CN102459312B

CN102459312B - 黑皮质素受体特异性肽

Info

Publication number: CN102459312B
Application number: CN201080030181.2A
Authority: CN
Inventors: J·H·多德; Y-Q·石; W·杨
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2009-06-08
Filing date: 2010-06-07
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2030-06-07
Also published as: US20130237473A1; US8455617B2; ZA201200128B; CO6480936A2; NI201100213A; UY32690A; CU20110227A7; CL2011003095A1; US20100311648A1; US8455618B2; WO2010144038A1; EP2440569A4; PE20150878A1; EP2440569B8; JP2012529505A; NZ596556A; AR077011A1; MX2011013173A; DOP2011000380A; EP2440569B1

Abstract

本发明涉及式(I)的黑皮质素受体特异性环肽或其药学上可接受的盐，其中R₁、R₂、R₃、R_4a、R_4b、R_4c、R₅、x和y如说明书中所定义。这些化合物尤其可用于治疗与能量稳态和代谢相关(例如糖尿病)、与食物摄取相关和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症，包括肥胖症、过重和与肥胖症和/或过重有关的疾病、障碍和/或病症，例如II型糖尿病和代谢综合症。

Description

黑皮质素受体特异性肽

技术领域

本发明涉及黑皮质素受体特异性环肽，其可以用于治疗黑皮质素受体介导的疾病、适应症、病症和综合症，尤其与能量稳态和代谢相关(例如糖尿病)、与食物摄取相关和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症，包括肥胖症、过重和与肥胖症和/或过重有关的疾病、障碍和/或病症，例如II型糖尿病和代谢综合症。

背景

以下论述用作者和出版年份提及了大量出版物，由于最近的出版日期，某些出版物不被认为是关于本发明的现有技术。本文中这种出版物的论述是为得到更全面的背景知识而给出的，不应解释为认可这种出版物对于能取得专利的决定来说是现有技术。

已识别了黑皮质素受体类型和亚型的家族，包括：黑皮质素-1受体(MC1-R)，其在正常人类黑素细胞和黑素瘤细胞上表达；ACTH(促皮质素)的黑皮质素-2受体(MC2-R)，其在肾上腺的细胞中表达；黑皮质素-3和黑皮质素-4受体(MC3-R和MC4-R)，其主要在丘脑下部、中脑和脑干的细胞中表达；以及黑皮质素-5受体(MC5-R)，其在广泛分布的外周组织中表达。MC1-R已表明与头发和皮肤色素沉着以及炎症有关，认为MC2-R介导甾体生成，MC3-R已表明与能量稳态、食物摄取和炎症有关，认为MC4-R控制摄食行为、能量稳态和性功能(例如***功能)，并且MC5-R已表明涉及外分泌腺***。

已在黑皮质素受体的结构的测定方面进行了大量工作，包括测定编码受体的核苷酸序列和组成受体的氨基酸序列。MC4-R是G蛋白偶联的7-跨膜受体，认为其主要表达在脑中。

MC4-R钝化已表明导致肥胖症(Hadley，1999，Ann N Y Acad Sci.，885：1-21)。刺鼠相关蛋白(AgRP)是内源性化合物，其已表明为MC4-R上的MC对抗剂或反激动剂。认为α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)是主要内源性MC4-R激动剂。

位于周围的MC4-R受体也已表明涉及能量稳态的控制，并且MC4-R信号在迷走神经中的作用和其对于治疗肥胖症和糖尿病的相关性由Gautron等人在The Journal of Comparative Neurology，518：6-24(2010)中论述。

认为MC4-R特异性肽和MC3-R特异性二级肽可用于调节哺乳动物能量稳态，包括用作减少食物摄取和体重增加的制剂。认为MC4-R激动剂肽可用于治疗性机能障碍，包括雄性***机能障碍，以及用于降低食物摄取和体重增加，例如用于治疗肥胖症。这种肽还可用于降低自主性乙醇消耗、治疗药物成瘾等等。MC4-R激动剂肽和MC3-R激动剂肽还可以用于治疗循环性休克、缺血、失血性休克、炎性疾病以及相关的疾病、适应症、病症和综合症。相反，认为MC4-R对抗剂肽可用于体重增加助剂，例如用于治疗恶病质、老年性肌肉萎缩、消瘦综合症或疾病以及厌食症。这种肽还可用于治疗抑郁症和相关病症。(Wikberg等人，NatureReviews，Drug Discovery，7，307，(2008)；Adan等人，British J.Pharm.，149，815-827(2006)；Nogueiras等人，J.Clin.，Invest.，117(11)：3475-3488(2007)；Maaser等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1072，123-134(2006)；Giuliani等人，British J.Pharm.，150，595-603(2007)；Balbani，Expert Opin.Ther.Patents，17(3)，287-297(2007)；和Navarro等人，Alcohol.Clin.Exp.Res.，29(6)，949-957(2005))。黑皮质素受体特异性肽包括环状α-MSH类似肽，例如Ac-Nle-环(-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH₂(SEQ ID NO：1)(参见美国专利号5,674,839和5,576,290)和Ac-Nle-环(-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH(SEQ ID NO：2)(参见美国专利号6,579,968和6,794,489)。这些和其它黑皮质素受体特异性肽一般含有天然α-MSH的中心四肽序列His⁶-Phe⁷-Arg⁸-Trp⁹(SEQ ID NO：3)或其模拟物或变体，包括用D-Phe替换Phe⁷。被认为对于一种或多种黑皮质素受体呈特异性的其它肽或肽样化合物公开在美国专利号5,731,408、6,054,556、6,350,430、6,476,187、6,600,015、6,613,874、6,693,165、6,699,873、6,887,846、6,951,916、7,008,925和7,176,279；美国公开专利申请公布号2001/0056179、2002/0143141、2003/0064921、2003/0105024、2003/0212002、2004/0023859、2005/0130901、2005/0187164、2005/0239711、2006/0105951、2006/0111281、2006/0293223、2007/0027091、2007/0105759、2007/0123453、2007/0244054和2008/0039387；和国际专利申请号WO 98/27113、WO 99/21571、WO00/05263、WO 99/54358、WO 00/35952、WO 00/58361、WO 01/30808、WO 01/52880、WO 01/74844、WO 01/85930、WO 01/90140、WO 02/18437、WO 02/26774、WO 03/006604、WO 2004/099246、WO 2004/046166、WO2005/000338、WO 2005/000339、WO 2005/000877、WO 2005/030797、WO 2005/060985、WO2006/048449、WO 2006/048450、WO 2006/048451、WO 2006/048452、WO 2006/097526、WO 2007/008684、WO 2007/008704和WO 2007/009894。尽管科学文献中的许多文章和许多专利申请和已颁发专利((Nozawa等人，Expert Opin.Ther.Patents 18(4)：403-427(2008)；Bednarek等人，Expert Opin.Ther.Patents 14(3)：327-336(2004)；Todorovic等人，Peptides，26，2026-2036(2005)；和Ujjainwalla等人，Current Topicsin Med.Chem.，7，1068-1084(2007))证明了对黑皮质素受体特异性肽的强烈的科学关注和药学关注，但尚未将黑皮质素受体特异性肽批准为用于任何治疗适应症的药物。事实上，还没有任何治疗适应症的任何黑皮质素受体特异性肽已发展通过II期临床试验的报道。仍存在对用于药学应用的黑皮质素受体特异性肽的显著和大量的需要。本发明是在这种背景下进行的。

发明内容

因此，本发明的目的是提供可用于治疗响应MC4-R和/或MC3-R的调节(包括激活)的疾病、障碍和/或病症，尤其治疗与能量稳态和代谢相关(例如糖尿病)、与食物摄取相关和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症，包括肥胖症、过重和与肥胖症和/或过重有关的疾病、障碍和/或病症，例如II型糖尿病和代谢综合症。

在一个方面，本发明涉及结构式(I)的环肽：

包括其所有对映异构物、立体异构体或非对映异构体，或上述任何一种的药学上可接受的盐，

其中：

R₁为-NH-C(＝O)-或-C(＝O)-NH-；

R₂为-H或-CH₂-，并且如果R₂为-CH₂-，则其与R₃形成吡咯烷环，吡咯烷环任选由-OH取代；

如果R₂为-CH₂-，则R₃为-(CH₂)₂-，且在其它情况下R₃选自：

R_4a、R_4b和R_4c各自独立选自氢、卤素、卤代(C₁-C₁₀)烷基、二卤代(C₁-C₁₀)烷基、三卤代(C₁-C₁₀)烷基、(C₁-C₁₀)烷基、(C₁-C₁₀)烷氧基、(C₁-C₁₀)烷硫基、芳基、芳氧基、硝基、腈基、氨磺酰基、氨基、单取代氨基、二取代氨基、羟基、羧基、或烷氧基羰基，前提条件是R_4a、R_4b和R_4c中至少一个不是氢；

R₅为-OH或-N(R_6a)(R_6b)；

R_6a和R_6b各自独立为H或C₁-C₄直链、支链或环状烷基链；

R₇为-H或-C(＝O)-NH₂；

w在各情况下独立为0到5；

x为1到5；

y为1到5；并且

z在各情况下独立为1到5。

在另一方面，本发明涉及式(I)的环肽或其药学上可接受的盐，所述式(I)环肽为式(II)的环肽：

在另一方面，本发明涉及式I、尤其是式(II)的环肽，其中R₁为-C(＝O)-NH-，x为2且y为3。

在另一方面，本发明涉及式(I)、尤其是式(II)的环肽，其中R₁为-NH-C(＝O)-，x为3且y为2。

在另一方面，本发明涉及式(I)、尤其是式(II)的环肽，其中R₂为-H或-CH₂-，并且如果R₂为-CH₂-，则其与R₃形成吡咯烷环，吡咯烷环任选由-OH取代；并且

如果R₂为-CH₂-，则R₃为-(CH₂)₂-，且在其它情况下R₃为

其中w在各情况下独立选自0到5，并且z在各情况下独立选自1到5。

在另一方面，本发明涉及式I、尤其是式(II)或(III)的环肽，其中R₂为H，R₃选自

在另一方面，本发明涉及式I、尤其是式(II)的环肽，其中R₂为-CH₂-且R₃为-(CH₂)₂-，R₂和R₃一起形成未取代的吡咯烷环。

在另一方面，本发明涉及式I、尤其是式(II)的环肽，其中R_4a、R_4b和R_4c中至少一个选自

在另一方面，本发明涉及式I、尤其是式(II)或(III)的环肽，其中R_4a位于4位且为-C≡N，并且R_4b和R_4c各自为H。

在另一方面，本发明涉及式(I)、尤其是式(II)或(III)的环肽，其中R_4a位于4位且为-F，并且R_4b和R_4c各自为H。

本发明的肽是一种或多种黑皮质素受体的配体，尤其是MC4-R的配体，更具体来说是MC4-R的激动剂(包括全激动剂和部分激动剂)。如本文所用的术语“配体”包括结合到活性部位的肽以及结合到所述受体中任何一个的一个或多个别构部位的肽。

因此，本发明的肽可以用作药物，尤其是用于治疗响应MC3-R和/或MC4-R的调节的障碍、疾病或病症，并且尤其是用于治疗响应MC4-R激活的障碍、疾病或病症。尤其，认为本发明的肽能减少食物摄取、体重和/或体重增加，并因此认为可用于在需要其的患者中治疗与能量稳态和代谢相关(例如糖尿病)、与食物摄取相关和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症，包括肥胖症和过重，和与肥胖症和/或过重有关的疾病、障碍和/或病症，例如II型糖尿病和代谢综合症。患者可以是人或非人的动物，且尤其是人。

本发明的肽可以具有与现有技术的肽相比有利的性能，尤其是增强的效能和/或增强的选择性。这些优点可以在实践中提供响应的有用性能。例如，当用作药物制剂时，本发明的肽可以以较低日临床剂量使用，可以具有较长作用持续时间，和/或改善的副作用特征。

在本发明的另一方面，提供一种治疗方法，其通过将治疗有效量的本发明的肽给予需要其的患者，治疗响应MC4-R和/或MC3-R的调节的障碍、疾病或病症，例如响应MC4-R的激活的障碍、疾病或病症，尤其是与能量稳态和代谢相关(例如糖尿病)、与食物摄取相关和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症，包括肥胖症和过重，和与肥胖症和/或过重有关的疾病、障碍和/或病症，例如II型糖尿病和代谢综合症。

根据本发明的另一方面，提供一种方法，其通过将药理学有效量的本发明的肽给予需要其的个体(例如人)，减少食物摄取、体重和/或体重增加。

根据本发明的另一方面，提供一种方法，其通过将药理学有效量的本发明的肽给予需要其的个体(例如人)，防止在体重减轻之后体重再增加。

在本发明的另一方面，本发明提供式I的肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗响应MC4-R的激活的疾病、障碍和/或病症，尤其是与能量稳态和代谢相关(例如糖尿病)、与食物摄取相关和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症，包括肥胖症和过重，和与肥胖症和/或过重有关的疾病、障碍和/或病症，例如II型糖尿病和代谢综合症。

在另一方面，本发明提供一种用于治疗黑皮质素受体介导的疾病、适应症、病症和综合症，尤其是响应MC4-R的调节(例如MC4-R的激活)的疾病、障碍、病症和/或综合症的基于黑皮质素受体特异性肽的药物组合物，其包含式I的肽和药学上可接受的载体。

