实施例
实施例1:使用从记忆B细胞提取的RNA构建scFv噬菌体展示文库
从正常健康供体通过在EDTA抗凝取样管中静脉穿刺收集外周血。scFv噬菌体展示文库如WO 2008/028946所述获得,所述文献援引加入本文。将记忆B细胞(CD24+/CD27+)与天然B细胞(CD24+/CD27-)和记忆T细胞(CD24-/CD27+)分离,在接下来的步骤中,使用IgM表达将IgM记忆B细胞(IgM+)与转换(switch)记忆B细胞(IgM-)分离。从IgM记忆B细胞分离RNA及制备cDNA。
进行两轮PCR扩增,使用表1和2中列出的引物,以从各自供体全部组成成分中分离免疫球蛋白VH和VL区。
使用表1中列出的引物组对各个cDNA进行第一轮扩增针对各自的VH、Vkappa和Vlambda区产生大约650碱基对的7、6和9个产物。对于IgM记忆B细胞VH区扩增,OCM恒定引物与OH1-OH7组合使用。第一轮扩增的热循环程序是:2分钟96℃(变性步骤);30个如下循环:30秒96℃/30秒55℃/60秒72℃;10分钟72℃最终延伸以及4℃冷却。将产物加样并分离自1%琼脂糖凝胶,使用凝胶提取柱(Qiagen)进行,并在50μl 1mMTris-HCl pH 8.0中洗脱。将10%的第一轮产物(5μl)进行第二轮扩增,使用表2列出的引物进行。这些引物用限制位点扩展,使得各自的VL和VH区定向克隆进噬菌体展示载体PDV-C06中。第二轮扩增的PCR程序如下:2分钟96℃(变性步骤);30个如下循环:30秒96℃/30秒60℃/60秒72℃;10分钟72℃最终延伸以及4℃冷却。首先根据在免疫球蛋白基因产物中发现的J节段的自然发生情况集合第二轮产物(~350个碱基对),针对VH、Vkappa和Vlambda可变区分别获得7、6和9个集合(见表3和4)。为了获得免疫球蛋白序列在免疫文库中的标准化分布,根据表3中所述百分比混合所述6个Vkappa和9个Vlambda轻链集合。将这个单一最终VL集合(3μg)用限制酶SalI和NotI消化过夜,加样并分离自1.5%琼脂糖凝胶(~350个碱基对),使用Qiagen凝胶提取柱进行,并如下所述在SalI-NotI切割PDV-C06载体(~5000碱基对)中连接:10μl PDV-C06载体(50ng/μl),7μl VL***体(10ng/μl),5μl 10X连接缓冲液(NEB),2.5 T4 DNA连接酶(400U/μl)(NEB),25.5μl超纯水(载体与***体比率为1∶2)。在16℃水浴中连接过夜。接下来,将该体积用水加倍,用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(75∶24∶1)(Invitrogen)提取,随后用氯仿(Merck)提取,及用1μl Pellet Paint(Novogen)、10μl乙酸钠(3MpH 5.0)和100μl异丙醇在-20℃沉淀2小时。获得的样品随后在4℃以20.000xg离心30分钟。将获得的沉淀用70%乙醇洗涤及在室温以20.000xg离心10分钟。通过真空抽吸除去乙醇,将所得沉淀风干几分钟,然后溶解在含有10mM Tris-HCl、pH 8.0的50μl缓冲液中。将1μl连接混合物用于在冷却的0.1cm电穿孔杯(Biorad)中转化40μl TG-1电感受态细胞(Stratagene),使用Genepulser II设备(Biorad),设定为1.7kV、200Ohm、25μF(时间常数~4,5msec)。紧接在脉冲后,将细菌用含有5%(w/v)葡萄糖(Sigma)的1000μl SOC介质(Invitrogen)在37℃从所述杯中冲洗出,移至15ml圆底培养管中。另外500μl SOC/葡萄糖用于从电穿孔杯中冲洗剩余的细菌并加入所述培养管中。通过在摇床培养箱中在37℃以220rpm培养精确1小时回收细菌。将转化的细菌铺板在大240mm方形培养皿(NUNC)中,所述培养皿含有200ml 2TY琼脂(16g/l细菌用胰蛋白胨,10g/l细菌用酵母提取物,5g/l NaCl,15g/l琼脂,pH 7.0),补加了50μg/ml氨苄青霉素和5%(w/v)葡萄糖(Sigma)。将1-1000稀释液铺板在含有相同介质的15cm培养皿上进行计数。重复进行20次这个转化程序,将完整的文库铺板在总共30个大方形培养皿上,在37℃培养器中生长过夜。典型地,使用上述方案获得大约1x107cfu。通过轻微刮取细菌置于10ml 2TY培养基/平板中而从所述平板收获中间体VL轻链文库。通过OD600测量确定细胞团块,将两倍的500OD细菌用于maxi质粒DNA制备物,使用两个P500 maxiprep柱(Qiagen)根据厂商指导进行。
与VL可变区相似,首先将第二轮VH-JH产物混合在一起,获得标准J节段使用分布(见表4),获得称作PH1-PH7的7个VH亚集合。将该集合使用表4所述百分比混合以获得标准化的序列分布,获得一个VH部分,将其用SfiI和XhoI限制酶消化并连接进如上述获得的SfiI-XhoI切割PDV-VL中间文库中。TG1的连接设置、纯化方法、随后的转化以及细菌的收获如针对VL中间文库所述(见上述)。使用集落PCR检测最终文库(大约5x106cfu)的***频率,使用在***的VH-VL区两侧的引物组进行。95%以上的集落示出适当长度的***物(见表5)。所述集落PCR产物用于随后的DNA序列分析以检测序列变异及评估示出完整ORF的集落百分比。这典型为70%以上(见表5)。也分析了V基因中的突变频率。在50个序列中,47个序列(94%)不是表示成熟过程的种系构型及与用作文库RNA来源的B细胞的记忆表型一致。最终,通过使用CT辅助噬菌体拯救文库及扩增(见WO 02/103012)并通过如下文所述淘选方法用于噬菌体抗体选择。
实施例2:携带针对甲型流感病毒亚型H3和H7及乙型流感病毒的单链Fv片段的噬菌体的选择
使用基本如上述构建的抗体噬菌体展示文库及一般的噬菌体展示技术和基本如美国专利6,265,150和WO 98/15833(均援引加入本文)所述的MABSTRACT
技术选择抗体片段。此外,如WO 02/103012(援引加入本文)所述方法和辅助噬菌体用于本发明中。
针对甲型流感病毒亚型H3(A/Wisconsin/67/2005)和H7(A/Netherlands/219/2003)或者乙型流感病毒(B/Ohio/01/2005)的重组血凝素(HA)进行选择。将HA抗原在PBS(5.0μg/ml)中稀释,加入MaxiSorpTMNunc-Immuno Tubes(Nunc)中,在4℃在旋转盘上保温过夜。倒空所述immunotubes,用封闭缓冲液(在PBS中2%脱脂奶粉(ELK))洗涤三次。随后将该immunotubes用封闭缓冲液完全充填,在室温保温1-2小时。将等份的噬菌体展示文库(500-1000μl,0.5x1013-1x1013cfu,使用CT辅助噬菌体扩增(见WO 02/103012))在补加10%非加热失活的胎牛血清和2%小鼠血清的封闭缓冲液中在室温封闭1-2小时。将封闭的噬菌体文库加入immunotubes中,在室温保温2小时,用洗涤缓冲液(在PBS中0.05%(v/v)Tween-20)洗涤以除去未结合的噬菌体。结合的噬菌体从各自的抗原中洗脱,通过与1ml的100mM三乙胺(TEA)在室温保温10分钟进行。随后,将洗脱的噬菌体与0.5ml的1M Tris-HCl pH7.5混合以中和pH。这个混合物用于感染已经在37℃生长至OD 600nm为大约0.3的5ml的XL1-Blue大肠杆菌培养物。使所述噬菌体在37℃感染XL1-Blue细菌30分钟。然后,将该混合物在室温以3000xg离心10分钟,将细菌沉淀重悬于0.5ml 2-胰蛋白胨酵母提取物(2TY)培养基中。将获得的细菌悬浮液分成两个补加了四环素、氨苄青霉素和葡萄糖的2TY琼脂平板中。在将平板在37℃保温过夜后,从平板中刮取集落,用于制备富集的噬菌体文库,基本如De Kruif et al.(1995a)和WO 02/103012所述进行。简而言之,刮取的细菌用于接种含有氨苄青霉素、四环素和葡萄糖的2TY培养基,在37℃生长至OD 600nm为~0.3。加入CT辅助噬菌体,并使其感染细菌,之后将培养基改变为含有氨苄青霉素、四环素和卡那霉素的2TY培养基。在30℃保温过夜。第二天,通过离心从所述2TY培养基除去细菌,之后培养基中的噬菌体通过使用聚乙二醇(PEG)6000/NaCl沉淀。最后,将噬菌体溶解于具有1%牛血清白蛋白(BSA)的2ml PBS中,过滤灭菌,并用于下一轮选择。对相同HA亚型或者对不同亚型的HA进行第二轮选择。
进行两轮连续选择,之后分离单独的单链噬菌体抗体。在第二轮选择后,单独的大肠杆菌集落用于制备单克隆噬菌体抗体。基本上,将单独的集落在96孔平板中生长至对数期,用VCS-M13辅助噬菌体感染,之后使得噬菌体抗体产生进行过夜。将含有噬菌体抗体的上清直接用于ELISA中以结合HA抗原。或者,将噬菌体抗体进行PEG/NaCl-沉淀并过滤灭菌,以进行ELISA和流式细胞计量术分析。
实施例3:HA特异性单链噬菌体抗体的确认
将含有在上述筛选中获得的单链噬菌体抗体的选择的上清在ELISA中确认特异性,即与不同HA抗原的结合。为此,用杆状病毒表达的重组H3(A/Wisconsin/67/2005)、H7(A/Netherlands/219/2003)和B(B/Ohio/01/2005)HA’s(Protein Sciences,CT,USA)包被MaxisorpTM ELISA平板。包被后,将平板用含有0.1%v/v Tween-20的PBS洗涤3次及在含有3%BSA或2%ELK的PBS中在室温封闭1小时。将选择的单链噬菌体抗体在含有4%ELK的等体积的PBS中保温1小时以获得封闭的噬菌体抗体。倒空该平板,用PBS/0.1%Tween-20洗涤3次,将封闭的单链噬菌体抗体加入孔中。保温1小时,将平板用PBS/0.1%Tween-20洗涤并使用与过氧化物酶缀合的抗M13抗体检测(使用OD492nm测量)结合的噬菌体抗体。作为对照,同时不使用单链噬菌体抗体及使用不相关阴性对照单链噬菌体抗体进行该方法。从用IgM记忆B细胞文库对不同HA抗原进行的选择中,获得特异于重组H3HA和H7HA的6个独特的单链噬菌体抗体(SC08-001、SC08-003、SC08-006、SC08-014、SC08-017和SC08-018)。此外,分离了特异于重组H3HA(SC08-015和SC08-016)的2个独特的单链噬菌体抗体及特异于重组H7HA(SC08-007、SC08-009、SC08-010、SC08-011和SC08-013)的5个独特的单链噬菌体抗体。见表6。
或者,使用PEG/NaCl-沉淀的及过滤灭菌的噬菌体抗体确认ELISA结合及特异性。为此,将杆状病毒表达的重组甲型流感病毒H1(A/NewCaledonia/20/1999)、H3(A/Wisconsin/67/2005)、H5(A/Vietnam/1203/2004)、H7(A/Netherlands/219/2003)和乙型流感病毒(B/Ohio/01/2005,B/Malaysia/2506/2004,B/Jilin/219/2003)HA’s(Protein Sciences,CT,USA)包被MaxisorpTM ELISA平板。包被之后,将平板用含有0.1%v/v Tween-20的PBS洗涤3次并在含有3%BSA或2%ELK的PBS中在室温封闭1小时。将选择的单链噬菌体抗体在等体积的含有4%ELK的PBS中保温1小时以获得封闭的噬菌体抗体。倒空该平板,用PBS/0.1%Tween-20洗涤3次,将封闭的单链噬菌体抗体加入孔中。继续保温1小时,将该平板用PBS/0.1%Tween-20洗涤,结合的噬菌体抗体用与过氧化物酶缀合的抗-M13抗体检测(使用OD 492nm测量)。作为对照,不用单链噬菌体抗体及使用阴性对照单链噬菌体抗体同时进行该程序。从使用IgM记忆B细胞文库对不同HA抗原的选择中,获得特异于重组H1、H3和H7HA的2个独特的单链噬菌体抗体(SC08-001和SC08-014)。此外,分离了特异于重组H3HA的6个独特的单链噬菌体抗体(SC08-003、SC08-006、SC08-015、SC08-016、SC08-017和SC08-018)及5个特异于重组H7HA的独特单链噬菌体抗体(SC08-007、SC08-009、SC08-010、SC08-011和SC08-013)。见表7。
或者,使用PEG/NaCl-沉淀的和过滤灭菌的噬菌体抗体通过FACS分析确认结合和特异性。为此,使全长重组甲型流感病毒亚型H1(A/NewCaledonia/20/1999)、H3(A/Wisonsin/67/2005)、H5(TV)、H7(A/Netherlands/219/2003)和乙型流感病毒(B/Ohio/o1/2005)HA在PER.C6细胞表面上表达。将该细胞与单链噬菌体抗体保温1小时,随后用PBS+0.1%BSA洗涤3次。结合的噬菌体用FITC缀合的M13-抗体检测。从使用IgM记忆B细胞文库对不同HA抗原的选择中,分离了特异于甲型流感病毒亚型H1、H3和H7HA的一个单链噬菌体抗体(SC08-001)。此外,分离了特异于H3HA的6个独特的单链噬菌体抗体(SC08-003、SC08-006、SC08-015、SC08-016、SC08-017和SC08-018)、特异于H7HA的4个独特的单链噬菌体抗体(SC08-007、SC08-010、SC08-011和SC08-013)。见表8。其中6个噬菌体抗体(SC08-001、SC08-003、SC08-015、SC08-016、SC08-017、SC08-018)用于构建完全人免疫球蛋白以进一步鉴定(见实施例5)。
实施例4:甲型流感病毒(H3N2)HA特异性永生化B细胞克隆的选择和确认
除了噬菌体展示之外,本发明的结合分子也可以通过其它方法分离,例如使用永生化B细胞,如WO 2007067046所述。将衍生自接种的供体的的永生化IgM记忆细胞(CD19+/CD27+,IgD+)用APC标记的H3HA染色,并将淘选的单细胞进行限制性稀释培养。在回收及细胞扩展后,通过固相ELISA测量H3HA淘选的细胞的上清的H1、H3和H7免疫反应性。
随后,鉴定靶特异性B细胞的结合活性和中和作用。将B细胞通过限制稀释克隆,产生单一克隆。将这些克隆种植在培养平板中,培养细胞14天。筛选克隆上清的抗-HA单克隆抗体的产生情况,所述抗-HA单克隆抗体结合表达H1、H3、H5和H7衍生的HA的HA转染的293细胞。作为特异性或者背景染色的对照,使用未转染的293细胞。
