CN116240196A - 一种磷酸酶的突变体及其在果糖和阿洛酮糖制备中的应用 - Google Patents
一种磷酸酶的突变体及其在果糖和阿洛酮糖制备中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种磷酸酶的突变体及在制备果糖和阿洛酮糖中的应用。本发明通过大量筛选获得单位点突变的突变体，进一步通过饱和突变获得组合突变，经实验表明，相比野生型而言，特异性和催化活性均明显提升；建立淀粉制备果糖和阿洛酮糖制备体系，最终果糖转化率均超过90%，最终产物体系中果糖含量占总糖比例超过90%，非常适合制备阿洛酮糖以及高果糖浆等产品。因此，本发明具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及磷酸酶的突变体及其果糖生物制备方法。
背景技术
果糖属于单糖，是目前已知的健康新型糖源，甜度为蔗糖的1.2～1.8倍，天然存在于水果、蜂蜜和谷物的浆汁中。果糖有水果香味，热值低，不易被口腔内链球菌转化为酸，从而抑制龋齿的产生；其甜度的最高峰值来得快，去得快，甜味不会影响其它香味，具有增强产品风味的作用。果糖有良好的溶解性，人体吸收速度快，可快速补充机体能量，是运动及体力消耗大人群的主要体能补充来源，国外利用这一特性开发出了各种营养型、能量型、清凉型的固体饮料。
果糖含有结晶果糖的特殊医学用途配方食品正逐渐被越来越多的消费者所接受。果糖注射液作为新一代不依赖胰岛素的高能量营养输液，在世界医药市场的表现十分活跃，被美、英、德、日等国家收录入药典，己成为仅次于葡萄糖的第二大注射液。甘油果糖输液、果糖氯化钠注射液以及果糖Vc片剂等都已经用于心血管病、糖尿病、脑颅病及肝等的治疗；果糖还可以加快乙醇的代谢作用，可用于治疗乙醇中毒。因此，果糖凭借其独特优势成为众多食品、保健品、医药等产品的重要原材料。
目前工业上大规模生产果糖主要采用采用淀粉水解制葡萄糖，后者经固定化葡萄糖异构酶转化为果糖及富含果糖的糖浆，再经分离、结晶技术得到结晶果糖。也有相关研究直接将蔗糖进行水解、分离、结晶获得果糖。采用上述方法获得果糖含量高的高果糖浆和结晶果糖，需要经过复杂的色谱分离过程。文献(A Biomimetic Biotechnological Processfor Converting Starch to Fructose:Thermodynamic and EvolutionaryConsiderations in Applied Enzymology.J.Am.Chem.SOC.1992,114,6980-6987)公开了淀粉制备果糖的路线和思路，该方法基于磷酸化和脱磷酸化反应，相比传统方法依赖葡萄糖制备果糖的方法，有可能具有较高的转化率。专利WO2018169957A1同样公布了淀粉制备果糖的方法，同时公布了路线中各个酶的来源和反应条件，但是该专利文献中公开了很多淀粉制备很多产物的方法，而且针对淀粉制备果糖实施方案，尽管标明了反应条件，但是并未给出真实转化率。淀粉制备果糖路线核心关键在于催化果糖6-磷酸合成果糖的磷酸酶，该酶的高活性和催化特异性直接决定果糖得率，因此如何活性催化活性高、特异性好的催化果糖6-磷酸脱磷酸反应合成果糖的磷酸酶是实现淀粉制备果糖的关键。
D-阿洛酮糖是果糖的差向异构体，其甜度为蔗糖的70％，低热量，是一种非常理想的低卡路里甜味剂，可作为蔗糖替代品应用于食品领域；已经被美国食品及药品管理局(FDA)正式批准D-阿洛酮糖为GRAS食品，允许应用到食品、医药制剂以及膳食补充剂中。传统阿洛酮糖制备方法依赖于生物转化果糖合成阿洛酮糖，而果糖生产成本远高于淀粉，因此如建立淀粉高效制备果糖路线，进而级联异构反应合成阿洛酮糖，将有助于实现阿洛酮糖的低成本制备。
发明内容
本发明的通过研究筛选获得磷酸酶的突变体，其特征在于，其相对于SEQ ID NO.1存在下述氨基酸位点的突变：第122、126、149、178、181和175中的单个位置存在取代突变，或多个位置存在取代突变。
优选地，其相对于SEQ ID NO.1存在下述氨基酸位点：第122位突变为Y、H或Q，或第126位突变为T、H、E或F，或第149位突变为M或E，或第178位突变为H或S，第181位突变为M、H、F或K，第175位突变为A或R。