在另一方面，本发明提供基于肽的黑皮质素受体特异性的药物组合物，其包含式I的肽和药学上可接受的载体，其中该肽是选择性的MC4-R配体，所述基于肽的黑皮质素受体特异性药物组合物用于治疗与能量稳态和代谢相关(例如糖尿病)、与食物摄取相关和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症，包括肥胖症和过重，和与肥胖症和/或过重有关的疾病、障碍和/或病症，例如II型糖尿病和代谢综合症。

在另一方面，本发明提供对于MC4-R呈特异性的并且对MC4-R是部分激动剂或全激动剂的肽。具体地讲，本发明提供对于MC4-R呈特异性的并且对MC4-R是部分激动剂或全激动剂的肽。

在另一方面，本发明提供在大的剂量范围内有效的特异性MC4-R环肽。

本发明的其它方面和新颖特征以及其它适用性范围将部分在下面的详细说明中阐述，并且部分地在本领域技术人员阅读下文之后变得明显，或者可以由本发明的实施教导。本发明的各方面可以借助于具体由所附权利要求书提出的手段和组合来实现和获得。

发明详述

1.0定义

在进行本发明的说明之前，将某些术语的定义阐述于此。

在针对本发明的肽给出的序列中，氨基酸残基具有其常规的含义，如在Manual of Patent Examining Procedure第8版第2400章所给定。因此，“Ala””为丙氨酸，“Asn”为天冬酰胺，“Asp”为天冬氨酸，″Arg″为精氨酸，“Cys”为半胱氨酸，“Gly”为甘氨酸，“Gln”为谷氨酰胺，“Glu”为谷氨酸，″His″为组氨酸，“Ile”为异亮氨酸，“Leu”为亮氨酸，″Lys″为赖氨酸，“Met”为蛋氨酸，″Phe″为苯丙氨酸，“Pro”为脯氨酸，“Ser”为丝氨酸，“Thr”为苏氨酸，″Trp″为色氨酸，“Tyr”为酪氨酸，并且“Val”为缬氨酸等等。应理解，“D”异构体的命名是在三字母编码或氨基酸名称之前加上“D-”，例如D-Phe为D-苯丙氨酸。上述未涵盖的氨基酸残基具有以下定义：

术语“酰基”包括R(C＝O)-基团，其中R为有机基团，例如烷基、芳基、杂芳基、碳环基或杂环基。因此，在本文中提及被取代的酰基时，其意思指所述有机基团(R)被取代。实例为乙酰基CH₃-C(＝O)-，在本文中成为“Ac”。在上文所定义的烷基或被取代的烷基通过一个或多个羰基{-(C＝O)-}结合时，肽或脂族部分被“酰基化”。肽最常在N-末端被酰基化。

术语“链烷”包括直链或支链饱和烃。直链烷的实例包括甲烷、乙烷、丙烷等等。支链或被取代的链烷的实例包括甲基丁烷或二甲基丁烷、甲基戊烷、二甲基戊烷或三甲基戊烷等等。一般说来，任何烷基都可以是链烷的取代基。

术语“烯烃”包括含有一个或多个碳碳双键的不饱和烃。这种烯烃的实例包括乙烯、丙烯等等。

术语“烯基”包括含有至少一个双键的具有2-6个碳原子的直链单价烃基或3-6个碳原子的支链单价烃基；其实例包括乙烯基、2-丙烯基等等。

术语“烷基”包括直链或支链的饱和脂族烃基。C_1-10烷基意思指具有1-10个碳原子的烷基。这种烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、异戊基、已基、异己基等等。

术语“炔烃”包括含有至少一个三键的2-6个碳原子的直链单价烃基或3-6个碳原子的支链单价烃基；其实例包括乙炔、丙炔、丁炔等等。术语“芳基”包括6-12个环原子的单环或双环芳族烃基，并且其任选独立地由一个或多个选自以下的取代基取代：烷基、卤代烷基、环烷基、烷氧基、烷硫基、卤素、硝基、酰基、氰基、氨基、单取代氨基、二取代氨基、羟基、羧基或烷氧基-羰基。术语“芳基”还包括双环芳族环体系，其中一个环为芳族环并且一个环为非芳族环(包括饱和或部分饱和的环)。在双环芳族环体系中，两个邻接环共用两个或多个环碳(所述环为″稠环″)。芳基的实例包括苯基、联苯基、茚满基、萘基、1-萘基和2-萘基、其衍生物等等。

术语“芳烷基”包括-R^aR^b基，其中R^a为亚烷基(二价烷基)并且R^b为如上文所定义的芳基。芳烷基的实例包括苄基、苯乙基、3-(3-氯苯基)-2-甲基戊基等等。

术语“脂族”包括具有烃链的化合物，例如链烷、烯烃、炔烃和其衍生物。

如本文所用，术语“酰胺”包括具有连接到羰基的三价氮即-C(＝O)-NH₂(即伯酰胺)、-C(＝O)-NHR_c和-C(＝O)-NR_cR_d的化合物，其中R_c和R_d各自独立代表有机基团。在本文中提及被取代的酰胺基时，其意指所述有机基团(R_c和R_d)中的至少一个被取代。酰胺的实例包括甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺等等。

术语“胺基”包括-NH₂、-NHR_a和-NR_aR_b，其中R_a和R_b各自独立代表有机基团。在本文中提及被取代的胺基时，其意指所述有机基团(R_a和R_b)中的至少一个被取代。

术语“腈基”包括官能团-C≡N。

术语“卤素”(或“卤代”)旨在包括卤素原子氟、氯、溴和碘。

术语“卤代烷基”包括由一个卤素原子取代的烷基，例如-CH₂F。术语“二卤代烷基”包括由两个卤素原子取代的烷基，例如-CHF₂。术语“三卤代烷基”包括由三个卤素原子取代的烷基，例如-CF₃。

术语“烷硫基”包括-S-烷基，其中烷基如上文所定义。C₁-C₁₀烷硫基的非限制性实例包括甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基和正丁硫基。

术语“硝基”旨在包括-NO₂。

术语“羟基”旨在包括-OH。

术语“烷氧基”包括-O-烷基，其中烷基如上文所定义。C₁-C₁₀烷氧基包括具有1-10个碳原子的烷基。C₁-C₁₀烷氧基的非限制性实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和2-甲基-1-丙氧基。

术语“芳氧基”包括-O-芳基，其中芳基如上文所定义。

术语“烷氧羰基”包括-C(＝O)-O-R，其中R为如上文所定义的烷基。C₁-C₁₀烷氧羰基的非限制性实例包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、异丙氧基羰基和异戊氧基羰基。

术语“羧基”包括-C(＝O)OH。

术语“氧代”包括＝O。

术语“氨磺酰基”包括连接到胺基的磺酰基，即-S(＝O)₂NH₂、-S(＝O)₂NHR_a和-S(＝O)₂NR_aR_b，其中R_a和R_b各自独立代表有机基团。在本文中提及被取代的氨磺酰基时，其意指所述有机基团(R_a和R_b)中的至少一个被取代。

术语“组合物”(如药物组合物中)旨在涵盖包含活性成分和组成载体的惰性成分的产物，以及直接或间接得自以下之任一产物：任何两种或多种成分的组合、络合或凝聚、或一种或多种成分的解离、或一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用。因此，用于本发明中的药物组合物涵盖由混合活性成分与一种或多种药学上可接受的载体来制备的任何组合物。

所谓黑皮质素受体“激动剂”意思指内源性物质、药物物质或化合物，包括诸如本发明的肽的化合物，其可以与黑皮质素受体相互作用并引发药理响应，包括但不限于腺苷酸环化酶激活，其具有黑皮质素受体的特征。

所谓“α-MSH”意思指肽Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂(SEQ ID NO：4)和其类似物及同源体，包括但不限于NDP-α-MSH。

所谓“NDP-α-MSH”意思指肽Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂(SEQ ID NO：5)和其类似物及同源体。

所谓“EC₅₀”意思指激动剂(包括部分激动剂)的产生50％的针对该激动剂的最大可能响应的摩尔浓度。举例而言，如果在MC4-R细胞表达***中，根据cAMP分析所测定，浓度为72nM的测试化合物产生50％的针对该化合物的最大可能响应，则其EC₅₀为72nM。除非另作说明，否则与EC₅₀测定有关的摩尔浓度是以纳摩尔/升(nM)来表示。

所谓“Ki(nM)”意思指平衡抑制剂解离常数，其代表在不存在放射性配体或其它竞争者的情况下，竞争性化合物在平衡状态下结合受体中一半结合位点时的摩尔浓度。一般说来，Ki的数值与该化合物对受体的亲和性呈反相关，从而如果Ki较低，则亲和性较高。Ki可使用Cheng和Prusoff的方程来确定(Cheng Y.，Prusoff W.H.，Biochem.Pharmacol.22：3099-3108，1973)：

Ki可以特定受体(例如MC1-R、MC3-R、MC4-R或MC5-R)及特定配体(例如α-MSH或NDP-α-MSH)表示。

所谓“抑制率”意思指在竞争性抑制分析中，受体结合性比已知标准物降低或减弱的百分比。因此，“在1μM下的抑制率(NDP-α-MSH)”意思指在(例如)下文所述分析条件下通过添加确定量的待测试化合物(如1μM测试化合物)以致NDP-α-MSH结合性降低的百分比。举例而言，不抑制NDP-α-MSH结合的测试化合物的抑制率为0％，完全抑制NDP-α-MSH结合的测试化合物的抑制率为100％。通常，如下文所述，使用放射性测定来进行竞争性抑制测试，例如使用I¹²⁵-标记的NDP-α-MSH来测试；或使用镧系元素螯合物荧光分析，例如使用Eu-NDP-α-MSH来测试。然而，本领域已知其它测试竞争性抑制的方法，包括使用除放射性同位素以外的标记或标签***，并且一般来说在本发明中可采用本领域已知的任何用于测试竞争性抑制的方法。因此可以了解，“抑制率”是确定测试化合物是否降低α-MSH与黑皮质素受体结合的一个量度。

所谓“结合亲和性”意思指化合物或药物与其生物靶结合的能力，在本文中以Ki(nM)表示。

所谓“固有活性”意思指化合物在指定的表达黑皮质素受体的细胞***中可实现的最大刺激(功能性活性)，如：对腺苷酸环化酶的最大刺激。将α-MSH或NDP-α-MSH实现的最大刺激指定为固有活性为1.0(或100％)，且将能刺激α-MSH或NDP-α-MSH达最大活性的一半值的化合物指定为固有活性为0.5(或50％)。将在本文所述分析条件下固有活性为0.7(70％)或更高的本发明的化合物归类为激动剂，将固有活性介于0.1(10％)与0.7(70％)之间的化合物归类为部分激动剂，且将固有活性低于0.1(10％)的化合物归类为非活性或不具有固有活性。在一方面，本发明的环肽的一般特征在于其相对于α-MSH或NDP-α-MSH是MC4-R的部分激动剂。

一般来说，“功能性活性”是在受到化合物激活后的受体(例如黑皮质素受体、且尤其MC4-R或hMC4-R)信号传导的量度，或受体相关信号传导变化的量度。黑皮质素受体通过激活杂三聚G蛋白来引发信号传导。在一方面，黑皮质素受体经由Gα_S传导信号，其通过腺苷酸环化酶催化cAMP的产生。因此，对腺苷酸环化酶的刺激的测定、例如对腺苷酸环化酶的最大刺激的测定是一种功能性活性的量度，且是本文所例示的主要量度。然而，应理解，在实施本发明时可采用功能性活性的替代性量度，且所述替代性量度明确地涵盖且包括于本发明的范围内。因此，在一个实施例中，可如以下文献中所报导且使用其中所公开的方法来测量细胞内的游离钙：Mountjoy K.G.等人，Melanocortin receptor-medicatedmobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells.Physiol Genomics5：11-19，2001或Kassack M.U.等人，Functional screening of Gprotein-coupled receptors by measuring intracellular calcium with afluorescence microplate reader.Biomol Screening 7：233-246，2002。也可通过使用(例如)放射性分析测量从磷脂酰肌醇4，5-二磷酸酯产生的三磷酸肌醇酯或甘油二酯来测量激活。功能性活性的另一个量度是因调节性途径激活所致的受体内化，例如使用以下文献中所公开方法：Nickolls S.A.等人，Functional selectivity of melanocortin 4 receptor peptide and nonpeptideagonists：evidence for ligand specific conformational states.J Pharm ExperTherapeutics 313：1281-1288，2005。功能性活性的另一个量度是与G蛋白受体激活相关的核苷酸的替换和替换速率，例如在G蛋白α亚单元上用GDP(鸟苷二磷酸)替换GTP(鸟苷三磷酸)，其可通过任一种方式来测量，包括使用鸟苷5′-(γ-[³⁵S]硫代)-三磷酸酯的放射性分析，如以下文献中所公开：Manning D.R，Measures of efficacy using G proteins as endpoints：differential engagement of G proteins through single receptors.MolPharmacol 62：451-452，2002。已建立多种基于基因的分析来测量G-偶联蛋白的激活，例如公开于以下文献中的那些：Chen W.等人，A colorimetricassay from measuring activation of Gs-and Gq-coupled signaling pathways.Anal Biochem 226：349-354，1995；Kent T.C.等人，Development of a genericdual-reporter gene assay for screening G-protein-coupled receptors.Biomol Screening，5：437-446，2005或Kotarsky K.等人，Improved receptorgene assays used to identify ligands acting on orphan seven-transmembranereceptors.Pharmacology & Toxicology 93：249-258，2003。Chen等人的比色分析已被调整用于测量黑皮质素受体激活，如以下文献中所公开：HrubyV.J.等人，Cyclic lactam α-melanocortin analogues of Ac-Nle⁴-cyclo[Asp⁵，D-Phe⁷，Lys¹⁰]α-melanocyte-stimulating hormone-(4-10)-NH₂ with bulkyaromatic amino acids at position 7 shows high antagonist potency andselectivity at specific melanocortin receptors，J Med Chem 38：3454-3461，1995。一般来说，功能性活性可通过任何方法来测量，包括测定G-偶联受体的激活和/或信号传导的方法，且进一步包括可能在今后建立或报导的方法。本文所用术语“治疗”涵盖在患者患有指定疾病、障碍和/或病症时进行且可降低该疾病、障碍和/或病症的严重度的活动。此外，本文所用术语“治疗”旨在包括对指定疾病、障碍和/或病症的治疗性(治疗的)、预防性(预防的)、控制和缓解性治疗。