为了确定在上述筛选中获得的含有IgM或IgG抗体的选择的B细胞克隆上清是否能阻断甲型流感病毒(H3N2)感染,进行体外病毒中和测定(VNA)。在MDCK细胞(ATCC CCL-34)上进行VNA。将MDCK细胞在MDCK细胞培养基(MEM培养基,补加抗生素、20mM Hepes和0.15%(w/v)碳酸氢钠(完全MEM培养基),补加10%(v/v)胎牛血清)中培养。将在测定中使用的毒株H3N2(A/Wisconsin/67/2005)稀释至5.7×103TCID50/ml效价(50%组织培养物感染剂量/ml),效价根据Spearman和Karber方法计算。在一式四份孔中将IgG或者IgM制备物在完全MEM培养基中进行2-倍系列稀释(1∶2-1∶64)。将25μl各个IgG稀释液与25μl病毒悬浮液(100TCID50/25μl)混合,在37℃保温1小时。然后将此悬浮液移至96孔平板的一式四份孔中,所述孔中含有在50μl完全MEM培养基中铺满的MDCK培养物。在使用前,将MDCK细胞以3x104个细胞/孔种植在MDCK细胞培养基中,生长直至细胞达到铺满,用300-350μl PBS、pH 7.4洗涤,最后将50μl完全MEM培养基加入每个孔中。接种的细胞在37℃培养3-4天,每天观测致细胞病变作用(CPE)的发生。将CPE与阳性对照进行对比。
在检测的187个IgG上清中,发现43个中和这个测定中使用的H3N2(A/Wisconsin/67/2005)毒株。其中14个用于构建人IgG免疫球蛋白,如实施例5所述。
实实例5:从选择的单链Fv和B细胞克隆构建完全人免疫球蛋白分子(人单克隆抗体)
从选择的特异性单链噬菌体抗体(scFv)克隆中获得质粒DNA,根据标准技术确定核苷酸和氨基酸序列。通过限制性消化直接克隆scFv的重链和轻链可变区,以在IgG表达载体pIg-C911-HCgammal(见SEQ ID No:189)、pIG-C909-Ckappa(见SEQ ID NO:190)或者pIg-C910-Clambda(见SEQ IDNo:191)中表达。将B细胞克隆的重链和轻链可变区通过PCR扩增并通过限制性消化直接克隆以在IgG表达载体pIg-C911-HCgammal(见SEQ IDNo:190)、pIG-C909-Ckappa(见SEQ ID NO:191)或者pIg-C910-Clambda(见SEQ ID No:192)中表达。确定scFv的VH和VL基因相同性(见Tomlinson IMet al.V-BASE Sequence Directory.Cambridge United Kingdom:MRC Centrefor Protein Engineering(1997))(见表9)。
根据本领域技术人员已知的标准技术证实所有构建体的核苷酸序列。所得的编码人IgG1重链和轻链的表达构建体在293T细胞中组合瞬时表达,使用标准纯化方法获得并产生含有人IgG1抗体的上清。将人IgG1抗体在10-0.003μg/ml浓度范围对H3、H7或B抗原进行滴定(数据未示出)。不相关抗体作为对照抗体。
选择的免疫球蛋白分子的重链和轻链的CDR的氨基酸序列在表9中给出。重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列在下文给出。所述免疫球蛋白包含CR6261的重链和轻链恒定区,如下文示出。
实实例6:通过H3N2结合IgG(病毒中和测定)对流感病毒的体外中和
为了确定选择的IgG是否能阻断甲型流感病毒(H3N2)感染,进行体外病毒中和测定(VNA)。对MDCK细胞(ATCC CCL-34)进行VNA。将MDCK细胞在MDCK细胞培养基中培养(MEM培养基,补加了抗生素、20mMHepes和0.15%(w/v)碳酸氢钠(完全MEM培养基),补加10%(v/v)胎牛血清)。将用于该测定中的H3N2(A/Wisconsin/67/2005)毒株稀释至5,7x103TCID50/ml效价(50%组织培养物感染剂量/ml),效价根据Spearman和Karber所述方法计算。将IgG制备物(200μg/ml)在一式四份孔中在完全MEM培养基中2-倍系列稀释(1∶2-1∶512)。将25μl各个IgG稀释液与25μl病毒悬浮液(100TCID50/25μl)混合,在37℃保温1小时。然后将该悬浮液移至96孔平板的一式四份孔中,孔中含有在50μl完全MEM培养基中铺满的MDCK培养物。在使用之前,将MDCK细胞以3x104个细胞/孔种植在MDCK细胞培养基中,生长直至细胞达到铺满,用300-350μl PBS pH 7.4洗涤,最后向每个孔中加入50μl完全MEM培养基。将接种的细胞在37℃培养3-4天,每天观测致细胞病变作用(CPE)的发生。将CPE与阳性对照进行对比。
对实施例5的人抗-H3HA和/或抗-H7HA抗体进行上述VNA。在这些抗体中,除了CR8040、CR8052和CR8069之外的所有抗体均中和A/Wisconsin/67/2005H3N2毒株。这些抗体保护MDCK培养物免于CPE的浓度(μg/ml)在表11中示出。
实施例7:抗-H3N2 IgG的交叉结合反应性
在ELISA中确认上述H3N2中和IgG抗体的结合特异性,即与不同HA抗原的结合。为此,杆状病毒表达的重组H1(A/New Caledonia/20/1999)、H3(A/Wisconsin/67/2005,A/New York/55/2004,A/Wyoming/3/2003)和H7(A/Netherlands/219/2003)HA’s(Protein Sciences,CT,USA)包被MaxisorpTMELISA平板。包被之后,将平板用含有0.1%v/v Tween-20的PBS洗涤3次并在含有3%BSA或2%ELK的PBS中在室温封闭1小时。倒空平板,用PBS/0.1%Tween-20洗涤3次,将所述IgG抗体加入孔中。继续保温1小时,将平板用PBS/0.1%Tween-20洗涤,使用与过氧化物酶缀合的抗人IgG抗体检测结合的抗体(使用OD 492nm测量)。作为对照,使用不相关的IgG CR4098。
从选择的H3N2中和抗体中,CR8001示出与所有检测的重组HA的异源亚型(heterosubtypic)交叉结合,CR8020、CR8021、CR8041、CR8043和CR8057示出与所有三个检测的H3HA以及H7HA的异源亚型交叉结合。CR8003、CR8015、CR8016、CR8017、CR8018、CR8038、CR8039、CR8040、CR8049、CR8050、CR8052和CR8069示出与所有3个检测的H3HA的交叉结合。一个抗体CR8019示出仅结合2个H3HA。见表12。
此外,选择的H3N2中和抗体用于通过FACS分析检测异源亚型结合。为此,使全长重组甲型流感病毒亚型H1(A/New Caledonia/20/1999)、H3(A/Wisonsin/67/2005)和H7(A/Netherlands/219/2003)HA在PER.C6细胞表面上表达。将细胞与IgG抗体保温1小时,随后用PBS+0.1%BSA洗涤3次。结合的抗体用PE缀合的抗人抗体检测。作为对照,使用未转染的PER.C6细胞。
从H3N2中和抗体中,CR8001示出对甲型流感病毒亚型H1、H3和H7HA的交叉结合活性而野生型PER.C6细胞没有。此外,CR8020和CR8041示出与H3和H7HA均强力结合。CR8043和CR8057示出与H3HA强力结合,与H7HA弱结合。CR8055示出在PER.C6细胞上低水平背景染色。剩余的13种抗体示出仅与H3转染的细胞结合。见表12。
实施例8:抗-H3N2 IgG的交叉中和活性
为了确定选择的IgG是否能阻断多个甲型流感病毒毒株,进行另外的体外病毒中和测定(VNA)。对MDCK细胞(ATCC CCL-34)进行VNA。将MDCK细胞在MDCK细胞培养基中培养(MEM培养基,补加了抗生素、20mM Hepes和0.15%(w/v)碳酸氢钠(完全MEM培养基),补加10%(v/v)胎牛血清)。将该测定中使用的H1N1(A/New Caledonia/20/1999A/Brisbane/59/2007和A/Solomon Islands/IVR-145)、H3N2(A/HongKong/1/68,A/Johannesburg/33/94,A/Panama/2000/1999,A/Hiroshima/52/2005和A/Wisconsin/67/2005)、H7N3(A/Mallard/Netherlands/12/2000)以及H10(A/Chick/Germany/N/49)毒株均稀释至5,7x103TCID50/ml效价(50%组织培养物感染剂量/ml),效价根据Spearman和Karber所述方法计算。将IgG制备物(80μg/ml)在一式四份孔中用完全MEM培养基2-倍系列稀释(1∶2-1∶512)。将25μl各个IgG稀释液与25μl病毒悬浮液(100TCID50/25μl)混合,在37℃保温1小时。然后将悬浮液移至96孔平板的一式四份孔中,所述孔中含有在50μl完全MEM培养基中的铺满MDCK培养物。在使用之前,将MDCK细胞以3x104个细胞/孔种植在MDCK细胞培养物中,生长直至细胞达到铺满,用300-350μl PBS,pH 7.4洗涤,最后在每个孔中加入50μl完全MEM培养基。将接种的细胞在37℃培养3-4天,每天观察致细胞病变作用(CPE)的发生。将CPE与阳性对照对比。
从一组H3N2中和抗体中,CR8020和CR8041示出对所有检测的甲型流感病毒亚型H3、H7和H10病毒的异源亚型交叉中和活性,但是对H1病毒没有。此外,CR8043示出对所有检测的H3和H10病毒毒株的交叉中和作用。CR8039、CR8041、CR8043和CR8057示出对所有检测的H3病毒毒株的交叉中和作用。另外的13种抗体示出对1种以上检测的H3病毒毒株的交叉中和作用。见表13。
实施例9:抗-H3N2抗体结合HA的融合前构象
为了确定选择的IgG是否能结合HA分子的融合前或者融合后构象,进行体外pH转移实验。
为此,使全长重组甲型流感病毒亚型H3(A/Wisonsin/67/2005)HA在PER.C6细胞表面上表达。为了测定在不同结构HA构象的特异性反应性,将3×105个细胞用在DMEM中的10μg/ml胰蛋白酶-EDTA在室温处理30分钟,洗涤及在酸化PBS(pH 4.9)中保温5分钟,洗涤,然后在存在20mMDTT条件下在室温保温20分钟。使细胞在每个步骤均***,未处理的粘附细胞重悬于0.05%EDTA中。将每次处理的细胞级分与抗-H3N2 IgGCR8001、CR8020、CR8041、CR8043和CR8057保温30分钟。然后将细胞与藻红蛋白缀合的抗-IgG(Southern Biotech)保温30分钟。使用FACSCalibur用CELLQuest Pro软件(Becton Dickinson)分析染色的细胞。在用胰蛋白酶(条纹条)、pH 4.9缓冲的介质(实心白条)以及DTT(交叉条)相继处理后测量IgG1与表面表达的H3rHA的FACS结合并以与未处理的rHA(实心黑条)的结合百分比表示。见图2。
抗体CR8001、CR8020、CR8041和CR8043均示出在pH转移后结合显著降低,表明对于表位的特异性仅存在于低pH诱导的HA分子构象改变之前。抗体CR8057示出仅在DTT处理后结合降低,表明仅当存在HA1时才能获得对于构象非依赖性表位的特异性。
实施例10:抗-H3N2抗体CR8041阻止HA0裂解
为确定选择的IgG是否能保护HA分子免于蛋白酶裂解,进行体外蛋白酶易感性测定。
为此,对7.5μg重组可溶甲型流感病毒亚型H3(A/Wisonsin/67/2005)HA(Protein Sciences,CT,USA)在37℃进行1小时不同pH(4.9、5.3和8.0)处理。在保温后,中和反应。将样品在存在和不存在7.5μg CR8041或CR8057Fab片段的条件下用0.5μg胰蛋白酶消化过夜。通过加入SDS加样缓冲液猝灭反应。在每个样品中加入3μl Nupage还原剂(Invitrogen)。将样品在1x MOPS缓冲液中4-12%BisTris凝胶上运行。蛋白质条带通过胶体蓝染色观测(见图3)。在不存在Fab条件下,H3HA分子在pH 4.9或5.3易于被转变为其蛋白酶易感的融合后形式,但是在pH 8.0则否。在存在Fab片段CR8057条件下,H3HA的降解及因此在pH4.9的构象变化不被抑制。相反,FabCR8041的存在不仅防止在低pH条件下H3HA的构象变化和降解,而且还防止HA0的pH非依赖性裂解为HA1和HA2。这些结果表明CR8041的表位在裂解位点上或者在其附近。用抗-H3N2抗体进行的竞争实验(结果未示出)表明CR8001、CR8020和CR8043抗体的重叠表位和相似工作机制。
实施例11:本发明结合分子的作用机制
HA糖蛋白是三聚体,其中每个单体由两个二硫键连接的糖多肽(称作HA1和HA2)组成,其是在感染期间由于前体(HA0)的蛋白酶解而产生的。裂解是病毒感染性必需的,因为其需要引发HA的膜融合,使得构象改变。
引发的分子的活化在内体中在pH5-pH6之间的低pH条件下发生,且需要HA结构的广泛改变。融合前未裂解的(I)、融合前裂解的(II)以及融合后HA(III)构象的三维结构在图4中示出。
在体外,HA分子的构象改变可以使用HA表面表达哺乳动物细胞模拟。首先,可以通过向细胞中加入胰蛋白酶而触发蛋白酶解。其次,融合前至融合后的构象改变可以通过降低pH实现。此外,所述分子的HA1部分可以通过加入还原剂如DTT而除去。以此方式及通过在特定阶段加入抗体,可以检验所述抗体在哪个阶段干扰感染进程。为此,将PER.C6细胞用携带来自A/Wisonsin/67/2005的HA的H3HA表达构建体转染并进行如实施例10所述的不同处理。
对于这个实验,首先将细胞与抗-H3mAb在胰蛋白酶裂解之前保温,随后如上述进行处理(见图5)。
抗-H3mAb的结合通过使用PE缀合的抗人抗体根据标准方案进行检测。荧光信号通过FACS分析测量。“仅细胞”是指在mAb与未处理的细胞结合后获得的信号,设定为100%。从图5可以看出,在不同处理后所述mAb仍结合HA。因为在实施例10中表明H3mAb CR8020、CR8041和CR8043仅结合融合前状态(即在由于降低pH而导致构象改变之前),由此推断抗体的结合实际上至少在体外抑制胰蛋白酶裂解(也见实施例10),且因此也抑制随后的导致构象改变和融合的步骤。结合在受体附着位点附近的HA分子的HA1部分的抗体CR8057在构象改变之后能结合HA,以及正如所期望的HA1部分在当通过DTT处理使得HA1与HA2结构域之间的二硫键破坏之后被除去时丧失。
