ITMI20011057A1 - Preparazione ed uso di peptidi ciclici e ramificati e loro deriati marcati come agenti terapeutici agonisti o antagonisti della colecistochi - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“PREPARAZIONE ED USO DI PEPTIDI CICLICI E RAMIFICATI E LORO DERIVATI MARCATI COME AGENTI TERAPEUTICI, AGONISTI O ANTAGONISTI DELLA COLECISTOCHININA E COME AGENTI DIAGNOSTICI PER L’INDIVIDUAZIONE E LA LOCALIZZAZIONE DI TUMORI”

La presente invenzione riguarda peptidi ciclici e ramificati aventi formula generale (I) e i loro derivati coniugati con una molecola spaziatrice Y ed un agente chelante C, marcati con un metallo paramagnetico o radioattivo.

I composti oggetto della presente invenzione vengono utilizzati sia come agenti diagnostici per l’individuazione e la localizzazione di tumori umani primari e loro metastasi, che sovraesprimono i recettori della colecistochinina di tipo A e/o di tipo B, che come agenti terapeutici agonisti o antagonisti della colecistochinina.

Le colecistochinine (CCK) costituiscono una famiglia di molecole di natura peptidica che esplica la propria azione biologica sia come ormone che come neurotrasmettitore. Le CCK hanno tutte origine da un processo di frammentazione che ha luogo su un preormone costituito da 115 residui amminoacidici e a cui segue un processo post-translazionale di alfaammidazione del residuo di fenilalanina C-terminale e, talvolta, di solfatazione del residuo di tirosina contenuto nella porzione C-terminale. Le colecistochinine esistono quindi in diverse forme molecolari, le più importanti presentano una sequenza di 58, 39, 33 o 8 residui amminoacidici e sono comunque tutte caratterizzate dalla stessa sequenza C-terminale di 8 residui amminoacidi:

Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met- Asp-Phe-ammide .

La forma contenente solo questa sequenza è nota come CCK8.

L’attività biologica della colecistochinina dipende dal tipo di recettore con cui interagisce. Sono noti due tipi di recettori: il recettore di tipo A ed il recettore di tipo B. In situazioni non patologiche il recettore di tipo A è presente in tessuti di organi periferici come stomaco, cistifellea, intestino e pancreas. Le più importanti azioni fisiologiche dovute all’ interazione dell’ormone peptidico CCK con il recettore di tipo A sono: contrazione della cistifellea, secrezione di enzimi pancreatici, regolazione di secrezione e assorbimento nel tratto gastrointestinale. Il recettore di tipo B è prevalentemente presente invece nel Sistema Nervoso Centrale dove l’interazione con la colecistochinina provoca analgesia, sazietà, ansietà e regola il rilascio di dopamina.

Entrambi i recettori delle colecistochinine appartengono alla classe di G-Protein Coupled Receptors (GPCRs), recettori di membrana caratterizzati da sette eliche trans-membrana uniti da loop intra ed extra cellulari con un braccio N-terminale extracellulare e la parte C-terminale intracellulare. Entrambi i recettori possiedono alta affinità per le varie forme della colecistochinina, comunque il recettore di tipo A possiede una più elevata affinità per le forme solfatate di colecistochinine, quelle cioè che contengono un gruppo solforico sul residuo di Tyr 27, mentre il recettore di tipo B possiede alta affinità sia per le varie forme di colecistochinina non solfatate che per la gastrina. Ad oggi sono note una serie di molecole analoghe della colecistochinina sia di natura peptidica che non (P. De Tullio, Current Medicinal Chemistry, 6, 433, 1999; F. Noble, Progress in Neurobiology, 58, 349, 1999), con attività agonista o antagonista sia per il recettore di tipo A che per quello di tipo B. Nessuna delle molecole note ha trovato comunque applicazione farmacologica a causa di una bassa biodisponibilità e dovuta o a scarsa solubilità o ad alta degradazione enzimatica.

Inoltre recentemente è stata individuata la presenza dei recettori delle colecistochinine in tumori umani, sia primari che metastasi (J.C. Reubi, Cancer Research, 57, 1377, 1997, W09731657). Sia nell’articolo che nel brevetto citato di J. C. Reubi viene descritto in particolare l’utilizzo di peptidi funzionalizzati e marcati con metalli radioattivi come <125>I (Biochemical Journal, 89, 114-123, 1963), <1H>In o <115>In ed utilizzati nella medicina nucleare, per la visualizzazione di tumori umani.

In particolare il recettore di tipo A è trovato sovraespresso in tumori pancreatici e dell’esofago mentre il recettore di tipo B è stato individuato sovraespresso nel tumore delle piccole cellule del polmone, in tumori del colon e del tratto gastrointestinale, in tumori midollari della tiroide, in astrocitomi e in tumori ovarici stromali.

Sono oggetto di studi clinici alcuni peptidi derivati della colecistochinina modificati con agenti chelanti di metalli radioattivi o paramagnetici. In particolare sono riportati (M. De Jong, The Journal of Nuclear Medicine, 40, 2082, 1999) derivati del CCK8 contente i chelanti DTP A o DOTA complessanti metalli radioattivi come <lu>In o <90 >Y e la loro applicazione per l’individuazione e la terapia di tumori che sovraesprimono il recettore di tipo B della colecistochinina.

E stata recentemente pubblicata (M. Pellegrini, Biochemistry, 38, 14775, 1999) la struttura NMR del complesso fra il peptide CCK8 non solfatato e la parte N-terminale del recettore delle colecistochinine di tipo A responsabile dell’interazione con l’ormone peptidico. La parte N-terminale del recettore (frammento del recettore) è costituita da 47 amminoacidi e rappresenta il braccio N-terminale extracellulare e la prima parte dell’elica transmembrana 1 del recettore di tipo A. Questo frammento non contiene il residuo di Arg 197, presente su loop trans-membrana, responsabile dell’interazione conjl gruppo solforico della Tyr 27 del CCK8 e pertanto il peptide CCK8 utilizzato non è nella forma solfatata (V. Gigoux, Protein Science, 8, 2347, 1999). Oltre alle dettagliate informazioni strutturali indicate dallo studio NMR, una recente indagine ottenuta osservando variazioni della fluorescenza di residui di Triptofano presenti sul frammento del recettore e sul peptide conferma il binding (R. Ragone, Biopolymers, 2001, in stampa) e consente di determinare la costante di affinità tra il CCK8 non solfatato ed il frammento del recettore.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

I composti oggetto della presente invenzione sono peptidi ciclici di formula generale (I):

m cui:

Xaa è un qualunque amminoacido o un peptide costituito da amminoacidi Xaa indipendentemente uguali o diversi tra loro;

Xbb è un alfa o beta amminoacido, contenente almeno tre gruppi funzionali scelti nel gruppo costituito da:

-COOH, -NH2, -SH O -OH,

n è compreso tra 0 e 15; e

m è compreso tra 2 e 12.

Xbb è preferibilmente scelto nel gruppo costituito da:

Lys, Asp, Giu, Cys, Om, Dap, Dab, Gaba, epsilon-Aca, delta-Ava.

L’invenzione riguarda inoltre i composti di formula (I) marcati, attraverso l’utilizzo di un gruppo chelante o direttamente, con metalli radioattivi, paramagnetici o con alogeni radioattivi e i sali degli stessi con basi organiche o inorganiche fisiologicamente accettabili oppure con anioni di acidi organici o inorganici fisiologicamente accettabili.

Preferibilmente almeno uno degli amminoacidi Xaa è un residuo di metionina (Met), di tirosina (Tyr) o di tirosina-m-solfonata (S03H-Tyr).

Nel caso sia presente il gruppo solfato sul residuo di tirosina (Tyr o S03H-Tyr), viene favorita l’interazione con il recettore della colecistochinina di tipo A; viceversa un residuo di tirosina (Tyr o S03H-Tyr) non solfatato favorisce l’interazione con il recettore della colecistochinina di tipo B.

Il termine “qualunque amminoacido” precedentemente utilizzato si riferisce agli isomeri L e D sia di amminoacidi naturali sia di amminoacidi “non proteici” comunemente adoperati nella chimica dei peptidi per la preparazione di analoghi sintetici di peptidi naturali, ad esempio Alfaamminoacidi sostituiti e non sostituiti nelle posizioni alfa e beta sia di configurazione L che D ed amminoacidi alfa-beta insaturi.