如本文所用，术语“药理学有效量”(包括“治疗有效量”)意思指根据本发明的肽足以诱导期望治疗性的效果或生物效果的量。

如本文所用，术语“治疗有效量”意思指本发明的肽可在内科医生或其它临床医师正在治疗的哺乳动物中引起生物或医学响应的量。

本文所用术语“预防有效的”或“预防的”意思指本发明的肽可在患者开始罹患指定疾病或障碍之前，在患有内科医生或其它临床医师正试图预防、抑制或减轻的医学病症的哺乳动物中预防或抑制痛苦或减轻痛苦的量。

术语“糖尿病”包括I型糖尿病，其是根据Report of the ExpertCommittee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus(DiabetesCare，第24卷，增刊1，2001年1月)中公开的标准来诊断的胰岛素依赖性糖尿病，其中空腹血糖水平大于或等于126毫克/分升且其主要病因是胰腺β细胞破坏；II型糖尿病，其是根据Report of the Expert Committee onthe Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus中公开的标准诊断的非胰岛素依赖性糖尿病，其中空腹血糖水平大于或等于126毫克/分升；和成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)。

术语“代谢综合症”是指代谢障碍，尤其是葡萄糖和脂质调节障碍，包括胰岛素抗性及胰腺β细胞的胰岛素分泌缺陷；且可进一步包括诸如以下的病症和状态：腹型肥胖、异常脂肪血症、高血压、葡萄糖耐受不良或血栓前状态；且其可进一步导致诸如以下的障碍：高脂血症、肥胖症、糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖症和高血压。

2.0临床适应症和应用

本文所公开的组合物和方法可用于医学应用和畜牧业或兽医学应用。通常，所述方法用于人，但也可用于其它哺乳动物。术语“患者”旨在表示哺乳动物个体，且在整个说明书和权利要求书中如此使用。本发明的主要应用涉及人类患者，但本发明可应用于实验室动物、农场动物、动物园动物、野生动物、宠物、运动用动物或其它动物中。临床适应症和具体应用包括以下：

2.1肥胖症和相关代谢综合症

人们已发现式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽是MC4受体的配体。具体来说，认为式(I)的肽可用于治疗响应MC4-R功能调节、尤其响应MC4-R的激活的疾病、障碍和/或病症，即可受益于在MC4-R上的激动(包括完全或部分激动)的疾病、障碍和/或病症，包括能量稳态和与代谢相关(例如糖尿病，尤其II型糖尿病；异常脂肪血症；脂肪肝；高胆固醇血症；高甘油三酯血症；高尿酸血症；糖耐量减低；空腹血糖异常；胰岛素抗性综合症；和代谢综合症)、与食物摄取相关(例如饮食过度；暴食症；贪食症；和强迫性进食)和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症，更具体来说是这种特征为体重过重和/或食物摄取过量的疾病、障碍及病症。

认为式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽尤其可用于治疗特征为体重过重的与体重相关疾病、障碍和/或病症，包括肥胖症和过重(通过促进体重减轻、维持体重减轻和/或防止体重增加(包括药物诱导的体重增加或戒烟后的体重增加)来治疗)、和与肥胖症和/或过重有关的疾病、障碍和/或病症，例如胰岛素抗性；糖耐量减低；II型糖尿病；代谢综合症；异常脂肪血症(包括高脂血症)；高血压；心脏病(例如冠心病、心肌梗塞)；心血管病；非酒精性脂肪肝病(包括非酒精性脂肪性肝炎)；关节病(包括继发性骨关节炎)；胃食管反流；睡眠呼吸暂停；动脉粥样硬化；中风；大血管和微血管病；脂肪变性(例如在肝中)；胆结石；和胆囊病。

认为式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽尤其可用于治疗肥胖症和II型糖尿病，尤其肥胖症。

应理解，肥胖症和过重具有医学界公认的定义。可通过(例如)测量身体质量指数(BMI)并将结果与定义对比来鉴定患者，该指数是通过将体重(以公斤表示)除以身高(以米表示)的平方来计算。由鉴定、评估和治疗成人过重和肥胖专家组(Expert Panel on the Identification，Evaluation andTreatment of Overweight and Obesity in Adults)所采纳且由保健专家的领导组织所认可的人类BMI推荐分类法如下：体重过轻＜18.5kg/m²，正常体重18.5-24.9kg/m²，过重25-29.9kg/m²，肥胖症(1类)30-34.9kg/m²，肥胖症(2类)35-39.9kg/m²，严重肥胖症(3类)≥40kg/m²(Practical Guide tothe Identification，Evaluation，and Treatment of Overweight and Obesity inAdults、The North American Association for the Study ofObesity(NAASO)and National Heart，Lung and Blood Institute(NHLBI)2000)。此分类法的修改形式可用于特定种族人群和儿童。评价过重和肥胖症的另一个替代性方式是测量腰围。已提出若干种分类法且其截止值根据种族人群不同而存在差异。例如，根据International DiabetesFederation的分类法，腰围在94cm(白色人种的截止值)以上的男性和腰围在80cm(白色人种的截止值)以上的女性因腹部脂肪过多而患糖尿病、异常脂肪血症、高血压及心血管疾病的风险较高。另一种分类法是基于AdultTreatment Panel III的推荐，其中推荐截止值是102cm(男性)及88cm(女性)。然而，式(I)的肽也可用于减少自我诊断的过重和降低因生活方式、遗传因素、遗传和/或其它因素而变胖的风险。

认为式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽在给予包括人在内的动物后可降低该动物的食物摄取、体重和/或体重增加。

不受限于理论，认为式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽可通过调节食欲和/或饱足感、提高代谢速率、降低脂肪和/或碳水化合物的摄取和/或对脂肪和/或碳水化合物的渴望来发挥作用。

不受限于理论，同样认为式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽可通过增强葡萄糖耐受和/或降低胰岛素抗性来发挥作用。因此认为式(I)的肽也可用于在体重过轻和正常体重个体以及过重和肥胖个体中治疗II型糖尿病。

本发明的肽也可用于(i)预防因血管阻塞所致的灌注不足(例如因血栓形成而引发)、出血、创伤、手术、出血性休克、心源性休克、中毒性休克或感染性休克引发的器官或组织损伤，或(iii)治疗雄性或雌性性功能障碍，例如雄性***功能障碍或雌性性唤起功能障碍。

根据本发明的另一个方面，提供如上文所定义的式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽，其可用作药物。

在另一方面，本发明提供式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽的用途，其用于治疗响应MC4-R的调节的疾病、障碍和/或病症，例如响应MC4-R的激活的疾病障碍和/或病症，尤其与能量稳态和代谢相关(例如糖尿病)、与食物摄取相关和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症，包括肥胖症、过重及与肥胖症和/或过重有关的疾病、障碍和/或病症，例如II型糖尿病和代谢综合症。

在另一个方面，本发明提供式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽的用途，其用于制备用于治疗响应MC4-R的调节(例如MC4-R的激活)的疾病、障碍和/或病症的药物，所述疾病、障碍和/或病症尤其与能量稳态和代谢相关(例如糖尿病)、与食物摄取相关和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症，包括肥胖症、过重和与肥胖症和/或过重有关的疾病、障碍和/或病症，例如II型糖尿病和代谢综合症。

本发明的肽对MC4-R和/或MC3-R的选择性有利地高于(即亲和性较高和/或特异性较高)对MC1-R、MC2-R和MC5-R的选择性，尤其高于对MC1-R的选择性。具体来说，本发明的肽对MC4-R的选择性有利地高于对MC3-R和MC1-R中任何一个的选择性。适当地，本发明的肽对MC4-R的选择性比对MC1-R、MC2-R、MC3-R和MC5-R中的任何一个的选择性高至少3倍、尤其10倍、更尤其30倍。本发明的某些肽对MC4-R的选择性比对MC1-R的选择性高甚至超过100倍，例如甚至约150倍，如7.1中所述的受体结合测定中所测定。应注意，选择性特征可影响在给予所述肽后获得的体内安全性和副作用。

在治疗与能量稳态和代谢相关、与食物摄取相关和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症后，期望可减少或消除可因MC4-R激活所致的不期望副作用，例如性副作用(包括******)及血压效果。

认为本发明的肽可用于治疗与能量稳态和代谢相关(例如糖尿病)、与食物摄取相关和/或与能量平衡及体重相关的疾病、障碍和/或病症，包括肥胖症、过重和与肥胖症和/或过重有关的疾病、障碍和/或病症，例如II型糖尿病及代谢综合症，而不会引发显著的不良心血管影响，包括血压显著升高。

认为本发明的肽可用于治疗与能量稳态和代谢相关(例如糖尿病)、与食物摄取相关和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症，包括肥胖症、过重和与肥胖症和/或过重有关的疾病、障碍和/或病症，例如II型糖尿病和代谢综合症，而不会引发由于MC4-R激活所致的显著不期望性效果，例如******。

认为式I的肽、且尤其式(II)或(III)的肽具有良好的药理学特征和有希望的生物药学性质，例如毒理学特征、代谢和药代动力学性质、溶解度和渗透性。应理解，合适的生物药学性质的确定属于本领域技术人员的知识。

3.0某些适应症的组合疗法

本发明的肽、组合物和方法可用于通过与一种或多种其它药学活性化合物组合给药来治疗任何上述疾病、适应症、病症或综合症，或黑皮质素受体介导的任何疾病、适应症、病症或综合症。这种组合给药通过单一剂型来实施，其包括本发明的肽和一或多种其它药学活性化合物，这种单一剂型包括锭剂、胶囊、喷雾剂、吸入用粉剂、注射用液体等等。或者，组合给药可通过给予两种不同剂型来实施，其中一种剂型含有本发明的肽，且另一剂型包括另一种药学活性化合物。在此情况下，这些剂型可相同或不同。下文例示了某些可用组合疗法但并不欲限制于组合疗法。

3.1肥胖症和相关代谢综合症的组合疗法

一种或多种本发明的肽可与一种或多种其它药理学活性剂组合，其它药理学活性剂可用于治疗各种体重和摄食相关障碍，例如肥胖症和/或过重，具体来说其它药理学活性剂是其它抗肥胖症药物，其可影响能量消耗、糖酵解、糖异生、糖原分解、脂解作用、脂肪生成、脂肪吸收、脂肪储存、脂肪***、饥饿和/或饱足感和/或渴望机制、食欲/动机、食物摄取或胃肠活动。可降低能量摄取的药物(部分)包括各种称作食欲减退剂的药理学药剂，其可用作体重减轻方案中行为疗法的佐药。

一般来说，在单一剂量或2-4次分开剂量中，下述肥胖症控制剂或药物在与一种或多种本发明的肽组合使用时的总剂量可在0.1-3,000毫克/天，优选约1-1,000毫克/天且更优选约1-200毫克/天的范围内。然而，确切剂量取决于出诊临床医师且取决于诸如以下因素：所给予的化合物的效能、患者的年龄、体重、健康状况和响应。

一种或多种本发明的肽可与一种或多种可用于治疗糖尿病的其它药理学活性剂(例如其它抗糖尿病药物)组合。

或者或另外，一种或多种本发明的肽可另外与一种或多种可用于治疗与肥胖症和/或过重相关的疾病、障碍和/或病症的其它药理学活性剂组合，这些疾病、障碍和/或病症是例如胰岛素抗性；糖耐量减低；II型糖尿病；代谢综合症；异常脂肪血症(包括高脂血症)；高血压；心脏病(例如冠心病、心肌梗塞)；心血管病；非酒精性脂肪肝疾病(包括非酒精性脂肪性肝炎)；关节病(包括继发性骨关节炎)；胃食管反流；睡眠呼吸暂停；动脉粥样硬化；中风；大血管和微血管疾病；脂肪变性(例如在肝中)；胆结石；和胆囊病症。

根据本发明的另一方面，提供组合治疗，其包含给予需要治疗性治疗的诸如人类的哺乳动物药理学有效量的本发明的肽、或其药学上可接受的盐、以及任选地药学上可接受的稀释剂或载体，且同时、依序或分开给予一种或多种选自以下的药剂：

