CN102443578A - 一种葡萄糖异构酶突变体及其应用 - Google Patents

一种葡萄糖异构酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种葡萄糖异构酶突变体及其应用，属于酶基因工程和酶工程领域。本发明由嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)总DNA获得高温葡萄糖异构酶基因(NCBI编码：CP000088)，经定点突变后，葡萄糖异构酶基因以质粒pT7-7或能表达该酶的载体为表达载体，以E.coli BL21(DE3)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现高转化率葡萄糖异构酶基因的高效表达；该葡萄糖异构酶基因全长个1158核苷酸，编码385个氨基酸，本发明构建了表达质粒，转化细菌或酵母表达葡萄糖异构酶，所获得的重组酶突变体具有葡萄糖异构酶活性，在70℃条件下转化率为60％，比亲本的转化率高出7％。该重组葡萄糖异构酶的最适温度为80℃，最适pH＝10，70℃半衰期不低于30h。此酶非常适合食品工业生产F55高果糖浆应用的需要。

Description

一种葡萄糖异构酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种葡萄糖异构酶，具体地说涉及一种高转化率葡萄糖异构酶突变体及其生产与应用。
技术背景
葡萄糖异构酶(glucose isomerase，GI)，又称木糖异构酶(xylose isomerase，XI)(EC5.3.1.5)，可以催化D-葡萄糖等醛糖至D-果糖等相应酮醣的异构化反应。因此是工业生产上大规模以淀粉制备高果糖浆的关键酶之一。
果葡糖浆也称高果糖浆或异构糖浆，它是以酶法糖化淀粉所得的糖化液经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆。高果糖浆是甜度与蔗糖相当、风味纯正、营养丰富，且具有协同增效、冷甜爽口、低热量、不致龋齿：防腐效果佳、吸水性好、发酵性能好等特点，是可以最佳替代蔗糖使用或取代蔗糖使用的新型甜味剂。此外，果糖代谢过程中不需胰岛素的辅助，在体内代谢转化的肝糖生成量是葡萄糖的三倍，具有保肝作用；它还能抑制体内蛋白质的消耗，有利于运动员和体力劳动者的营养补给。由于果葡糖浆具有比葡萄糖、蔗糖明显优越的保健与营养功效以及良好的食品加工性能，目前被越来越广泛地应用于饮料、冷食品、糖果、烘焙制品、水果罐头及蜜饯、果酱等食品加工中，其需求量将不断增加。
果葡糖浆是一种由果糖和葡萄糖所组成的混合物，根据其果糖含量的不同，目前市场上主要有F42(果糖占42％)和F55(果糖占55％)两个品种，F55糖浆相对于F42糖浆的主要优点在于：a.F42糖浆不能在低温下储存，易结晶析出葡萄糖，而F55糖浆则可以在26～30℃的范围内储存；b.在同等碳水化合物的前提下，F42糖浆其甜度只有普通蔗糖甜度75％，而F55糖浆甜度与蔗糖甜度相当；c由于F55糖浆果糖含量更高，其保健价值更高。而根据目前国内的具体生产、技术条件和成本要求，绝大部分生产企业只能先生产F42产品，再经色谱分离***的浓缩出F90糖浆(果糖占90％)，再与F42糖浆勾兑出F55糖浆，如果能直接生产出F55糖浆，则生产投资将大大降低。
高温有利于葡萄糖异构转化率的提高，目前，人们已经从一些天然嗜热菌中分离出许多了耐热性葡萄糖异构酶，如Bacills thermoantarcti.CUS，Thermus aquaticus HB8，Thermotoga neapolitana等。人们对其产生的耐热葡萄糖异构酶进行了纯化、定性，肯定了它在制备高糖果浆工业中的巨大潜力。但由于嗜热菌苛刻的培养条件、低的细胞产量及90℃以上的异构转化温度造成副产物和色素的大量生成，其产酶并不适合工业化生产。所以能在60-70℃下就有55％以上的转化率的葡萄糖异构酶真正是果葡糖浆工业生产所要解决的头等问题！
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种葡萄糖异构酶突变体，其亲本具有NCBI编码：YP_289661所示的氨基酸序列，所述葡萄糖异构酶突变体是第243位或244位或284位或286位的氨基酸突变为突变为脯氨酸(Pro)或丝氨酸(Ser)或丙氨酸(Ala)或异亮氨酸(Ile)或苏氨酸(Thr)或缬氨酸(Val)。
所述葡萄糖异构酶突变体为第244位组氨酸、第243位苯丙氨酸分别突变为脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸中的一种。
所述葡萄糖异构酶突变体为第243位苯丙氨酸、第244位组氨酸、284位脯氨酸、286位组氨酸均突变为脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸中的一种。
所述葡萄糖异构酶突变体为是286位组氨酸突变为脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸中的一种。
编码本发明的葡萄糖异构酶突变体的基因序列也属于本发明要求保护的范围。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种生产葡萄糖异构酶突变体的方法，具体技术方案如下：根据嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)葡萄糖异构酶基因NCBI编码：CP000088，设计定点突变的突变引物，以携带葡萄糖异构酶基因的克隆载体为模板进行定点突变构建突变体；以质粒pT7-7或能表达该酶的载体为表达载体，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞或能表达该酶的宿主细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养。
本发明应用于果葡糖浆的生产，应用温度为60-70℃，应用pH为5.0-8.5，应用磷酸盐浓度为50-100mM、镁离子浓度为5-8mM。
使用本突变体生产果葡糖浆，在上述转化条件下，突变体酶生产果葡糖浆的转化率达到55％-60％，较野生酶高3％-8％左右，此酶突变体解决了长期困扰果葡糖浆工业生产的技术难题，具有突出的技术进步。
附图说明
图1葡萄糖异构酶突变体的分离纯化SDS-PAGE图谱
M：标准蛋白Marker，1破壁上清液，2热处理纯化后的酶液，3离子交换和凝胶排阻纯化后的酶液，
图2葡萄糖异构酶突变体的最适温度
图3葡萄糖异构酶突变体的最适pH
NaAc-HAc缓冲液(pH 4.0-5.0)，Na-K-PO4缓冲液(pH 5.0-9.0)和Gly-NaOH缓冲液(pH9.0-12.0)
图4葡萄糖异构酶突变体在70℃稳定性研究
图5葡萄糖异构酶突变体在70℃转化率研究
pH7.5(○)，pH5.0(□)
具体实施方式
实施例1、葡萄糖异构酶单位点突变体的构建
根据嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)葡萄糖异构酶基因NCBI编号：CP000088，采用化学全合成法合成亲本序列，克隆到pMD18-T，构建载体xylA/pMD18-T。根据亲本序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以载体xylA/pMD18-T为模板，单突变P284S引物为：
引物B-ST-1：5’-AGTGGCTACGACGGATCGCGCCACTTCGACTTCAAGACC-3’(下划线为突变碱基)
引物B-ST-2：5’-GGTCTTGAAGTCGAAGTGGCGCGATCCGTCGTAGCCACT-3’(下划线为突变碱基)