Esempi di amminoacidi “non proteici” sono norleucina, norvalina, alloisoleucina, allotreonina, omoarginina, tioprolina, deidroprolina, idrossiprolina, acido pipecolico, acido azetidinico, omoserina, cicloesilglicina, acido alfa-ammino-n-butirrico, cicloesilalanina, acido amminofenilbutirrico, fenilalanine mono e di sostituite nelle posizioni orto, meta e para dell’anello aromatico, derivati O-alchilati della serina, treonina e tirosina, cisteina S-alchilata, lisina epsilon-alchilata, omitina delta-alchilata, amminoacidi aromatici, sostituiti nelle posizioni meta o para dell’anello quali fenilalaninanitrato, -solfato, -fosfato, -acetato, -carbonato, -metisolfonato, -metilfosfonato, tirosina-solfato, -fosfato, -solfonato, -fosfonato, para-amido-fenilalanina amminoacidi C-alfajilfa-dialchilati quali alfa,alfa-dimetilglicina (Aib), acido alfa-amminociclopropan-carbossilico (Ac3c), acido alfa-amminociclobutancarbossilico (Ac4c), acido alfa-amminociclopentancarbossilico (Ac5c), acido alfa-amminocicloesancarbossilico (Ac6c), dietilglicina (Deg), dipropilglicina (Dpg), difenilglicina (Dph). Esempi di beta-amminoacidi sono beta-alanina (beta- Ala), acido 2,3-diamminopropionico (Dap) cis e trans.

Altri amminoacidi non proteici sono identificati nel sito Internet: httn://CHEMLIBRARY.BRI.NRC.CA/.

Composti preferiti di formula (I), sono quelli in cui :

a) m è un numero intero da 4 a 8, n è un numero intero da 3 a 5, e tra gli amminoacidi Xaa sono compresi almeno un residuo di metionina e un residuo di tirosina nella forma solfonata o non solfonata;

b) m è un numero intero da 4 a 8, n è un numero intero da 3 a 5, e tra gli amminoacidi Xaa sono compresi almeno un residuo di metionina, un residuo di tirosina nella forma solfonata o non solfonata e un residuo di lisina;

c) m è un numero intero da 4 a 8, n è un numero intero da 3 a 5, e tra gli amminoacidi Xaa sono compresi almeno un residuo di metionina, di tirosina nella forma solfonata o non solfonata e di lisina o di un aminoacido scelto tra omitina, acido aspartico e acido glutammico.

Composti particolarmente preferiti sono i peptidi di formula generale (Π):

in cui;

m corrispondeva 4;

n è un numero intero compreso tra 3 e 5;

Xaal e/o Xaa2 possono essere assenti;

Xaa3 corrisponde a Asp o Giu;

Xaa4 corrisponde a Tyr o S03H-Tyr;

Xaa 10 corrisponde a Phe o ad un aminoacido scelto tra Leu, Ile, Val, Ala, Trp, Gly e Pro.

Più particolarmente preferiti sono i peptidi di formula (III)-VIII):

I composti dell’invenzione vengono sintetizzati con tecniche note, quali sintesi peptidica in fase solida, sintesi peptidica in soluzione, metodiche sintetiche di chimica organica, oppure con una qualunque combinazione fra di esse. Di preferenza sono utilizzate metodiche sintetiche basate su appropriate combinazioni di tecniche in fase solida e di metodi classici in soluzione, che comportano bassi costi produttivi, in particolare su scala industriale. Nel dettaglio tali metodiche consistono nella sintesi in fase solida del peptide comprendente la ramificazione grazie all’ utilizzo di amminoacidi protetti con funzioni ortogonali, eventuale coniugazione in fase solida del macrociclo, distacco dalla resina del peptide protetto, ciclizzazione in soluzione in concentrazioni diluite e purificazione del composto.

I composti preparati e in accordo con la formula generale (I) possono essere marcati, attraverso l’utilizzo di un gruppo chelante o direttamente, con metalli radioattivi, paramagnetici o con alogeni radioattivi.

Sono ulteriore oggetto della presente invenzione i composti di formula generale (IX):

in cui

A rappresenta un peptide di formula generale (I);

z è un numero intero che va da 0 a 5,

Y rappresenta una catena spaziante legata rispettivamente ad una delle funzionalità presenti sulle catene laterali dei singoli aminoacidi presenti nel peptide A, oppure ad un gruppo N-terminale (gruppo -NH2) o C-terminale (gruppo -C02H) di A e a C; nel caso in cui z sia un intero da 2 a 5, le unità Y possono essere uguali o diverse l’una dall’altra;

C rappresenta un agente chelante, legato covalentemente alla catena spaziante Y o direttamente al peptide A, o a più unità amminoacidiche del peptide A e

capace di complessare un metallo paramagnetico o un radioisotopo.

Y è preferibilmente un gruppo di formula:

in cui

r, 1, e q indipendentemente tra loro possono assumere i valori di 0 o 1 , p può variare tra 0 e 10, con la condizione che almeno uno di 1, r, e q sia diverso da zero;

X rappresenta un atomo di O, o un gruppo -NR dove R è un atomo di H o un gruppo alchile (C1-C5);

K rappresenta un nucleo benzenico, sostituito o no, oppure un gruppo -CHRi

dove Ri rappresenta un atomo di idrogeno oppure un gruppo -COOH o -SO3H;

W rappresenta un gruppo -CO- o -CS-.

Composti preferiti di formula (IX), sono quelli in cui le catene spazianti Y hanno le seguenti formule (X), (XI) e (XII).

Sono particolarmente preferiti i composti (IX) in cui Y rappresenta uno dei (XI) e (XII) vengono gruppi seguenti :

C rappresenta preferibilmente un gruppo chelante scelto nel gruppo costituito da:

un residuo di un acido poliamminopolicarbossilico e i suoi derivati, in particolare scelto tra acido dietilentriamminopentaacetico (DTP A), acido 1.4.7.10-tetraazaciclododecan-l,4,7,10-tetraacetico (DOTA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-l,4,7-triacetico (D03A), acido [10-(2-idrossipropil)-1.4.7.10-tetraazaciclododecan-l,4,7-triacetico (HPD03A), acido 4-carbossi-5,8,ll-tris(carbossimetil)-l-fenil-2-ossa-5,8,ll-triazatridecan-13-oico (BOPTA), N-[2-[bis(carbossimetil)ammino]-3-(4-etossifenil)propil]-N-[2-[bis(carbossimetil)ammino]etilglicina (EOB-DTPA), N,N-bis[2-[(carbossimetil)[(metilcarbamoil)metil] animino] etil] glieina (DTPA-BMA), acido 2-metil- 1 ,4,7, 10-tetraazaciclododecan- 1 ,4,7,10-tetraacetico (MOTA), acido (a,a',a",a'")-tetrametil- 1 ,4,7, 10-tetraazaciclododecan- 1 ,4,7, 10-tetracetico (DOTMA); oppure è il residuo di un legante acido poliamminofosfato o di suoi derivati, in particolare acido N,N'-bis-(piridossal-5-fosfato)etilendiammina-Ν,Ν'-diacetico (DPDP) e acido etilenedinitrilotetrakis(metilfosfonico) (EDTP); oppure è il residuo di un legante acido poliamminofosfonico e di suoi derivati, o acido poliamminofosfmico e suoi derivati, in particolare acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano- 1 ,4,7, 10-tetrakis[metilen(metilfosfonico)] e acido 1.4.7. 10-tetraazaciclododecano- 1 ,4,7, 10-tetrakis [metilen(metilfosfmico)] ; oppure è il residuo di chetanti macrociclici come le texafirine, le porfirine e le ftalocianine; oppure è acido N,N-bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]L-glutammico (DTPA-GLU) o DTPA coniugato con Lys (DTPA-Lys).

L'aggancio del peptide ciclico e/o ramificato A al gruppo chelante C, può avvenire direttamente con un legame covalente tra due gruppi funzionali di A e C, oppure tramite la catena spaziante Y e può essere ottenuto ad esempio con i gruppi acidi del legante, oppure tramite un opportuno gruppo reattivo presente nel legante di partenza, ad esempio un gruppo amminico, oppure un gruppo funzionale presente su un fenile, etc.