-胰岛素和胰岛素类似物；

-胰岛素促分泌剂，包括磺脲(例如格列吡嗪(glipizide))和餐时血糖调节剂(有时称作“短效促分泌剂”)，例如氯茴苯酸(meglitinide)(例如瑞格列奈(repaglinide)和那格列奈(nateglinide))；

-改善肠降血糖素作用的药剂，例如二肽基肽酶IV(DPP-4)抑制剂(例如维格列汀(vildagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)和西格列汀(sitagliptin))和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)激动剂(例如艾塞那肽(exenatide))；

-胰岛素敏化剂，包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂，例如噻唑啶二酮(例如吡咯列酮(pioglitazone)和罗格列酮(rosiglitazone))和具有PPARα、γ和δ活性的任何组合的药剂；

-调节肝葡萄糖平衡的药剂，例如双胍(例如二甲双胍(metformin))、果糖1，6-二磷酸酶抑制剂、糖原磷酸化酶抑制剂、糖原合成酶激酶抑制剂和葡萄糖激酶激活剂；

-设计来降低/减慢从肠吸收葡萄糖的药剂，例如α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如米格列醇(miglitol)和阿卡波糖(acarbose))；

-拮抗高血糖素的作用或降低其分泌的药剂，例如淀粉不溶素类似物(例如普兰林肽(pramlintide))；

-预防肾脏重吸收葡萄糖的药剂，例如钠依赖性葡萄糖转运蛋白2(SGLT-2)抑制剂(例如达帕洛珍(dapagliflozin))；

-设计来治疗延长高血糖症的并发症的药剂，例如醛糖还原酶抑制剂(例如依帕司他(epalrestat)和雷尼司他(ranirestat))；和用于治疗与微血管病相关的并发症的药剂；

-抗异常脂肪血症药剂，例如HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类(statin)，例如瑞舒伐他汀(rosuvastatin))和其它降胆固醇药；PPARα激动剂(贝特类(fibrate)，例如吉非贝齐(gemfibrozil)和非诺贝特(fenofibrate))；胆汁酸螯合剂(例如考来烯胺(cholestyramine))；胆固醇吸收抑制剂(例如植物固醇(即植物甾醇)、合成抑制剂)；胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂；回肠胆汁酸转运***抑制剂(IBAT抑制剂)；胆汁酸结合树脂；烟酸(尼克酸(niacin))和其类似物；抗氧化剂，例如普罗布克(probucol)；和ω-3脂肪酸；

-抗高血压药，包括肾上腺素能受体拮抗剂，例如β阻断剂(例如阿替洛尔(atenolol))、α阻断剂(例如多沙唑嗪(doxazosin))和混合α/β阻断剂(例如拉贝洛尔(labetalol))；肾上腺素能受体激动剂，包括α-2激动剂(例如可乐定(clonidine))；血管紧张肽传化酶(ACE)抑制剂(例如赖诺普利(lisinopril))；钙通道阻断剂，例如二氢吡啶(例如硝苯地平(nifedipine))、苯基烷基胺(例如维拉帕米(verapamil))和苯并硫氮杂(例如地尔硫卓(diltiazem))；血管紧张肽II受体拮抗剂(例如坎地沙坦(candesartan))；醛固酮受体拮抗剂(例如依普利酮(eplerenone))；中枢作用肾上腺素能药，例如中枢α激动剂(例如可乐定)；和利尿剂(例如呋塞米(furosemide))；

-瘀血调节剂，包括抗凝剂，例如纤维蛋白溶解激活剂；凝血酶拮抗剂；因子VIIa抑制剂；抗凝血药，例如维生素K拮抗剂(例如华法林(warfarin))、肝素和其低分子量类似物、因子Xa抑制剂和直接凝血酶抑制剂(例如阿加曲班(argatroban))；抗血小板药，例如环加氧酶抑制剂(例如阿司匹林(aspirin))、腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂(例如氯吡格雷(clopidogrel))、磷酸二酯酶抑制剂(例如西洛他唑(cilostazol))、糖蛋白IIB/IIA抑制剂(例如替罗非班(tirofiban))和腺苷再摄取抑制剂(例如双嘧达莫(dipyridamole))；

-抗肥胖症剂，例如食欲抑制剂(例如麻黄素(ephedrine))，包括去甲肾上腺素能药(例如芬特明(phentermine))和血清素作用剂(例如***(sibutramine))、胰脂肪酶抑制剂(例如奥利司他(orlistat))、微粒体转移蛋白(MTP)调节剂、二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)抑制剂和***素(CB1)受体拮抗剂(例如利莫那班(rimonabant))；

-摄食行为改性剂，例如食欲素(orexin)受体调节剂和黑色素聚集激素(MCH)调节剂；

-高血糖素样肽-1(GLP-1)受体调节剂；

-神经肽Y(NPY)/NPY受体调节剂；

-丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)调节剂；

-血清素受体调节剂；

-瘦素/瘦素受体调节剂；

-脑肠肽(ghrelin)/脑肠肽受体调节剂；或

-单胺传导调节剂，例如选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)(例如氟西汀(fluoxetine))、去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NARI)、去肾上腺素-血清素再摄取抑制剂(SNRI)、三单胺再摄取阻断剂(例如特索芬辛(tesofensine))和单胺氧化酶抑制剂(MAOI)(例如托洛沙酮(toloxatone)和阿米夫胺(amiflamine))，

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、这种盐的溶剂化物或前药，以及任选地药学上可接受的载体。

根据本发明另一方面，提供组合治疗，其包含给予药理学有效量的本发明的化合物、或其药学上可接受的盐以及任选地药学上可接受的载体，并且同时、依序或分开给予极低热量饮食(VLCD)或低热量饮食(LCD)。

4.0制备方法。

一般来说，本发明的肽可通过固相合成来合成并根据本领域已知方法来纯化。可使用采用多种树脂和试剂的多种熟知方法中的任何一种来制备本发明的肽。

可通过用于在氨基酸之间形成肽键的已知常规方法容易地合成本发明的环肽。这种常规方法包括(例如)任何允许缩合羧基和其它反应性基团受保护的氨基酸或其残基的游离α氨基与氨基或其它反应性基团受保护的另一氨基酸或其残基的游离伯羧基的溶液相方法。在优选的常规方法中，本发明的环肽可通过固相合成来合成并根据本领域已知方法来纯化。可使用采用多种树脂和试剂的多种熟知方法中的任何一种来制备本发明的肽。

可通过将期望序列中的各氨基酸一次一个依序加成至另一个氨基酸或其残基的方法或通过首先以常规方式合成具有期望氨基酸序列的肽片段且随后将其缩合以提供期望肽的方法来实施合成环肽的方法。然后将所得肽环化以获得本发明的环肽。

固相肽合成方法为本领域所熟知并且可熟练实践。在这种方法中，本发明的肽的合成可通过根据固相方法的一般原理一次一个地将期望氨基酸残基依序结合到生长肽链中来实施。这些方法公开于多个参考文献中，包括Merrifield，R.B.，Solid phase synthesis(Nobel lecture).AngewChem 24：799-810(1985)；和Barany等人，The Peptides，Analysis，Synthesis and Biology，第2卷，Gross，E.和Meienhofer，J.编辑，AcademicPress 1-284(1980)。

在肽的化学合成中，用适宜的保护基团保护各氨基酸残基的反应性侧链基团，这在移除保护基团之前防止在该位点发生化学反应。通常在氨基酸或片段在羧基处反应时也保护该实体的α氨基，随后选择性移除α氨基保护基团，从而允许该位点进行后续反应。已公开具体保护基团并且可参见固相合成方法和溶液相合成方法。

α氨基可通过适宜保护基团来保护，包括氨基甲酸酯型保护基团，例如苄氧基羰基(Z)和被取代苄氧基羰基，例如对氯苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、对联苯基-异丙氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)和对甲氧基苄氧基羰基(Moz)和脂族氨基甲酸酯型保护基团，例如叔丁氧基羰基(Boc)、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基和烯丙氧基羰基(Alloc)。对于α氨基保护，优选Fmoc。

胍基可通过适宜的保护基团来保护，例如硝基、对甲苯磺酰基(Tos)、Z、五甲基色烷磺酰基(Pmc)、金刚烷氧基羰基、五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)和Boc。Pbf和Pmc是Arg的优选保护基团。

本文所述的本发明的肽是使用固相合成来制备，例如使用制造商提供的编程模块根据制造商说明书中所述方案通过Symphony MultiplexPeptide Synthesizer(Rainin Instrument Company/Protein TechnologiesCompany)自动化肽合成器来制备。

固相合成是通过将受保护α氨基酸偶联至适宜的树脂而从该肽的C-末端开始。该起始材料是通过将α氨基受保护的氨基酸通过酰胺键连接至4-(2′，4′-二甲氧基苯基-氨基甲基-苯氧基(Rink Amide)树脂、4-(2′，4′-二甲氧基苯基-氨基甲基)-苯氧基乙酰氨基-正亮氨酰基-MBHA树脂、氨基-呫吨-3-基氧基-merifiel树脂(Sieber Amide)树脂、或通过酯键连接至对苄氧基苄醇(Wang)树脂、2-氯三苯甲基氯树脂、或通过其它本领域熟知方式来制备。Fmoc-连接基-BHA树脂载体可从市场上购得并在可行时广泛使用。根据需要反复循环使用树脂以依序添加氨基酸。在碱性条件下移除α氨基Fmoc保护基团。N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的哌啶、哌嗪、二乙胺或吗啉(20-40％v/v)可用于此目的。

在移除α氨基保护基团后，使随后受保护氨基酸以期望次序逐步偶联以获得中间体，即受保护的肽-树脂。在肽的固相合成中用于偶联氨基酸的活化试剂是本领域所熟知的。在肽合成后，如果期望，则可使用本领域熟知的方法来移除正交保护的侧链保护基团以进一步衍生肽。

通常，可视情况使用正交保护基团。例如，本发明的肽含有多个具有含氨基侧链的氨基酸。在一方面，使用烯丙基-Alloc保护方案，其中氨基酸通过侧链形成内酰胺桥，且可在不同反应性条件下裂解的正交保护基团用于其它具有含氨基侧链的氨基酸。因此，例如，Fmoc-Orn(Alloc)-OH和Fmoc-Glu(OAll)-OH氨基酸(Glu(OAll)是指谷氨酸5-烯丙基酯)可用于在环化后形成内酰胺桥的位置，而其它具有含氨基侧链的氨基酸具有不同的正交保护基团，例如Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Pbf)-OH、Fmoc-Dab(Pbf)-OH等等。可以类似方式采用其它保护基团；例如但不限于，Mtt/OPp(4-甲基三苯甲基/2-苯基异丙基)可用于在环化后形成内酰胺桥的侧链，而正交保护基团是用于其它在使用适于裂解Mtt/OPp的条件时可不裂解的位置。

肽中的反应性基团可在固相合成期间或在从树脂移除后进行选择性修饰。例如，可在树脂上修饰肽以获得N-末端修饰，例如乙酰化，或可通过使用裂解试剂从树脂上移除且随后进行修饰。类似地，修饰氨基酸侧链的方法为肽合成领域技术人员所熟知。对肽中存在的反应性基团所作修饰的选择部分取决于肽中的期望特征。

在本发明的肽中，在一个实施方式中，通过引入N-乙酰基来修饰N-末端基团。在一方面，采用如下方法：在移除N-末端的保护基团后，在诸如吡啶的有机碱存在下在DMF中使结合树脂的肽与乙酸酐反应。其它使N-末端乙酰化的方法为本领域已知，包括溶液相乙酰化，且可采用这些方法。

在一个实施方式中，可在从肽-树脂裂解之前使肽环化。就通过反应性侧链部分环化而言，使期望侧链去保护，且使肽悬浮于适宜溶剂中并添加环偶联剂。适宜溶剂包括(例如)DMF、二氯甲烷(DCM)或1-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)。适宜环偶联剂包括(例如)四氟硼酸2-(1H-苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(TBTU)、六氟磷酸2-(1H-苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(HBTU)、六氟磷酸苯并***-1-基-氧基-三(二甲基氨基)磷(BOP)、六氟磷酸苯并***-1-基-氧基-三(吡咯啶并)磷(PyBOP)、四氟硼酸2-(7-氮杂-1H-苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(TATU)、四氟硼酸2-(2-氧代-1(2H)-吡啶基)-1，1，3，3-四甲基脲(TPTU)或N，N′-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并***(DCCI/HOBt)。偶联通常是通过使用适宜碱来引发，例如N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、对称可力丁(sym-collidine)或N-甲基吗啉(NMM)。

然后可使用任何适宜试剂从固相裂解环化肽，所述试剂是例如DCM中的乙胺或各试剂的不同组合，例如三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、二甲氧基苯(DMB)、水等等。干燥所得粗肽且使用任何适宜试剂裂解剩余氨基酸侧链保护基团(如果存在)，所述试剂是(例如)TFA的水溶液、TIS、2-巯基乙烷(ME)和/或1，2-乙二硫醇(EDT)。通过添加冷醚来沉淀最终产物并通过过滤来收集。通过反相高效液相层析(RP-HPLC)使用诸如C₁₈管柱之类适宜管柱来实施最终纯化，或也可采用其它分离或纯化方法，例如基于肽的尺寸或电荷的方法。在纯化后，可通过任何多种方法来表征肽，例如高效液相层析(HPLC)、氨基酸分析、质谱等等。