更优选地，其相对于SEQ ID NO.1存在下述氨基酸位点组合的突变：第122位和第126位同时存在突变，第122位和第149位同时存在突变，第122位和第178位同时存在突变，第122位和第181位同时存在突变，第122位和第175位同时存在突变；第126位和第149位同时存在突变，第126位和第178位同时存在突变，第126位和第181位同时存在突变，第126位和第175位同时存在突变；第149位和第1178位同时存在突变，第149位和第181位同时存在突变，第149位和第175位同时存在突变；第178位和第181位同时存在突变，第178位和第1175位同时存在突变；第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位和第149位同时存在突变，第126位、第149位和第178位同时存在突变；第178位、第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位、第149位和第178位同时存在突变；第126位、第149位、第178位和第181位同时存在突变；第149位、第178位、第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位、第149位、第178位和第181位同时存在突变；第126位、第149位、第178位、第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位、第149位、第178位、第181位和第175位同时存在突变。
本发明进一步提供所述磷酸酶的突变体在合成果糖中的应用。
具体地，以淀粉、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖为底物。
在一个具体实施方式中，当以淀粉底物,其反应体系为含有下述酶：
(1)葡聚糖磷酸化酶GP，该酶催化麦芽糊精转化为葡萄糖1-磷酸，(2)葡萄糖磷酸变位酶PGM,该酶催化1-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖；(3)葡萄糖磷酸异构酶：葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶，以及如权利要求1-4任一项所述的磷酸酶突变体；优选的，其反应体系中含有淀粉、Mg2+、葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶，以及所述的磷酸酶突变体；更优选地，葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotogamaritima，基因在KEGG上的标号为TM1168，葡萄糖磷酸变位酶来源于Thermotogamaritima，基因在KEGG上的编号为TM0769；葡萄糖磷酸异构酶PGI选择来源于Thermusthermophilus,其在UniProt上的标号为A3DBX9。
优选地，反应体系中还含有葡萄糖异构酶、葡萄糖激酶和聚磷酸激酶；优选地，葡萄糖异构酶来源于Thermus thermophilus，基因在Uniprot上的编号为P26997；葡萄糖激酶来源于Thermobifida fusca，基因在KEGG上的标号为Tfu_1811；聚磷酸激酶来源于Thermusthermophi lus，基因在KEGG上的编号为TT_C0637。
更优选地，所述反应体系中，淀粉的浓度为1-500g/L,磷酸盐浓度为1-100mM,葡聚糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为0.1-1000U/mL，果糖6-磷酸磷酸酶用量为0.1-1000U/mL。
优选的麦芽糊精的浓度为100g/L,磷酸盐浓度为20mM,葡聚糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为10U/mL，果糖6-磷酸磷酸酶10U/mL。
所述酶催化的反应条件为10-80℃，反应时间为1-120小时；优选为60℃，反应48-96小时。
为了进一步提升转化率，淀粉可经异淀粉酶处理或者直接添加至反应体系中，异淀粉酶的添加量为0.1-1000U/mL,优选0.5U/mL。
进一步提升转化率，反应体系中可添加4-葡聚糖转移酶，4-葡聚糖转移酶用量为0.1-1000U/mL，优选0.5U/mL。
为了进一步提升转化率，体系中增加葡萄糖激酶，聚磷酸激酶，葡萄糖激酶的用量为0.1-1000U/mL,聚磷酸激酶用量为0.1-1000U/mL,优选葡萄糖激酶用量为0.5U/mL，葡萄糖异构酶用量为0.5U/mL。
在另一个实施方式中，当以蔗糖为底物,其反应体系含有下述酶：蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶以及如权利要求1至3任一项所述磷酸酶突变体；优选反应体系为含有蔗糖、Mg2+、ATP，以及蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶以及所述磷酸酶突变体；优选地，蔗糖磷酸化酶来源于Bifidobacteriumadolescentis，基因在KEGG上的标号为A0ZZH6。
在具体实施方式中，于50-60℃反应16-32h；反应结束后，沸水浴加热终止反应。
所述反应体系中，蔗糖的浓度为1-500g/L,磷酸盐浓度为1-100mM,蔗糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为0.1-1000U/mL，果糖6-磷酸磷酸酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖激酶用量为0.1-1000U/mL，聚磷酸激酶用量为0.1-1000U/mL。