I gruppi reattivi particolarmente preferiti e presenti su C o Y, sono scelti nel gruppo costituito da -C02H, -NH2, -NCS, -NHCSNHNH2, -NHCSNH(CH2)2NH2, -NCO, -NHNH2, -NHCONHNH2, -CHO.

Particolarmente preferiti sono i composti di formula (IX) in cui C è un residuo del legante DTP A, D03A o DOTA.

Ulteriori esempi di gruppi chelanti C, utilizzabili in particolare come chelanti di radionuclidi (ad es. Tc, Re, Cu, Ga) sono amino/amidi tiolo derivati rappresentabili dalla formula generale (XIII), in cui J è compreso nell’ intervallo 0÷2 e ha generalmente valore unitario.

(N amino/amido)4.j (S tiol derivato); (XIII)

Gruppi chelanti preferiti di formula (XIII) includono N4 amino propilen ossime, diaminediossime, idrazine, N3S triamide monotioli, N2S2 diamido ditioli, diamine ditioli, monoamide monoamineditioli e monoamine monoamideditioli .

Sono note in letteratura un elevato numero di applicazioni dei composti chelanti di formula (XIII) marcati con Tecnezio o Renio.

Residui preferiti di chelanti C di ioni di metalli e in particolare di Renio o Tecnezio di formula (XIV a), (XIV b), (XIV c) e (XV) sono descritti rispettivamente in EP629617, EP544412, US5663307 e US5651954, il cui contenuto è qui incorporato per riferimento, in particolare per quanto riguarda le definizioni dei gruppi Q, R, R*, G1,G2 e RI.

Un ulteriore esempio di un composto utilizzabile come gruppo chelante C di formula (XlIIÌ^è la dimetilglicina-L-serina-L-cisteinilglicinamide (XVI), dimostratasi di notevole interesse e adatta all’utilizzo come legante bifunzionalizzato sia per la coniugazione a peptidi e proteine che per la complessazione del radionuclide <99m>Tc o <188>Re. Altri derivati utilizzabili come gruppi chelanti C sono descritti in W09933863, il cui contenuto è qui incorporato per riferimento.

dei gruppi chelanti di formula (XIII) consente di utilizzarli come coniugati legati con legami di tipo covalente per una vasta gamma di molecole biologicamente attive.

In particolare, nella preparazione dei composti di formula (IX) utilizzati nella diagnostica per medicina nucleare, i composti chelanti C vengono selezionati in modo che consentano di ottenere dei corrispondenti complessi stabili con i radioisotopi che emettono radiazioni gamma, beta o positroni, utilizzando ad esempio i radioisotopi di Tc, Re, Tl, In, Cu, Ga, Rb o Y.

È noto l’utilizzo nella diagnostica della medicina nucleare del <99m>Tc, che comporta una serie di vantaggi tali da renderlo uno dei radionuclidi più utilizzati. La sua emivita di 6 ore è infatti un tempo sufficientemente breve per la somministrazione di una dose di radiazione che consente di ottenere una buona qualità delle immagini senza compromettere la salute del paziente.

Inoltre sono sfate sviluppate molte tecniche che consentono di legare il Tc a diverse molecole ad attività biologica quali ad esempio anticorpi, proteine e peptidi.

Generalmente il legame della molecola al radionuclide viene realizzata con una delle seguenti metodiche:

a) legame diretto del radionuclide alla molecola interessata, che viene realizzato ad esempio con l’utilizzo di un agente riducente che consenta di ridurre i ponti disolfuro di un peptide o di una proteina a due gruppi idrosolfuro, che legano direttamente il Tc(V);

b) utilizzo di un chelante C del tipo descritto in precedenza, generalmente bifunzionalizzato, in cui una funzionalità viene utilizzata per il legame diretto al peptide (o al composto in accordo con la formula generale Y, coniugato ad A) e l’altra per la complessazione con il radionuclide che viene realizzata a seconda dei casi prima o dopo del legame con la molecola biologicamente attiva (preformed-chelate or fìnal-steplabeling method).

La preparazione del complesso radioattivo viene realizzata con metodi noti in letteratura e ad esempio per reazione del composto chelante funzionalizzato con un sale, in cui viene preferibilmente utilizzato Tc-99m pertecnetato, in presenza di un opportuno agente riducente.

Tra gli agenti riducenti utilizzati vi sono quelli noti in letteratura e ad esempio il ditionito, gli ioni ferroso e stannoso (ad es. tartrato, cloruro, fluoruro) o altri agenti riducenti allo stato solido.

Generalmente la preparazione di questo tipo di complessi avviene utilizzando un kit diagnostico inattivo, preventivamente preparato in condizioni asettiche_che contiene sia una quantità predefinita ed in polvere liofilizzata del composto coniugato con il chelante, che di agente riducente, entrambi formulati in presenza di opportuni agenti stabilizzanti, tensioattivi e/o tamponi che possono essere utilizzati nella preparazione del bulk farmaceutico.

Generalmente la soluzione contenente il chelante viene opportunamente formulata e successivamente ripartita in flaconi che vengono liofilizzati e chiusi in atmosfera di azoto per garantire il mantenimento delle proprietà dell’agente riducente (ad es. cloruro stannoso) presente nella composizione.

I kit inattivi preparati vengono successivamente ricostituiti ad esempio con una soluzione di sodio pertecnetato in modo da formare i corrispondenti complessi con <99m>Tc, utilizzati nella diagnostica radiologica per esami funzionali e morfologici di organi del corpo umano e in particolare per i composti oggetto della presente invenzione utilizzati nell’imaging di tumori che sovraesprimono i recettori della colecistochinina.

L’uso di isotopi radioattivi del Renio in alternativa a quelli del tecnezio è stato proposto da Wong et al. (Wong, Inorganic Chemistry, voi. 36, 5799-5808, 1997) soprattutto nello stato di coordinazione (V) e gli isotopi <186>Re e <188>Re si sono dimostrati di grande interesse nella medicina nucleare trovando un elevato numero di applicazioni nella terapia radiofarmaceutica.

Un’ulteriore classe di composti chelanti C, adatti alla coniugazione con i composti dell 'invenzione ed utilizzabili non solo come chelanti di metalli paramagnetici (imaging MRI) ma anche di metalli radioattivi (radioterapia o radiodiagnosi) è costituita dai poliazamacrocicli di formula (XVII). Questi composti chelanti contengono almeno un gruppo amminico, tiolico, carbossilico, carbossilico derivato o un tiocarbossilato presente come funzionalità libera ed adatta ad essere utilizzata nella reazione di coniugazione alla catena spaziante Y o al peptide A e in accordo con la formula generale (IX).

?19 3⁄4>

G-(R"R'qP^ j \ ^,(CR'R")m-G

<R>i8-p<'N N^>T— 3⁄4

-Λ T >

G(R"R'Qo <*>Q —

**14 **16

(XVII)

Per una descrizione completa dei composti di formula (XVII) si rimanda al brevetto US6093382, qui incorporato per riferimento.

I composti (I) e (IX) possono formare chelati complessi con gli ioni bitrivalenti degli elementi metallici aventi numero atomico variabile fra 20 e 31, 39, 42, 43, 44, 49, o fra 57 e 83, con isotopi radioattivi di metalli o alogeni (<i23>I, <125>I, <131>I, <75>Br, <76>Br, <74>Br, <77>Br e <82>Br) o metalli paramagnetici (<99m>Tc, <203>Pb, <67>Ga, <68>Ga, <72>As, <11 >'In, <113>In, <90>Yt, <97>Ru, <82m>Rb, <62>Cu, <64>Cu, <52>Fe, <52m>Mn, <140>La, <175>Yb, <153>Sm, <166>Ho, <149>Pm, <177>Lu, <142>Pr, <159>Gd, <212>Bi, <47>Sc, <149>Pm, <67>Cu, <lu>Ag, <199 >Au, <188>Re, <186>Re, <161>Tb e <51>Cr) eventualmente come sali con basi o acidi fisiologicamente compatibili.

Particolarmente preferiti sono i complessi con Fe(2+), Fe(3+), Cu(2+), Cr(3<+>), Gd(3+), Eu(3+), Dy(3+), La(3+), Yb(3+) o Mn(2+) o con radioisotopi come SlCr, 67Qa, 68Ga, Hlln, 99mTCj 140La, 175γ3⁄4, 153sm, 166H0, 90γ? 149pm} 177Lu> 47SC, 142PT5 159Gd e 212Bi.