对于本发明的具有C-末端被取代的酰胺衍生物或N-烷基的肽，可通过将受保护α氨基酸偶联至适宜树脂而从肽的C-末端开始的固相合成来进行合成。本领域已阐述这种在固相上制备被取代的酰胺衍生物的方法。参见，例如Barn D.R.等人，Synthesis of an array of amides by aluminumchloride assisted cleavage on resin bound esters.Tetrahedron Letters，37：3213-3216(1996)；DeGrado W.F.和Kaiser E.T，Solid-phase synthesis ofprotected peptides on a polymer bound oxime：Preparation of segmentscomprising the sequences of a cytotoxic 26-peptide analogue.J.Org.Chem，47：3258-3261(1982)。这种起始材料可通过以熟知方式使α氨基受保护的氨基酸通过酯键连接至对苄氧基苄醇(Wang)树脂上或通过酰胺键连接至4-(2′，4′-二甲氧基苯基-氨基甲基-苯氧基(Rink Amide)树脂上来制备。使肽链以期望的氨基酸序列来生长。在裂解前，在固相上使肽环化。可通过DCM中的氯化铝来从树脂裂解采用对苄氧基苄醇(Wang)树脂的肽，且可通过TFA、TIS与水的混合物来裂解采用Rink Amide树脂的肽。

尽管主要参考固相Fmoc化学方法来描述合成，但应理解，可采用其它化学和合成方法来制备本发明的环肽，例如但不限于采用Boc化学方法、溶液化学方法和其它化学和合成方法。

5.1本发明的环肽的盐形式

应理解，当在本文中提及本发明的肽(包括具体化学式或名称)时，都旨在包括其所有药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、多晶型物、前药、代谢物、立体异构体和互变异构体。

本发明的环肽可呈任何药学上可接受的盐的形式。术语“药学上可接受的盐”是指从药学上可接受的非毒性碱或酸(包括无机或有机碱和无机或有机酸)制备的盐(参见“Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection and Use”，P.H.Stahl，P.G.Wermuth，IUPAC，Wiley-VCH，2002)。衍生自无机碱的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐、三价铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、六价锰盐、二价锰盐、钾盐、钠盐、锌盐等等。尤其优选的是铵盐、钙盐、锂盐、镁盐、钾盐和钠盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺、被取代胺(包括天然取代胺)、环胺以及碱性离子交换树脂的盐，例如精胺酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N，N′-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基-吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、葡萄糖胺、组胺酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因(procaine)、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等等。当本发明的环肽是碱性时，可从药学上可接受的无毒酸(包括无机和有机酸)来制备酸加成盐。这种酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、羧酸、柠檬酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、丙二酸、黏酸、硝酸、扑姆酸(pamoic acid)、泛酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸等等。本发明的肽的酸加成盐是在肽的适宜溶剂和过量酸中制备，所述酸是(例如)盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸(TFA)、柠檬酸、酒石酸、马来酸、琥珀酸或甲磺酸。特别有用的是乙酸盐、乙酸铵和TFA酸盐形式。

在本发明的肽包括酸性部分的情况下，适宜的药学上可接受的盐可包括碱金属盐(例如钠盐或钾盐)或碱土金属盐(例如钙盐或镁盐)。也应理解，某些式(I)的肽可以溶剂化形式存在，包括游离肽的溶剂化物或化合物的盐的溶剂化物，以及非溶剂化形式。本文所用术语“溶剂化物”描述包含本发明化合物和一种或多种药学上可接受的溶剂分子(例如乙醇)的分子络合物。在所述溶剂为水时使用术语“水合物”。应理解，所有多晶型体(包括不同多晶型体的混合物)都包括在所主张的肽的范围内。

5.2药物组合物

本发明提供包括一种或多种本发明的环肽和药学上可接受的载体的药物组合物。在用药学上可接受的载体配制时，本发明的化合物可以以总组合物的重量计0.1-99.5％、例如0.5-95％的浓度存于药物组合物中。选择载体的选择属于本领域技术人员的知识且该选择取决于(例如)给药方式、剂型和活性化物的物理性质，例如溶解度和稳定性。本文所用术语“载体”是指无治疗活性成分。剂型可为固体、半固体或液体体系。制剂可为立即释放和/或修饰释放制剂，包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、受控释放、靶向释放和程序化释放制剂。

载体可为液体制剂，且优选是缓冲溶液、等渗溶液、水溶液。药学上可接受的载体也可包括赋形剂(例如稀释剂、载体等等)和添加剂(例如稳定剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂等等)，如下文所述。

本发明的环肽组合物可被配制或混合成药物组合物，其包括至少一种本发明的环肽和一种或多种药学上可接受的载体，包括可能需要的赋形剂(例如稀释剂、载体等等)和添加剂(例如稳定剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂等等)。制剂赋形剂可包括聚乙烯吡咯啶酮、明胶、羟丙基纤维素(HPC)、***胶、聚乙二醇、甘露醇、氯化钠和柠檬酸钠。对于注射用制剂或其它液体给药制剂，优选的是含有至少一种或多种缓冲组分的水，且也可采用稳定剂、防腐剂和增溶剂。对于固体给药制剂，可采用多种增稠剂、填充剂、增量剂和载体添加剂中的任何一种，例如淀粉、糖、纤维素衍生物、脂肪酸等等。对于局部给药制剂，可采用多种乳霜、软膏、凝胶、洗剂等等中的任何一种。对于大多数药物制剂，以重量或体积计，非活性成分可占制剂的较大部分。对于药物制剂，也涵盖可采用多种计量释放、缓释或持续释放制剂和添加剂中的任何一种，从而使得剂量可被配制以便在一段期间内输送本发明的肽。

一般来说，给予患者的本发明的环肽的实际量可在较宽范围内变化，其取决于给药方式、所用制剂和所期望响应。

在实际应用中，可根据常规药物混合技术将本发明的环肽作为活性成分与药学载体组合成混合物。载体可采用多种形式，其取决于给药例如口服、非肠道(包括静脉内)、尿道、***、鼻内、颊内、舌下给药等等所期望的制剂形式。在制备口服剂型组合物时，可采用任何常用药学介质，例如：在为诸如悬浮液、酏剂和溶液等口服液体制剂时，可采用(例如)水、二醇类、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等等；或者在诸如粉剂、硬胶囊和软胶囊和片剂等口服固体制剂时，可采用载体，例如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等等。

由于片剂和胶囊易于给药，故其代表有利的口服剂量单位形式。如果需要，可通过标准水性或非水性技术来涂布片剂。活性肽在这种治疗可用组合物中的量应可实现有效剂量。在另一剂量单位形式中，可采用舌下构成物，例如薄片、糯米纸囊剂(wafer)、片剂等等。

片剂、丸剂、胶囊等等也可含有粘合剂，例如聚维酮(povidone)、黄耆胶、***胶、玉米淀粉或明胶；稀释剂；填充剂，例如微晶纤维素；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或海藻酸；防腐剂；着色剂；润滑剂，例如硬脂酸镁；和甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式是胶囊时，其除上述类型的材料外也可含有诸如脂油等液体载体。可采用各种其它材料作为包衣或用于改变剂量单位的物理形式。例如，可用虫胶、糖或这二者涂布片剂。糖浆或酏剂除活性成分外可含有蔗糖(作为甜味剂)、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯(作为防腐剂)、染料和调味剂(例如，樱桃味或橙味调味剂)。

如果配制用于口服输送，则对肽的配制和制备优选可使得将其包装在肠保护剂中，优选地使得在片剂或胶囊运送至胃部、且任选地进一步运送至部分小肠中之前不释放该肽。在此应用的背景下，应理解，术语肠包衣或材料是指可基本上完整地通过胃部但会在通过胃部后崩解以释放活性药物的包衣或材料。可用材料包括乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基甲基-乙基纤维素琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯和甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物。所用肠包衣促使剂型主要在胃外位点溶解，且所选肠包衣应可在约至少5.5的pH、优选约6.0至约8.0的pH下溶解。

可采用多种渗透促进剂中的任何一种来增强肠包衣在溶解后在肠中的摄取。在一个方面，渗透促进剂促进细胞旁或跨细胞输送***。这种渗透促进剂的代表性非限制性实例包括钙螯合剂、胆汁盐(例如胆酸钠)和脂肪酸。在一些实施方式中，另外添加用作肠蛋白酶底物的肽或多肽。也可非经肠地给予环肽。可在(例如)混合有(例如)羟丙基纤维素的水中制备这些活性肽的溶液或悬浮液。也可在甘油、液体聚乙二醇和其在油中的混合物中制备分散液。这些制剂可任选地含有防腐剂以防止微生物生长。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于即时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，该形式必须无菌且其流动程度必须使其可通过注射器来给药。该形式在制备和储存条件下必须稳定，且必须保存来防止诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可为含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇或液体聚乙二醇)、其适宜混合物和植物油的溶剂或分散介质。

本发明的环肽可通过鼻内给药来治疗性应用。所谓“鼻内给药”意思指本发明的任何环肽的任何形式的鼻内给药。肽可呈水溶液形式，例如包括盐水、柠檬酸盐或其它常用赋形剂或防腐剂的溶液。肽也可呈干燥制剂或粉剂形式。

如果呈水溶液形式，则环肽可通过盐水、乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐或其它缓冲剂来加以适当缓冲，缓冲剂可具有任何生理上可接受的pH，例如约pH 4至约pH 7。也可采用缓冲剂的组合，例如磷酸盐缓冲盐水、盐水和乙酸盐缓冲液等等。在盐水的情况下，可采用0.9％的盐水溶液。在乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐等等的情况下，可采用50mM溶液。除缓冲剂外，可采用适宜防腐剂来防止或限制细菌和其它微生物生长。可用的一种这类防腐剂是0.05％苯扎氯铵(benzalkonium chloride)。

在供选实施方式中，本发明的环肽可直接给药至肺中。可通过计量吸入器来实施肺内给药，该装置使得患者可通过在吸气时推动来自给药已计量的大剂量的本发明的肽。可使用多种不同技术中的任何一种来制备干燥粉微粒，包括但不限于微研磨、喷雾干燥和快速冷冻气溶胶，然后冻干。

本发明的环肽可通过注射持续释放制剂来治疗性给药。一般来说，在可注射持续释放制剂中可采用多种可注射生物蚀解聚合物中的任何一种。或者，可采用其它持续释放制剂，包括允许皮下注射的制剂，所述其它制剂可包括在油中的以下中的一种或多种：纳米球体/微球体、脂质体、乳液(例如油包水乳液)、凝胶、不溶性盐或悬浮液。制剂可能需要每日、每周、每月或基于其它周期来注射，取决于以下因素而定：环肽的浓度和量、所用材料的持续释放速率和本领域技术人员已知的其它因素。

5.3给药途径

如果通过注射来给予包括一种或多种本发明的肽的组合物，则可通过静脉内、皮下、肌内、腹膜腔内或本领域已知的其它方式来注射。

可通过本领域已知的任何方式来配制本发明的肽，包括但不限于配制为片剂、胶囊、小胶囊、悬浮液、粉剂、冻干制剂、栓剂、眼滴剂、皮肤贴剂、口服可溶制剂、喷雾剂、气溶胶等等，且可用缓冲剂、粘合剂、赋形剂、稳定剂、抗氧化剂和其它本领域已知药剂来混合和配制。一般来说，可采用任何跨越表皮细胞层引入本发明的肽的给药途径。因此给药方式可包括通过粘膜给药、颊内给药、口服给药、经皮给药、吸入给药、鼻内给药、尿道给药、***给药等等。

5.4治疗有效量

一般来说，给予患者的本发明的环肽的实际量可在较宽范围内变化，其取决于以下因素：给药方式、患者情况(包括体重、性别、健康状况和饮食)、所用制剂和期望响应。治疗剂量是通过任何上述方式或本领域已知的任何其它方式来给予足以引发期望治疗效果的量。本发明的环肽具有高活性。例如，取决于所选特异性肽、期望治疗响应、给药途径、制剂和本领域技术人员已知的其它因素，可以约0.1、0.5、1、5、50、100、500、1000或5000μg/kg体重给予环肽(以单一剂量或以分开的日剂量)。

6.0本发明的肽

在一个方面，本发明涉及结构式(I)的环肽：

包括其所有对映异构体、立体异构体或非对映异构体，或上述任何一个的药学上可接收的盐，

其中：

R₁为-NH-C(＝O)-或-C(＝O)-NH-；

R₂为-H或-CH₂-，并且如果R₂为-CH₂-，则其与R₃形成吡咯烷环，该吡咯烷环任选由-OH取代；

如果R₂为-CH₂-，则R₃为-(CH₂)₂-，且在其它情况下R₃选自

R_4a、R_4b和R_4c各自独立选自氢、卤素、卤代(C₁-C₁₀)烷基、二卤代(C₁-C₁₀)烷基、三卤代(C₁-C₁₀)烷基、(C₁-C₁₀)烷基、(C₁-C₁₀)烷氧基、(C₁-C₁₀)烷硫基、芳基、芳氧基、硝基、腈基、氨磺酰基、氨基、单取代氨基、二取代氨基、羟基、羧基或烷氧基-羰基，前提条件是R_4a、R_4b和R_4c中至少一个不为氢；

