重要来源。目前用于抗肿瘤药物中的天然药物包括了长春碱类、三尖杉酯碱类、鬼臼毒素类、喜树碱类、紫杉醇类等。相对于人工合成的化学药物，天然药物毒性较低的优点在肿瘤治疗中得到了大量应用。因此，从天然产物中寻找新的活性成分，并进而研制新的药物为当今寻找安全有效的抗肿瘤药物的重要途径。

霞草（Gypsophila oldhamiana Miq.）为石竹科石头花属植物，主产于山东、山西、陕西等地。具有清热凉血、活血散瘀、消肿止痛、化腐生肌等功效。霞草中富含三萜皂苷类，如皂皮酸、丝石竹皂苷、常青藤皂苷等成分。霞草总皂苷储量丰富，该部位在药材中含量高达约20%，但其活性并不十分明确。

专利200510044301.5提供了一种从霞草（Gypsophila oldhamiana Miq.）根中提取的霞草提取物的方法，具体如下：

1、霞草粗提物的制取：

(1)、取霞草根自然干燥后粉碎； (2)、用溶剂提取；所说的溶剂它选自丙酮、醇类水或水醇混合溶剂，所说的醇类为甲醇、乙醇、异丙醇等短链醇。 (3)、提取液减压浓缩得提取物浸膏，即为霞草粗提物，该粗提物中含有5%-30%的皂苷；

该霞草粗提物也可以按以下方法来提取：

A、粉碎的霞草根用水提取； B、提取液浓缩成相对密度1.04～1.34的稠浸膏C、稠浸膏中加入乙醇至乙醇浓度为40～95%；D、静置，取上清液浓缩成浸膏，即为霞草粗提物。

2、霞草粗提物的精制：

(1)、将霞草粗提物加水制成水混悬液； (2)、过大孔树脂柱，这里所用的大孔树脂孔为中低极性大孔树脂，先用水或l-l0%低浓度的乙醇或甲醇溶液洗脱，除去极性溶剂中的杂质；(3)、再用20%以上的高浓度乙醇或甲醇洗脱； (4)、收集高浓度醇洗脱液，蒸馏回收溶剂，干燥、制得含皂苷的精制霞草提取物，该提取物中含有30%以上的皂苷。

3、含皂苷霞草提取物的纯化：

上述经精制后的霞草提取物，进一步用有机溶剂进行纯化可制得更高纯度的霞草提取物，其中皂苷含量可达到80%以上，这里所说的有机溶剂它选自正丁醇、醋酸乙酯、丙酮一***的混合溶剂、氯仿一甲醇一水的混合溶剂或石油醚。

专利200510044301.5的霞草提取物的制备方法，根据需要可以制备得到皂苷含量在5%以上或10%以上或30%以上或50%以上或80%以上，具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物。但是，制备得到的霞草提取物其活性较低，在成药过程中服用量较大。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种霞草提取物的制备方法。

本发明的另一目的在于提供该方法制备霞草提取物在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用。所述癌细胞为肝癌细胞Bel-7402、胃癌细胞BGC-823、乳腺癌细胞MCF-7、结肠癌细胞HCT-8、卵巢癌A2780、口腔上皮细胞癌KB，***细胞Hela，***癌细胞PC-3M，肺腺癌细胞A549中的一种或几种。

本发明是通过下述的技术方案来实现的：

一种霞草提取物的制备方法，包括下述的步骤：

（a）霞草干燥根为原料，以4-10倍量的10-80%乙醇回流提取2-3次，每次0.5-1.5小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，过滤或高速离心，滤液或离心上清液上大孔树脂柱，以乙醇-水***梯度洗脱，合并40-70%乙醇洗脱液，减压蒸干，得到霞草总皂苷。步骤（a）得到的提取物中，其有效成分为霞草总皂苷，该提取物中霞草总皂苷含量≥50%；

（b）将1重量份步骤（a）中所得的霞草总皂苷和5-20重量份1-10%氢氧化钾或氢氧化钠水溶液于40-100℃水浴中温热或回流进行反应1-40小时，至反应液中的霞草总皂苷提取物主斑点消失；反应液放冷后加酸调节pH值至5-6，然后上大孔树脂柱，以乙醇-水***梯度洗脱，合并40%-70%乙醇液洗脱液，减压回收乙醇至相对密度1.08-1.25的稠膏，冷冻干燥，即得。

