CN110129381B - 一种高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株及其构建方法与应用，重组菌株的构建方法包括：在解脂耶氏酵母全基因组中获得SNF1基因，以解脂耶氏酵母基因组为模板，通过PCR反应分别扩增SNF1基因的上下游片段及URA3片段，然后通过重叠延伸PCR方法，将SNF1基因的上下游片段连接在URA3片段的上游和下游，得到SNF1基因敲除组件，再将SNF1基因敲除组件转入已筛选好的尿嘧啶缺陷型的解脂耶氏酵母菌株，筛选得到SNF1基因被敲除的解脂耶氏酵母重组菌株。本发明通过敲除Snf1蛋白的SNF1基因，解除了氮饥饿胁迫与赤藓醇合成之间的偶联作用，本发明的重组酵母菌株能够在高氮条件下合成赤藓醇，且发酵效率明显提高，解决了赤藓醇的工业生产中发酵延迟、产率低下的问题。

Description

一种高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于DNA重组技术领域，尤其涉及一种高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株及其构建方法与应用。

背景技术

赤藓醇(Erythritol)是一种常用的非糖甜味剂，具有极低的热量值(0.2kcal/g)及零升糖指数，是唯一通过尿液直接排出体外而不参与人体代谢的糖醇，因而极适合糖尿病人、肥胖病及心血管疾病患者食用，成了极为重要的特殊膳食添加剂。赤藓醇的获取方法主要是发酵法，在高渗透压环境下，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)能够直接利用各种工农业废弃物生成赤藓醇，该方法在发酵产量、菌株安全性及低成本发酵等方面独具优势。Y.lipolytica等报道了利用甘油合成赤藓醇，其途径为：甘油经磷酸化进入糖酵解途径，而后参与磷酸戊糖(PPP)途径，最后经赤藓糖还原酶的作用生成赤藓醇。该方法中，培养基高碳氮比(即氮饥饿)是细胞启动赤藓醇生成的必需前提，氮饥饿能抑制菌体生长、改变胞内物质代谢，促使碳源流向赤藓醇生成的PPP途径。然而氮饥饿对菌体生长产生的过度限制会导致发酵滞缓及碳源过剩，引起产物发酵效率低下，这成为很多产物发酵的共性问题。针对培养基高碳氮比引起的赤藓醇发酵效率过低问题，目前研究主要集中于菌种选育及发酵条件优化两个方面，但均未有突破性提高。

酵母菌中存在一种具有胞内能量感应器功能的激酶，即SNF1蛋白激酶(简称SNF1)，SNF1是高度保守的异源三聚体，包含α亚基(Snf1蛋白)，β亚基(Sip1、Sip2或Gal83蛋白)及γ亚基(Snf4)三个亚基，其中α亚基的Snf1蛋白是感知能量、调控酶活性的关键亚基，在营养胁迫条件下，上游激活蛋白及高水平ADP使Snf1蛋白的Thr210位点发生磷酸化激活，实现其下游调控功能。Snf1蛋白的活化是氮饥饿胁迫下胞内反应的限速步骤，同时，Snf1蛋白在碳源利用、产物合成及这些途径关联中起重要作用。因此，通过解除氮饥饿胁迫与赤藓醇合成之间的偶联作用的途径，使解脂耶氏酵母能够在高氮条件下合成赤藓醇，对解决传统发酵中氮饥饿启动的赤藓醇合成中出现的发酵滞缓及效率低下问题具有极为重要的意义。

发明内容

针对上述背景技术指出的不足，本发明提供了一种高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株及其构建方法与应用，通过敲除Snf1蛋白的SNF1基因，解除了氮饥饿胁迫与赤藓醇合成之间的偶联作用，使得解脂耶氏酵母能够在高氮条件下合成赤藓醇，解决了传统发酵中氮饥饿启动的赤藓醇合成中发酵滞缓及效率低下问题。

本发明的目的在于提供一种高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株，所述重组酵母菌株为Snf1蛋白的SNF1基因被敲除的解脂耶氏酵母菌株，所述SNF1基因的序列如SEQNO.1所示，所述重组酵母菌株的保藏编号为：CGMCC NO.17555，分类命名为：解脂耶罗维亚酵母Yarrowia lipolytica，保藏日期为：2019年04月11日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明的另一目的在于提供一种高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株的构建方法，包括在解脂耶氏酵母全基因组中获得SNF1基因，SNF1基因的序列如SEQ NO.1所示，以解脂耶氏酵母基因组为模板，通过PCR反应分别扩增所述SNF1基因的上游、下游片段及解脂耶氏酵母菌筛选标记URA3片段，然后通过重叠延伸PCR方法，将SNF1基因的上游、下游片段连接在解脂耶氏酵母菌筛选标记URA3片段的上游和下游，构建得到SNF1基因敲除组件，所述SNF1基因敲除组件的序列为SEQ NO.5，再将所述SNF1基因敲除组件转入已筛选好的尿嘧啶缺陷型的解脂耶氏酵母菌株，经转化筛选得到SNF1基因被敲除的解脂耶氏酵母菌株，即为重组酵母菌株。