优选的蔗糖的浓度为340g/L,磷酸盐浓度为50mM,蔗糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为10U/mL，果糖6-磷酸磷酸酶10U/mL，葡萄糖异构酶10U/mL，葡萄糖激酶用量为10U/mL，聚磷酸激酶用量为10U/mL。
所述酶催化的反应条件为10-80℃，反应时间为1-120小时；优选为55℃，反应24小时。
进一步地，本发明提供所述磷酸酶的突变体在合成阿洛酮糖中的应用，优选地以淀粉、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖为底物。
在一个具体实施方式中，当以淀粉底物,其反应体系为含有下述酶：葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，异淀粉酶,葡聚糖转移酶,阿洛酮糖3-差向异构酶以及所述的磷酸酶突变体；优选地，其反应体系中含有淀粉、Mg2+、葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，异淀粉酶,葡聚糖转移酶,阿洛酮糖3-差向异构酶以及所述的磷酸酶突变体；
在另一个具体实施方式中，当以蔗糖为底物,其反应体系含有下述酶：蔗糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶,葡萄糖磷酸异构酶,阿洛酮糖3-差向异构酶以及所述磷酸酶突变体；优选反应体系为含有蔗糖、Mg2+、ATP，以及蔗糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶,葡萄糖磷酸异构酶,阿洛酮糖3-差向异构酶以及所述磷酸酶突变体。
本发明通过大量筛选获得单位点突变的突变体，进一步通过饱和突变获得组合突变，经实验表明，相比野生型而言，最终果糖转化率均超过90％，最终产物体系中果糖含量占总糖比例超过90％，非常适合制备高果糖浆。同时，本发明也非常适合制备阿洛酮糖。因此，本发明具有较高的应用价值。
附图说明
图1淀粉/麦芽糊精/蔗糖合成果糖技术路线。
具体实施方式
以下结合实施例进一步详述本发明。
本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明中所用引物和基因由江苏金唯智生物技术有限公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1磷酸酶F6PP基因的获得和载体构建
将来源于Thermotoga sp.38H的磷酸酶序列(SEQ ID NO.1)，其氨基酸序列经密码子优化后，基因序列具有大肠杆菌偏爱密码子后核苷酸序列(SEQ ID NO.2)，送至江苏金唯智生物技术有限公司及基因合成，并构建至表达载体pET-21a中。
实施例2基因的表达和纯化
将含有上述磷酸酶基因(是优化后的序列SEQ ID NO.2)的重组质粒转入大肠杆菌中，进行外源表达及纯化。
(1)将大肠杆菌表达型重组质粒pET-F6PP转入E.coli BL21(DE3)中，获得重组菌。
(2)挑单克隆至5mL LB液体培养基中，37℃、220r/min培养至OD600为0.6-0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中，37℃、220rpm培养至OD600为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h。
(3)将上述培养菌液收集到50mL离心管中，5500r/min离心15min；
(4)弃上清，用2mL三乙醇胺缓冲液，pH 7.5，重悬菌体。
(5)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下进行破菌2次。4℃、20000r/min离心45min。
(6)纯化：上清在70℃水浴下热处理20分钟，4℃、20000r/min离心45min，取上清即得纯蛋白。
实施例3磷酸酶活性测定
针对上述纯化获得的磷酸酶，测定其针对果糖6-磷酸的脱磷酸活性，酶活性测定体系包括如下：果糖6-磷酸(20mM),Mg2+(1mM),磷酸盐缓冲液(pH 7.5,50mM),酶(0.5mg/mL),55℃，反应10min。酶活性定义(1U)：每毫克M6PP每分钟催化生成甘露糖的量为1微摩尔。将样品进行高效液相色谱检测。经计算分析获得的酶活性如表1所示，Ts-F6PP的酶活性为0.7U/mg。
实施例4.针对Ts-F6PP突变体库的构建
1、设计易错PCR所使用的的引物如下：
P3：ATGTACCGTGTTTTCGTTTTCGACCT
P4：CCGCTCGAGTTAGCATTCCAGGTGACGGG