Cationi preferiti di basi inorganiche adatte a salificare i complessi dell’ invenzione comprendono in particolare gli ioni di metalli alcalini o alcalino-terrosi quali potassio, sodio, calcio, magnesio.

Cationi preferiti di basi organiche comprendono quelli di animine primarie, secondarie e terziarie quali, ad esempio, etanolammina, dietanolammina, morfolina, glucammina, N-metilglucammina, N,N-dimetilglucammina.

Anioni preferiti di acidi inorganici comprendono, in particolare, gli ioni degli acidi alogenidrici quali cloruri, bromuri, ioduri o altri ioni quali ad es. solfato.

Anioni preferiti di acidi organici comprendono quelli di acidi normalmente impiegati in tecnica farmaceutica per la salificazione di sostanze basiche, quali ad esempio, acetato, succinato, citrato, fumarato, maleato, ossalato.

Cationi ed anioni preferiti di amminoacidi comprendono, ad esempio, quelli di taurina, glieina, lisina, arginina o or o dell'acido aspartico e glutammico.

I composti (I) e (IX) sono utili anche come agonisti o antagonisti della colecistochinina e, a seguito della marcatura attraverso l’utilizzo di un gruppo chelante o direttamente con metalli radioattivi, paramagnetici o con alogeni radioattivi, come agenti terapeutici e diagnostici per l’individuazione e la localizzazione di tumori umani, primari e loro metastasi, che sovraesprimono i recettori di tipo A e/o di tipo B della colecistochinina. È possibile che al binding al recettore faccia seguito un processo di intemalizzazione nelle cellule.

In particolare i composti di formula (IX) marcati con metalli paramagnetici, si sono rivelati utili agenti di contrasto per la risonanza magnetica e in particolar modo per l"'imaging" di cellule tumorali animali che sovraesprimono i recettori della colecistochinina di tipo A e/o di tipo B.

I composti (I) presentano particolari caratteristiche tali da renderli adatti agli scopi sopra indicati in cui:

a) assumono una struttura in soluzione tale da poter interagire con i recettori della colecistochinina di tipo A e/o di tipo B in modo specifico e con affinità almeno comparabile con il CCK8;

b) grazie alla presenza del ciclo, risultano particolarmente stabili alla degradazione enzimatica in condizioni fisiologiche;

c) assumono una conformazione tale per cui la presenza di un eventuale sostituente chelante non interferisce con il binding al recettore.

I composti di formula (IX) possono essere preparati con metodi di sintesi convenzionali. In particolare, l'ottenimento di un composto di formula (IX) è realizzabile mediante una sintesi convergente che prevede:

1) sintesi di un legante funzionalizzato, ovvero di un legante capace di coordinare uno ione metallico paramagnetico o l’isotopo di un metallo radioattivo, in grado allo stesso tempo di legarsi stabilmente e direttamente al peptide o mediante un opportuno gruppo funzionale;

2) sintesi del peptide;

3) reazione di aggancio tra i due diversi sintoni, anche con utilizzo della unità spaziatrice Y;

4) sblocco degli eventuali gruppi protettivi;

5) complessazione con lo ione di un metallo paramagnetico o radioattivo.

La coniugazione dei due sintoni avviene attraverso diversi metodi noti d'aggancio, largamente utilizzati in sintesi (vedi ad es. Brinkley, M., Bioconjugate Chem. 1992, 3, 2), che prevedono ad esempio la formazione di un'ammide, di una tiourea o di un estere.

Sono inoltre noti alogeni radioattivi utilizzati sia in terapia che in diagnostica. Per esempio lo <123>I è noto per il suo utilizzo nell’imaging mentre <131>I può essere utilizzato oltre che nell’imaging preferibilmente in terapia. I radionuclidi del bromo <75>Br e <76>Br sono utilizzati nella diagnosi mentre <77>Br viene utilizzato nella radioterapia. <18>F e <211>At vengono utilizzati nella diagnostica e in radioterapia.

Nel caso in cui il radionuclide sia un isotopo di un alogeno radioattivo, può essere legato direttamente al peptide (I), per reazione con un residuo di Trp o di Tyr.

I metodi di marcatura con gli isotopi dello iodio comprendono oltre alla iodurazione diretta con metodi ossidativi, la reazione di sostituzione nucleofila e la reazione di scambio isotopico. La scelta del metodo di marcatura in tal caso viene realizzata in funzione della struttura del precursore, delle problematiche legate alle tecniche di purificazione e alla economicità del processo utilizzato.

Un esempio di un metodo di marcatura con alogeni radioattivi indiretto che può essere utilizzato con i composti di formula (I) è descritto in US5290937, qui incorporato per riferimento, e consente di ottenere proteine radiomarcate aventi formula (XVIII)

CHJn

-<

O-aLkyl

OH

(xvm)

in cui X è un radionuclide selezionato tra <125>I, <131>I, <123>1, <75>Br, <76>Br e <77>Br e A ha il significato precedentemente descritto per i composti di formula (I).

L’utilizzo dei corrispondenti composti marcati con radioisotopi che emettono raggi-gamma o particelle alfa o beta consente di veicolare al sito di interesse una quantità di prodotto tale da avere un effetto citotossico. Il decadimento radioattivo dell’isotopo viene generato al sito di binding del tumore e determina una presenza di radiazione ionizzante localizzata e in quantità sufficiente da risultare tossica per le cellule tumorali.

La specificità del binding per le cellule che sovraesprimono i recettori della colecistochinina consente a questi composti di minimizzare l’esposizione delle cellule normali agli agenti citotossici consentendo un efficace trattamento con minori effetti collaterali.

Per i composti di formula (I) e (IX), sia i composti solubili sia quelli meno solubili sono adatti per la somministrazione orale o parenterale.

Per somministrazione parenterale sono preferibilmente formulati come soluzione o sospensione acquosa sterile, il cui pH può variare per esempio tra 6.0 e 8.5.

Tali soluzioni o sospensioni acquose possono essere somministrate in concentrazioni variabili tra 0.002 e 1.0 molare.

Tali formulazioni possono essere liofilizzate in forma di polveri da ricostituire al momento dell'uso. Per uso gastrointestinale o per iniezione nelle cavità corporee, tali agenti possono essere formulati come una soluzione o sospensione contenente opportuni additivi adatti per esempio a controllarne la viscosità.

Per somministrazione orale possono venire formulati secondo metodi di preparazione comunemente impiegati in tecnica farmaceutica eventualmente anche come formulazione ricoperta in modo da avere una protezione addizionale contro il pH acido dello stomaco, essendo in tal modo impedito il rilascio dello ione metallico chelato, che si verifica particolarmente ai valori di pH tipici dei succhi gastrici.

Altri eccipienti, come ad esempio edulcoranti e/o aromatizzanti possono essere ugualmente aggiunti secondo tecniche note.

I composti di formula (I) e (IX), opportunamente formulati, sono particolarmente utili per la visualizzazione di tumori pancreatici e dell’esofago e di altri tumori che sovraesprimono i recettori della colecistochinina di tipo A oltre che di tumori delle piccole cellule del polmone, del colon, del tratto gastrointestinale, di tumori midollari della tiroide, di astrocitomi, tumori ovarici stromali e altri tumori che sovraesprimono i recettori della colecistochinina di tipo B.

Nella parte sperimentale viene riportata la sintesi del composto di formula (IV).

H-Asp-Tyr-Met-E&p-Trp-Met-Asp-Fhe-llys (^0

Il composto di formula (IV) mostra un comportamento conformazionale simile a quello esistente nel complesso NMR tra il peptide CCK8 e il recettore CCK-A.

In figura 1 vengono mostrate:

a) la struttura del peptide CCK8 assunta nel complesso con il frammento N-terminale L-47 del recettore CCK di tipo A come riportato da M. Pellegrini in Biochemistry, 38, 14775, 1999; e

b) la struttura prevista per il composto ciclico di formula (IV).