优选地，所述SNF1基因敲除组件的构建过程中，SNF1基因的上游序列为SEQ NO.2，SNF1基因的下游序列为SEQ NO.3；URA3序列为SEQ NO.4。

优选地，所述PCR反应中，扩增SNF1基因上游的引物为：

SNF1-UR 5'-atggcgaccgaacacg-3'，

SNF1-UR：5'-acagatactcgtcgaccctgcatatccgact-3'；

扩增SNF1基因下游的引物为：

SNF1-DF：5'-caggcctttgtcgactttgacggctgggagt-3'，

SNF1-DR：5'-ttacttctcactctccttct-3'；

扩增URA3的引物为：

URA3-F：5'-agtcg gatatgcagg gtcgacgagt atctgt-3'，

URA3-R：5'-actccc agccgtcaaa gtcgacaaag gcctg-3'。

优选地，所述SNF1基因敲除组件通过乙酸锂转化法转入已筛选好的尿嘧啶缺陷型的解脂耶氏酵母菌株。

优选地，所述SNF1基因敲除组件通过电击转化法转入已筛选好的尿嘧啶缺陷型的解脂耶氏酵母菌株。

本发明的又一目的在于提供一种高氮条件下重组酵母菌株在发酵产生赤藓醇中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种高氮条件下重组酵母菌株发酵产生赤藓醇的方法，包括如下步骤：

首先将重组酵母菌株，即SNF1基因被敲除的解脂耶氏酵母菌株，接种在YPD培养平板上，培养基为20.0g/L葡萄糖、20.0g/L蛋白胨、10.0g/L酵母粉和15.0g/L琼脂，在28℃培养3天长出单菌落；

然后将单菌落接种于YPD液体培养基中，28℃振荡培养至DO₆₀₀＝30，获得种子液，将种子液接入赤藓醇发酵培养基中，接种量10％，28℃振荡培养5天即得赤藓醇。

优选地，所述赤藓醇发酵培养基的组成为：甘油100g/L，硫酸铵12.5g/L，K₂HPO₄0.23g/L，MgSO₄ 1.0g/L，酵母粉1.0g/L，氯化钠25.0g/L，以蒸馏水配制。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明基于解脂耶氏酵母产生赤藓醇的天然特性，通过遗传重组改造酵母的生理代谢途径，利用基因敲除技术对酵母进行改造，获得了一种SNF1基因被敲除的解脂耶氏酵母重组菌株。经过实验发现，该重组酵母菌株在制备赤藓醇方面具有显著的进步性，能在高氮条件下合成赤藓醇，相对于传统氮饥饿启动赤藓醇合成的发酵特征，发酵赤藓醇产量相近的情况下，发酵时间缩短了28.6％，因而本发明重组菌株能明显提高赤藓醇的发酵效率。此外，在高氮条件下制备赤藓醇，解决了赤藓醇的工业生产方法所存在的发酵延迟、产率低下的问题，促进了微生物发酵方法在赤藓醇工业生产中的应用。

附图说明

图1是本发明实施例2提供的原始菌株与重组菌株分别在低氮和高氮培养基中产生的赤藓醇含量及碳源消耗比较图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株的构建方法

(1)SNF1基因序列分析及克隆

参照解脂耶氏酵母SWJ-1b(分离自渤海鱼类肠道)全基因组中SNF1，Genbank基因登录号为XP_502312的基因为SNF1基因。SNF1基因序列如SEQ NO.1所示。

(2)构建基因SNF1敲除菌株

采用基因融合技术构建基因敲除组件，以解脂耶氏酵母基因组为模板，设计扩增引物，通过PCR反应分别扩增SNF1基因的上游、下游片段及解脂耶氏酵母菌筛选标记URA3片段，上下游片段PCR反应体系：2μL酵母基因组DNA、1μL引物、2μL dNTP、5μL MgCl₂、5μL LATaq聚合酶缓冲液和0.5μL LA Taq聚合酶。PCR循环条件：94℃预变性5min，30个循环(94℃变性30s，55℃退火30s和72℃延伸1min)，循环结束后再在72℃延伸5min。URA3片段PCR反应体系：2μL酵母基因组DNA、1μL引物、2μL dNTP、5μL MgCl₂、5μL LA Taq聚合酶缓冲液和0.5μL LA Taq聚合酶。PCR循环条件：94℃预变性5min，30个循环(94℃变性30s，55℃退火30s和72℃延伸1.5min)，循环结束后再在72℃延伸5min。