R₅为-OH或-N(R_6a)(R_6b)；

R_6a和R_6b各自独立为H或C₁-C₄直链、支链或环状烷基链；

R₇为-H或-C(＝O)-NH₂；

w在各情况下独立为0到5；

x为1到5；

y为1到5；并且

z在各情况下独立为1到5。

在另一个方面，本发明涉及式(I)环肽或其药学上可接受的盐，所述式(I)环肽是式(II)的环肽：

在另一个方面，本发明涉及式(I)环肽或其药学上可接受的盐，所述式(I)环肽是式(III)的环肽：

在一个方面，本发明提供环状七肽，其在环状部分内含有衍生自His-Phe-Arg-Trp的核心序列，且其中第一位的氨基酸是Arg且其位于环状部分以外。不受限于理论，认为Arg残基显著有利于针对MC1-R的低活性。

此外，式I的肽中的核心序列包括被取代的D-Phe。不受限于理论，认为通过在本发明的肽中使用被取代的D-Phe可降低固有活性同时基本上维持效能。可比较表1中称作参照实施例1的肽(包括未被取代的D-Phe)与实施例1-5、9-11、17、26和27中的一个或多个。可注意到，表1包括平均值。

表1

在本发明的另一个实施方式中，提供式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽，其中R_4a、R_4b和R_4c中的一个或多个各自独立选自氢、卤素、卤代(C₁-C₁₀)烷基、二卤代(C₁-C₁₀)烷基、三卤代(C₁-C₁₀)烷基、(C₁-C₁₀)烷基、(C₁-C₁₀)烷氧基、苯基、硝基、腈基、氨基或羟基，前提条件是R_4a、R_4b和R_4c中至少一个不为氢。

在本发明的另一个实施方式中，提供式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽，其中R_4a、R_4b和R_4c中的一个或多个各自独立选自氢、卤素、卤代(C₁-C₄)烷基、二卤代(C₁-C₄)烷基、三卤代(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基、苯基、硝基、腈基、氨基或羟基，前提条件是R_4a、R_4b和R_4c中至少一个不为氢。

在本发明的另一个实施方式中，提供式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽，其中R_4a、R_4b和R_4c中的一个或多个各自独立选自：

氟、氯、

在本发明的另一个实施方式中，提供式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽，其中R_4a、R_4b和R_4c中的一个或多个各自独立选自氢、卤素、卤代(C₁-C₄)烷基、二卤代(C₁-C₄)烷基、三卤代(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基、硝基、腈基、氨基或羟基，前提条件是R_4a、R_4b和R_4c中至少一个不为氢。

氟、氯、

在本发明的另一个实施方式中，提供式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽，其中R_4a选自：

氟、氯、

并且R_4b和R_4c各自为H。

在本发明的另一个实施方式中，提供式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽，其中R_4a选自-C≡N或-F，并且R_4b和R_4c各自为H。

在本发明一个具体实施方式中，提供式(I)肽、且尤其式(II)或(III)的肽，其中R_4a位于4位且是-C≡N并且R_4b和R_4c各自为H。

在本发明另一个具体实施方式中，提供式(I)肽、且尤其式(II)或(III)的肽，其中R_4a位于4位且为-F并且R_4b和R_4c各自为H。

式(I)内所涵盖的肽含有一个或多个不对称元素，例如立体中心、立体轴等等，从而使得式(I)内所涵盖的肽可以以不同的立体异构形式存在。对于特别描述的肽和大致描述的肽(包括式(I)内所涵盖的肽)，在所有手性或其它异构中心处的所有异构体形式(包括对映异构体和非对映异构体)都将涵盖在本文中。本发明的肽各自包括多个手性中心，且本发明的肽除了以对映体纯(enantiopure)制剂形式来使用外，可以以外消旋混合物或对映异构体富集混合物形式来使用。通常，本发明的肽可使用手性纯试剂(例如指定的L-或D-氨基酸)来合成，其中所用试剂、条件和方法使得可维持对映异构体纯度，但可能且预期可制备外消旋混合物。这些外消旋混合物可任选地使用熟知技术来分离，且可单独使用个别对映异构体。在肽可以互变异构形式存在的温度、溶剂和pH的情况和特定条件下，本发明范围内旨在包括每种互变异构形式，不论其是以平衡状态存在或主要以一种形式存在。因此，可通过不对称合成、从光学纯前体合成或通过拆分外消旋体来获得呈光学活性形式的式(I)的肽的单一对映异构体。

式(II)和(III)的肽是式(I)的肽的特定立体异构形式，但不应认为本发明受限于式(II)和(III)所涵盖的立体异构形式。

本发明另外旨在包括本发明的肽的前药，其在施药时因代谢过程而发生化学转化，从而变成药理学活性肽。一般来说，这种前药可为本发明的肽的功能性衍生物，其在体内易于转化为式(I)的肽。前药是任何共价键合的化合物，其在体内释放式(I)的活性母体肽药物。合适的前药衍生物的选择和制备的常规方法阐述在(例如)以下文献中：″Design ofProdrugs″，H.Bundgaard编辑，Elsevier，1985。前药的典型实例在官能部分上具有生物易变性保护基团，例如通过羟基、羧基或氨基官能团的酯化来保护。因此，作为实例但不受限地，前药包括采用酯前药形式的式(I)的肽，所述酯前药形式是(例如)式(I)中R基团的低碳烷基酯，例如其中R是-OH，所述低碳烷基酯可在烷基中包括1-8个碳；或在芳烷基中具有6-12个碳的芳烷基酯。在广义上，前药包括可在体内发生以下反应而产生式(I)的活性母体肽药物的化合物：氧化、还原、胺化、脱胺化、羟基化、脱羟基化、水解、脱水、烷基化、脱烷基化、酰基化、脱酰基化、磷酸化或脱磷酸化。

可对式I的肽进行某些修饰以延长该肽的半衰期(参见G.Pasuta和F.M.Veronese(2007)“Polymer-drug conjugation，recent achievements andgeneral strategies”Progress in Polymer Science 32(8-9)：933-961)。

本发明也包括与式(I)所列举的肽相同的肽，但事实上式(I)中所描绘的一个或多个原子由原子质量或质量数与自然界中通常所发现的原子质量或质量数不同的原子替代。可结合到本发明的肽中的同位素的实例包括氢、碳、氮和氧的同位素，分别例如²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O和¹⁷O。含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的本发明的肽和所述肽的药学上可接受的盐或溶剂合物涵盖于本发明的范围内。某些同位素标记的本发明的肽，例如结合有诸如³H和¹⁴C等放射性同位素的那些可用于多种测定中，例如药物和/或基质组织分布测定。用较重同位素取代，例如用氘(²H)取代一个或多个氢原子在某些情况下可提供药理学优势，包括提高代谢稳定性。同位素标记的式(I)的肽一般可通过用同位素标记的试剂取代非同位素标记的试剂来制备。

在式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽的一个实施方式中，R₁是-C(＝O)-NH-，x为2且y为3。

在式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽的另一个实施方式中，R₁是-C(＝O)-NH-，x为1且y为4。

在式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽的另一个实施方式中，R₁是-NH-C(＝O)-，x为3且y为2。

在式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽的又一个实施方式中，R₁是-NH-C(＝O)-，x为4且y为1。

在式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽的特定实施方式中，R₁是-C(＝O)-NH-，x为2且y为3，或者R₁是-NH-C(＝O)-，x为3且y为2。更具体来说，R₁是-C(＝O)-NH-，x为2且y为3。惊讶且意外地发现，如通过EC₅₀所测定，尤其在本文所述低密度hMC4-R***中，通过Glu(位于环状部分的N-末端)的侧链和Orn(位于环状部分的C-末端)的侧链定位酰胺键的具有内酰胺桥的本发明的肽一般可提供与通过Asp和Lys的侧链定位酰胺键但其它方面相同的肽相比有改善的效能。此发现与现有技术中的如下论断相反：在黑皮质素受体特异性肽的内酰胺桥中酰胺键的位置和方向对活性几乎无作用且不与受体相互作用。例如，参见BednarekMA等人，Potent and selective peptide agonists of α-melanotropin action athuman melanocortin receptor 4：their synthesis and biological evaluation invitro.Biochem.Biophys.Res.Comm.286：641-645(2001)。

在式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽的一个实施方式中，R₂为-H或-CH₂-，并且如果R₂为-CH₂-，则其与R₃形成吡咯烷环，所述吡咯烷环任选由-OH取代；

其中w在各情况下独立选自0到5，并且

z在各情况下独立选自1到5。

其中w在各情况下独立选自0到5，并且

z在各情况下独立选自1到5。

在式(I)的肽、且式(II)或(III)的肽的一个实施方式中，R₂为H。

在式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽的一个实施方式中，R₂为H或-CH₂-，并且如果R₂为-CH₂-，则其与R₃形成吡咯烷环，所述吡咯烷环任选由-OH取代；并且

不受限于理论，认为用非芳族氨基酸尤其非极性小脂族氨基酸(例如Pro或Ala)或极性不带电或带电荷氨基酸(例如Lys、Asp、Gln和Asn)替代His有利于降低血压效果。因此，核心序列中的His位置可由(例如)Dab、Dab(乙酰基)、Ser、Met(O)、Met(O₂)、Thr、Hyp、Gln、Pro、Ala、Asn、Cit、Orn、Dap、Lys或Arg，尤其Pro、Asn或Gln来替代。

因此，在本发明另一个实施方式中，提供式(I)的肽、尤其式(II)或(III)的肽，其中R₂为-H或-CH₂-，并且如果R₂为-CH₂-，则其与R₃形成吡咯烷环，所述吡咯烷环任选由-OH取代；并且如果R₂为-CH₂-，则R₃为-(CH₂)₂-，且在其它情况下R₃选自：

其中w在各情况下独立选自0到5，并且

z在各情况下独立选自1到5。

在本发明另一个实施方式中，提供式(I)的肽、尤其式(II)或(III)的肽，其中R₂为-H或-CH₂-，并且如果R₂为-CH₂-，则其与R₃形成吡咯烷环，所述吡咯烷环任选由-OH取代；并且如果R₂为-CH₂-，则R₃为-(CH₂)₂-，且在其它情况下R₃选自：

其中w在各情况下独立选自0到5，并且

z在各情况下独立选自1到5。

在本发明的一个具体实施方式中，提供式(I)的肽、尤其式(II)或(III)的肽，其中R₂为-H或-CH₂-，并且如果R₂为-CH₂-，则其与R₃形成吡咯烷环，所述吡咯烷环任选由-OH取代；并且

其中w在各情况下独立选自0到5，尤其0到2，例如0，并且

z在各情况下独立选自1到5，尤其1到4。

在本发明的另一个具体实施方式中，提供式(I)的肽、尤其式(II)或(III)的肽，其中R₂为-H或-CH₂-，并且如果R₂为-CH₂-，则其与R₃形成吡咯烷环，所述吡咯烷环任选由-OH取代；并且

其中w在各情况下独立选自0到5，尤其0到2，例如0，并且

z在各情况下独立选自1到5，尤其1到4。

在式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽的其它实施方式中，R₂为H或-CH₂-，并且如果R₂为-CH₂-，则其与R₃形成吡咯烷环，所述吡咯烷环任选由-OH取代；并且

R₃选自

在本发明的另一个实施方式中，提供式(I)的肽、尤其式(II)或(III)的肽，其中R₂为H且R₃选自

在本发明的另一个实施方式中，提供式(I)的肽、尤其式(II)或(III)的肽，其中R₂为H且R₃选自：

在本发明的另一个实施方式中，提供式(I)的肽、尤其式(II)或(III)的肽，其中R₂为-CH₂-且R₃为-(CH₂)₂-，R₂和R₃一起形成未被取代的吡咯烷环。

在本发明的又一个实施方式中，提供式(I)的肽、尤其式(II)或(III)的肽，其中R₂为-CH₂-且R₃为-(CH₂)₂-，R₂和R₃一起形成由-OH取代的吡咯烷环。在式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽的另一个实施方式中，R₅为-NH₂或-OH。

在式(I)的肽、且尤其式(II)或(III)的肽的特定实施方式中，R₅为-NH₂。

可组合上述实施方式中的一个或多个以提供本发明的肽的其它特定实施方式。

因此，在本发明的一个具体实施方式中，提供式(I)的肽、尤其式(II)或(III)的肽，其中：

R₁为-C(＝O)-NH-，x为2且y为3；

R₂为-H或-CH₂-，并且如果R₂为-CH₂-，则其与R₃形成吡咯烷环，所述吡咯烷环任选由-OH取代；

w在各情况下独立选自0到5；

z在各情况下独立选自1到5；

R_4a、R_4b和R_4c中的一个或多个各自独立选自：

氟、氯、

并且

R₅为-NH₂或-OH。

本发明某些特异性肽是以下中的一个或多个：

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(2-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：6)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(3-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：7)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(4-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：8)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(2，4-二Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ IDNO：9)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(3，4-二Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ IDNO：10)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(3-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：11)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：12)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Tyr-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：13)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(2-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：14)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(3-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：15)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：16)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(2-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：17)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(2-CF₃)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：18)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(3-CF₃)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：19)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(4-Me)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：20)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(4-OMe)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：21)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(3，5-二F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ IDNO：22)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(2-Me)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：23)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(3-Me)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：24)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(4-CF₃)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：25)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(2，4-二Me)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ IDNO：26)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(2-NO₂)-Arg-Trp-Orn-NH₂(SEQ ID NO：27)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(3-NO₂)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：28)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(4-NO₂)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：29)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(3，4-二OMe)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ IDNO：30)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(3，4-二F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ IDNO：31)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(3，4，5-三F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ IDNO：32)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(4-NH₂)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：33)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(4-tBu)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：35)；