步骤（b）对霞草总皂苷进行了进一步的水解，得到水解后的霞草总皂苷称之为霞草总次级皂苷，该霞草总次级皂苷是霞草抗肿瘤作用的主要活性成分。该提取物中活性总次级皂苷含量≥50%。

上述的霞草提取物的制备方法中，所述步骤（a）中大孔树脂柱为D101、D1、HPD100、HPD300或AB-8大孔树脂柱中的一种。

优选的，上述的霞草提取物的制备方法中，所述步骤（a）中大孔树脂柱为D101大孔树脂柱。

上述的霞草提取物的制备方法中，所述步骤（a）中乙醇-水***梯度洗脱为，先用20%以下的乙醇洗脱去除杂质，再用30%以上的高浓度乙醇洗脱，收集40-70%乙醇洗脱液。

上述的霞草提取物的制备方法，所述步骤（b）中氢氧化钾或氢氧化钠水溶液浓度为5%（5%为质量百分比浓度），氢氧化钾或氢氧化钠的用量为10ml/g霞草总皂苷，水浴温度为60℃，回流进行反应时间为10小时。

上述的霞草提取物的制备方法中，所述步骤（b）中大孔树脂柱为D101、D1、HPD100、HPD300或AB-8大孔树脂柱中的一种。

上述的霞草提取物的制备方法中，所述步骤（b）中乙醇-水***梯度洗脱为，先用20%以下的乙醇洗脱去除杂质，再用30%以上的高浓度乙醇洗脱，收集40-70%乙醇洗脱液。

以上所述的霞草提取物的制备方法，详细步骤为：

（a）取霞草干燥根为原料，以6-8倍量的40-60%乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，过滤或高速离心，滤液或离心上清液上D101型大孔树脂充分吸收后，依次用水、20%乙醇、50%乙醇液洗脱至洗脱液无色，收集50%乙醇洗脱液，减压蒸干，得到霞草总皂苷；

（b）步骤（a）中所得的霞草总皂苷加入5%氢氧化钾或氢氧化钠水溶液，氢氧化钾或氢氧化钠水溶液的用量为10ml/1g霞草总皂苷，于60℃水浴中温热或回流进行反应10小时，至反应液中的霞草总皂苷提取物主斑点消失；反应液放冷后加浓盐酸调pH值至5-6，然后上D101大孔树脂柱，充分吸收后，依次用水、20%乙醇、50%乙醇液洗脱至洗脱液无色，收集50%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至相对密度1.12-1.18的稠膏，冷冻干燥，即得霞草总次级皂苷提取物，该提取物中总皂苷含量≥70%。

本发明的霞草提取物可以和药学上可接受的载体混合制备成各种药物制剂，如片剂、颗粒剂、胶囊、缓释剂、微丸、注射剂等剂型。所述的药学上可接受的载体可以是：崩解剂、稀释剂、粘合剂、缓释材料等药学上常用的材料。

上述的霞草提取物在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用，所述癌细胞为肝癌细胞Bel-7402、胃癌细胞BGC-823、乳腺癌细胞MCF-7、结肠癌细胞HCT-8、卵巢癌细胞A2780、口腔上皮癌细胞KB，***细胞Hela，***癌细胞PC-3M，肺腺癌细胞A549中的一种或几种。

本发明的有益效果在于，通过碱水解将大量存在于霞草根中没有抗肿瘤活性的，或活性较弱的总皂苷转变成具有强抗肿瘤活性的提取物，称为霞草总次级皂苷。发明人在研究中发现，当将霞草总皂苷进行碱水解后，仅水解其皂苷中糖酯键而不破坏糖链，克服了酸水解目的性差、产物复杂、分离纯化困难的缺点，制备工艺简便易行，产物得率高，纯度好，活性强。本发明制备的抗肿瘤活性提取物，具有来源充足、成本低、适合工业化生产的优点，拥有广阔的市场前景和开发价值。