SNF1基因的上游序列为SEQ NO.2，SNF1基因的下游序列为SEQ NO.3；URA3序列为SEQ NO.4。

PCR反应中，扩增SNF1基因上游的引物为：

SNF1-UR 5'-atggcgaccgaacacg-3'，

SNF1-UR：5'-acagatactcgtcgaccctgcatatccgact-3'；

扩增SNF1基因下游的引物为：

SNF1-DF：5'-caggcctttgtcgactttgacggctgggagt-3'，

SNF1-DR：5'-ttacttctcactctccttct-3'；

扩增URA3的引物为：

URA3-F：5'-agtcg gatatgcagg gtcgacgagt atctgt-3'，

URA3-R：5'-actccc agccgtcaaa gtcgacaaag gcctg-3'。

然后利用SNF1-UF和SNF1-DR引物，通过重叠延伸PCR方法，将SNF1基因的上游、下游片段分别连接在解脂耶氏酵母菌筛选标记URA3基因表达元件的上游和下游，PCR反应体系：2μL酵母基因组DNA、1μL引物、2μL dNTP、5μL MgCl₂、5μL LA Taq聚合酶缓冲液和0.5μLLA Taq聚合酶。PCR循环条件：94℃预变性5min，30个循环(94℃变性30s，55℃退火30s和72℃延伸2min)，循环结束后再在72℃延伸5min。构建得到SNF1基因敲除组件(genereplacement construct)，基因敲除组件是将基因SNF1上下游片段与抗性筛选基因融合而成的片段，基因敲除组件结构为：SNF1上游—URA3基因—SNF1下游，SNF1基因敲除组件的序列为SEQ NO.5。

解脂耶氏酵母于5-FOA(YPD培养基中加入1g/L的5-FOA)平板上多次划线培养单菌落，筛选出尿嘧啶缺陷型的解脂耶氏酵母菌株。再利用乙酸锂转化法将SNF1基因敲除组件转入尿嘧啶缺陷型的解脂耶氏酵母菌株，基因敲除组件进入菌体后经同源重组可以将SNF1的部分序列替换，破坏该基因的功能。转化子经YNB平板(0.17g/L YNB，0.5g/L硫酸铵，1.0g/L葡萄糖，2.0g/L琼脂粉)及PCR筛选，得到SNF1基因被敲除的解脂耶氏酵母菌株，即为重组酵母菌株。SNF1基因敲除组件也可通过电击转化法转入尿嘧啶缺陷型的解脂耶氏酵母菌株。

得到的重组酵母菌株为SNF1基因被敲除的解脂耶氏酵母菌株，保藏编号为：CGMCCNO.17555，分类命名为：解脂耶罗维亚酵母Yarrowia lipolytica，保藏日期为：2019年04月11日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

实施例2

一种高氮条件下重组酵母菌株发酵产生赤藓醇

分别将原始菌株和实施例1获得的重组酵母菌株(SNF1基因被敲除的解脂耶氏酵母菌株)分别在YPD培养平板上(20.0g/L葡萄糖、20.0g/L蛋白胨、10.0g/L酵母粉和15.0g/L琼脂)，在28℃培养3天长出单菌落；

然后将单菌落分别接种于低氮及高氮发酵培养基中，28℃振荡培养至DO₆₀₀＝30，获得种子液，将种子液接入赤藓醇发酵培养基中，赤藓醇发酵培养基的组成为：甘油100g/L，硫酸铵12.5g/L，K₂HPO₄ 0.23g/L，MgSO₄ 1.0g/L，酵母粉1.0g/L，氯化钠25.0g/L，以蒸馏水配制。接种量10％，28℃振荡培养5天。培养液经离心获得上清液，上清液分别稀释20倍后，利用分光光度计法测定赤藓醇含量。

测定方法为：各稀释的试样中加入0.5mL高碘酸钠试剂(0.03M)，室温下放置8～10min；随后加入0.5mL SnCl₂(0.125M)，摇匀；接着加2.0mL变色酸(0.2M)，用力摇匀后置于沸水浴30min，待冷却后转移至比色管中定容至25mL，于570nm处测吸光度，并通过标准曲线计算出产量。

结果如图1所述，图1中，线条1为高氮条件下重组菌株发酵赤藓醇产量，线条2为低氮条件下原始菌株发酵赤藓醇产量，线条3为高氮条件下底物甘油的含量，线条4为低氮条件下底物甘油的含量。由图可知，原始菌株的发酵赤藓醇产量为74.9g/L，发酵时间长达168h，重组菌株的发酵赤藓醇产量为77.5g/L，但发酵时间缩短至120h，虽然产量相差不大，但发酵时间缩短了28.6％，因而表面重组菌株在高氮条件下培养能够显著提高赤藓醇发酵效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 淮阴师范学院