胰蛋白酶裂解的抑制随后在不同的体外实验中证实。首先,进行时程实验以确定应将H3HA与胰蛋白酶保温多长时间以实现HA0适当地裂解为HA1和HA2。为此,将重组可溶H3HA(A/Wisconsin/67/2005;ProteinSciences,CT,USA)在含有6.7μg/ml胰蛋白酶和1%N-dodecyl-β-demaltosid的4mM Tris.HCl缓冲液pH8.0中保温。在不同时间点通过加入1%BSA终止胰蛋白酶消化。根据标准方法使样品在SDS-page凝胶(还原的)上运行和印迹。HA0、HA1和HA2条带使用兔抗-H3HA多克隆抗体(Protein Sciences,CT,USA)检测。图6示出2小时保温足以几乎完全裂解,通过还原凝胶上HA1和HA2条带的显现而证实。接下来,将重组可溶H3HA与CR8020、CR8041、CR8043或CR8057任一保温,随后在pH8.0进行胰蛋白酶裂解。胰蛋白酶消化再次在不同时间点通过加入1%BSA终止。将样品在SDS-page凝胶(还原的)上运行及印迹。HA0、HA1和HA2条带使用抗-H3多克隆抗体进行检测。结果示出所有这三种mAb CR8020、CR8041和CR8043均阻止体外胰蛋白酶裂解,因为与抗体结合的H3HA与胰蛋白酶保温导致凝胶上HA的HA0形式被保护(图7)。相反,H3HA与对照mAb(CR8057)在相同条件下保温导致HA0条带消失。这个实验证实在实施例10中针对CR8041揭示的数据,并将这个观测结果扩展至CR8020和CR8043抗体。本发明的结合分子因此至少在体外防止HA0分子的胰蛋白酶裂解。然而,应注意这不排除另外的抑制作用也由CR8020、CR8041和CR8043mAb介导,其在感染过程的更下游且导致干扰pH诱导的构象改变和/或融合过程。
为研究是否可能存在这种情况,重复上述实验,但是仅在胰蛋白酶裂解之后,将抗体CR8043或作为对照的抗体CR8057加入表达H3HA的细胞中。在保温之后,随后将细胞如实施例10所述在低pH条件下保温及用DTT处理。如果作用机制限于胰蛋白酶裂解抑制,期望所述mAb CR8043在pH处理后丧失结合,因为我们在实施例10中已经确定所述抗体不结合HA的融合后构象。相反,从图8中可以看出,mAb CR8043结合在暴露于低pH及随后DTT处理后仍被检测到,表明pH诱导的构象改变至少在体外也由CR8043抑制。已经示出结合HA的HA1区的CR8057正如期望地起作用,而且当HA1部分在DTT处理后丧失时不再可检测到。
为了检验抗体CR8020和CR8041是否也能阻断HA的pH诱导的构象改变,重复上述实验。现在在上述所有处理之后、在低pH保温之前或者在胰蛋白酶裂解之前,将抗体CR8020、CR8041和CR8043或者作为对照的抗体CR8057加入表达A/Hong Kong/1/1968、A/Hong Kong/24/1985或者A/Wisconsin/67/2005亚型H3HA的细胞中。
如先前对于A/Wisconsin/67/2005 H3HA所示,CR8020、CR8041和CR8043抗体识别仅在低pH处理之前存在的表位。这个表位在用于这个实验中的三个HA中是保守的,从图9c中可以看出。如果作用机制限于胰蛋白酶裂解的抑制,预期mAb CR8020、CR8041和CR8043在pH处理后丧失与已经裂解的HA的结合,因为我们在实施例10中已经确定所述抗体不结合HA的融合后构象。相反,从图9b可以看出三种不同的H3HA在暴露于低pH及随后的DTT处理之后仍可检测到mAb结合,表明pH诱导的构象改变至少在体外也被CR8020、CR8041和CR8043抑制。已经示出结合HA的高可变HA1区的CR8057示出不结合A/Hong kong/1/1968和A/Hong Kong/24/1985HA。
实施例12:体外产生的逃逸突变体表明所述表位的位置与H3HA中保守序列一致
为了研究CR8020、CR8041和CR8043结合HA中的哪个区域,尝试在体外培养物中产生逃逸突变体。将A/Hong Kong/1/1968病毒在存在限制量的单克隆抗体的条件下在MDCK细胞培养物中传代。首先,在用100TCID50单位的混合不同量单克隆抗体的MDCK细胞接种及保温3天之后,确定导致病毒感染降低3log的抗体浓度。将这个浓度的抗体加入系列传代的接种物中,在每次传代后,在不存在和存在不同量抗体的条件下对病毒进行噬斑滴定以确定该病毒是否仍对抗体介导的中和作用敏感。对每一个mAb CR8020、CR8041和CR8043进行这个程序。从每个培养物中可以通过噬斑测定分离逃逸病毒,从每个病毒的两个分离株中提取病毒RNA并用于确定HA序列。观测到的突变的氨基酸如下:
CR8020:D19N和Q27L,在分析的两个噬斑中;
CR8041:G33E,在两个噬斑中;
CR8043:R25M,在一个噬斑中;Q34R,在另一噬斑中。
所有三个单克隆抗体均示出在与融合肽相邻的HA干区的HA2部分中相似结构域中的逃逸突变。存在于NCBI流感病毒数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/select.cgi)中H3N2病毒的这个区域的氨基酸序列对比显示出该序列的一个明显保守。表14示出HA2区中W14与K39氨基酸之间的序列变异,标明了观测到的逃逸突变。N=具有特定序列的毒株数目。此外,也示出了分离年份以及在用H3抗体的中和试验中检测阳性的毒株(Pa=A/Panama/2000/1999;Wis=A/Wisconsin/67/2005;Hs=A/Hiroshima/52/2005;HK=A/HongKong/1/1968)。在含有所述HA2序列的数据库中存在的1363个H3病毒中,大部分(81%)具有示出被中和的病毒毒株中存在的序列。在剩下的序列中,大多数具有可以认为是保守改变的氨基酸。对于其它突变,需要功能性中和试验以确定所述改变是否影响抗体的功能性。重要的是在逃逸病毒实验发生的三个氨基酸改变(R25、G33和Q34)在天然流感病毒序列中不出现,另两个突变仅组合出现(D19和Q27),这是在天然序列中也不存在的一个组合。这可能意味着所述突变对于病毒适合度具有负面影响。总之,推断所述抗体与HA2上在H3亚型病毒之间高度保守的表位相互作用,证实所述单克隆抗体的广泛中和能力。
实施例13:进行体内实验的单克隆抗体的制备
为了能鉴定及随后确认IgG作为潜在的体内治疗抗体,需要以足够数量生产及纯化其。使IgG在PER.C6细胞中在25L Wave-bag中产生并收获培养物。从澄清的收获物中,使用A蛋白亲和性层析及缓冲液交换步骤纯化IgG。纯化的缓冲液交换的IgG的单体含量在0.2μm灭菌过滤之前和之后均是~99%。此外,用如上述获得的不同抗体制备物进行体外病毒中和测定(VNA)。结果在表15中示出。
实施例14:人IgG单克隆抗体对于体内致死性H3N2攻击的预防活性
在雌性129X1/SvJ小鼠(Jackson Labs)中用流感病毒A/HK/1/68-MA20(H3N2)病毒的小鼠致死性攻击模型检测mAb CR8020、CR8041和CR8043的预防效力(MA=小鼠适应的)。A/HK/1/68-MA20病毒得自E.G.Brown教授,University of Ottawa,Ottawa,Ontario,Canada;Brown,E.G.et al.(2001)。将该病毒在含胚鸡蛋中传代一次,之后用于所述小鼠实验。使所有小鼠适应环境并维持至少4天,之后再开始实验。
在攻击前一天在尾静脉(vena coccygeus)中通过静脉内注射给予30、10、3和1mg/kg的mAb,假定小鼠平均体重为18g/小鼠,给予固定剂量体积为0.2mL。然后对小鼠(n=8只/组)在第0天通过鼻内接种用25LD50A/HK/1/68-MA20(H3N2)病毒攻击。施用的病毒的实际剂量通过滴定在完成动物接种后剩余的接种物的少量复制样品估计。所述接种物的病毒效价(TCID50/mL)在MDCK细胞上确定。结果示出在所述接种物的制备或者施用期间没有无意病毒失活发生。从攻击前一天开始每天确定临床迹象和体重直至在第21天结束研究。用评分***对临床迹象打分(0=无临床征象;1=皮毛粗糙;2=皮毛粗糙,反应性较低,在操作期间被动状态;3=皮毛粗糙,蜷缩,呼吸困难,在操作期间被动状态;4=皮毛粗糙,蜷缩,呼吸困难,当背部向下躺时不滚回至腹部向下)。对得分为4的动物行安乐死。为了分析在第0天的mAb血浆水平及在第21天确定血凝抑制(HI)抗体的存在,在D0、攻击之前以及在感染后D21从所有小鼠中抽取血样。
在2个单独实验中检测mAb。在每个实验中,阴性对照抗体(CR3014)组给予30mg/kg。在第一个实验中检测mAb CR8020,在第二个实验中检测mAb CR8041和CR8043。
在适应环境期间,所有小鼠均是活性的且表现为无疾病迹象的健康状态。图10示出在施用mAb之后小鼠的存活率。观测到明显的剂量应答关系,给予30、10或者3mg/kg的CR8020、CR8041或者CR8043的所有组示出100%存活率,而在1mg/kg CR8020组中25%的小鼠存活,1mg/kgCR8041和CR8043组中无小鼠存活。两个对照mAb组示出0%存活率。在第一个实验中,与对照组相比(p<0.005;Log Rank Test),施用mAb CR8020在检测的所有四个浓度均导致存活时间存在统计学显著差异。在第二个实验中,与对照组相比(对于两个mAb均p<0.001;Log Rank Test),施用mAbCR8041和CR8043在检测的所有四个浓度均导致存活时间存在统计学显著差异。
在图11中,示出在施用mAb之后的21天研究期间小鼠的平均体重改变。与存活率一样,在体重下降与使用的抗体剂量之间存在明确的反比关系。当抗体浓度增加时,体重降低下降:给予30、10或者3mg/kg的CR8020、CR8041或者CR8043组中的小鼠示出从第0-21天平均体重增加大约10-15%,与年龄相关的体重增加一致,而在1mg/kg组及对照mAb组中小鼠的平均体重在研究期间降低。
使用曲线下面积(AUC)分析更详细地分析体重改变。对于这个分析,如果小鼠在研究继续期间死亡/行安乐死,则最后观测的体重结转至第21天。简而言之,第0天的体重/小鼠作为基线值,确定相对于基线的从0-21天的体重改变。AUC被定义为基线上面积和基线下面积的总和。使用多重比较Dunnet’s调整方差分析,将给予mAb组的平均AUC值与各自的对照组进行对比(表16)。
分析示出3、10和30mg/kg的CR8020、CR8041和CR8043组的平均AUC与相应对照组相比存在统计学显著差异(P<0.001)(表16)。对于1mg/kg CR8041-和CR8043组,当与对照组相比时发现统计学显著差异(分别为p=0.004及p<0.001)。然而,由于在CR8020 1mg/kg剂量组中两只小鼠存活,观测到体重变化增加及因此当与对照组相比时无统计学显著差异可被证实。
使用多重比较Tukey’s调整方差分析,通过对比每个抗体的每个抗体浓度的平均AUC值进行另外的分析以研究体重降低下降的剂量应答(表16)。对于mAb CR8020和CR8041,1mg/kg组的体重下降统计学上明显高于各自的3mg/kg组(p<0.001),而3、10和30mg/kg组之间无统计学显著差异(p>0.05)。对于mAb CR8043,1mg/kg组的体重下降统计学上显著高于3mg/kg组的(p<0.001);3mg/kg组的体重下降明显高于10mg/kg组的(p<0.001)。CR8043的10和30mg/kg组的平均AUC无明显差异(p=0.997)。
小鼠的中位数临床得分在图12中示出。给予30和10mg/kg的CR8020、CR8041或者CR8043的小鼠未示出任何临床迹象,通过在2项研究的第0-21天研究期间的中位数临床得分表明。mAb 8020在3mg/kg剂量组中也示出无临床得分,而在mAb 8041和8043的3mg/kg剂量组中观测到临床得分的中位数得分分别为1分和3分。在所有三种mAb的1mg/kg剂量组中,临床得分增加达到在所有组中的中位数得分为4分。在同一天对临床得分为4分的小鼠行安乐死。在CR8020 1mg/kg剂量组中2只存活的小鼠在研究的第7天发病并示出分别为1分和3分的最大临床得分。这两只小鼠均完全康复。在CR8041和CR8043 3mg/kg剂量组中,体重降低谱示出与临床得分谱相似的模式。
这些结果示出本文鉴别和揭示的至少三种人抗-H3N2抗体(CR8020、CR8041和CR8043)均能单独提供针对致死剂量流感病毒H3N2的体内保护作用。观测到在施用的每种抗体的量与存活率之间的明确剂量应答关系。结果示出当在感染前一天以10mg/kg或更高的剂量施用时,抗-H3N2 IgG抗体CR8041和8043能预防小鼠中H3N2感染的临床表现。当在感染前一天以3mg/kg或更高剂量施用时,mAb CR8020能预防小鼠中H3N2感染的临床表现。
实施例15:人IgG单克隆抗体对体内致死性l H3N2攻击的保护和治疗活性
进行研究以检测本文揭示的单克隆抗体如CR8020在感染后模型中对于致死性H3N2 A/HK/1/68-MA20流感病毒体内攻击的治疗作用。
在攻击前一天(第1组;预防阳性对照)或者在攻击后第1、2、3、4、5或者第6天(2-7组)在尾静脉(vena coccygeus)静脉内给予小鼠(n=10只/组)15mg/kg的mAb CR8020,假定小鼠平均体重为18g/小鼠,给予固定剂量体积0.2mL。第8组在攻击后第1天接受阴性对照mAb CR3014(15mg/kg)。将小鼠在第0天用25LD50(2.8log TCID50)A/HK/1/68-MA20(H3N2)病毒通过鼻内接种进行攻击。病毒批次和类型以及鼠龄与实施例14所用相同。从攻击前一天开始直至在第21天研究结束,每日确定临床迹象和体重。
图13A示出在静脉内施用mAb CR8020(15mg/kg,所有组)或者对照mAb(15mg/kg)之后小鼠的存活率。当在攻击前1天或者攻击后1或2天施用15mg/kg mAb CR8020时,所有动物在病毒攻击下均存活,而在对照mAb组中存活率为0%。当在攻击后3或4天施用15mg/kg mAb CR8020时,观测到分别为50%和10%的存活率。这些组的每一组存活时间与对照组相比存在统计学显著差异(第3天组:p<0.001,第4天组:p=0.002;Log Rank Test)。用15mg/kg CR8020处理的组在第5或6天示出存活率为0%。在第5或6天处理组与对照组相比存活时间无统计学显著差异(分别为p=0.648和p=0.342;Log Rank Test).