经药理实验证明，本发明的制备方法制备的霞草提取物具有优异的抗肿瘤活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。

实施例1

霞草药材（干燥根）100g粉碎后，分别用8倍量60%、50%和40%乙醇各回流提取一次，每次1小时，合并三次提取液，减压浓缩至无醇；高速离心，离心上清液上D101型大孔树脂充分吸附后，依次用水、20%乙醇、50%乙醇液洗脱至洗脱液近无色，收集50%乙醇液洗脱液，减压浓缩至无醇，减压蒸干，即得浅黄色霞草总皂苷提取物约20g。

取上述方法制备的霞草总皂苷提取物8g，加入5%NaOH溶液80mL，于60℃水浴回流反应10h，至反应液中的霞草总皂苷提取物主斑点消失。放冷后加入浓盐酸调节PH值至5~6，然后上大孔树脂柱充分吸收后，依次用水、20%乙醇、50%乙醇液洗脱至洗脱液近无色，收集50%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至稠膏，冷冻干燥，即得白色霞草总次级皂苷提取物约4g。

实施例2

霞草药材（干燥根）100g粉碎后，分别用10倍量80%、70%和60%乙醇各回流提取一次，每次1.5小时，合并三次提取液，减压浓缩至无醇；过滤，滤液上HPD100型大孔树脂充分吸附后，依次用水、20%乙醇、70%乙醇液洗脱至洗脱液近无色，收集70%乙醇液洗脱液，减压浓缩至无醇，减压蒸干，即得浅黄色霞草总皂苷提取物约15g。

取上述方法制备的霞草总皂苷提取物8g，加入20%NaOH溶液40mL，于100℃沸水浴回流反应1h，至反应液中的霞草总皂苷提取物主斑点消失。放冷，加入浓HCL调节值至5~6。然后上大孔树脂柱充分吸收后，依次用水、20%乙醇、70%乙醇液洗脱至洗脱液近无色，收集70%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至稠膏，冷冻干燥，即得类白色霞草总次级皂苷提取物约3.2g。

实施例3

霞草药材（干燥根）100g粉碎后，分别用10倍量30%、20%和10%乙醇各回流提取一次，每次0.5小时，合并三次提取液，减压浓缩至无醇；高速离心，离心上清液上AB-8型大孔树脂充分吸附后，依次用水、20%乙醇、40%乙醇液洗脱至洗脱液近无色，收集40%乙醇液洗脱液，减压浓缩至无醇，减压蒸干，即得浅黄色霞草总皂苷提取物约17g。

取上述方法制备的霞草总皂苷提取物8g，加入1%NaOH溶液240mL，于80℃水浴回流反应1.5h，至反应液中的霞草总皂苷提取物主斑点消失。放冷，加入浓HCL调节值至5~6。然后上大孔树脂柱充分吸收后，依次用水、20%乙醇、40%乙醇液洗脱至洗脱液近无色，收集40%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至稠膏，冷冻干燥，即得类白色霞草总次级皂苷提取物约3.4g。

对比例1

霞草药材（干燥根）100g粉碎后，分别用8倍量60%、50%和40%乙醇各回流提取一次，每次1小时，合并三次提取液，减压浓缩至无醇；高速离心，离心上清液上D101型大孔树脂充分吸附后，依次用水、20%乙醇、50%乙醇液洗脱至洗脱液近无色，收集50%乙醇液洗脱液，减压浓缩至无醇，减压蒸干，即得得浅黄色霞草总皂苷提取物约20g。

对实施例1和对比例1制备的霞草提取物进行了体外对肿瘤细胞的抑制作用试验，详情如下:

一、本发明霞草总皂苷及其总次级皂苷体外对肿瘤细胞的抑制作用：

1）细胞系与试剂：Bel-7402(肝癌)，BGC-823(胃癌)，MCF-7(乳腺癌)，HCT-8(结肠癌)，A2780(卵巢癌)，KB(口腔上皮癌)，Hela(***)，PC-3M(***癌转移株)，A549(肺腺癌)。DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司。小牛血清、非必需氨基酸购自Hyclone公司。胰蛋白酶、MTT试剂购自Sigma公司。

2）受试药物：本发明的实施例1制得的霞草提取物；对比例制备的霞草提取物。阳性对照药物为阿霉素（Doxorubicin）.