<120> 一种高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株及其构建方法与应用

<150> 2019103790315

<151> 2019-05-08

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1740

<212> DNA

<213> Yarrowia lipolytica

<400> 1

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<210> 2

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<212> DNA

<213> Yarrowia lipolytica

<400> 2

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<210> 3

<211> 180

<212> DNA

<213> Yarrowia lipolytica

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<210> 4

<211> 1710

<212> DNA

<213> Yarrowia lipolytica

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<213> Yarrowia lipolytica

<400> 5

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gcgagtactc caagcagacc attgagcttg cccgatccga ccccgagttt gtggttggct 1260

tcattgccca gaaccgacct aagggcgact ctgaggactg gcttattctg acccccgggg 1320

tgggtcttga cgacaaggga gacgctctcg gacagcagta ccgaactgtt gaggatgtca 1380

tgtctaccgg aacggatatc ataattgtcg gccgaggtct gtacggccag aaccgagatc 1440

ctattgagga ggccaagcga taccagaagg ctggctggga ggcttaccag aagattaact 1500

gttagaggtt agactatgga tatgtcattt aactgtgtat atagagagcg tgcaagtatg 1560

gagcgcttgt tcagcttgta tgatggtcag acgacctgtc tgatcgagta tgtatgatac 1620

tgcacaacct gtgtatccgc atgatctgtc caatggggca tgttgttgtg tttctcgata 1680

cggagatgct gggtacaagt agctaatacg attgaactac ttatacttat atgaggcttg 1740

aagaaagctg acttgtgtat gacttattct caactacatc cccagtcaca ataccaccac 1800

tgcactacca ctacaccaaa accatgatca aaccacccat ggacttcctg gaggcagaag 1860

aacttgttat ggaaaagctc aagagagaga agccaagata ctatcaagac atgtgtcgca 1920

acttcaagga ggaccaagct ctgtacaccg agaaacaggc ctttgtcgac tttgacggct 1980

gggagtgcga gacggagagc ggtgagatta agacccgcga tgtcgcccag gtgtcgaatt 2040

caaagtccgc caacgagacc ttcacgtttt ccgcataccc cttcttgcat ctggccaccc 2100

ggctcattat ggagctggcc gtgagttctc agaaggagag tgagaagtaa 2150

Claims (6)

1.一种高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株，其特征在于，所述重组酵母菌株为Snf1蛋白的SNF1基因被敲除的解脂耶氏酵母菌株，所述SNF1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组酵母菌株的保藏编号为：CGMCC NO.17555，分类命名为：解脂耶罗维亚酵母Yarrowia lipolytica，保藏日期为：2019年04月11日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.一种如权利要求1所述的高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，在解脂耶氏酵母全基因组中获得SNF1基因，SNF1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，以解脂耶氏酵母基因组为模板，通过PCR反应分别扩增所述SNF1基因的上游、下游片段及解脂耶氏酵母菌筛选标记URA3片段，然后通过重叠延伸PCR方法，将SNF1基因的上游、下游片段连接在解脂耶氏酵母菌筛选标记URA3片段的上游和下游，构建得到SNF1基因敲除组件，所述SNF1基因敲除组件的序列为SEQ ID NO.5，再将所述SNF1基因敲除组件转入已筛选好的尿嘧啶缺陷型的解脂耶氏酵母菌株，经转化筛选得到SNF1基因被敲除的解脂耶氏酵母菌株，即为重组酵母菌株。

3.如权利要求2所述的高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述SNF1基因敲除组件的构建过程中，SNF1基因上游序列为SEQ ID NO.2，所述SNF1基因的下游序列为SEQ ID NO.3；所述URA3序列为SEQ ID NO.4。

4.如权利要求2所述的高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述PCR反应中，扩增SNF1基因上游的引物为：

SNF1-UR 5'-atggcgaccgaacacg-3'，

SNF1-UR：5'-acagatactcgtcgaccctgcatatccgact-3'，

扩增SNF1基因下游的引物为：

SNF1-DF：5'-caggcctttgtcgactttgacggctgggagt-3'，

SNF1-DR：5'-ttacttctcactctccttct-3'；

扩增URA3的引物为：

URA3-F：5'-agtcg gatatgcagg gtcgacgagt atctgt-3'，

URA3-R：5'-actccc agccgtcaaa gtcgacaaag gcctg-3'。

5.如权利要求2所述的高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述SNF1基因敲除组件通过乙酸锂转化法转入已筛选好的尿嘧啶缺陷型的解脂耶氏酵母菌株。

6.如权利要求2所述的高氮条件下发酵赤藓醇的重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述SNF1基因敲除组件通过电击转化法转入已筛选好的尿嘧啶缺陷型的解脂耶氏酵母菌株。

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