在图13B中,示出在21天研究期间相对于第0天的小鼠平均体重改变。与存活率一样,体重降低与施用15mg/kg mAb CR8020的时间存在明确关系:当在较晚的时间点施用15mg/kg mAb CR8020处理时,体重降低增加。
使用曲线下面积(AUC)分析,对体重改变进行更详细的统计学分析(表17)。对于曲线下面积分析,如果小鼠在研究继续期间死亡/行安乐死,则最后观测的体重结转至第21天。简而言之,在第0天的体重/小鼠作为基线值,确定相对于基线的从第0-21天的体重改变。AUC被定义为基线上面积和基线下面积的总和。
小鼠的中位数临床得分示于图13C。在攻击前一天用15mg/kg CR8020处理的小鼠在观测期间全部存活,无一示出任何临床迹象。在攻击后第1天用15mg/kg CR8020处理的小鼠示出100%存活,然而10只小鼠中的4只示出临床迹象,达到在1-3之间的最大临床得分。在攻击后第2天用15mg/kg CR8020处理的动物全部存活。然而,10只小鼠中有9只示出临床迹象,达到2或3分的最大临床得分。在攻击后第3天用15mg/kg CR8020处理的动物示出50%存活率。在存活的小鼠中(n=5),所有小鼠均示出临床迹象,最大临床得分3分。在攻击后第4天用15mg/kg CR8020处理的动物除了一只之外全部死亡。存活的小鼠示出临床迹象,达到最大临床得分2分。经处理存活的所有小鼠在21天均无症状。
使用GENMOD程序(SAS)分析临床得分以对于用小鼠作为对象的重复测量和在分类量表上测量的数据拟合模型(表18)。由于该曲线具有不同模式,因此在这个模型中输入可变的“天数”作为类别变量(class variable)。在其中100%动物存活的、攻击前1天和攻击后第1和2天用15mg/kg mAbCR8020处理组中,在最多21天的研究期间其中位数临床得分与对照mAb组明显不同(三组均p≤0.001)。在攻击后第3或4天用15mg/kg mAb CR8020处理组中(其中分别具有50%和10%的小鼠存活),其在最多21天研究期间的中位数临床得分与对照mAb组也显著不同(两组均p<0.05)。在攻击后第5或6天用15mg/kg mAb CR8020处理组中,中位数临床得分与对照mAb组仅在第3天具有显著不同(p≤0.001)。这种差异尽管具有统计学显著性,但不认为是相关的。
综上所述,在致死性H3N2小鼠模型中,在直至攻击后第2天用15mg/kg的mAb CR8020治疗提供100%保护作用。当在攻击后第3天或第4天施用15mg/kg mAb CR8020治疗时提供部分保护作用。当在攻击后第5或第6天施用时,在致死性H3N2小鼠模型中观测到15mg/kg mAb CR8020无保护作用。
这些结果示出在感染后用本文揭示的针对H3N2流感病毒的单克隆抗体如抗体CR8020进行治疗,在致死剂量H3N2流感病毒攻击后可以挽救哺乳动物对象如本文小鼠所示。即使在晚期,即在感染后第4天,所述抗体也能部分保护小鼠免于流感病毒H3N2致死感染。引人注目地,在感染后第21天,所有存活的经抗体治疗的动物均达到正常体重水平且不示出任何残余临床迹象。
实施例16:人IgG单克隆抗体针对体内致死性H7N7攻击的预防活性
进行研究以检测本文所述单克隆抗体如CR8020针对体内流感病毒H7N7的致死性攻击的预防作用。在小鼠致死攻击模型中检测mAb CR8020的预防效力,使用小鼠适应的流感病毒A/Chicken/Netherlands/621557/2003(H7N7)病毒(Central Veterinary Institute(CVI),Lelystad,The Netherlands)。使A/CH/NL/621557/03(H7N7)病毒在肺-肺传代3次之后以适应小鼠。在CVI实验室中将小鼠适应的H7N7 3代病毒在含胚鸡卵中增殖。使所有小鼠(Balb/c,雌性,6-8周龄,n=8只/组)适应环境并维持至少4天,之后再开始实验。在攻击前一天在尾静脉(vena coccygeus)静脉内给予30、10、3或者1mg/kg的mAb CR8020,假定小鼠平均体重为18g/小鼠,给予固定剂量体积0.2mL。对照组给予30mg/kg阴性对照mAb CR3014。然后将小鼠在第0天用25LD50A/CH/NL/621557/03(H7N7)病毒通过鼻内接种进行攻击。施用的病毒的实际剂量通过滴定在完成动物接种后剩余的接种物的少量复制样品估计。接种物的病毒效价(TCID50/mL)在MDCK细胞上确定。从攻击前一天开始直至在第21天结束,以如实施例14所述相同方式每日确定临床迹象和体重。为了分析在第0天的mAb血浆水平以及确定在第21天血凝抑制(HI)抗体的存在,在D0、就在攻击之前以及在感染后D21从所有小鼠中抽取血样。
所有小鼠在适应环境期间均是活性且表现为无疾病迹象的健康状态。图14A示出在施用mAb之后小鼠的存活率。给予1mg/kg或更多的mAbCR8020的小鼠示出存活率为100%,而在对照mAb组中存活率为0%。图14B示出了在施用mAb之后的21天研究期间小鼠的平均体重变化。在mAbCR8020的3、10和30mg/kg组中,小鼠在21天研究期间未示出体重降低,而在mAb CR8020 1mg/kg以及对照mAb组中观测到体重降低,在mAbCR8020 1mg/kg组中小鼠平均体重在第21天恢复至基线水平。使用曲线下面积(AUC)分析更详细地分析体重变化(表19)。对于曲线下面积分析,如果小鼠在研究继续期间死亡/行安乐死,则最后观测的体重结转至第21天。简而言之,在第0天的体重/小鼠作为基线值,确定相对于基线的从第0-21天的体重改变。AUC被定义为基线上面积和基线下面积的总和。
在体重降低与抗体使用剂量之间存在明确的反比关系。当抗体浓度增加时,体重降低下降。与对照mAb组相比,mAb CR8020的1、3、10和30mg/kg组中体重降低的平均差异分别是47.44、79.75、86.71和80.48g*天。所有差异均是统计学显著的(p<0.001)。
小鼠的中位数临床得分在图14C中示出。除了一或两只外,每个组内的所有动物在攻击后第1天均示出临床迹象(得分=1)。这可能与病毒攻击不相关,因为该研究中的未攻击组在第1天也示出相似作用(数据未示出)。
在攻击前1天用3、10或者30mg/kg mAb CR8020处理的小鼠中,在观测期间所有小鼠均存活且无一动物示出任何临床迹象(从感染后第2天至第21天)。在攻击前1天用1mg/kg mAb CR8020处理的小鼠示出100%存活率,但是8只小鼠中的8只示出临床迹象,达到最大临床得分3分。
这些结果示出本文鉴别和揭示的人抗-H3N2抗体CR8020(CR8020)能提供针对体内致死剂量流感病毒H7N7的异源亚型保护作用。当在感染前一天以3mg/kg或更高剂量施用时,mAb CR8020在小鼠中能完全预防H7N7感染的临床表现。在感染前一天以1mg/kg CR8020剂量施用时,所有小鼠在致死攻击下均存活,在21天研究期间结束时观测到体重降低和临床迹象完全消失。
进行另外研究以评估和对比mAb CR8020、CR8041和CR8043在H7N7小鼠模型中的预防效力。在小鼠致死性攻击模型中,检测mAb CR8020、CR8041和CR8043(在PER.C6
细胞中产生)的预防效力,使用小鼠适应的流感病毒A/Chicken/Netherlands/621557/2003(H7N7)病毒(Central VeterinaryInstitute(CVI),Lelystad,The Netherlands。简而言之,使所有小鼠(Balb/c,雌性,6-8周龄,n=8只/组)适应环境并维持至少4天,之后开始实验。在攻击前一天在尾静脉(vena coccygeus)静脉内给予10、3或1mg/kg的mAbCR8020,假定小鼠平均体重为18g/小鼠,固定剂量体积0.2mL。以相同方式给予30、10、3或者1mg/kg的mAb CR8041和CR8043。对照组给予30mg/kg阴性对照mAb CR3014。在施用mAb后,在第0天用25LD
50小鼠适应的A/CH/NL/621557/03(H7N7)通过鼻内接种攻击小鼠。从攻击前一天直至第21天研究结束,每日确定临床迹象和体重。
图15示出了在预防性施用所述mAb之后小鼠的存活率、体重改变百分比以及临床得分。如图15A示出,在接受3或10mg/kg CR8020、10或30mg/kg CR8041以及接受30mg/kg CR8043的组中观测到100%存活率。在对照mAb组中,存活率为0%。预防性施用所有这三个剂量水平的CR8020以及所有4个剂量水平的CR8041与对照mAb组相比均提供了统计学显著的存活时间改善(log-rank,p<0.002)。预防性施用1mg/kg的CR8043与对照mAb组相比未导致存活时间统计学显著改善(log-rank,p=0.692)。将CR8043剂量增加至3mg/kg或更多导致与对照mAb组相比存活时间统计学显著改善(log-rank,p≤0.034)。
在事后分析中,对比mAb CR8020、CR8041和CR8043最低剂量组的存活时间。预防性施用1mg/kg CR8020导致与施用1mg/kg的CR8041和1mg/kg的CR8043相比其存活时间统计学显著改善(log-rank,分别为p=0.029和p<0.001)。此外,预防性施用1mg/kg CR8041导致当与施用1mg/kg CR8043相比时存活时间统计学显著改善(log-rank,p=0.004)。
图15B示出在预防性施用所述mAb之后,在21天研究期间小鼠的平均体重改变。在mAb CR8020和mAb CR8041的1mg/kg组中,观测到与对照mAb组相当的体重降低。在较高剂量mAb CR8020和CR8041组中,在21天研究期间体重降低有限或者不降低。在给予mAb CR8043的组中,在所有组都观测到严重的体重降低,给予30mg/kg组的平均体重在第21天几乎恢复到基线水平。用曲线下面积(AUC)分析更详细地分析体重变化(表21)。在体重降低与抗体使用剂量之间存在明确的反比关系。当抗体浓度增加时,体重降低下降。使用1mg/kg的CR8020与对照组相比体重降低无统计学显著下降(p=0.356)。剂量增加至3或10mg/kg导致与对照组相比体重降低统计学显著下降(在两种情况中均p<0.001)。使用1mg/kg的CR8041,与对照组相比体重降低无统计学显著下降(p=1)。
剂量增加至3、10或者30mg/kg CR8041导致与对照组相比体重降低统计学显著下降(在三种情况中均p<0.001)。使用1、3或者10mg/kg的CR8043与对照组相比体重降低无统计学显著下降(分别为p=0.997、0.510和0.992)。剂量增加至30mg/kg导致与对照组相比体重降低统计学显著下降(p<0.001)。在另外的体重变化数据平均AUC分析中,使用单变量方差分析对比mAb CR8020、CR8041和CR8043,模型中包含抗体和剂量作为固定因子。由于该研究中不包含30mg/kg的CR8020剂量,因此对比限于1、3和10mg/kg抗体剂量。通过使用多重比较Sidak调整边际均数估计抗体之间的差异。在这三个抗体剂量中,用CR8020处理与CR8041和CR8043相比导致体重降低统计学显著下降(边际均数中平均差异分别为23.73和68.29g*day,p=0.013和p<0.001)。此外,用CR8041处理导致与CR8043相比体重降低统计学显著下降(边际均数中差异为44.56g*day,p<0.001)。
小鼠的中位数临床得分在图15C中示出。除了在第0天有一只(3mg/kgCR8020组)之外,所有小鼠在第0-3天均示出临床迹象(得分=1,皮毛粗糙))。这个增加在适应环境期间和攻击前一天未观测到。导致这个临床得分增加的原因还未十分明确。在攻击前一天用3或10mg/kg mAb CR8020处理组中,中位数临床得分在攻击后第9天恢复至0分;而在对照组中,中位数临床得分在第8天为4分,所有小鼠在第9天均死亡或行安乐死。1mg/kgCR8020处理组示出在第4-13天中位数临床得分为3分,在第15天恢复至0分。在攻击前一天用3、10或30mg/kg mAb CR8041处理组中,中位数临床得分分别在攻击后第9、10或12天恢复至0分。1mg/kg CR8041组在攻击后第10天中位数临床得分达到4分。在用1、3或10mg/kg CR8043处理组中,中位数临床得分分别在第9、9或12天达到4分;而30mg/kg CR8043组的中位数临床得分在第6-13天达到3分及在第14天恢复至0分。
上述结果清晰示出人抗-H3N2抗体CR8020、CR8041和CR8043能提供针对体内致死剂量流感病毒H7N7攻击的异源亚型保护作用。基于存活时间和体重改变事后分析结果,发现mAb CR8020在这三种mAb中最强力对抗小鼠适应的流感病毒A/CH/NL/621557/03(H7N7)。在感染前一天施用3或10mg/kg剂量的mAb CR8020,100%的小鼠在致死攻击下均存活且H7N7感染的临床表现明显降低。在感染前一天施用1mg/kg剂量的CR8020,75%的小鼠在这个实验中在致死攻击下存活且存活小鼠的临床迹象在21天研究期间的第15天完全消失。
实施例17:人IgG单克隆抗体针对体内致死性H7N7攻击的治疗活性
进行这项研究以在H7N7模型中评估mAb CR8020的治疗效力和窗口。在小鼠致死攻击模型中检测mAb CR8020(在PER.C6
细胞中产生)的治疗效力,使用小鼠适应的流感病毒A/Chicken/Netherlands/621557/2003(H7N7)病毒(Central Veterinary Institute(CVI),Lelystad,The Netherlands)。简而言之,使所有小鼠(Balb/c,雌性,6-8周龄,n=8只/组)适应环境并维持至少4天,之后开始实验。在攻击前一天(第1组,预防性阳性对照)或者在攻击后第1、2、3、4、5或6天(第2-7组)在尾静脉(vena coccygeus)静脉内给予15mg/kg的mAb CR8020,假定平均体重为18g/小鼠,固定剂量体积0.2mL。第8组在攻击后第1天接受对照mAb CR3014(15mg/kg)。在第0天用25LD
50小鼠适应的A/CH/NL/621557/03(H7N7)通过鼻内接种攻击小鼠。从攻击前一天直至第21天研究结束,每日确定临床迹象和体重。
图16A示出在静脉内施用mAb CR8020(所有组15mg/kg)或者对照mAb(15mg/kg)之后小鼠的存活率。当在攻击前一天或者在攻击后第1或3天施用15mg/kg mAb CR8020时,所有动物在病毒攻击下均存活,而在对照mAb组中小鼠存活率为0%。当在第2天和第4天施用15mg/kg mAbCR8020时,观测到分别为87.5%和50%的存活率。这些组的存活时间与对照mAb组相比具有统计学显著差异(分别为p=0.002和p=0.014)。在第5天和第6天15mg/kg CR8020处理组的存活率为0%,这些组中存活时间与对照mAb组相比无统计学显著差异(分别为p=0.837和p=0.876)。
图16B示出在21天研究期间相对于第0天小鼠平均体重变化。通常,当在攻击后较晚时间点施用mAb CR8020时,小鼠平均体重降低增加。然而,在第2天和第3天mAb CR8020处理组的平均体重曲线与第10天交叉,由于在第2天处理组中无存活小鼠所致。体重变化的曲线下面积分析示出在第-1天至第3天之间处理与在第4-6天处理相比平均体重降低的显著转变(表22)。用15mg/kg的CR8020在攻击前1天或者在攻击后第1、2或3天处理导致与对照组相比体重降低的统计学显著下降(四组均p<0.001)。在第4、5或6天用15mg/kg的CR8020处理与对照组相比不导致体重降低的统计学显著下降(分别为p=0.566、p=0.979和p=0.858)。
小鼠的中位数临床得分在图16C中示出。在攻击前一天用15mg/kgCR8020处理的动物中,所有动物在观测期间均存活且无一动物示出任何临床迹象。在攻击后第1天处理的动物示出100%存活率,然而8只动物中有7只示出临床迹象,最大临床得分1分。第8只动物最大临床得分达到3分。在攻击后第2天处理的动物中,除了一只之外所有动物均存活。存活的动物(8只中的7只)示出临床迹象,最大临床得分1分(n=4)或者3分(n=3)。在攻击后第3天处理的动物示出100%存活,所有动物示出临床迹象,最大临床得分3分。在攻击后第4天处理的动物中,50%的动物在致死攻击下存活。存活动物示出临床迹象,最大临床得分达到3分。在攻击后第5或6天处理的动物未存活。使用GENMOD程序(SAS)分析临床得分以对于以小鼠作为对象的重复测量和在分类量表上测量的数据拟合模型(表23)。在攻击前1天和攻击后第1、2、3或4天用15mg/kg mAb CR8020处理组中,在大部分21天研究期间其中位数临床得分与对照mAb组存在统计学显著差异(第8-21天,四组均p≤0.038)。在攻击后第5天用15mg/kg mAb CR8020处理组中,仅在第8天其中位数临床得分与对照mAb组显著不同(p≤0.001)。这种差异尽管具有统计学显著性,但不认为是相关的。在第6天15mg/kgmAb CR8020处理组的中位数临床得分与对照组无统计学显著差异。