3）细胞培养：9种肿瘤细胞均用含10%小牛血清培养液于37℃，5%CO2及饱和湿度条件下培养。取对数生长期状态良好的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞后计数，调整细胞数约为1×10^5个/mL，接种于96孔板内，100μL/孔，至于CO2孵箱内培养24小时；将霞草总次级皂苷和霞草总皂苷用质量分数为0.9%的氯化钠注射液溶解，过滤除菌，制成不同质量浓度药液，药物终浓度为12.5、25、50、100、200、400、800μg/ml，共6个剂量组，每个剂量组设5个复孔，同时以含0.02%二甲亚砜的培养液为阴性对照组，以阿霉素为阳性对照组。置于CO2孵箱内37℃培养48小时后，终止培养。每孔加MTT溶液（5㎎/ml）10μL，置于CO2孵箱内4小时后取出，倾去孔内液体，每孔加200μL二甲基亚砜，充分振荡使其充分溶解，置酶标仪于560nm波长处记录吸光度(OD) 值，取各剂量组中受试药物的 3个复孔OD值平均数，计算细胞的抑制率及IC50。

按下式计算细胞抑制率：

细胞抑制率（%）=（阴性对照组OD值－受试物组OD值）/阴性对照组OD值×100%。

以药物的不同浓度及对细胞的抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出药物的半数抑制浓度(IC₅₀)，结果见表1。

Claims

1.霞草提取物在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述癌细胞为肝癌细胞Bel-7402、胃癌细胞BGC-823、乳腺癌细胞MCF-7、结肠癌细胞HCT-8中的一种或几种，上述霞草提取物的制备方法，包括下述的步骤：

（a）霞草干燥根为原料，以4-10倍量的10-80%乙醇回流提取2-3次，每次0.5-1.5小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，过滤或高速离心，滤液或离心上清液上大孔树脂柱，以乙醇-水***梯度洗脱，合并40-70%乙醇洗脱液，减压蒸干，得到霞草总皂苷；

2.根据权利要求1所述的霞草提取物在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述步骤（a）中大孔树脂柱为D101、D1、HPD100、HPD300或AB-8大孔树脂柱中的一种。

3.根据权利要求2所述的霞草提取物在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述步骤（a）中大孔树脂柱为D101大孔树脂柱。

4.根据权利要求1所述的霞草提取物在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述步骤（a）中乙醇-水***梯度洗脱为，先用20%以下的乙醇洗脱去除杂质，再用30%以上浓度乙醇洗脱，收集40-70%乙醇洗脱液。

5.根据权利要求1所述的霞草提取物在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述步骤（b）中氢氧化钾或氢氧化钠水溶液浓度为5%，氢氧化钾或氢氧化钠的用量为10ml/g霞草总皂苷，水浴温度为60℃，回流进行反应时间为10小时。

6.根据权利要求1所述的霞草提取物在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述步骤（b）中大孔树脂柱为D101、D1、HPD100、HPD300或AB-8大孔树脂柱中的一种。

7.根据权利要求1所述的霞草提取物在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述步骤（b）中乙醇-水***梯度洗脱为，先用20%以下的乙醇洗脱去除杂质，再用30%以上浓度乙醇洗脱，收集40-70%乙醇洗脱液。

8.根据权利要求1所述的霞草提取物在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述的霞草提取物的制备方法详细步骤为：

（b）步骤（a）中所得的霞草总皂苷加入5%氢氧化钾或氢氧化钠水溶液，氢氧化钾或氢氧化钠水溶液的用量为10ml/1g霞草总皂苷，于60℃水浴中温热或回流进行反应10小时，至反应液中的霞草总皂苷提取物主斑点消失；反应液放冷后加浓盐酸调pH值至5-6，然后上D101大孔树脂柱，充分吸收后，依次用水、20%乙醇、50%乙醇液洗脱至洗脱液无色，收集50%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至相对密度1.12-1.18的稠膏，冷冻干燥，即得。