La struttura del complesso fra il peptide CCK8 non solfatato e la parte N terminale del recettore delle colecistochinine di tipo A, responsabile dell’interazione con l’ormone peptidico, è depositata nel protein Data Bank (http://www.rcsb.org"> con sigla “pdblDóG.ent”. La parte N terminale del recettore (filamento del recettore) è costituita da 47 residui amminoacidi e rappresenta il braccio N terminale extracellulare e la prima parte dell’elica transmembrana 1 del recettore di tipo A.

Anche lo studio della struttura del complesso: frammento 1-47 del recettore CCK di tipo A e il peptide CCK8, ottenuta con la spettroscopia NMR e il successivo studio del binding ottenuto con la spettroscopia di fluorescenza sono stati effettuati utilizzando il peptide CCK8 nella forma non solfatata.

Elenco delle abbreviazioni

Per la nomenclatura e le abbreviazioni degli amminoacidi si fa riferimento alle raccomandazioni della IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical nomenclature (Eur. J. Biochem. 1984, 138, pp 9); gli amminoacidi si intendono nella configurazione L se non altrimenti specificato. Le altre abbreviazioni usate sono:

Om = omitina, Nle, norleucina, Hyp = idrossiprolina, delta-Pro = deidroprolina, delta-Glu = acido alfa-beta-deidroglutammico, alfa-Me-Glu = acido alfa-metil-glutammico, Cha = cicloesilalanina, alle = alloisoleucina, Chg = cicloesilglicina, Sar = sarcosina, Deg = dietilglicina, Dpg = dipropilglicina, Aib = acido alfa-amminoisobutirrico, Dap = acido 2,3 diamminopropionico, Dab = acido 2,4 diamminobutirrico, epsilon-Aca = acido epsilonamminocaproico, delta-Ava = acido delta-amminovalerico, beta-Ala = beta-Alanina, Ac3c = acido alfa-amminociclopropancarbossilico, Ac4c = acido alfaamminociclobutancarbossilico, Ac5c = acido alfa-amminociclopentancarbossilico, Ac6c = acido alfa-amminocicloesancarbossilico, Alfa-Ac5c = acido alfaamminociclopentancarbossilico, Alfa-Ac6c = acido alfa-amminocicloesancarbossilico, NOz-Phe = nitrofenilalanina, S03H-Phe = fenilalaninsolfonata, P03H2-Phe = fenilalaninafosfonata, P04H2-Phe = fenilalaninafosfato, S04H-Phe = fenilalaninasolfato, S03H-Tyr = tirosina-m-solfonata„ P03H2-Tyr, = tirosina-m-fosfonata, Boc = tert-butilossicarbonile, Fmoc = fluorenilmetossicarbonile, TFA = acido trifluoroacetico, DCM = diclorometano, DIEA = diisopropiletilammina, DMF = dimetilformammide, Obzl = benziletere, EDT = Etanditiolo, TIS = triisopropilsilano, HATU = 0-(7-azabenzotriazol-il)-1,1,3,3-tetrametiluronim tetrafluroborato, PyBop = benzotriazolo-l-il-oxi-trispirrolidinio-fosfonio-esafluofosfato, Tri = tritìi, Pmc = 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil, Mtt = 4-metil-tritil, Dde = l-(4,4-dimetil-2,6-diossocicloesildene)-etil, Opfjp = pentafluorofenil estere, tBu = tert-butil etere, OtBu = tert-butil estere, Ac = acetil, HPLC = cromatografia liquida ad alta pressione.

I seguenti esempi illustrano ulteriormente l’invenzione.

Esempio 1

Sintesi del peptide ciclico di formula (IV):

H-Asp-Tyr-Met-1 •Lp-Trp-Met-Asp-Phe-liys (IV)

Nel peptide avente formula (IV) è presente l amminoacido non naturale Dap (acido 2,3-diamminopropionico) e tale residuo viene utilizzato per formare il peptide ciclico grazie alla formazione del legame ammidico tra il gruppo carbossilico C-terminale dell’ amminoacido lisina ed il gruppo amminico in posizione 3 dell’acido 2,3-diamminopropionico.

La sintesi del peptide è stata effettuata utilizzando la strategia di sintesi peptidica in fase solida, ed impiegando il sintetizzatore automatico di peptidi Shimadzu per la sintesi in batch. In particolare è stata utilizzata la metodologia che impiega quale gruppo protettore della funzione alfa-amminica il gruppo Fmoc. La sintesi è stata condotta impiegando come supporto solido la resina 2-cloro-tritil-cloruro che consiste in un supporto di polistirene al 2% di divinilbenzene funzionalizzato con il gruppo cloruro di 2-cloro-tritile; tale resina consente di ottenere, per idrolisi in condizioni debolmente acide, il peptide C-terminale carbossile e completamente protetto sulle catene laterali degli amminoacidi.

È stata utilizzata una scala di sintesi di 0.176 mmoli. Tale scala di sintesi è stata ottenuta utilizzando 400 mg della resina che è stata previamente e solo parzialmente funzionalizzata con il primo amminoacido Fmoc-Lys(Boc)-OH, secondo la seguente procedura: è stato utilizzato un reattore manuale in batch aggiungendo l amminoacido in difetto (0.6 equivalenti) in DCM rispetto ai gruppi funzionali presenti sulla resina (0.83 mmoli/g); sono aggiunti un ammontare equivalente di PyBop e 4 equivalenti di DIEA, rispetto all’ammontare di amminoacido usato. La stima del numero di mmoli di aminoacido legatosi alla resina è stata effettuata, su di una aliquota, valutando l’ammontare di gruppo Fmoc, presente sul gruppo amminico in alfa del residuo di lisina ed allontanato con una soluzione basica al 20% in volume di piperidina in DMF, mediante misura dell 'assorbenza del cromoforo effettuata nella regione dell’UV (lambda=290, epsilon290=5.10<3>). A seguito della sopra citata procedura, il grado di sostituzione della resina 2-cloro-tritil-Lys(Boc)-Fmoc risulta essere pari a 0.44mmoli/g. Successivamente si è provveduto a completare la sintesi del peptide trasferendo la resina legata al primo amminoacido (Fmoc-Lys(Boc)-) nel reattore del sintetizzatore e programmando la sintesi con la seguente procedura: eccesso dei singoli amminoacidi 2.5 equivalenti, attivante PyBop 1 equivalente rispetto all’ amminoacido, DIEA 1,5 equivalenti rispetto all’ amminoacido ed al PyBop, solvente DMF anidro, tempo di accoppiamento 60 minuti (singolo accoppiamento). Gli amminoacidi utilizzati in sequenza sono stati i seguenti: Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Dap(Dde)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Boc-Asp(OtBu)-OH. Una volta terminato l’assemblaggio del peptide sulla resina, è stato rimosso il gruppo protettore Dde della catena laterale del residuo di Dap, mediante trattamento con una soluzione al 4% di idrazina in DMF. Due trattamenti successivi di 10 minuti sono stati utilizzati per tale reazione di deprotezione. Successivamente si è provveduto alla reazione di distacco del peptide parzialmente protetto dalla resina: la resina è stata posta su un setto poroso e trattata con una soluzione allo 0.5% in volume di TFA in diclorometano in 3-5 minuti ripetendo l’operazione 10 volte. La soluzione acida di lavaggio è raccolta in un pallone contenente il 10% di piridina. Dopo aver eliminato per evaporazione a pressione ridotta il 90% del volume iniziale di solvente, il peptide è precipitato per aggiunta di acqua fredda e successivamente lavato con acqua. Dopo aver verificato con la spettroscopia di massa MALDI la presenza del peptide con tutti i gruppi di protezione, ad eccezione di quello sulla catena laterale del Dap, (peso molecolare 1691), si è provveduto alla reazione di ciclizzazione. Il gruppo carbossilico C-terminale sul residuo di lisina forma legame ammidico con il gruppo amminico in posizione 3 dell’acido 2,3 diammino propionico. La reazione è condotta in DMF ad una concentrazione di peptide 5. IO<"4 >M aggiungendo l’attivante della funzione carbossilica HATU in eccesso di 4 equivalenti e la base DIEA fino a pH 8.5. La miscela viene tenuta sotto agitazione per 5 ore a 40°C. Successivamente si elimina il solvente sotto pressione ridotta, e si provvede al distacco dei gruppi protettori con la seguente procedura. Il peptide ciclico viene trattato in un pallone sotto agitazione per 2 ore con una miscela di TFA contenente EDT (2.5%), TIS (1%) e acqua (2.5%). L’omogeneità del prodotto grezzo è stata verificata mediante HPLC analitico: il prodotto grezzo mostra un picco principale con un tempo di ritenzione pari a 16.7 min. (colonna: fase inversa CI 8, eluenti: acqua con 1% TFA e acetonitrile con 1% TFA, gradiente di eluizione: percentuale di acqua da 80% a 20% in 25 minuti). Il prodotto è stato purificato mediante HPLC preparativo con lo stesso metodo di separazione utilizzato in scala analitica. Si ottiene il prodotto ad un grado di purezza superiore al 98%, confermato da HPLC analitico, con una resa superiore al 50% del teorico atteso. L’identità del prodotto è stata confermata con spettroscopia di massa Maldi che mostra il picco al valore di massa atteso: 1202.