Ac-Arg-环(Glu-Ser-D-Phe(2-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：36)；

Ac-Arg-环(Glu-Thr-D-Phe(2-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：37)；

Ac-Arg-环(Glu-Hyp-D-Phe(2-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：38)；

Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(2-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：39)；

Ac-Arg-环(Glu-Ser-D-Phe(3-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：40)；

Ac-Arg-环(Glu-Thr-D-Phe(3-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：41)；

Ac-Arg-环(Glu-Hyp-D-Phe(3-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：42)；

Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(3-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：43)；

Ac-Arg-环(Glu-Pro-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：44)；

Ac-Arg-环(Glu-Hyp-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：45)；

Ac-Arg-环(Glu-Ala-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：46)；

Ac-Arg-环(Glu-Asn-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：48)；

Ac-Arg-环(Glu-Thr-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：49)；

Ac-Arg-环(Glu-Ser-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：50)；

Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：51)；

Ac-Arg-环(Glu-Orn-D-Phe(2-Cl)-Arg-Trp-Orn)-OH(SEQ ID NO：54)；

Ac-Arg-环(Glu-Orn-D-Phe(3-Cl)-Arg-Trp-Orn)-OH(SEQ ID NO：60)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab(乙酰基)-D-Phe(2-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ IDNO：61)；

Ac-Arg-环(Glu-Ser-D-Phe(2-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：63)；

Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(2-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：64)；

Ac-Arg-环(Glu-Hyp-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：65)；

Ac-Arg-环(Glu-Dap-D-Phe(3-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：66)；

Ac-Arg-环(Glu-Dap-D-Phe(2-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：67)；

Ac-Arg-环(Glu-Hyp-D-Phe(2-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：69)；

Ac-Arg-环(Glu-Ser-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：70)；

Ac-Arg-环(Glu-Pro-D-Phe(2-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：71)；

Ac-Arg-环(Glu-Pro-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：72)；

Ac-Arg-环(Glu-Met(O₂)-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ IDNO：73)；

Ac-Arg-环(Glu-Asn-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：74)；

Ac-Arg-环(Glu-Asn-D-Phe(2-Me)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：78)；

Ac-Arg-环(Glu-Asn-D-Phe(3，5-二F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ IDNO：81)；

Ac-Arg-环(Glu-Asn-D-Phe(2-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：89)；

Ac-Arg-环(Glu-Asn-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-OH(SEQ ID NO：90)；

Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-OH(SEQ ID NO：91)；

Ac-Arg-环(Glu-Dab-D-Phe(3-OMe)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：92)；

Ac-Arg-环(Glu-Pro-D-Phe(2-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：93)；

Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：97)；

Ac-Arg-环(Glu-Asn-D-Phe(3，4，5-三F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ IDNO：100)；

Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(3，4，5-三F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ IDNO：102)；

Ac-Arg-环(Glu-Arg-D-Phe(3-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：104)；

Ac-Arg-环(Glu-Lys-D-Phe(3-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：105)；

Ac-Arg-环(Glu-Orn-D-Phe(3-Cl)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：106)

Ac-Arg-环(Glu-Pro-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-OH(SEQ ID NO：107)；

Ac-Arg-环(Glu-Asp-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：111)；

Ac-Arg-环(Glu-Asp-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-OH(SEQ ID NO：112)；

Ac-Arg-环(Glu-Glu-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：113)；

Ac-Arg-环(Glu-Glu-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-OH(SEQ ID NO：114)；

Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(2-Me)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：115)；

Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(2-CF₃)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：119)；

Ac-Arg-环(Glu-Asn-D-Phe(2-CF₃)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：121)；或上述任何一个的药学上可接受的盐。

尤其，本发明涉及：

Ac-Arg-环(Glu-Asn-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：48)；

Ac-Arg-环(Glu-Asn-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：74)；

Ac-Arg-环(Glu-Asn-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-OH(SEQ ID NO：90)，或上述任何一个的药学上可接受的盐。

尤其，本发明还涉及：

Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：51)；

Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-OH(SEQ ID NO：91)；

Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：97)，或上述任何一个的药学上可接受的盐。

尤其，本发明还涉及：

Ac-Arg-环(Glu-Pro-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：44)；

Ac-Arg-环(Glu-Pro-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO：72)；

Ac-Arg-环(Glu-Pro-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-OH(SEQ ID NO：107)；或上述任何一个的药学上可接受的盐。

本发明的某些其它特异性肽是：

Ac-Arg-环(Orn-Asn-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ ID NO：75)；

Ac-Arg-环(Orn-Asn-D-Phe(2-F)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ ID NO：76)；

Ac-Arg-环(Orn-Asn-D-Phe(3-Me)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ ID NO：77)；

Ac-Arg-环(Orn-Asn-D-Phe(2-Me)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ ID NO：79)；

Ac-Arg-环(Orn-Asn-D-Phe(3，4-二F)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ IDNO：80)；

Ac-Arg-环(Orn-Asn-D-Phe(3，5-二F)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ IDNO：82)；

Ac-Arg-环(Orn-Asn-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ ID NO：96)；

Ac-Arg-环(Orn-Gln-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ ID NO：99)；

Ac-Arg-环(Orn-Asn-D-Phe(3，4，5-三F)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ IDNO：101)；

Ac-Arg-环(Orn-Gln-D-Phe(3，4，5-三F)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ IDNO：103)；

Ac-Arg-环(Orn-Pro-D-Phe(2-F)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ ID NO：110)；

Ac-Arg-环(Orn-Gln-D-Phe(2-Me)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ ID NO：116)；

Ac-Arg-环(Orn-Gln-D-Phe(2-Cl)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ ID NO：117)；

Ac-Arg-环(Orn-Asn-D-Phe(2-Cl)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ ID NO：118)；

Ac-Arg-环(Orn-Gln-D-Phe(2-CF₃)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ ID NO：120)；

Ac-Arg-环(Orn-Asn-D-Phe(2-CF₃)-Arg-Trp-Glu)-NH₂(SEQ ID NO：122)；或上述任何一个的药学上可接受的盐。

6.1特异性肽

具有以下结构的肽是通过上述一般方法来合成，只是其中所示各肽的MC1-R Ki和MC4-R Ki值是如下文7.1中所述在竞争性结合测定中使用[I¹²⁵]-NDP-α-MSH来测定。所有肽都制备为TFA酸性盐形式，但实施例43、46和67的肽例外，其制备为乙酸盐形式。

本发明某些特异性肽的合成阐述于下文中。这些肽是使用固相肽合成通过Symphony Multiplex Peptide Synthesizer(Rainin InstrumentCompany/Protein Technologies Inc.)自动化肽合成器来制备。

步骤1：Orn的偶联

在3×5mL DMF中将Sierber树脂9-Fmoc-氨基呫吨-3-基氧基-聚苯乙烯树脂(0.39mol/g，ChemPep Inc.，#151902)溶胀10分钟。此后，经10分钟使用2×5mL在DMF中的20％哌啶使Fmoc去保护。然后在6×5mL DMF中将树脂洗涤30秒。添加5mL在DMF中的200mMFmoc-Orn(Alloc)-OH和5mL在DMF中且含有400mM NMM的200mMHBTU并在30分钟后用3×5mL DMF将树脂洗涤30秒。

步骤2：随后6个氨基酸(AA)的偶联

首先将步骤1的树脂在3×5mL DMF中溶胀30秒，经10分钟使用2×5mL在DMF中的20％哌啶使Fmoc去保护，且随后用6×5mL DMF洗涤30秒。添加5mL 200mM Fmoc-AA-OH溶液和5mL在DMF中且含有400mM NMM的200mM HBTU，且在30分钟后用3×5mL DMF将树脂洗涤30秒。

针对每一氨基酸(AA)重复此步骤。

步骤3：乙酰化

经10分钟使用2×5mL在DMF中的20％哌啶使Fmoc去保护且随后用3×5mL DMF将树脂洗涤30秒。此后，添加5mL 50％Ac₂O/DMF溶液且在30分钟后用3×5mL DMF将肽-树脂洗涤30秒并用6×5mLDCM洗涤30秒。

步骤4：烯丙基/Alloc去保护

将肽-树脂(0.6mmol)与苯基硅烷(Oakwood Chemical，#S13600)(20当量)在20mL DCM中混合且用氮鼓泡5分钟。

添加四(三苯基膦)合钯(0)(Strem Chemicals，Inc.，#46-2150)(0.2当量)且用氮将混合物搅拌1小时。经1小时将该程序重复一次且经30分钟用新鲜试剂将该程序再重复一次。然后用DCM×3和DMF×3洗涤经处理肽-树脂。

步骤5：内酰胺形成

在肽-树脂上经1小时使用在20mL DMF中的TBTU(2当量)和乙基二异丙基胺(DIEA)(4当量)来形成内酰胺环。如果观察到阳性KaiserNinhydrin测试，则可能需要第二偶联。

步骤6：肽裂解

将肽-树脂(0.6mmol)与20mL在DMF中的5％二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物(NaCS₂NEt₂，Aldrich，#228680)混合20分钟且随后用DMF×3、DCM×3和二***×2洗涤。

然后将树脂(0.6mmol)在25mL TFA/TIS/H₂O(90∶5.0∶5.0v/v/v)中搅拌2.5小时。过滤树脂。将滤液浓缩至体积为约10mL且添加约140mL冷二***(预冷却至约0℃)。

涡旋搅拌混合物，且随后将其在冰箱(约-4℃)中放置1h，以2800rpm离心5分钟，并倾倒出醚层。

用90mL冷二***(预冷却至约0℃)洗涤肽，涡旋搅拌，以2800rpm离心5分钟，并倾倒出醚层。

将所得固体溶于50％AcOH/H₂O中并在室温下储存过夜。

浓缩粗肽溶液以提供用于HPLC纯化的固体粗肽。

在HPLC纯化后，使用离子交换(×100当量)将肽的TFA盐转化为肽的乙酸盐。所用阴离子交换树脂是Dowex SBR LC NG，OH形式(Supelco，目录号14036-U)。

实施例46：Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH ₂ (SEQ ID NO：51)

在标题肽制备中遵循上述程序。

按照偶联顺序，在步骤2中添加的氨基酸是Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe(4-CN)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OAll)-OH和Fmoc-Arg(Pbf)-OH。

通过HPLC(管柱：Atlantis dC18 OBD ^TM 19×100mm(5μ，Waters部件号186001367))使用10％含有0.1％TFA的MeOH/H₂O(溶剂A)和90％含有0.1％TFA的MeOH/H₂O(溶剂B)来纯化所得肽。使用0％-5％溶剂B(5分钟)和5％-35％溶剂B(30分钟)的梯度。

肽的产率为10％。

实施例67：Ac-Arg-环(Glu-Pro-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-NH ₂ (SEQ ID NO：72)

在标题肽的制备中遵循上述程序，只是在步骤6中使用15mL在DMF中的5％二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物、16mL TFA/TIS/H₂O和90mL+60mL二***。此外，将滤液浓缩至5mL。

按照偶联顺序，在步骤2中添加的氨基酸是Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe(4-F)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Glu(OAll)-OH和Fmoc-Arg(Pbf)-OH。

通过HPLC(管柱：Atlantis dC18OBD ^TM 19×100mm(5μ，Waters部件号186001367))使用10％含有0.1％TFA的MeOH/H₂O(溶剂A)和90％含有0.1％TFA的MeOH/H₂O(溶剂B)来纯化所得肽。使用5％-10％溶剂B(5分钟)和10％-40％溶剂B(30分钟)的梯度。

肽的产率为16％。

7.0用于评估本发明的肽的测试和测定

可通过多种测定***和动物模型来测试本发明的黑皮质素受体特异性肽以测定结合、功能状态和效力。

7.1使用[I¹²⁵]-NDP-α-MSH的竞争性抑制测定

使用从表达重组hMC4-R、hMC3-R或hMC5-R的HEK-293细胞和B-16小鼠黑素瘤细胞(含有内源性MC1-R)制备的膜匀浆物对本发明的例示性肽实施竞争性抑制结合测定。在某些情况下，采用表达重组hMC1-R的HEK-293细胞。在预涂布有0.5％牛血清白蛋白(部分V)的96孔GF/B微孔多重筛网过滤板(MAFB NOB10)中实施分析。在含有25mM HEPES缓冲液(pH 7.5)和100mM NaCl、2mM CaCl₂、2mM MgCl₂、0.3mM 1，10-二氮杂菲和0.2％牛血清白蛋白的缓冲液中，将膜匀浆物与0.2nM(对于hMC4-R)、0.4nM(对于MC3-R和MC5-R)或0.1nM(对于小鼠B16MC1-R或hMC1-R)[I¹²⁵]-NDP-α-MSH(Perkin Elmer)和升高浓度的本发明测试肽一起培育。在37℃下培育60分钟后，过滤测定混合物并用冰冷缓冲液将膜洗涤三次。干燥过滤器并在用于结合放射活性的γ计数器中进行计数。在1μM NDP-α-MSH的存在下通过对[I¹²⁵]-NDP-α-MSH的结合的抑制来测量非特异性结合。将最大特异性结合(100％)定义为在不存在与存在1μM NDP-α-MSH的情况下结合细胞膜的放射活性(cpm)的差。相对于100％特异性结合来标准化在测试肽存在下获得的放射活性(cpm)以测定对[I¹²⁵]-NDP-α-MSH结合的抑制百分比。各测定进行三次且阐述实际平均值，小于0％的结果报告为0％。使用Graph-Pad Prism曲线拟合软件来测定本发明测试肽的Ki值。本文中展示此测定的结果(参见6.1)。对于某些肽来说，展示两个以上数值的平均值。