PCR反应体系为：2×PrimeSTARTM GC Buffer(含Mg2+)25μL，dNTPs(各2.5mmol/L)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimeSTARTM HS DNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后进行30个循环(94℃10s，60℃5s，72℃4min30s)；72℃延伸10min；最后4℃保温。
PCR产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养，后提取质粒，突变质粒测序正确，构建的突变体命名为xylA-S。
实施例2、葡萄糖异构酶双位点突变体的构建
根据嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)葡萄糖异构酶基因NCBI编号：CP000088，采用化学全合成法合成亲本序列，克隆到pMD18-T，构建载体xylA/pMD18-T。根据亲本序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以载体xylA/pMD18-T为模板，双突变F243I、H244T，定点突变引物为：
引物A-IT-1：5’-TGGCACGGCAAACTGATCACCATCGACCTCAACGGC-3’(下划线为突变碱基)
引物A-IT-2：5’-GCCGTTGAGG TCGATGGTGA TCAGTTTGCC GTGCCA-3’(下划线为突变碱基)
PCR反应体系为：2×PrimeSTARTM GC Buffer(含Mg2+)25μL，dNTPs(各2.5mmol/L)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimeSTARTM HS DNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后进行30个循环(94℃10s，60℃5s，72℃4min30s)；72℃延伸10min；最后4℃保温。
PCR产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养，后提取质粒，突变质粒测序正确，构建的突变体命名为xylA-IT。
实施例3、葡萄糖异构酶四位点突变体的构建
根据嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)葡萄糖异构酶基因NCBI编号：CP000088，采用化学全合成法合成亲本序列，克隆到pMD18-T，构建载体xylA/pMD18-T。根据亲本序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以载体xylA/pMD18-T为模板，双突变F243I/H244T，定点突变引物为：
引物A-IT-1：5’-TGGCACGGCAAACTGATCACCATCGACCTCAACGGC-3’(下划线为突变碱基)
引物A-IT-2：5’-GCCGTTGAGG TCGATGGTGA TCAGTTTGCC GTGCCA-3’(下划线为突变碱基)
再以载体xylA(F243I/H244T)/pT7-7为模板，双突变P284S/H286T，定点突变引物为：
引物B-ST-1：5’-AGTGGCTACGACGGATCGCGCACCTTCGACTTCAAGACC-3’(下划线为突变碱基)
引物B-ST-2：5’-GGTCTTGAAGTCGAAGGTGCGCGATCCGTCGTAGCCACT-3’(下划线为突变碱基)
PCR反应体系均为：2×PrimeSTARTM GC Buffer(含Mg2+)25μL，dNTPs(各2.5mmol/L)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimeSTARTM HS DNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR扩增条件均为：94℃预变性4min；随后进行30个循环(94℃10s，60℃5s，72℃4min30s)；72℃延伸10min；最后4℃保温。
PCR产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养，后提取质粒，突变质粒测序正确，构建的突变体命名为xylA-ITST。
实例4、野生或突变重组葡萄糖异构酶的表达与发酵制备
将上述得到的质粒与pT7-7载体(商业化载体)，进行NdeI和HindIII双酶切，酶切产物经胶回收后，用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌JM109，经37℃培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，8h后抽提质粒，得到富集的亲本葡萄糖异构酶质粒和葡萄糖异构酶突变体质粒。
将他们分别转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞后在LB/Amp(含100μg/mL氨苄青霉素)平板上37℃培养，8h后挑选转化子在LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)37℃培养2h后，降温至25℃后，用4mg/LIPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导培养30h。
实例5、野生或突变重组葡萄糖异构酶的纯化
取100ml培养后的菌体10,000rpm，4℃离心10min，去尽上清，加入10mL PBS缓冲液(50mM KPO4，10mM MgSO4，pH 7.5)，充分混匀，ON 10s，OFF 10s，超声破碎。4℃，13,000rpm，离心30min，上清即为粗酶液，把粗酶液在70℃水浴10min，4℃，13,000rpm，离心30min，取上清进行离子柱纯化。采用ARTK蛋白纯化***，采用Sepharose Fast Flow层析柱，DEAE为其阴离子交换介质基团，洗脱液为：A液(50mM KPO4，5mMMgSO4，pH 7.5)，B液(0mM KPO4，5mMMgSO4，1M NaClpH 7.5)。对出峰蛋白进行酶活测定，选取合适的洗脱液比例洗脱含目的蛋白的吸收峰。再把目的蛋白用分子排阻色谱进行二次纯化，对出峰蛋白进行酶活测定，选取合适的洗脱时间回收含目的蛋白的吸收峰，把目的蛋白用分子用SDS-PAGE蛋白电泳对粗酶液和不同纯化的阶段产物进行电泳，比较纯化效果(见图1)。
多突变位点、双突变位点和单突变位点葡萄糖异构酶的酶学性质基本相同，下文中以实例1中制备的多突变位点葡萄糖异构酶为例进行说明。
实例6、重组葡萄糖异构酶的特性。
当以葡萄糖为底物时，葡萄糖异构酶的最适温度为80℃(图2)，最适pH10(图3)，在70℃具有很高的稳定性，半衰期大于30h(图4)。
实例7、HPLC方法分析葡萄糖异构酶的转化率。
考察两种pH条件下重组葡萄糖异构酶的转化能力，葡萄糖转化体系为5mL，包含50mMNa-K-PO4缓冲液(pH 7.5或5.0)，42％(W/V)D-葡萄糖水溶液，5mM MgSO4水溶液，100U的酶液，70℃水浴，间隔一定时间取样，样品于沸水中加热5min使样品中的酶失活变性后，稀释为1/100，12000r/min离心25min，上清经0.45μm超滤膜过滤后取500μL进行分析。HPLC分析的条件为：Agilent1200 HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱AminexHPX-87H lon Exclusion Cloumn(7.8mm×300mm)，Agilent1200示差检测器；流动相为0.0005M H2SO4溶液，流速0.6mL/min；柱温50℃；池温(检测器)30℃；进样量10μL。
实验结果如图5，将上述突变体表达获得的突变酶与野生酶相比，可以发现，突变体实现了葡萄糖转化率的提高，终产量达到60％。
Figure IDA0000117701800000011
Figure IDA0000117701800000021