Esempio 2

Determinazione del binding tra il composto di formula (IV) con il frammento 1-47 del recettore delle colecistochinine di tipo A, CCKA-R(l-47).

Il binding tra il composto preparato come nell’esempio 1 con il frammento 1-47 del recettore delle colecistochinine di tipo A è stato studiato utilizzando la spettroscopia di fluorescenza. Benché il composto di formula (IV), non possedendo la funzione solfato sul residuo di tirosina, dovrebbe avere una maggiore affinità con il recettore di tipo B delle colecistochinine, l’esperimento effettuato e i risultati ottenuti sono del tutto legittimi in quanto il frammento di recettore utilizzato non contiene i residui (Arg 197) che sono noti essere responsabili dell’interazione con il gruppo solfato. Anche lo studio della struttura del complesso: frammento 1-47 del recettore CCK di tipo A/peptide CCK8, ottenuta con la spettroscopia NMR e il successivo studio del binding ottenuto con la spettroscopia di fluorescenza sono stati effettuati utilizzando il peptide CCK8 nella forma non solfatata.

Sono stati utilizzati il frammento 1-47 del recettore di tipo A, CCKA-R(l-47), ed il composto di formula (IV) entrambi sintetizzati con le metodologie di sintesi peptidica in fase solida. In particolare per la sintesi del composto (IV) si rimanda all’esempio 1 mentre per la sintesi del frammento del recettore si rimanda a G. Morelli, Bìopolymers, 2001, (in stampa).

L’interazione tra il frammento di recettore CCKA-R(l-47) ed il composto (IV) è stata seguita monitorando la fluorescenza del triptofano. Gli spettri di emissione sono stati registrati a temperatura ambiente usando uno spettrofluorimetro Jasco FP-750 alla lunghezza d’onda di eccitazione a 296 nm, per eccitare selettivamente il triptofano. Piccole aliquote di una soluzione concentrata del composto (IV) disciolto in tampone fosfato a pH 7.2 sono state aggiunte ad un volume fisso di una soluzione di CCKA-R(l-47) sciolto nello stesso solvente ed in presenza di una soluzione di micelle di Sodio Dodecilsolfato 10 jnM, utilizzato per mimare la membrana cellulare. Gli spettri finali usati nei calcoli furono corretti per la diluizione e per i contributi delle singole molecole isolate.

Come indicato nella figura 2, dalla valutazione del grafico si ha una misura del binding del peptide con formula (IV) al frammento 1-47 del recettore delle colecistochinine di tipo A, CCKA-R(l-47), in cui la concentrazione del recettore è 2.6 μΜ in 10 mM tampone fosfato, pH 7.2 (valore misurato dall’assorbanza a 280 nm.) ed in presenza di una soluzione di micelle SDS 10 mM. Quantità crescenti di composto di formula (IV) vengono aggiunte da una soluzione madre concentrata contenente micelle di SDS 10 mM. La fluorescenza è misurata a 335 nm e la curva di binding risultante dall’esperimento è in accordo con un valore di Κά = 255 nM.

Infatti, come può essere apprezzato in figura 2 che esemplifica una tipica curva di saturazione, il segnale della fluorescenza è gradualmente quenched a seguito del binding. Gli esperimenti sono stati eseguiti a varie concentrazioni del recettore ed il quencing della fluorescenza è stato sempre osservato. Inoltre per un dato esperimento la stessa curva di titolazione è riscontrata indipendentemente dalla lunghezza d’onda di emissione scelta per eseguire i calcoli. Per discriminare le modifiche della fluorescenza originate dal binding i contributi alla fluorescenza del recettore e del peptide isolati sono stati sottratti, ottenendo alla fine una variazione piccola della fluorescenza rispetto al valore misurato. Ciò comporta una elevata variazione statistica che comunque non impedisce una corretta valutazione del quencing della fluorescenza. Le procedure di fitting impiegate portano a stimare un valore di Kd nel range 50-200 nM, con una media di 120 nM (deviazione standard /- 27 nM). Questo valore è nello stesso range submicromolare di affinità riscontrato per il binding di CCK8 lineare non solfatato al frammento 1-47 del recettore di tipo A o all’intero recettore di tipo B.

Esempio 3

Valutazione dell’attività biologica del peptide di formula (IV).

Sono state condotte prove biologiche per confermare l’attività del composto ciclico di formula (IV) utilizzando cellule neuronali che esprimono il recettore delle colecistochinine di tipo A. L’attività del composto di formula (IV) è stata paragonata con il peptide CCK8 nella forma non solfatata sul residuo di tirosina. Entrambi questi composti dovrebbero mostrare una attività più bassa rispetto agli analoghi corrispondenti contenenti il gruppo solfato sul residuo di tirosina. Le prove di attività biologica prevedono l’utilizzo di neuroni mienterici come cellule esprimente il recettore e l’impiego di un microscopio confocale, dotato di un opportuno pacchetto software per misurare l’attività dei peptidi. Le prove sperimentali si basano sui seguenti presupposti:

1) i neuroni mienterici (della parete intestinale) esprimono normalmente il recettore per la CCK di tipo A;

2) il legame della CCK al recettore induce l'eccitazione della cellula (cambiamento del potenziale di membrana) che può essere registrato mediante studi di elettrofisiologia;

3) l'eccitazione cellulare è accoppiata al passaggio di calcio dall'esterno all'interno della cellula attraverso specifici canali di membrana;

4) rendendo fluorescente il calcio (si utilizzano chelanti del calcio che se eccitati ad una particolare lunghezza d'onda sono capaci di modificare la lunghezza d'onda di emissione) è possibile registrare l'incremento della concentrazione del calcio intracellulare in risposta ad uno stimolo;

5) la microscopia confocale laser con l'ausilio di software specifici, permette quindi di rilevare questi fenomeni e di convertire la fluorescenza in concentrazione del calcio intracellulare.

Esponendo i neuroni al peptide CCK8 non solfatato ed all'analogo ciclico dell’esempio 1 (perfusione per 60 secondi) abbiamo registrato che entrambe le sostanze sono capaci di indurre un aumento della concentrazione del calcio intracellulare.

Il risultato sperimentale è mostrato in figura 3. Il grafico mostra due curve distinte ed è relativo alla stessa cellula in due tempi differenti, prima è stata infusa con il peptide CCK8 non solfata e dopo wash-out (5 min circa) con il peptide ciclico dell’esempio 1 e di formula (IV). Sulle ordinate sono indicate le Unità di fluorescenza e sulle ascisse il tempo di perfusione (sec). Il grafico mostra un primo picco massimo (eccitazione dopo perfusione con K<+ >75 mM) che è lo stimolo adoperato per individuare funzionalmente i neuroni, quindi la risposta ai peptidi CCK8 e peptide ciclico di formula (IV) ed infine nuovamente K<+ >75mM per confermare la vitalità cellulare.

Sebbene resperimento non consenta di valutare la potenza d'azione delle due molecole in esame, il risultato indica che l'analogo di sintesi è in grado di legarsi allo specifico recettore e di indurre una risposta cellulare.

Esempio 4

Preparazione del peptide ciclico funzionalizzato di formula (XIX).

COOH COOH

o

COOH NH V γ N/^N'

H-Asp-Tyr-Met-Dap-Trp-Met-Asp-Phe-L ys COOH COOH

(XIX)

La componente peptidica del composto (XIX) è la stessa di quella riportata nell’esempio 1; inoltre viene utilizzata la catena laterale del residuo di lisina presente nella parte peptidica del composto di formula (IV) per legare covalentemente il chetante: acido N,N-bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]L-glutammico (DTPA-GLU).