7.2对激动剂活性的测定

检查细胞内cAMP的积累作为本发明的肽在表达MC4-R的HEK-293细胞中引起功能性响应的能力的量度。通过在无酶细胞解离缓冲液中培育从培养板分离汇合的表达重组hMC4-R的HEK-293细胞。使分散细胞悬浮于含有10mM HEPES(pH 7.5)、1mM MgCl₂、1mM谷氨酰胺、0.5％白蛋白和0.3mM 3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤(IBMX)(磷酸二酯酶抑制剂)的厄尔平衡盐溶液(Earle′s Balanced Salt Solution)中。以0.5×10⁵细胞/孔的密度将细胞平铺于96孔板上且预培育10分钟。在37℃下使细胞暴露于本发明的肽15分钟，这些肽以0.05-5000nM的浓度范围和200μL的总测定体积溶于DMSO(最终DMSO浓度为1％)中。使用NDP-α-MSH作为参照激动剂。通过得自Cisbio Bioassays的HTRFcAMP细胞基测定***(其中采用穴状化合物标记的抗cAMP和d2标记的cAMP)来测定cAMP含量，且在Perkin-Elmer Victor板读数器上于665nM和620nM下进行板读数。使用Graph-Pad软件通过非线性回归分析来实施数据分析。比较本发明测试肽的最大效力与在此背景中用作完全激动剂基准的参照黑皮质素激动剂NDP-α-MSH实现的最大效力。

7.3高密度和低密度hMC4-R功能性分析

使用由人类MC4-R传染的HEK293细胞系(Palatin Technologies，US，具有University of Michigan颁发的许可证)。通过使用T-REx^TM***(Invitrogen)将人类MC4-R引入HEK293中。T-REx^TM***采用四环素调节的哺乳动物表达体系，其使用源自大肠杆菌(E.coli)Tn10-编码的四环素(Tet)抗性操纵子的调节元件。通过使用T-REx^TM***，在不存在四环素或多西环素时抑制所关注基因(即人类MC4-R基因)的表达，且在存在四环素或多西环素时诱导所关注基因(即人类MC4-R基因)的表达(参见T-REx^TM***手册，Invitrogen出版)。

在5％CO₂和95％湿度和37℃下，在补加有L-谷氨酰胺(Gibco25030)、10％胎牛血清(FBS)、200μg/mL博来霉素(Zeocin)(Invitrogen46-0072)和6μg/mL杀稻瘟菌素(Blasticidin)(Invitrogen 46-1120)的DMEM(Gibco 11965)中培养HEK293-T-REx-MC4-R细胞。将T-150烧瓶中75％汇合的细胞与两种浓度的多西环素(0.1ng/mL，提供低密度hMC4-R体系；和10ng/mL，提供高密度hMC4-R体系)在5％CO₂和37℃下一起培育16-18小时以诱导MC4-R表达。在测定当天，用PBS(Gibco14190)洗涤细胞并使用细胞解离缓冲液(Gibco 13150-016)来收获，然后进行离心并使其再悬浮于含有10mM 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)(pH 7.4)(Sigma H0887)、1mM L-谷氨酰胺(Gibco 25030)、1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)(Sigma A3311)和0.3mM 3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤(IBMX)的汉克斯平衡盐溶液(Hanks′Balanced Salt Solution)(+Ca，+Mg)(Gibco 14025)中。然后对细胞进行计数并将体积调节至2.5×10⁵细胞/毫升。

然后以198μL(约5×10⁴)细胞/孔将细胞分配至96孔板(BD 353916)中并在37℃下培育10分钟。用DMSO将待测试化合物稀释至1mM的最终浓度。在抽取式12孔文库管排(VWR目录号83009-682)中于聚丙烯中制备连续稀释物。将120μL 1mM的化合物原液移液至板上的第二列孔中。使用Janus液体处理器将化合物以1∶10(25μL化合物+225μL DMSO)连续稀释为总计9种浓度(代表介于10^-5M至10^-13M范围内的最终分析浓度)。

使用Janus机器人***将2μL标准[Nle⁴，D-Phe⁷]-α-黑素细胞刺激激素(NDP-α-MSH)或化合物添加至96孔板中。所有测定样品都进行两次(即每个样品分别存于两个低多西环素(dox)板和两个高多西环素板中)。在37℃下将各板缓慢振荡并培育15分钟。通过添加15μL/孔的溶解缓冲液来终止反应且在室温下将各板振荡30分钟。

MC4-R的激动剂刺激激活腺苷酸环化酶，其是催化从三磷酸腺苷(ATP)形成3′，5′-环腺苷单磷酸(cAMP)的酶。因此，MC4-R的激动剂刺激提高cAMP水平。用cAMP动态2HTRF试剂盒(CisBio目录号62AM4PEC；参见CisBio出版的手册)来测量cAMP水平。相对于板对照(1％DMSO用于0％，400nM NDP-α-MSH用于100％)和介于712nM至0.04nM cAMP范围内的校正曲线来标准化cAMP水平(基本上如CisBioHTRF试剂盒中所述)。在室温下将板于振荡器上培育1小时且在Perkin-Elmer Victor板读数器上于665nm和620nm下读取。然后如CisBioHTRF试剂盒中所述计算荧光比率，其中使用GraphPad Prism软件以斜率可变剂量响应曲线且基于所计算的cAMP浓度来绘制荧光百分比数值相对于cAMP浓度的变化的图，从而确定EC₅₀值和激活百分比。本文中展示此测定的结果(参见8.0)。

7.4食物摄取和体重变化

评估通过皮下注射途径给药的所选肽引起的食物摄取和体重变化。自Hilltop Lab Animals，Inc.(Scottdale，PA)获得雄性Sprague-Dawley大鼠。将动物单独饲养在常规聚苯乙烯吊笼中并维持受控的12小时亮/暗光循环。无限制提供水和粒化食物(ProLab RMH 2500，W.F.Fisher & SonInc.)。向大鼠皮下给药载体(3.2％甘露醇/50mM Tris缓冲液)或所选肽(1.0mg/kg)。在给药后4小时和24小时阶段内测定食物摄取的变化，且在给药后24小时阶段内测定体重变化。也在施用后48小时和72小时阶段内测量体重与食物摄取的变化，从而确定体重和食物摄取效果变化是否逆转到基线程度(未显示)。

使用1.0mg/kg皮下注射的实施例43、46和67和平行分析的相应载体对照的研究的食物摄取(FI，0-4h和0-24h)和体重(BW，0-24h)结果示于下表2中，表示为平均值±SEM(n＝8-10)。

表2

7.5******的诱导

使用所选肽来评估本发明的肽在雄性大鼠中诱导******(PE)的能力。将重250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠保持在12小时亮/暗光循环中，且食物和水无限制。所有行为研究都在上午9时与下午4时之间实施。经由皮下注射途径向具有6-8只大鼠的组给药不同剂量的肽。在处理后，立即将大鼠置于单独聚苯乙烯笼(长27cm，宽16cm，且高25cm)中以进行行为观察，通常通过远程视频监测(具有CCD摄影机的高速数字视频记录***EVS-DSX-16000DVD-H，Epic Systems Inc.，St.Louis，MO，USA)来观察，之后对视频记录进行离线盲法评分。观察大鼠1小时，且记录每10分钟时段内打哈欠、理毛行为和PE的次数。

使用1.0-3.0mg/kg皮下注射的实施例43、46和67以及参照实例2的研究的PE结果示于下表3中，表示为PE/大鼠的总数、平均值±SEM(n＝7-11)和每组中在研究期间表现至少一次***的大鼠数量(响应者％)。平行测定相应载体对照(3.2％甘露醇/50mM Tris缓冲液)。

表3

治疗	剂量(mg/kg，s.c.)	n	PE/rat 0-1h的总数	响应者％
					载体		11	1.0±0.27	64
参照实施例2	3.0	7	6.0±0.44	100
					实施例43	1.0	7	1.7±0.36	29
	3.0	7	6.0±0.76	100
					实施例46	1.0	7	4.9±1.1	100
	3.0	7	4.4±1.1	86
					实施例67	1.0	7	2.3±0.42	86
	3.0	7	3.3±1.0	100

8.0高密度和低密度hMC4-R功能性测定结果

如上文7.3部分中所述使用高密度和低密度hMC4-R功能性测定来测试例示性肽，结果展示于下表4中。表4包括单点值和平均值。

表4

认为在上述高密度hMC4-R体系(即经10ng/ml多西环素处理的HEK293TRexMC4R细胞)中，基于化合物在相同高密度hMC4-R体系中可实现的对腺苷酸环化酶的最大刺激(其中将α-MSH或NDP-α-MSH可实现的最大刺激指定为固有活性为1.0(100％))，表现出固有活性等于或大于约0.1(10％)(例如大于0.2(20％)或大于约0.3(30％)或大于约0.4(40％)或大于约0.5(50％)或大于约0.6(60％)％)或大于约0.7(70％)，或大于约0.8(80％)、或大于约0.9(90％)、或等于或大于约1.0(100％))的本发明的肽可提供针对MC4受体的激动剂(完全或部分)活性。

在上述高密度hMC4-R体系(即经10ng/ml多西环素处理的HEK293TRexMC4R细胞)中所测试的各实施例的肽中，大多数肽在所述测定中所得针对cAMP产生的EC₅₀值小于0.05μM，例如小于0.01μM，且尤其小于0.001μM。

从表4可以看出，本发明的肽在低密度hMC4-R体系中可能缺乏固有活性，且在高密度hMC4-R体系中可为完全激动剂。

从表4中还可看出，本发明的肽在上述低密度hMC4-R体系中可为部分激动剂且在上述高密度hMC4-R体系中可为完全激动剂。

从表4中还可以看出，本发明的肽在低密度hMC4-R体系和高密度hMC4-R体系中都可为完全激动剂。

不受限于任何理论，认为与在低和高密度hMC4-R体系中都是完全激动剂的肽相比，在上述低密度hMC4-R体系中缺乏固有活性或是部分激动剂的肽(即在低密度hMC4-R体系中固有活性为0至70％的肽)和在上述高密度hMC4-R体系中是部分或完全激动剂的肽(即在高密度hMC4-R***中固有活性等于或大于10％或大于70％的肽)可消除或降低因MC4受体激活所致的性效应(例如******)程度。如上文所阐释，认为在治疗与能量稳态和代谢相关、与食物摄取相关和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症时这些性效应是不期望的副作用。

因此相信，本发明的肽具有有希望的MC4受体亲和性、可用于治疗以下疾病、障碍和/或病症的效力和效能：响应MC4受体激活的疾病、障碍和/或病症，尤其与能量稳态和代谢相关(例如糖尿病)、与食物摄取相关和/或与能量平衡和体重相关的疾病、障碍和/或病症，包括肥胖症、过重和与肥胖症和/或过重有关的疾病、障碍和/或病症，例如II型糖尿病和代谢综合症。

尽管已特别参考这些优选实施方式详细阐述本发明，但其它实施方式可实现相同结果。本发明的变化和修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的，且本发明旨在涵盖所有这些修改和等效形式。

Claims

1.一种环肽，所述环肽为Ac-Arg-环(Glu-Pro-D-Phe(4-F)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO:72)或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的环肽，其为乙酸盐。

3.根据权利要求1所述的环肽，其为三氟乙酸盐。

4.一种环肽，所述环肽为下式或其药学上可接受的盐：

5.根据权利要求4所述的环肽，其为乙酸盐。

6.根据权利要求4所述的环肽，其为三氟乙酸盐。

7.一种药物组合物，其包含根据权利要求4所述的环肽或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

8.一种环肽，所述环肽为Ac-Arg-环(Glu-Gln-D-Phe(4-CN)-Arg-Trp-Orn)-NH₂(SEQ ID NO:51)或其药学上可接受的盐。

9.根据权利要求8所述的环肽，其为乙酸盐。

10.根据权利要求8所述的环肽，其为三氟乙酸盐。

11.一种环肽，其为以下结构或其药学上可接受的盐：

12.根据权利要求11所述的环肽，其为乙酸盐。

13.根据权利要求11所述的环肽，其为三氟乙酸盐。

14.一种药物组合物，其包含根据权利要求8或权利要求11所述的环肽或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

15.根据权利要求1-6或8-13中任一项所述的环肽在制备用于治疗响应MC4受体的激活的疾病、障碍和/或病症的药物中的用途。