这项研究明确表明在致死性H7N7小鼠模型中,用15mg/kg的mAbCR8020治疗当在直至攻击后第3天施用时也提供87.5-100%的保护作用。当在攻击后第4天施用时,用15mg/kg mAb CR8020治疗提供部分保护作用。当在攻击后第5或6天施用时,观测到15mg/kg mAb CR8020在致死性H7N7小鼠模型中无保护作用。换句话说,当在死亡之前4天或者更多天施用时,CR8020在这个致死性小鼠模型中提供保护作用。
实施例18:有效中和来自***发生类群1和2的多种流感病毒亚型的单克隆抗体的混合物
每年的季节性流感疫苗由诱导针对甲型流感病毒毒株免疫性的两种不同的制备物组成,一个代表循环H1亚型,一个代表循环H3毒株。其根本原因在于H1和H3亚型的流感病毒毒株太不相同,以至于从任一型中制备的疫苗均不诱导针对另一亚型的保护作用。理想的是治疗流感的广泛保护性单克隆抗体制备物可有效抗来自两个***发生类群1(H1)和2(H3)的流感病毒毒株。然而,再次由于HA分子之间的序列差异,难以发现这种单一抗体。例如,WO 2009/115972中描述的Fab28抗体结合并中和H1亚型优于与H3亚型病毒,可能是由于类群1与类群2病毒之间的表位保守性与一个***发生类群中的病毒相比较低。为了实现一种产品可有效抗来自两个***发生类群的多种流感病毒亚型的目标,因此可将两或多种不同抗体组合在一种混合物中。为了成功,这种制备物应由彼此不相干扰的抗体组成。
有效中和H1、H5和H9亚型病毒的抗体已经在WO2008/028946中描述,典型以CR6261和CR6323为例。CR6261的结合区(表位)已经详细阐明,使用H1或H5HA分子与CR6261的共结晶阐明(也见PDB数据库条目3GBM和3GBM,http://www.pdb.org和Ekiert et al.,2009)。为了研究本发明的单克隆抗体是否可以与先前描述的CR6261抗体组合使用,检测所述抗体是否能结合***发生类群1和2的亚型。至此,如实施例7所述进行ELISA和FACS结合试验,使用H1和H5亚型以及H3和H7亚型的HA分子及CR6261、CR6323、CR8001、CR8020、CR8041和CR8043进行。结果概括在表20中,示出广泛中和***发生类群1的病毒的抗体不结合***发生类群2的病毒,反之亦然。由于所述抗体不彼此干扰,预期所述抗体针对各个亚型的中和潜力得以保持,使得可以有效中和类群1和2的亚型。
因此,一方面包含CR6261和/或CR6323及另一方面包含CR8020、CR8041和/或CR8043的混合物对于至少H1和H3亚型的病毒具有活性。因此,使用一种制备物有效防护***发生类群1和2的流感病毒亚型是可能的。
实施例19:结合分子的结合动力学
使用Octet RED***和来自ForteBio的链霉抗生物素蛋白生物传感器测量CR8020和CR8043的木瓜蛋白酶裂解的Fab片段的亲和性。将H3亚型A/Wisconsin/67/2005(Protein Science)和A/Brisbane/10/2007(ProteinScience)流感病毒血凝素抗原生物素酰化以固定在链霉抗生物素蛋白生物传感器(ForteBio)上。使用浓度范围分别在2.3-150nM和0.16-30nM之间的CR8020和CR8043,在动力学缓冲液(ForteBio,18.5032)中重复进行5次Fab结合实验。在Octet上的亲和性测量实验设置如下:将所述生物素酰化的血凝素固定至链霉抗生物素蛋白生物传感器上1800秒,随后结合系列稀释的Fab CR8020和CR8043 1200秒,及随后在动力学缓冲液中解离1800秒。结合数据使用Octet分析软件使用1∶1模型分析。
H3亚型HA的结合分子的亲和性常数(Kd-值)在表24中示出。
表1:第一轮Vkappa,Vlambda和VH扩增
引物名称 |
引物核苷酸序列 |
SEQ ID NO: |
OK1(HuVK1B) |
GAC ATC CAG WTG ACC CAG TCT CC |
192 |
OK2(HuVK2) |
GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CC |
193 |
OK3(HuVK2B2) |
GAT ATT GTG ATG ACC CAG ACT CC |
194 |
OK4(HuVK3B) |
GA AATT GTG WTG ACR CAG TCT CC |
195 |
OK5(HuVK5) |
GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC |
196 |
OK6(HuVK6) |
GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CC |
197 |
OCK(HuCK) |
ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT |
198 |
OL1(HuVL1A)* |
CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CC |
199 |
OL1(HuVL1B)* |
CAG TCT GTG YTG ACG CAG CCG CC |
200 |
OL1(HuVL1C)* |
CAG TCT GTC GTG ACG CAG CCG CC |
201 |
OL2(HuVL2B) |
CAG TCT GCC CTG ACT CAG CC |
202 |
OL3(HuVL3A) |
TCC TATG WG CTG ACT CAG CCA CC |
203 |
OL4(HuVL3B) |
TCT TCT GAG CTG ACT CAG GAC CC |
204 |
OL5(HuVL4B) |
CAG CYT GTG CTG ACT CAA TC |
205 |
OL6(HuVL5) |
CAG GCT GTG CTG ACT CAG CCG TC |
206 |
OL7(HuVL6) |
AAT TTT ATG CTG ACT CAG CCC CA |
207 |
OL8(HuVL7/8) |
CAG RCT GTGG TGA CYC AGG AGCC |
208 |
OL9(HuVL9)# |
CWG CCT GTG CTG ACT CAG CCM CC |
209 |
OL9(HuVL10)# |
CAG GCA GGG CTG ACT CAG |
210 |
OCL(HuCL2)X |
TGA ACA TTC TGT AGG GGC CAC TG |
211 |
OCL(HuCL7)X |
AGA GCA TTC TGC AGG GGC CAC TG |
212 |
OH1(HuVH1B7A)+ |
CAG RTG CAG CTG GTG CAR TCT GG |
213 |
OH1(HuVH1C)+ |
SAG GTC CAG CTG GTR CAG TCT GG |
214 |
OH2(HuVH2B) |
CAG RTC ACC TTG AAG GAG TCT GG |
215 |
OH3(HuVH3A) |
GAG GTG CAG CTG GTG GAG |
216 |
OH4(HuVH3C) |
GAG GTG CAG CTG GTG GAG WCY GG |
217 |
OH5(HuVH4B) |
CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG |
218 |
OH6(HuVH4C) |
CAG STG CAG CTG CAG GAG TCS GG |
219 |
OH7(HuVH6A) |
CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG |
220 |
OCM(HuCIgM) |
TGG AAG AGG CAC GTT CTT TTC TTT |
221 |
*以1∶1∶1比率混合
#以1∶1∶1比率混合
X以1∶1比率混合
+以1∶1比率混合
表2:第二轮Vkappa,Vlambda和VH扩增
*以1∶1∶1比率混合
#以1∶1比率混合
+以1∶1比率混合
表3.第二轮VL区域扩增总体情况
表4.第二轮VH区域扩增总体情况
表5:个体IgM记忆B细胞文库的特征
表6:由ELISA(ELISA效价;OD 492nm)测得的单链噬菌体抗体对不同HA亚型的HA分子的交叉结合活性。X=未确定;H3=H3亚型的HA;H7=H7亚型的HA;HB=乙型流
感病毒的HA
SC# |
H3 |
H7 |
HB |
sc08-001 |
0.885 |
2.451 |
× |
sc08-003 |
1.320 |
0.222 |
× |
sc08-006 |
0.511 |
0.227 |
× |
sc08-007 |
0.074 |
2.365 |
× |
sc08-009 |
0.095 |
1.130 |
× |
sc08-010 |
0.165 |
1.242 |
× |
sc08-011 |
0.090 |
1.802 |
× |
sc08-013 |
0.078 |
1.400 |
× |
sc08-014 |
0.239 |
0.834 |
× |
sc08-015 |
0.727 |
0.165 |
× |
sc08-016 |
1.112 |
0.164 |
× |
sc08-017 |
1.158 |
0.285 |
× |
sc08-018 |
0.711 |
0.221 |
× |
表7:由ELISA(OD 492nm)测得的PEG/NACl沉淀并过滤灭菌的噬菌体抗体对不同HA亚型的HA分子的交叉结合活性。H1=H1亚型的HA,H3=H3亚型的HA;H5=H5亚型的HA;H7=H7亚型的HA;B(O)=乙型流感病毒/Ohio/01/2005的HA
SC# |
H1 |
H3 |
H5 |
H7 |
B(O) |
sc08-001 |
+ |
+ |
- |
+ |
- |
sc08-003 |
- |
+ |
- |
- |
- |
sc08-006 |
- |
+ |
- |
- |
- |
sc08-007 |
- |
- |
- |
+ |
- |
sc08-009 |
- |
- |
- |
+ |
- |
sc08-010 |
- |
- |
- |
+ |
- |
sc08-011 |
- |
- |
- |
+ |
- |
sc08-013 |
- |
- |
- |
+ |
- |
sc08-014 |
+ |
+ |
- |
+ |
- |
sc08-015 |
- |
+ |
- |
- |
- |
sc08-016 |
- |
+ |
- |
- |
- |
sc08-017 |
- |
+ |
- |
- |
- |
sc08-018 |
- |
+ |
- |
- |
- |
表8:PEG/NACl沉淀并过滤灭菌的噬菌体抗体的FACS分析(表示为MFI=平均荧光强度)。PER.C6=未转染的PER.C6细胞(对照);mH1,mH3,mH5,mH7,mHB=分别为亚型H1、H3、H5、H7和乙型流感病毒亚型的膜结合的HA。
SC# |
PER.C6 |
mH1 |
mH3 |
mH5 |
mH7 |
mHB |
sc08-001 |
2 |
27 |
68 |
5 |
62 |
X |
sc08-003 |
5 |
9 |
77 |
7 |
7 |
X |
sc08-006 |
2 |
6 |
69 |
5 |
6 |
X |
sc08-007 |
1 |
5 |
4 |
4 |
73 |
X |
sc08-009 |
11 |
12 |
11 |
10 |
15 |
X |
sc08-010 |
2 |
4 |
3 |
4 |
60 |
X |
sc08-011 |
1 |
3 |
4 |
4 |
73 |
X |
sc08-013 |
2 |
5 |
3 |
7 |
61 |
X |
sc08-014 |
10 |
26 |
82 |
17 |
32 |
X |
sc08-015 |
3 |
7 |
79 |
7 |
6 |
X |
sc08-016 |
1 |
7 |
82 |
5 |
5 |
X |
sc08-017 |
1 |
6 |
81 |
5 |
5 |
X |
sc08-018 |
2 |
6 |
74 |
6 |
7 |
X |
表9:HA特异性免疫球蛋白的CDR区的数据(SEQ ID NO)
表10.HA特异性IgG的数据。重链和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列的SEQ ID NO
表11:流感病毒H3N2由选择的IgG的体外中和
表12:抗H3N2 IgG的交叉结合反应性。NCal.=A/New Caledonia/20/1999(H1N1);
Wisc.=A/Wisconsin/67/2005(H3N2);NY.=A/New York/55/2004(H3N2),Wyo.=A/Wyoming/3/2003(H3N2);Neth.=A/Netherlands/219/2003(H7N7);ND=未进行
表13:抗H3N2 IgG的交叉中和活性;ND=未进行
表14:H3 mAb CR8020,CR8041和CR8043的结合区附近的序列保守
表15:对各种甲型流感病毒株的中和效价
所有SK50效价均在ug/ml;小鼠适应的毒株;Ma‘pandemic’H7毒株
表16.从第0天基线开始的体重变化的平均曲线下面积
amAb给药组的平均AUC值用方差分析与对照Ab组比较,该方差分析具有Dunnet’s调整以用于多重比较。
b每种抗体浓度的平均AUC值针对每种抗体用方差分析进行比较,该方差分析具有Tukey’s调整以用于多重比较。
ns=非统计学显著的
表17.从第0天基线开始的体重变化的平均曲线下面积
组 |
平均AUC(g*天) |
SD(g*天) |
p-值 |
15mg/kg CR8020于第-1天 |
33.44 |
10.06 |
<0.001 |
15mg/kg CR8020于第1天 |
10.70 |
16.23 |
<0.001 |
15mg/kg CR8020于第2天 |
-15.23 |
11.60 |
<0.001 |
15mg/kg CR8020于第3天 |
-65.45 |
35.90 |
0.003 |
15mg/kg CR8020于第4天 |
-85.95 |
23.14 |
0.742 |
15mg/kg CR8020于第5天 |
-100.88 |
12.78 |
0.986 |
15mg/kg CR8020于第7天 |
-84.91 |
12.28 |
0.653 |
对照mAb于第1天 |
-95.76 |
11.55 |
|
a15mg/kg mAb CR8020给药组的平均AUC值用方差分析与对照mAb组进行比较,该方差分析具有Dunnet’s调整以用于在事后分析中的多重比较。用15mg/kg mAb CR8020的预防性治疗产生与对照组相比统计学显著的体重降低减少(p<0.001)。在第1天、第2天或第3天用15mg/kg mAb CR8020治疗也产生与对照组相比统计学显著的体重降低减少(分别为p<0.001,p<0.001和p=0.003)。在第4天、第5天或第6天用15mg/kg mAb CR8020治疗不产生与对照组相比统计学显著的体重降低减少(所有三个组均为p>0.05)。
表18中位数临床得分
列出了与对照mAb组相比临床得分差异显著的间隔(例如,在第-1天的15mg/kg与对照组之间临床得分的差异从第4天开始显著)
表19.从第0天基线开始的体重变化的平均曲线下面积
amAb CR8020给药组的平均AUC值用方差分析与对照mAb组进行比较,该方差分析具有Dunnet’s调整以用于在事后分析中的多重比较。
表20:特异于流感病毒HA的单克隆抗体的结合和中和性质总结
表21.从第0天基线开始的体重变化的平均曲线下面积.