La sintesi del composto di formula (XIX) è stata effettuata in analogia a quanto riportato per il composto (IV) utilizzando la strategia di sintesi peptidica in fase solida, ed impiegando sia procedure di sintesi in reattori manuali che il sintetizzatore automatico di peptidi Shimadzu per la sintesi in batch. In particolare è stata utilizzata la metodologia che impiega quale gruppo protettore della funzione alfa-amminica il gruppo Fmoc. La sintesi è stata condotta impiegando come supporto solido la resina 2-cloro-tritil-cloruro che consiste in un supporto di polistirene al 2% di divinilbenzene funzionalizzato con il gruppo cloruro di 2-cloro-tritile; tale resina consente di ottenere, per idrolisi in condizioni debolmente acide, il peptide C-terminale carbossile e completamente protetto sulle catene laterali degli amminoacidi.

E stata utilizzata una scala di sintesi di 0.180 mmoli. Tale scala di sintesi è stata ottenuta utilizzando 400 mg della resina che è stata previamente e solo parzialmente funzionalizzata con il primo amminoacido Dde-Lys(Fmoc)-OH, secondo la seguente procedura: è stato utilizzato un reattore manuale in batch aggiungendo l amminoacido in difetto (0.8 equivalenti) in DCM rispetto ai gruppi funzionali presenti sulla resina (1.08 mmoli/g); sono aggiunti un ammontare equivalente di PyBop e 4 equivalenti di DIEA, rispetto all’ ammontare di amminoacido usato. La stima del numero di mmoli di amminoacido legatosi alla resina è stata effettuata valutando, su una aliquota, l’ammontare di gruppo Fmoc, presente sul gruppo amminico in epsilon del residuo di lisina ed allontanato con una soluzione basica al 20% in volume di piperidina in DMF, mediante misura dell’assorbanza del cromoforo effettuata nella regione dell’UV (lambda=290, epsilon29o=5.10<3>). A seguito della sopra citata procedura, il grado di sostituzione della resina 2-cloro-tritil-Lys(Fmoc)-Dde risulta essere pari a 0.44mmoli/g. Successivamente si è provveduto al distacco del gruppo protettore Fmoc dalla funzione amminica in epsilon del residuo di Lys, mediante trattamento con una soluzione al 20% di piperidina in DMF. Due trattamenti successivi di 7 minuti sono stati utilizzati per tale reazione di deprotezione. In una fase successiva si è provveduto ad effettuare la reazione di condensazione del chelante DTPA-GLU, protetto su cinque delle sue sei funzioni carbossiliche con gruppi terbutile, attraverso il suo unico gruppo carbossilico libero, con il gruppo amminico in posizione epsilon del residuo di Lys legato alla resina. La reazione è stata effettuata utilizzando come attivante HATU, con un eccesso di DTPA-GLU di 2.5 equivalenti ed impiegando la base DIEA per stabilizzare il pH a 8.5. Il test di Kaiser è stato effettuato per confermare la completezza della reazione di accoppiamento. Successivamente si è provveduto al distacco del gruppo protettore Dde, presente sulla funzione amminica in alfa del residuo di Lys, mediante trattamento con una soluzione al 4% di idrazina in DMF. Due trattamenti successivi di 10 minuti sono stati utilizzati per tale reazione di deprotezione. Ciò ha reso possibile effettuare, ancora con un sistema manuale, la successiva reazione di accoppiamento dell’ amminoacido Fmoc-Phe-OH nelle medesime condizioni di reazione illustrate per il chelante DTPA-GLU. L’impiego del test di Kaiser anche in questo caso ha confermato la completezza della reazione di accoppiamento.

Successivamente si è provveduto a completare la sintesi del peptide trasferendo la resina Lys(Glu-DTPA)-Phe-Fmoc nel reattore del sintetizzatore automatica e progammando la sintesi con la seguente procedura: eccesso dei singoli amminoacidi 2.5 equivalenti, attivante PyBop 1 equivalente rispetto all’amminoacido, DIEA 1,5 equivalenti rispetto all’ amminoacido ed al PyBop, solvente DMF anidro, tempo di accoppiamento 60 minuti (singolo accoppiamento). Gli amminoacidi utilizzati in sequenza sono stati i seguenti: Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Dap(Dde)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Boc-Asp(OtBu)-OH. Una volta terminato l’assemblaggio del peptide sulla resina, è stato rimosso il gruppo protettore Dde della catena laterale del residuo di Dap, mediante trattamento con una soluzione al 4% di idrazina in DMF. Due trattamenti successivi di 10 minuti sono stati utilizzati per tale reazione di deprotezione. Successivamente si è provveduto alla reazione di distacco del peptide parzialmente protetto dalla resina: la resina è stata posta su un setto poroso e trattata con una soluzione allo 0.5% in volume di TFA in diclorometano in 3-5 minuti ripetendo l’operazione 10 volte. La soluzione acida di lavaggio è raccolta in un pallone contenente il 10% di piridina. Dopo aver eliminato per evaporazione a pressione ridotta il 90% del volume iniziale di solvente, il peptide è precipitato per aggiunta di acqua fredda e successivamente lavato con acqua. Dopo aver verificato con la spettroscopia di Massa Maldi la presenza del peptide con tutti i gruppi di protezione, ad eccezione di quello sulla catena laterale del Dap, (peso molecolare 2320), si è provveduto alla reazione di ciclizzazione. Il gruppo carbossilico C-terminale sul residuo di lisina forma legame ammidico con il gruppo amminico in posizione 3 dell’acido 2,3 diammino propionico. La reazione è condotta in DMF ad una concentrazione di peptide 5. IO<-4 >M aggiungendo l’attivante della funzione carbossilica HATU in eccesso di 4 equivalenti e la base DIE A fino a pH 8.5. La miscela viene tenuta sotto agitazione per 5 ore a 40 °C. Successivamente si elimina il solvente sotto pressione ridotta, e si provvede al distacco dei gruppi protettori presenti sia sulle catene laterali degli amminoacidi che sulle funzioni carbossilica del chetante DTPA, con la seguente procedura. Il composto peptidico viene trattato in un pallone sotto agitazione per 2 ore con una miscela di TFA contenete EDT (2.5%), TIS (1%) e acqua (2.5%). L’omogeneità del prodotto grezzo è stata verificata mediante HPLC analitico: il prodotto grezzo mostra un picco principale con un tempo di ritenzione pari a 16.3 min. (colonna: fase inversa CI 8, eluenti: acqua con 1% TFA e acetonitrile con 1% TFA, gradiente di eluizione: percentuale di acqua da 80% a 20% in 25 minuti). Il prodotto è stato purificato mediante HPLC preparativo con lo stesso metodo di separazione utilizzato in scala analitica. Si ottiene il prodotto ad un grado di purezza superiore al 98%, confermato da HPLC analitico, con una resa superiore al 50% del teorico atteso. L’identità del prodotto è stata confermata con spettroscopia di massa MALDI che mostra il picco al valore di massa atteso: 1650.

Esempio 5

Preparazione del complesso di Indio di formula (XX)

n)

H-Asp-Tyr-Met- >-Trp-Met-Asp-Phe- T ΓΡΑ-GLU (I

I

(XX)

La sintesi del composto di formula (XX) è stata effettuata per reazione del composto di formula (XIX), preparato come descritto nell’esempio 4, con tricloruro di Indio. Il sale di Indio (III) viene sciolto in una soluzione di tampone citrato al 3% in acqua e la soluzione risultante viene aggiunta ad una soluzione contenente il composto di formula (XX), 0.5 equivalenti rispetto all’Indio, in acqua a pH 7-8. Dopo 24 ore il prodotto viene purificato con HPLC e caratterizzato con spettroscopia di massa Maldi che mostra il picco al valore di massa atteso: 1762.