Claims (9)

1.一种葡萄糖异构酶突变体，其特征在于在NCBI登陆号YP_289661所示的氨基酸序列中进行一个或多个酶的氨基酸位点的取代。
2.权利要求1所述的葡萄糖异构酶突变体，其特征所述氨基酸取代位点为第243位苯丙氨酸、第244位组氨酸、284位脯氨酸、286位组氨酸的一个或其组合。
3.权利要求2所述的葡萄糖异构酶突变体，其特征是第244位组氨酸、第243位苯丙氨酸分别突变为脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸中的一种。
4.权利要求2所述的葡萄糖异构酶突变体，其特征是第243位苯丙氨酸、第244位组氨酸、284位脯氨酸、286位组氨酸均突变为脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸中的一种。
5.权利要求2所述的葡萄糖异构酶突变体，其特征是第286位组氨酸突变为脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸中的一种。
6.权利要求1-5任一所述突变体应用于葡萄糖到果糖的转化或制备果葡糖浆。
7.权利要求6所述应用，其特征在于葡萄糖到果糖的转化的处理工艺控制温度为70℃，pH为7.5。
8.编码权利要求1-5任一所述葡萄糖异构酶突变体的核苷酸序列。
9.一种生产权利要求1-5任一所述葡萄糖异构酶突变体的方法，其特征是由嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)总DNA获得葡萄糖异构酶基因，NCBI编码为CP000088，经定点突变后，突变基因以质粒pT7-7或能表达该酶的质粒为表达载体，以E.coli BL21(DE3)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现葡萄糖异构酶基因的高效表达。
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