amAb CR8020给药组的平均AUC值用方差分析与对照mAb组进行比较,该方差分析具有Dunnet’s调整以用于在事后分析中的多重比较。
表22.从第0天基线开始的体重变化的平均曲线下面积
组 |
平均AUC(g*天) |
SD(g*天) |
p值(mAb比对照)a |
15mg/kg CR8020于第-1天 |
-7.68 |
8.17 |
<0.001 |
15mg/kg CR8020于第1天 |
-20.43 |
8.41 |
<0.001 |
15mg/kg CR8020于第2天 |
-38.18 |
37.35 |
<0.001 |
15mg/kg CR8020于第3天 |
-28.27 |
9.63 |
<0.001 |
15mg/kg CR8020于第4天 |
-99.11 |
37.90 |
0.566 |
15mg/kg CR8020于第5天 |
-93.62 |
10.29 |
0.979 |
15mg/kg CR8020于第6天 |
-94.06 |
7.65 |
0.858 |
|
|
|
|
对照抗体于第1天 |
-93.33 |
10.58 |
|
a平均AUC值用RobustReg程序(SAS)进行比较,该程序分配较低权重给无关项(outlier)。
表23.中位数临床得分
表24:结合动力学
重链和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列:
>SC08-001VH DNA(SEQ ID NO:1)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGATCCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT
GGATTCACCGTCAGTAGCAACTACGTGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTCTCACTT
ATTTACACGGGTGGTACCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCAAG
AATACGGTGTTTCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACGCGGCCATGTATTACTGTGCGAGAGTGTCAGCA
TTACGGTTTTTGCAGTGGCCAAACTACGCGATGGACGTC
>SC08-001VH蛋白(SEQ ID NO:2)
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSNYVSWVRQAPGKGLEWLSLIYTGGTTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTVFLQMNSLRAEDAAMYYCARVSALRFLQWPNYAMDV
>SC08-001VL DNA(SEQ ID NO:3)
CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACGGTCGATCACCATCTCCTGCTCTGGAACC
CGCAGTGACGTTGGTGGTCATAATTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATT
TATGAGGTCAGTCATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAGCACGGCCTCCCTG
ACCATCTCTGGCCTCCAGTCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCTTATACAGGTGAAGGCCCCCTAGGA
GTG
>SC08-001VL蛋白(SEQ ID NO:4)
QSALTQPASVSGSPGRSITISCSGTRSDVGGHNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSHRPSGVSNRFSGSKSGSTASL
TISGLQSEDEADYYCSSYTGEGPLGV
>SC08-003VH DNA(SEQ ID NO:5)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGACCGGGGGAGACTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTTCAGCCTCT
GAATTCAGCTTCAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTGGAGTGGGTGGCCAAC
ATGAAGCAAGATGGAAGTGAGAAGTACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCC
AAGAACTCATTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGGCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGGGTTCC
TGTGACGATTCTTGGACTGGTTGTCATGATGCTTTTGACATC
>SC08-003VH蛋白(SEQ ID NO:6)
EVQLVETGGDLVQPGGSLRLSCSASEFSFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANMKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNA
KNSLYLQMNSLRGEDTAVYYCARGSCDDSWTGCHDAFDI
>SC08-003VL DNA(SEQ ID NO:7)
GTGTTGACGCAGCCGCCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTGCCTGTGGGGGAAACAACATT
GGGAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGCC
CGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAATTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTC
GAGGCCGGGGATGAAGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGAGAGTGGTAGTGATCTACGACTGCTT
>SC08-003VL蛋白(SEQ ID NO:8)
VLTQPPSVSVAPGQTARIACGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSARPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRV
EAGDEADYYCQVWESGSDLRLL
>SC08-015VH DNA(SEQ ID NO:9)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGGGGAGACTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTTCAGCCTCT
GAATTCAGCTTCAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTGGAGTGGGTGGCCAAC
ATGAAGCAAGATGGAAGTGAGAAGTACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCC
AAGAACTCATTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGGCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGGGTTCC
TGTGACGATTCTTGGACTGGTTGTCATGATGCTTTTGACATC
>SC08-015VH蛋白(SEQ ID NO:10)
QVQLQESGGDLVQPGGSLRLSCSASEFSFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANMKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNA
KNSLYLQMNSLRGEDTAVYYCARGSCDDSWTGCHDAFDI
>SC08-015VL DNA(SEQ ID NO:11)
GTGTTGACGCAGCCGCCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAAGATTACCTGTGGGGGAGACAACATT
GGAAGAAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCTGGCCCCTGTGCTGGTCGTCAATGATAATAGCGAC
CGGCCCTCAGGGATCCCTGCGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTC
GAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCACGTGTGGGGTAGTAGTCGTGACCATTATGTC
>SC08-015VL蛋白(SEQ ID NO:12)
VLTQPPSVSVAPGQTAKITCGGDNIGRKSVHWYQQKPGLAPVLVVNDNSDRPSGIPARFSGSNSGNTATLTISRV
EAGDEADYYCHVWGSSRDHYV
>SC08-016VH DNA(SEQ ID NO:13)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTTCAGCCTCT
GAATTCAGCTTCAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTGGAGTGGGTGGCCAAC
ATGAAGCAAGATGGAAGTGAGAAGTACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCC
AAGAACTCATTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGGCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGGGTTCC
TGTGACGATTCTTGGACTGGTTGTCATGATGCTTTTGACATC
>SC08-016VH蛋白(SEQ ID NO:14)
EVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCSASEFSFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANMKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNA
KNSLYLQMNSLRGEDTAVYYCARGSCDDSWTGCHDAFDI
>SC08-016VL DNA(SEQ ID NO:15)
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGC
AGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATC
TATGGTAACAACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGATCCAGGTCTGGCCCTTTAGCCCTCCTG
GCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGTTTAT
GTC
>SC08-016VL蛋白(SEQ ID NO:16)
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNNNRPSGVPDRFSGSRSGPLALL
AITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSVYV
>SC08-017VH DNA(SEQ ID NO:17)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGACTGGGGGAGACTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTTCAGCCTCT
GAATTCAGCTTCAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTGGAGTGGGTGGCCAAC
ATGAAGCAAGATGGAAGTGAGAAGTACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCC
AAGAACTCATTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGGCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGGGTTCC
TGTGACGATTCTTGGACTGGTTGTCATGATGCTTTTGACATC
>SC08-017VH蛋白(SEQ ID NO:18)
EVQLVETGGDLVQPGGSLRLSCSASEFSFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANMKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNA
KNSLYLQMNSLRGEDTAVYYCARGSCDDSWTGCHDAFDI
>SC08-017VL DNA(SEQ ID NO:19)
TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGAC
AGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGCTAAA
ACCAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCACCTCAGGAAACACTGCTTCCTTGACCATCACT
GGGGCTCAGGCGGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGTGGTA
>SC08-017VL蛋白(SEQ ID NO:20)
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYAKTNRPSGIPDRFSGSTSGNTASLTIT
GAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVV
>SC08-018VH DNA(SEQ ID NO:21)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGACTGGGGGAGACTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTTCAGCCTCT
GAATTCAGCTTCAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTGGAGTGGGTGGCCAAC
ATGAAGCAAGATGGAAGTGAGAAGTACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCC
AAGAACTCATTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGGCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGGGTTCC
TGTGACGATTCTTGGACTGGTTGTCATGATGCTTTTGATATC
>SC08-018VH蛋白(SEQ ID NO:22)
EVQLVETGGDLVQPGGSLRLSCSASEFSFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANMKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNA
KNSLYLQMNSLRGEDTAVYYCARGSCDDSWTGCHDAFDI
>SC08-018VL DNA(SEQ ID NO:23)
CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACC
AGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATT
TATGAGGTCAGTCATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAGCACGGCCTCCCTG
ACCATCTCTGGCCTCCAGTCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCTTATACAGGTGAAGGCCCCCTAGGA
GTG
>SC08-018VL蛋白(SEQ ID NO:24)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSHRPSGVSNRFSGSKSGSTASL
TISGLQSEDEADYYCSSYTGEGPLGV
>SC08-019VH DNA(SEQ ID NO:25)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGGAGCCTCT
GGAATCAGCGTTAGCACTTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGTTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGT
ATTAGTGGTAGTGGTGCTACCACATACTACGCAGGCTCCGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAAATCC
AAGAACACACTGCATCTGCAAATGAGCAGACTGAGAGCCGAGGACACGGCCATTTACTACTGTGCGAAAGATACC
TCCTTGTTTGAGTATGATACAAGTGGTTTTACGGCTCCCGGCAATGCTTTTGATATC
>SC08-019VH蛋白(SEQ ID NO:26)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCGASGISVSTSAMSWVRQVPGKGLEWVSGISGSGATTYYAGSVKGRFTISRDKS
KNTLHLQMSRLRAEDTAIYYCAKDTSLFEYDTSGFTAPGNAFDI
>SC08-019VL DNA(SEQ ID NO:27)
GACATCCAGWTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGATGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCA
AGTCAGAGCATTAGCGGCTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTATGGT
GCATCCACTTTGCAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC
ACCAGTCTGCAACCTGAAGACTATGCAACTTACTACTGTCAACAGACTTACACCTCCCCTCCGTACGCT
>SC08-019VL蛋白(SEQ ID NO:28)
DIQXTQSPSSLSASVDDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPNLLIYGASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI
TSLQPEDYATYYCQQTYTS PPYA
>SC08-020VH DNA(SEQ ID NO:29)
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGAGCTGAGGTGAAGACCCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCT
GGATACACCTTTACCAGGTTTGGTGTCAGCTGGATACGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATTGGATGG
ATCAGCGCTTACAATGGTGACACATACTATGCACAGAAGTTCCAGGCCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCC
ACGACCACAGCCTACATGGAGATGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAACCC
CCCCTTTTTTACAGCAGCTGGTCTCTTGACAAC
>SC08-020VH蛋白(SEQ ID NO:30)
QVQLQQSGAEVKTPGASVKVSCKASGYTFTRFGVSWIRQAPGQGLEWIGWISAYNGDTYYAQKFQARVTMTTDTS
TTTAYMEMRSLRSDDTAVYYCAREPPLFYSSWSLDN
>SC08-020VL DNA(SEQ ID NO:31)
GAAATTGTGWTGACRCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCC
AGTCAGAGTGTTAGCATGAACTACTTAGCCTGGTTCCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT
GGTGCGTCCCGCAGGGCCACTGGCATCCCCGACAGGATCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACC
ATCAGCAGACTGGAGCCTGCAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTACCTCACCTCGGACG
>SC08-020VL蛋白(SEQ ID NO:32)
EIVXTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMNYLAWFQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRISGSGSGTDFTLT
ISRLEPADFAVYYCQQYGTSPRT
>SC08-021VH DNA(SEQ ID NO:33)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGATACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT
GGATTCACCTTTAGCGCCTATGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCT
ATTGGTGGTAGTGGCGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACTCC
AAGAAGATCCTGTATCTGCAAATGAACGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCATATATTACTGTGCGAAAGGCCGG
GATTGGACTGGGGGTTACTTCTTTGACTCC
>SC08-021VH蛋白(SEQ ID NO:34)
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSAYAMNWVRQAPGKGLEWVSAIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNS
KKILYLQMNGLRAEDTAIYYCAKGRDWTGGYFFDS
>SC08-021VL DNA(SEQ ID NO:35)
GACATCCAGWTGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCC
AGCCAGAGTATTTTCTACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAACTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCT
AAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGAGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACA
GATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATACTATAGTATT
CCCTACACT
>SC08-021VL蛋白(SEQ ID NO:36)
DIQXTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSIFYSSNNKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGT
DFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSIPYT
>SC08-038VH DNA(SEQ ID NO:37)
GAGGTGCAGCTGGTGGACTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT
GGATTCGCCTTTAGCGGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGAT
ATTGGTGGTAGTGGTGGTGGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATGCC
AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAGCAGT
AGCTGGGACCGGGCCTACTTCTTTGACTCC
>SC08-038VH蛋白(SEQ ID NO:38)
VQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSDIGGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNAK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSSWDRAYFFDS
>SC08-038VL DNA(SEQ ID NO:39)
GATATTGTGATGACCCAGACTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCC
AGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCATCCATAAGAACTACTTAGCCTGGTACCAGCAAAAACCAGGACAGCCTCCT
AAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACA
GATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGATCT
CCTCCAACT
>SC08-038VL蛋白(SEQ ID NO:40)
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSIHKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGT
DFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYRSPPT
>SC08-039VH DNA(SEQ ID NO:41)
CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACGTGCACTGTCTCT
GGCGGCTCCATCGGTAGTTACTACTGGAGCTGGATACGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGATAT
ATCTATTACCGTGGGGGTACCAGTTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTCGACACGTCCAAG
AGCCAGTTCACCTTGAAGCTGAACTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAAGGACTGG
GGATCAGCGGCCGGAAGTGTCTGGTACTTCGATCTC
>SC08-039VH蛋白(SEQ ID NO:42)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYRGGTSYNPSLKSRVTISVDTSK
SQFTLKLNSVTAADTAVYYCARKDWGSAAGSVWYFDL
>SC08-039VL DNA(SEQ ID NO:43)
CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACC
AGCAGTGACGTTGGTGGTTATAATTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATT
CGTGAGGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTG
ACCGTCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGAATACTACTGCAGCTCGTATGCAGGCAGCAACAATCTGATA
>SC08-039VL蛋白(SEQ ID NO:44)
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIREVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASL
TVSGLQAEDEAEYYCSSYAGSNNLI
>SC08-040VH DNA(SEQ ID NO:45)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCT
GGATTCGCTTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGACCTTT
ATATGGTATGATGGAAGTAATAAACACTATGCAGACTCCATGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCC
AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGATGGG
GGATATAGCACCTGGGAATGGTACTTCGATCTC
>SC08-040VH蛋白(SEQ ID NO:46)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVTFIWYDGSNKHYADSMKGRFTISRDNS
KNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARDGGYSTWEWYFDL
>SC08-040VL DNA(SEQ ID NO:47)
GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCGGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAGAGAGTCACCATCACCTGCCGGGCC
AGTCAGGGCATTGGCAGTAACTTACACTGGTACCAGCAGAAACCAGATCAGTCTCCAAAGCTCCTCATCAAGTAT
GCTTCCCAGTCCATCACAGGGGTCCCCTCGAGGTTCAGTGGCAGGGGATCTGGGACAGATTTCACCCTCACCATC
AATAGCCTGGAAGTTGAAGATGCTGCAGTGTATTACTGTCATCAGAGTAGTAGTTTACCGCTCACT
>SC08-040VL蛋白(SEQ ID NO:48)
EIVLTQSPDFQSVTPKERVTITCRASQGIGSNLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSITGVPSRFSGRGSGTDFTLTI
NSLEVEDAAVYYCHQSSSLPLT
>SC08-041VH DNA(SEQ ID NO:49)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCCAGGCTTCG
GGTTACACCTTTACCTCCTTTGGTCTCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCCTGAGTGGATGGGATGG
ATCAGCGCTTACAATGGTGAAATAAAGTATGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCTCCATGACCACAGACACATCA
ACGAGGACAGCCTACATGGAGGTGCGGAGCCTCAGACCTGACGACACGGCCGTATACTACTGTGCGAGAGAGCCC
CCCCTGTATTTCAGTAGCTGGTCTCTCGACTTC
>SC08-041VH蛋白(SEQ ID NO:50)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCQASGYTFTSFGLSWVRQAPGQGPEWMGWISAYNGEIKYAQKFQGRVSMTTDTS
TRTAYMEVRSLRPDDTAVYYCAREPPLYFSSWSLDF
>SC08-041VL DNA(SEQ ID NO:51)
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCC
AGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTACTTAGCCTGGTTCCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT
GGTGCATCAAGGAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACC
ATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGATAGCTCACCTCGGACG
>SC08-041VL蛋白(SEQ ID NO:52)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWFQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLT
ISRLEPEDFAVYYCQQYDSSPRT
>SC08-043VH DNA(SEQ ID NO:53)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTTTCCTGCAAGGCTTCT
GGATACACCTTCACTGCCTATTCTATGCATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGCCTTGAGTGGTTGGGATGG
ATCAACACTGCCATCGGTAACACACAATATTCACAGAAGTTCCAGGACAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCT
GCGCGCACATCGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGGAGACACGGCTGTCTATTTCTGTGCGAGAGGGGCC
TCTTGGGACGCCCGTGGGTGGTCTGGCTAC
>SC08-043VH蛋白(SEQ ID NO:54)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTAYSMHWVRQAPGQSLEWLGWINTAIGNTQYSQKFQDRVTITRDTS
ARTSYMELSSLRSGDTAVYFCARGASWDARGWSGY
>SC08-043VL DNA(SEQ ID NO:55)
GACATCCAGWTGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCC
AGCCAGAGTGTTTTTTCCAGCTCCACCAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCT
AAGGTGCTAATTTACTGGTCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGCCAGCGGGTCTGGGACA
GATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGCAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAATATTATACTGCT
CCGTGGACG
>SC08-043VL蛋白(SEQ ID NO:56)
DIQXTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVFSSSTNKNYLAWYQQKPGQPPKVLIYWSSTRESGVPDRFSASGSGT
DFTLTISSLQAADVAVYYCHQYYTAPWT
>SC08-049VH DNA(SEQ ID NO:57)
CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTACTGGTGAAGCCCAAAGAGACCCTCACGCTGACCTGCACCGTCTCT
GGGTTCTCACTCAGCAACACTAGAATGGGTGTGAGTTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT
GCGCACATCTTTTCGAACGACGAAACATCCTACAGGACATCTCTGAAGAGGAGGCTCACCATCTCCCAGGACATC
TCCAAAAGTCAGGTGGTCCTTTCTATGACCAACGTGGACCCTGCAGACACAGCCACATATTTTTGTGCACGGATC
GGGTCTGGCTATGAGAGTAGTGCTTACTCCACCTGGCTCGACCCC
>SC08-049VH蛋白(SEQ ID NO:58)
QVTLKESGPVLVKPKETLTLTCTVSGFSLSNTRMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDETSYRTSLKRRLTISQDI
SKSQVVLSMTNVDPADTATYFCARIGSGYESSAYSTWLDP
>SC08-049VL DNA(SEQ ID NO:59)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGGCAGACGGCCAGGCTCACCTGTGAGGGAGAC
ACAATTGGCAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAGGCCAGGCCAGGCCCCTGTGTTGGTCGTCTATAATGAT
CGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGCGCACGGCCACCCTGACCATCAGC
AGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTTCTGTCAGGTGTGGGAGAGTGGAGGTGATCAGACTGTC
>SC08-049VL蛋白(SEQ ID NO:60)
QSVLTQPPSVSVAPGQTARLTCEGDTIGSKSVHWYQQRPGQAPVLVVYNDRDRPSGIPERFSGSNSGRTATLTIS
RVEAGDEADYFCQVWESGGDQTV
>SC08-050VH DNA(SEQ ID NO:61)
CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTATTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTAT
GGTGGGTCGTTCACTGATCACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGTGAA
GTCGTTCATAGTGGAGACACCAACTACACCCCGTCCCTCAGAAATCGAGTTTCCATATCGGTCGACTCGTCCAAG
AATCAGTTCTCCCTGAGGCTGGGGTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGAGGCAGGAAT
GTTGCGGTAGTTGGTGCTATTCAGAGGCACTATGACTAC
>SC08-050VH蛋白(SEQ ID NO:62)
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFTDHYWSWIRQSPGKGLEWIGEVVHSGDTNYTPSLRNRVSISVDSSK
NQFSLRLGSVTAADTAVYYCARGRNVAVVGAIQRHYDY
>SC08-050VL DNA(SEQ ID NO:63)
GAAATTGTGATGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCC
AGTCAGAGTGTTAGCAGAAACTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCTGGCTCCCAGGCTCCTCATCTCT
GGTGCATCGAGCAGGGCCACTGGCGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGGGGGTCTGACACAGACTTCACTCTCACC
ATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCCGTGTATTACTGTCAGCACTATGGTTCGGTCCTTGTAGCT
>SC08-050VL蛋白(SEQ ID NO:64)
EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRNYLAWYQQKPGLAPRLLISGASSRATGVPDRFSGRGSDTDFTLT
ISRLEPEDFAVYYCQHYGSVLVA
>SC08-052VH DNA(SEQ ID NO:65)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCT
GGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTACTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATT
GGGGATATCTCTTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATTTCTAGAGACACG
TCCAAGAACCTGGTCTCCCTGAAGCTGACCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGCATTACTGTGCGAGAGCG
ATGGCGGCTTATAATTATGACAGGGGTGGTTATAACGACTACTACTACATGGACGTC
>SC08-052VH蛋白(SEQ ID NO:66)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGTYYWSWIRQPPGKGLEWIGDISYSGSTNYNPSLKSRVTISRDT
SKNLVSLKLTSVTAADTAVHYCARAMAAYNYDRGGYNDYYYMDV
>SC08-052VL DNA(SEQ ID NO:67)
GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCA
AGTCAGGGCATTAACACCTATTTAAATTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAGGCCCCTAAGGTCCTGATCTTTGCT
GCATCCACTTTGCAAAGTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGTTCTGGGACAGAATTCACTCTCAACATC
AACAATCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACTGCGATCACT
>SC08-052VL蛋白(SEQ ID NO:68)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINTYLNWYQQKPGKAPKVLIFAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLNI
NNLQPEDFATYYCQQSYSTAIT
>SC08-055VH DNA(SEQ ID NO:69)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCGTCT
GGATTCAGCTTCACCACCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCTTT
ATTTGGTATGATGGAAGTAACAAACACTATCAAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAGGACAATTCC
AACAACATGTTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGTCGCCGACACGGCTGTTTATTACTGTGTGAGAGATGGG
GGATATAGCACCTGGGAATGGTACTTCGATCTC
>SC08-055VH蛋白(SEQ ID NO:70)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFTTYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIWYDGSNKHYQDSVKGRFTISKDNS
NNMLYLQMDSLRVADTAVYYCVRDGGYSTWEWYFDL
>SC08-055VL DNA(SEQ ID NO:71)
GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGGCTCCAAAGGAGAAAGTCACCATCACCTGCCGGGCC
AGTCGGAGCATTGGTAGTGACTTGCACTGGTTTCAGCAGAGGCCAGATCAGTCTCCAAAGCTCCTCATCAAGTTT
GCTTCCCAGTCCATGTCAGGGGTCCCCTCGAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGAGAGATTTCACCCTCACCATC
AGTAGCCTGGAGGCTGAAGATGCTGCTACGTATTACTGTCATCAGAGTAGTAGTTTACCGCTCACT
>SC08-055VL蛋白(SEQ ID NO:72)
EIVLTQSPDFQSVAPKEKVTITCRASRSIGSDLHWFQQRPDQSPKLLIKFASQSMSGVPSRFSGSGSGRDFTLTI
SSLEAEDAATYYCHQSSSLPLT
>SC08-057VH DNA(SEQ ID NO:73)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCCAACCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT
GGGTTCACCGACAGTGTCATCTTCATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGTGTCTCAATT
ATTTATATCGATGATTCCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGACACAATTCCATG
GGCACAGTGTTTCTTGAAATGAACAGCCTGAGACCTGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGACAGAGAGCGGA
GACTTTGGTGACCAAACGGGTCCCTATCATTACTACGCTATGGACGTC
>SC08-057VH蛋白(SEQ ID NO:74)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTDSVIFMSWVRQAPGKGLECVSIIYIDDSTYYADSVKGRFTISRHNSM
GTVFLEMNSLRPDDTAVYYCATESGDFGDQTGPYHYYAMDV
>SC08-057VL DNA(SEQ ID NO:75)
CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAAGC
AGCGGTGACATTGGTGGTTATAACGCTGTCTCCTGGTACCAACACCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTGATGATT
TATGAGGTCACTAGTCGGCCCTCAGGGGTTTCCGATCGCTTCTCTGCGTCCAGGTCTGGCGACACGGCCTCCCTG
ACTGTCTCTGGTCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTCACTATTACTGCTGCTCATTTGCAGACAGCAACATTTTGATT
>SC08-057VL蛋白(SEQ ID NO:76)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSGDIGGYNAVSWYQHHPGKAPKLMIYEVTSRPSGVSDRFSASRSGDTASL
TVSGLQAEDEAHYYCCSFADSNILI
>SC08-069VH DNA(SEQ ID NO:77)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGACTGGGGGAGTCGTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT
GGCTTCACGTTTGAGGATTATACCATGCACTGGGTCCGTCAAGTTCCGGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCGCTC
ATTAGTTGGGATGGCGGTATGTCAAACTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACAGC
AAAAACTCTCTGTATCTGCAAGTGAGCAGTCTGAGAAGTGAAGACACCGCCCTGTATTACTGTGCAAAAGATATA
CGACCCCGTATGCCAGCTCGTCACTTTATGGACGTC
>SC08-069VH蛋白(SEQ ID NO:78)
EVQLVETGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFEDYTMHWVRQVPGKGLEWVALISWDGGMSNYADSVKGRFTISRDNS
KNSLYLQVSSLRSEDTALYYCAKDIRPRMPARHFMDV
>SC08-069VL DNA(SEQ ID NO:79)
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCGGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCC
AGTCAGAATGTCAACTACAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGTT
GCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATC
AGCAGTCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCCGGCGATCACT
>SC08-069VL蛋白(SEQ ID NO:80)
EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQNVNYNLAWYQQKPGQAPRLLIYVASTRATGIPDRFSGSGSGTEFTLTI
SSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPAIT
>CR6261HC DNA(SEQ ID NO:185)
gaggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaagtc 60
tcttgcaagg cttctggagg ccccttccgc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcctgagtg gatgggaggg atcatcccta tttttggtac aacaaaatac 180
gcaccgaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg atttcgcggg cacagtttac 240
atggagctga gcagcctgcg atctgaggac acggccatgt actactgtgc gaaacatatg 300
gggtaccagg tgcgcgaaac tatggacgtc tggggcaaag ggaccacggt caccgtctcg 360
agtgctagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
agctggaaca gcggcgcctt gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa acgcgtggag 660
cccaagagct gcgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctgctgggc 720
ggaccctccg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctcatgat cagccggacc 780
cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg accccgaggt gaagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agccccggga ggagcagtac 900
aacagcacct accgggtggt gagcgtgctc accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt gagcaacaag gccctgcctg cccccatcga gaagaccatc 1020
agcaaggcca agggccagcc ccgggagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgggag 1080
gagatgacca agaaccaggt gtccctcacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tcaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaaga gcctgagcct gagccccggc aag 1353
>CR6261HC蛋白(SEQ ID NO:186)
E V Q L V E S G A E V K K P G S S V K V S C K A S G G P F R S Y A I S W V R Q
A P G Q G P E W M G G I I P I F G T T K Y A P K F Q G R V T I T A D D F A G T
V Y M E L S S L R S E D T A M Y Y C A K H M G Y Q V R E T M D V W G K G T T V
T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E
P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S
S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C P
A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E
D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V
L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q
V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q
P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C
S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
>CR6261LC DNA(SEQ ID NO:187)
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aatgattatg tatcctggta ccagcagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240
actggggacg aggccaacta ttactgcgca acatgggatc gccgcccgac tgcttatgtt 300
gtcttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtgcgg ccgcaggcca gcccaaggcc 360
gctcccagcg tgaccctgtt ccccccctcc tccgaggagc tgcaggccaa caaggccacc 420
ctggtgtgcc tcatcagcga cttctaccct ggcgccgtga ccgtggcctg gaaggccgac 480
agcagccccg tgaaggccgg cgtggagacc accaccccca gcaagcagag caacaacaag 540
tacgccgcca gcagctacct gagcctcacc cccgagcagt ggaagagcca ccggagctac 600
agctgccagg tgacccacga gggcagcacc gtggagaaga ccgtggcccc caccgagtgc 660
agc 663
>CR6261LC蛋白(SEQ ID NO:188)
Q S V L T Q P P S V S A A P G Q K V T I S C S G S S S N I G N D Y V S W Y Q Q
L P G T A P K L L I Y D N N K R P S G I P D R F S G S K S G T S A T L G I T G
L Q T G D E A N Y Y C A T W D R R P T A Y V V F G G G T K L T V L G A A A G Q
P K A A P S V T L F P P S S E E L Q A N K A T L V C L I S D F Y P G A V T V A
W K A D S S P V K A G V E T T T P S K Q S N N K Y A A S S Y L S L T P E Q W K
S H R S Y S C Q V T H E G S T V E K T V A P T E C S
Vector pIg-C911-HCgammal(SEQID NO:190)
tcgacggatc gggagatctc ccgatcccct atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 60
tgccgcatag ttaagccagt atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg 120
cgcgagcaaa atttaagcta caacaaggca aggcttgacc gacaattgca tgaagaatct 180
gcttagggtt aggcgttttg cgctgcttcg ctaggtggtc aatattggcc attagccata 240
ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat 300
ccatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc atgttgacat 360
tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 420
atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 480
ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc 540
cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 600
tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 660
tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 720
atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt 780
gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 840
caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc 900
ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc 960
gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc 1020
ctccgcggcc gggaacggtg cattggaagc tggcctggat atcctgactc tcttaggtag 1080
ccttgcagaa gttggtcgtg aggcactggg caggtaagta tcaaggttac aagacaggtt 1140
taaggagatc aatagaaact gggcttgtcg agacagagaa gactcttgcg tttctgatag 1200
gcacctattg gtcttactga catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag 1260
ttcaattaca gctcgccacc atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtactgctgc 1320
tggcccagcc ggccagtgac cttgaccggt gcaccacttt tgatgatgtt caagctccta 1380
attacactca acatacttca tctatgaggg gggtttacta tcctgatgaa atttttagat 1440
cggacactct ttatttaact caggatttat ttcttccatt ttattctaat gttacagggt 1500
ttcatactat taatcatacg tttggcaacc ctgtcatacc ttttaaggat ggtatttatt 1560
ttgctgccac agagaaatca aatgttgtcc gtggttgggt ttttggttct accatgaaca 1620
acaagtcaca gtcggtgatt attattaaca attctactaa tgttgttata cgagcatgta 1680
actttgaatt gtgtgacaac cctttctttg ctgtttctaa acccatgggt acacagacac 1740
atactatgat attcgataat gcatttaatt gcactttcga gtacatatct gatgcctttt 1800
cgcttgatgt ttcagaaaag tcaggtaatt ttaaacactt acgagagttt gtgtttaaaa 1860
ataaagatgg gtttctctat gtttataagg gctatcaacc tatagatgta gttcgtgatc 1920
taccttctgg ttttaacact ttgaaaccta tttttaagtt gcctcttggt attaacatta 1980
caaattttag agccattctt acagcctttt cacctgctca agacatttgg ggcacgtcag 2040
ctgcagccta ttttgttggc tatttaaagc caactacatt tatgctcaag tatgatgaaa 2100
atggtacaat cacagatgct gttgattgtt ctcaaaatcc acttgctgaa ctcaaatgct 2160
ctgttaagag ctttgagatt gacaaaggaa tttaccagac ctctaatttc agggttgttc 2220
cctcaggaga tgttgtgaga ttccctaata ttacaaactt gtgtcctttt ggagaggttt 2280
ttaatgctac taaattccct tctgtctatg catgggagag aaaaaaaatt tctaattgtg 2340
ttgctgatta ctctgtgctc tacaactcaa catttttttc aacctttaag tgctatggcg 2400
tttctgccac taagttgaat gatctttgct tctccaatgt ctatgcagat tcttttgtag 2460
tcaagggaga tgatgtaaga caaatagcgc caggacaaac tggtgttatt gctgattata 2520
attataaatt gccagatgat ttcatgggtt gtgtccttgc ttggaatact aggaacattg 2580
atgctacttc aactggtaat tataattata aatataggta tcttagacat ggcaagctta 2640
ggccctttga gagagacata tctaatgtgc ctttctcccc tgatggcaaa ccttgcaccc 2700
cacctgctct taattgttat tggccattaa atgattatgg tttttacacc actactggca 2760
ttggctacca accttacaga gttgtagtac tttcttttga acttttaaat gcaccggcca 2820
cggtttgtgg accaaaatta tccactgacc ttattaagaa ccagtgtgtc aattttaatt 2880
ttaatggact cactggtact ggtgtgttaa ctccttcttc aaagagattt caaccatttc 2940
aacaatttgg ccgtgatgtt tctgatttca ctgattccgt tcgagatcct aaaacatctg 3000
aaatattaga catttcacct tgctcttttg ggggtgtaag tgtaattaca cctggaacaa 3060
atgcttcatc tgaagttgct gttctatatc aagatgttaa ctgcactgat gtttctacag 3120
caattcatgc agatcaactc acaccagctt ggcgcatata ttctactgga aacaatgtat 3180
tccagactca ggcaggctgt cttataggag ctgagcatgt cgacacttct tatgagtgcg 3240
acattcctat tggagctggc atttgtgcta gttaccatac agtttcttta ttacgtagta 3300
ctagccaaaa atctattgtg gcttatacta tgtctttagg tgctgatagt tcaattgctt 3360
actctaataa caccattgct atacctacta acttttcaat tagcattact acagaagtaa 3420
tgcctgtttc tatggctaaa acctccgtag attgtaatat gtacatctgc ggagattcta 3480
ctgaatgtgc taatttgctt ctccaatatg gtagcttttg cacacaacta aatcgtgcac 3540
tctcaggtat tgctgctgaa caggatcgca acacacgtga agtgttcgct caagtcaaac 3600
aaatgtacaa aaccccaact ttgaaatatt ttggtggttt taatttttca caaatattac 3660
ctgaccctct aaagccaact aagaggtctt ttattgagga cttgctcttt aataaggtga 3720
cactcgctga tgctggcttc atgaagcaat atggcgaatg cctaggtgat attaatgcta 3780
gagatctcat ttgtgcgcag aagttcaatg gacttacagt gttgccacct ctgctcactg 3840
atgatatgat tgctgcctac actgctgctc tagttagtgg tactgccact gctggatgga 3900
catttggtgc tggcgctgct cttcaaatac cttttgctat gcaaatggca tataggttca 3960