Claims (22)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composti di formula generale (I): (Xaa)n-xlb-(Xaa)m-xl>b (i) m cui: Xaa è un qualunque amminoacido o un peptide costituito da amminoacidi Xaa, indipendentemente uguali o diversi tra loro; Xbb è un alfa o beta amminoacido, contenente almeno tre gruppi funzionali scelti nel gruppo costituito da: -COOH, -NH2, -SH o -OH, preferibilmente scelto nel gruppo costituito da; Lys, Asp, Giu, Cys, Om, Dap, Dab, Gaba, epsilon-Aca, delta-Ava; n è compreso tra 0 e 15; e m è compreso tra 2 e 12, e i loro complessi con metalli radioattivi, paramagnetici o con alogeni radioattivi, e i sali degli stessi con basi organiche o inorganiche fisiologicamente accettabili oppure con anioni di acidi organici o inorganici fisiologicamente accettabili.
2. 2. Composti secondo la rivendicazione 1 in cui, almeno uno degli amminoacidi Xaa è un residuo di metionina, di tirosina o di tirosina-msolfonata.
3. 3. Composti secondo la rivendicazione 2 in cui: - m è un numero intero da 4 a 8, n è un numero intero da 3 a 5, e tra gli amminoacidi Xaa sono compresi almeno un residuo di metionina e un residuo di tirosina o di tirosina solfonata; - m è un numero intero da 4 e 8, n è un numero intero da 3 a 5, e tra gli amminoacidi Xaa sono compresi almeno un residuo di metionina, un residuo di tirosina o di tirosina solfonata e un residuo di lisina; - m è un numero intero da 4 e 8, n è un numero intero da 3 a 5, e tra gli amminoacidi Xaa sono compresi almeno un residuo di metionina, un residuo di tirosina o di tirosina solfonata e un residuo di lisina o di un aminoacido scelto tra omitina, acido aspartico e acido glutammico.
4. 4. Composti secondo la rivendicazione 3 di formula generale (II), in cui: H-Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Met-Dkp-Trp-Met-Asp-Xaal0-Lys m corrisponde a 4; n è un numero intero compreso tra 3 e 5; Xaal e/o Xaa2 possono essere assenti; Xaa3 corrisponde a Asp o Giu; Xaa4 corrisponde a Tyr o S03H-Tyr; XaalO corrisponde a Phe o ad un aminoacido scelto tra Leu, Ile, Val, Ala, Trp, Gly e Pro.
5. 5. Composti secondo la rivendicazione 4 scelti fra: H-Glu-Tyr-Met-Dlp-Trp-Met-Asp-Phe-L^s (III) H-Asp-Tyr-Met-C)Lp-Trp-Met-Asp-Phe-Jys (IV) H-Asp-S03HTyr-Met-cJap-Trp-Met-Asp-Phe-llys (V) H-Asp-S03HTyr-Met-DÌp-Trp-Met-Asp-Val-lJrs (VI) H-Asp-S03HTyr-Met-Dalp-Trp-Met-Asp-Phe-L^s (vn) H-Gly-AIa-Glu-Tyr-Met-Dkp-Trp-Met-Asp-Ala-l]ps (vm)
6. 6. Composti di formula generale (IX), A-[Y]Z-C (IX) in cui: A rappresenta un peptide delle rivendicazioni da 1 a 5; z è un numero intero che va da 0 a 5, Y rappresenta una catena spaziante legata rispettivamente ad una delle funzionalità presenti sulle catene laterali dei singoli aminoacidi presenti nel peptide A; oppure ad un gruppo N-terminale (gruppo -NH2) o C-terminale (gruppo -C02H) di A e a C; quando z è un intero da 2 a 5, le unità Y possono essere uguali o diverse l’una dall’altra; C rappresenta un agente chelante, legato covalentemente alla catena spaziante Y o direttamente al peptide A, o a più unità amminoacidiche del peptide A e capace di complessare un metallo paramagnetico o un radioisotopo.
7. 7. Composti secondo la rivendicazione 6, in cui C viene selezionato fra: EDTA; DTPA; EOB-DTPA; BOPTA; DTPA-BMA; DTPA-GLU; DTPA-Lys; DOTA; DOTMA; D03A; HPD03A; MCTA;DPDP; EDTP; acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-l,4,7,10-tetrakis[metilen(metilfosfmico)]; 1,4,7,10-tetraazaciclododecano- 1,4,7, 10-tetrakis[metilen(metilfosfonico)]; texafirine, porfirine, ftalocianine; composti di formula (XIII); (N amino/amido)^ (S tiol derivato^ (XIII), in cui j ha valore intero 0,1 o 2.
8. 8. Composti secondo le rivendicazioni 6 o 7, in cui Y è un gruppo di formula: χ> α3⁄4 κ w dove r, 1, e q indipendentemente tra loro possono assumere i valori di 0 o 1 , p può variare tra 0 e 10, con la condizione che almeno uno di 1, r, e q sia diverso da zero; X rappresenta un atomo di O, o un gruppo -NR dove R è un atomo di H o un gruppo alchile (C1-C5); K rappresenta un nucleo benzenico, sostituito o no, oppure un gruppo -CHRi dove Ri rappresenta un atomo di idrogeno oppure un gruppo -COOH o -SO3H; W rappresenta un gruppo -CO- o -CS-.
9. 9. Composti secondo le rivendicazioni 6, 7 e 8, in cui la catena spaziante Y ha la seguente formula (X), (X), in cui R, R1} 1, r, p, q e z hanno il significato precedentemente definito.
10. 10. Composti secondo le rivendicazioni 6, 7, 8 e 9 in cui la catena spaziante Y ha la seguente formula (XI), PO), Ri - i q z -1 in cui R, Rj, 1, r, p, q e z hanno il significato precedentemente definito.
11. 11. Composti secondo le rivendicazioni 6, 7 e 8, in cui la catena spaziante Y ha la seguente formula (XII), R t<N >α3⁄4 ; (ΧΠ), - w - q —I z-2 in cui R, Rj, W, 1, r, p, q e z hanno il significato precedentemente definito.
12. 12. Composti secondo le rivendicazioni da 6 a 11, in cui Y è uno dei seguenti gruppi: -(CH2)2-CO-, -(CH2)4-NH-, -(CH2)4-NH-CO-(CH2)2-CO-, -CH2-Ph-CH2-CO-, -CH2-Ph-NH-CS-.
13. 13. Composti secondo le rivendicazioni da 6 a 12, in cui C è un residuo di DTPA, DTPA-Lys, DTPA-GLU o di un loro derivato.
14. 14. Composti secondo le rivendicazioni da 6 a 12, in cui C è un residuo di DOTA, D03A, o di un loro derivato.
15. 15. Composti secondo le rivendicazioni da 1 a 14, come agonisti o antagonisti della colecistochinina.
16. 16. Composti secondo le rivendicazioni da 1 a 14, per la individuazione e localizzazione di tumori animali e umani primari e loro metastasi, che sovraesprimono i recettori di tipo A della colecistochinina in quantità maggiore che in situazioni non patologiche.
17. 17. Composti secondo le rivendicazioni da 1 a 14, per la individuazione e localizzazione di tumori animali e umani primari e loro metastasi, che sovraesprimono i recettori di tipo B della colecistochinina in quantità maggiore che in situazioni non patologiche.
18. 18. Composti secondo le rivendicazioni da 1 a 14, per la individuazione e localizzazione di tumori animali e umani primari e loro metastasi, che sovraesprimono i recettori di tipo A e/o B della colecistochinina in quantità maggiori che in situazioni non patologiche.
19. 19. Composti secondo le rivendicazioni da 1 a 14, per la terapia di tumori umani che sovraesprimono i recettori di tipo A e/o B della colecistochinina in quantità maggiori che in situazioni non patologiche.
20. 20. Composizione farmaceutica o diagnostica contrastografìca o scintigrafica, comprendente un chelato delle rivendicazioni da 1 a 14 o un suo sale.
21. 21. Kit diagnostico per la preparazione di una composizione radiofarmaceutica, in cui detto kit comprende un vial asetticamente sigillato e contenente una predeterminata quantità di un composto delle rivendicazioni da 1 a 14 e una sufficiente quantità di agente riducente utilizzata per marcare il reagente con tecnezio-99m, renio- 186 o renio- 188.
22. 22. Uso dei chelati dei composti delle rivendicazioni da 6 a 14 o dei loro sali, per la preparazione di formulazioni diagnostiche, allo scopo di ottenere immagini di organi e/o di tessuti e/o di cellule del corpo umano o animale, tramite l’impiego di risonanza magnetica nucleare o di scintigrafia.