atggcattgg agttacccaa aatgttctct atgagaacca aaaacaaatc gccaaccaat 4020
ttaacaaggc gattagtcaa attcaagaat cacttacaac aacatcaact gcattgggca 4080
agctgcaaga cgttgttaac cagaatgctc aagcattaaa cacacttgtt aaacaactta 4140
gctctaattt tggtgcaatt tcaagtgtgc taaatgatat cctttcgcga cttgataaag 4200
tcgaggcgga ggtacaaatt gacaggttaa ttacaggcag acttcaaagc cttcaaacct 4260
atgtaacaca acaactaatc agggctgctg aaatcagggc ttctgctaat cttgctgcta 4320
ctaaaatgtc tgagtgtgtt cttggacaat caaaaagagt tgacttttgt ggaaagggct 4380
accaccttat gtccttccca caagcagccc cgcatggtgt tgtcttccta catgtcacgt 4440
atgtgccatc ccaggagagg aacttcacca cagcgccagc aatttgtcat gaaggcaaag 4500
catacttccc tcgtgaaggt gtttttgtgt ttaatggcac ttcttggttt attacacaga 4560
ggaacttctt ttctccacaa ataattacta cagacaatac atttgtctca ggaaattgtg 4620
atgtcgttat tggcatcatt aacaacacag tttatgatcc tctgcaacct gagcttgact 4680
cattcaaaga agagctggac aagtacttca aaaatcatac atcaccagat gttgattttg 4740
gcgacatttc aggcattaac gcttctgtcg tcaacattca aaaagaaatt gaccgcctca 4800
atgaggtcgc taaaaattta aatgaatcac tcattgacct tcaagaactg ggaaaatatg 4860
agcaatatat taaatggcct ctcgacgaac aaaaactcat ctcagaagag gatctgaatg 4920
ctgtgggcca ggacacgcag gaggtcatcg tggtgccaca ctccttgccc tttaaggtgg 4980
tggtgatctc agccatcctg gccctggtgg tgctcaccat catctccctt atcatcctca 5040
tcatgctttg gcagaagaag ccacgttagg cggccgctcg agtgctagca ccaagggccc 5100
cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc ggcggcacag ccgccctggg 5160
ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg agctggaaca gcggcgcctt 5220
gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc agcggcctgt acagcctgag 5280
cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa 5340
ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa acgcgtggag cccaagagct gcgacaagac 5400
ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctgctgggc ggaccctccg tgttcctgtt 5460
cccccccaag cccaaggaca ccctcatgat cagccggacc cccgaggtga cctgcgtggt 5520
ggtggacgtg agccacgagg accccgaggt gaagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga 5580
ggtgcacaac gccaagacca agccccggga ggagcagtac aacagcacct accgggtggt 5640
gagcgtgctc accgtgctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt 5700
gagcaacaag gccctgcctg cccccatcga gaagaccatc agcaaggcca agggccagcc 5760
ccgggagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgggag gagatgacca agaaccaggt 5820
gtccctcacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag 5880
caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct gtgctggaca gcgacggcag 5940
cttcttcctg tacagcaagc tcaccgtgga caagagccgg tggcagcagg gcaacgtgtt 6000
cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaaga gcctgagcct 6060
gagccccggc aagtgataat ctagagggcc cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt 6120
gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga 6180
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taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 6300
agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac 6360
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agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 840
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 900
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 960
gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc 1020
gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaatcga tgactctctt aggtagcctt 1080
gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga caggtttaag 1140
gagatcaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc tgataggcac 1200
ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac tcccagttca 1260
attacagctc gccaccatgc ggttctccgc tcagctgctg ggccttctgg tgctgtggat 1320
tcccggcgtc tcgagatcta tcgatgcatg ccatggtacc aagcttgcca ccatgagcag 1380
cagctcttgg ctgctgctga gcctggtggc cgtgacagcc gcccagagca ccatcgagga 1440
gcaggccaag accttcctgg acaagttcaa ccacgaggcc gaggacctgt tctaccagag 1500
cagcctggcc agctggaact acaacaccaa catcaccgag gagaacgtgc agaacatgaa 1560
caacgccggc gacaagtgga gcgccttcct gaaggagcag agcacactgg cccagatgta 1620
ccccctgcag gagatccaga acctgaccgt gaagctgcag ctgcaggccc tgcagcagaa 1680
cggcagcagc gtgctgagcg aggacaagag caagcggctg aacaccatcc tgaacaccat 1740
gtccaccatc tacagcaccg gcaaagtgtg caaccccgac aacccccagg agtgcctgct 1800
gctggagccc ggcctgaacg agatcatggc caacagcctg gactacaacg agcggctgtg 1860
ggcctgggag agctggcgga gcgaagtggg caagcagctg cggcccctgt acgaggagta 1920
cgtggtgctg aagaacgaga tggccagggc caaccactac gaggactacg gcgactactg 1980
gagaggcgac tacgaagtga acggcgtgga cggctacgac tacagcagag gccagctgat 2040
cgaggacgtg gagcacacct tcgaggagat caagcctctg tacgagcacc tgcacgccta 2100
cgtgcgggcc aagctgatga acgcctaccc cagctacatc agccccatcg gctgcctgcc 2160
cgcccacctg ctgggcgaca tgtggggccg gttctggacc aacctgtaca gcctgaccgt 2220
gcccttcggc cagaagccca acatcgacgt gaccgacgcc atggtggacc aggcctggga 2280
cgcccagcgg atcttcaagg aggccgagaa gttcttcgtg agcgtgggcc tgcccaacat 2340
gacccagggc ttttgggaga acagcatgct gaccgacccc ggcaatgtgc agaaggccgt 2400
gtgccacccc accgcctggg acctgggcaa gggcgacttc cggatcctga tgtgcaccaa 2460
agtgaccatg gacgacttcc tgaccgccca ccacgagatg ggccacatcc agtacgacat 2520
ggcctacgcc gcccagccct tcctgctgcg gaacggcgcc aacgagggct ttcacgaggc 2580
cgtgggcgag atcatgagcc tgagcgccgc cacccccaag cacctgaaga gcatcggcct 2640
gctgagcccc gacttccagg aggacaacga gaccgagatc aacttcctgc tgaagcaggc 2700
cctgaccatc gtgggcaccc tgcccttcac ctacatgctg gagaagtggc ggtggatggt 2760
gtttaagggc gagatcccca aggaccagtg gatgaagaag tggtgggaga tgaagcggga 2820
gatcgtgggc gtggtggagc ccgtgcccca cgacgagacc tactgcgacc ccgccagcct 2880
gttccacgtg agcaacgact actccttcat ccggtactac acccggaccc tgtaccagtt 2940
ccagttccag gaggccctgt gccaggccgc caagcacgag ggccccctgc acaagtgcga 3000
catcagcaac agcaccgagg ccggacagaa actgttcaac atgctgcggc tgggcaagag 3060
cgagccctgg accctggccc tggagaatgt ggtgggcgcc aagaacatga atgtgcgccc 3120
cctgctgaac tacttcgagc ccctgttcac ctggctgaag gaccagaaca agaacagctt 3180
cgtgggctgg agcaccgact ggagccccta cgccgaccag agcatcaaag tgcggatcag 3240
cctgaagagc gccctgggcg acaaggccta cgagtggaac gacaacgaga tgtacctgtt 3300
ccggagcagc gtggcctatg ccatgcggca gtacttcctg aaagtgaaga accagatgat 3360
cctgttcggc gaggaggacg tgagagtggc caacctgaag ccccggatca gcttcaactt 3420
cttcgtgacc gcccccaaga acgtgagcga catcatcccc cggaccgaag tggagaaggc 3480
catccggatg agccggagcc ggatcaacga cgccttccgg ctgaacgaca actccctgga 3540
gttcctgggc atccagccca ccctgggccc tcccaaccag ccccccgtga gcatctggct 3600
gatcgtgttt ggcgtggtga tgggcgtgat cgtggtggga atcgtgatcc tgatcttcac 3660
cggcatccgg gaccggaaga agaagaacaa ggcccggagc ggcgagaacc cctacgccag 3720
catcgatatc agcaagggcg agaacaaccc cggcttccag aacaccgacg acgtgcagac 3780
cagcttctga taatctagaa cgagctcgaa ttcgaagctt ctgcagacgc gtcgacgtca 3840
tatggatccg atatcgccgt ggcggccgca ggccagccca aggccgctcc cagcgtgacc 3900
ctgttccccc cctcctccga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctcatc 3960
agcgacttct accctggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgacagcag ccccgtgaag 4020
gccggcgtgg agaccaccac ccccagcaag cagagcaaca acaagtacgc cgccagcagc 4080
tacctgagcc tcacccccga gcagtggaag agccaccgga gctacagctg ccaggtgacc 4140
cacgagggca gcaccgtgga gaagaccgtg gcccccaccg agtgcagcta atagacttaa 4200
gtttaaaccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 4260
cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 4320
atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 4380
ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg 4440
gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc 4500
cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 4560
ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 4620
ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 4680
tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 4740
cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 4800
tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga 4860
ttttggccat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga 4920
attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg 4980
cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg 5040
ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc 5100
gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca 5160
tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct ctgagctatt 5220
ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc 5280
ttgtatatcc attttcggat ctgatcagca cgtgatgaaa aagcctgaac tcaccgcgac 5340
gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc tccgacctga tgcagctctc 5400
ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga gggcgtggat atgtcctgcg 5460
ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat gtttatcggc actttgcatc 5520
ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa ttcagcgaga gcctgaccta 5580
ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac ctgcctgaaa ccgaactgcc 5640
cgctgttctg cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc gctgcggccg atcttagcca 5700
gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt caatacacta catggcgtga 5760
tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg caaactgtga tggacgacac 5820
cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg ctttgggccg aggactgccc 5880
cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac aatgtcctga cggacaatgg 5940
ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc ggggattccc aatacgaggt 6000
cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg gagcagcaga cgcgctactt 6060
cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc gccgcggctc cgggcgtata tgctccgcat 6120
tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat ttcgatgatg cagcttgggc 6180
gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc cggagccggg actgtcgggc gtacacaaat 6240
cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga tggctgtgta gaagtactcg ccgatagtgg 6300
aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc aaaggaatag cacgtgctac gagatttcga 6360
ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg 6420
gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc gcccacccca acttgtttat 6480
tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 6540
tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg 6600
tataccgtcg acctctagct agagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 6660
aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc 6720
ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt 6780
ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 6840
cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 6900
tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 6960
aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 7020
aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 7080
tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 7140
ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 7200
cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 7260
ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 7320
ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 7380
gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 7440
agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg 7500
cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 7560
aaccaccgct ggtagcggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 7620
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 7680
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 7740
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 7800
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 7860
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 7920
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 7980
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 8040
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 8100
tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 8160
ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 8220
tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 8280
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 8340
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 8400
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 8460
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 8520
ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 8580
ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 8640
gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 8700
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 8760
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cg 8792
A/Hong Kong/1/1968的不成熟HA的序列(SEQ ID NO:193)
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELV
QSSSTGKICNNPHRILDGIDCTLIDALLGDPHCDVFQNETWDLFVERSKAFSNCYPYD
VPDYASLRSLVASSGTLEFITEGFTWTGVTQNGGSNACKRGPG
SGFFSRLNWLTKSGSTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGVHHPSTNQEQTSLYVQASGR
VTVSTRRSQQTIIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDVLVINSNGNLIAPRGYFKMR
TGKSSIMRSDAPIDTCISECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNTLKLATGM
RNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQ
INGKLNRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQ
HTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVY
RDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
参考文献
Air MA(1981),Sequence relationships among the hemagglutinin genes of12 subtypes of influenza A virus.Proc Natl Acad Sci USA 78(12):7639-7643.
Boel E et al.(2000),Functional human monoclonal antibodies of allisotypes constructed from phage display library-derived single-chain Fvantibody fragments.J Immunol Methods 239:153-166.
Brown EG et al.(2001),Pattem of mutation in the genome of influenza Avirus on adaptation to increased virulence in the mouse lung:Identification offunctional themes.PNAS 98:6883-6888.
Burton DR and Barbas CF(1994),Human antibodies from combinatoriallibraries.Adv Immunol.57:191-280.
Chou TC and P Talalay(1984),Quantitative analysis of dose-effectrelationships:the
combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.Adv EnzymeRegul 22:27-55.
De Kruif J et al.(1995a),Rapid selection of cell subpopulation-specifichuman monoclonal antibodies from a synthetic phage antibody library.ProcNatl Acad Sci USA 92:3938.
De Kruif J et al.(1995b),Selection and application of human single-chainFv antibody fragments from a semi-synthetic phage antibody display librarywith designed CDR3 regions.J Mol Biol 248:97-105.
Ekiert et al.(2009),Antibody recognition of a highly conserved influenzavirus epitope.Science 324:246-251.
Fouchier AM et al.(2005),Characterization of a novel influenza A virushemagglutinin subtype(H16)obtained from black-headed gulls.J Virol79(5):2814-2822.
Gocník M.et al.(2007),Antibodies specific to the HA2 glycopolypeptideof influenza A virus haemagglutinin with fusion-inhibition activity contribute tothe protection of kice against lethal infection,J Gen Virol 88:951-955.
Huls G et al.(1999),Antitumor immune effector mechanisms recruited byphage display-derived fully human IgG1 and IgA1 monoclonal antibodies.Cancer Res 59:5778-5784.
L and Pursch E(1983),Human x(Mouse x Human)hybridomasstably producing human antibodies.Hybridoma 2(4):361-367.
Slootstra JW et al.(1996),Structural aspects of antibody-antigeninteraction revealed through small random peptide libraries.Mol Divers1:87-96.
StropkovskáA et al.(2009),Broadly cross-reactive monoclonal antibodiesagainst HA2 glycopeptide of influenza A virus hemagglutinin of H3 subtypereduce replication of influenza A viruses of human and avian origin.ActaVirologica 53:15-20.
The World Health Organization Global Influenza Program SurveillanceNetwork(2005),Evolution of H5N1 Avian Influenza Viruses in Asia.EmergInfect Dis 11:1515-1521.
E.et al.(2003a),Inhibition of fusion activity of influenza Ahaemagglutinin mediated by HA2-specific monoclonal antibodies.Arch Virol148:469-486.
E.et al.(2003b),A monoclonal antibody specific to the HA2glycoprotein of influenza A virus haemagglutinin that inhibits its fusion activityreduces replication of the virus.Acta Virologica 47:229-236.
Wang T.et al.(2010),Boradly protective monoclonal antibodies againstH3 influenza viruses following sequential immunization with differenthemagglutinins.PLoS Pathogens 6(2):1-9.