2、以实施例1中合成的甘油葡萄糖苷磷酸化酶的基因为模板，采用上述引物及随机突变PCR试剂盒以野生型甘油葡萄糖苷磷酸化酶的基因为模板进行PCR扩增，并对PCR产物进行切胶回收，经限制性内切酶NdeI、XhoI处理后与同样经过双酶切的pET21a载体进行连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，突变LB平板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜，待长出转化子后，用灭菌的牙签挑取单个转化子至96孔板中，每个孔中加1mL LB液体培养基，37℃培养6h后，加入终浓度为0.1mM IPTG，并降低温度至16℃诱导过夜。
3、将上述培养的96孔板进行离心，弃上清，用50mM MES(pH＝6.5)重悬菌体沉淀，并加入溶菌酶，37℃处理1h，反复冻融2次，获得含甘油葡萄糖苷磷酸化酶的大肠杆菌细胞裂解液。
4、取20μL上述大肠杆菌细胞裂解液测定突变体的活性及热稳定性，得到活性或者热稳定性提升的突变位点。
实施例5磷酸酶催化特异性筛选实验
建立体外多酶催化体系，通过检测体系中果糖和葡萄糖浓度，测定不同种类磷酸酶的催化特异性。体外多酶催化转化麦芽糊精为果糖体系包括：(1)葡聚糖磷酸化酶GP，该酶催化麦芽糊精转化为葡萄糖1-磷酸，(2)葡萄糖磷酸变位酶PGM,该酶催化1-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖；(3)葡萄糖磷酸异构酶PGI，可直接催化葡萄糖6-磷酸转化为果糖6-磷酸；(4)果糖6-磷酸磷酸酶Ts-F6PP，该酶催化果糖6-磷酸脱磷酸生成果糖。
在本发明中，葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的标号为TM1168，葡萄糖磷酸变位酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的编号为TM0769；葡萄糖磷酸异构酶PGI选择来源于Thermus thermophilus,其在UniProt上的标号为A3DBX9，果糖6-磷酸磷酸酶选择Ts-F6PP突变体。其中葡聚糖磷酸化酶GP，葡萄糖磷酸变位酶PGM，葡萄糖磷酸异构酶PGI，这三个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过酶切连接方法克隆到pET21载体中，获得相应的表达载体pET21-GP，pET21-PGM,pET21-PGI。
建立如下反应体系，30mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM氯化镁，所述淀粉的浓度为10g/L,葡聚糖磷酸化酶用量为2U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为2U/mL，葡萄糖磷酸异构酶PGI用量为2U/mL，Ts-F6PP突变体用量为2U/mL,在55℃进行催化反应，反应24小时，反应最终样品进行液相色谱检测。假定Ts-F6PP对葡萄糖6-磷酸特异性好，则反应体系中葡萄糖浓度高；假定Ts-F6PP对果糖6-磷酸特异性好，则反应体系中果糖浓度高。因此，通过计算反应体系中果糖占总果糖和葡萄糖含量的比例，筛选特异性好的突变体。
表1不同Ts-F6PP突变体特异性比较
根据表1结果所示，与野生型Ts-F6PP相比，共计获得特异性显著提升的突变体16个。经筛选发现，122、126、149、178、181和175位点氨基酸突变之后对果糖6-磷酸催化特异性的影响较大，果糖占比从4％最高可提升至75.2％。
实施例6催化特异性提高位点的组合突变
将上述相对特异性显著提高的突变体与其他位点进行逐轮组合突变，并基于实施例5的筛选方法，计算组合突变体特异性。结果如表2所示：
表2催化特异性提高显著的组合突变体
本发明提供了能够提升果糖6-磷酸磷酸酶活性的组合突变位点和/或突变体，经大量的筛选发现，选自122、126、149、178、181和175中的一个或多个的位置上突变的突变位点和/或突变体组合，上述位点的组合可进一步提升果糖占比从单点突变的75％最高可提升至96％。
实施例7体外多酶催化体系转化淀粉合成果糖
建立如下反应体系，30mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM氯化镁，所述淀粉的浓度为100g/L,葡聚糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶PGI用量为10U/mL，果糖6-磷酸磷酸酶用量为10U/mL，异淀粉酶IA用量为0.5U/mL,葡聚糖转移酶4GT用量为0.5U/mL,在55℃进行催化反应，反应24小时，反应最终样品进行液相色谱检测。
其中异淀粉酶IA，该酶催化淀粉脱支链生成直链淀粉；4-葡聚糖转移酶，该酶催化麦芽二糖和麦芽三糖聚合生成长度聚合度更高的糊精，便于葡聚糖磷酸化酶GP进行催化。异淀粉酶来源于Sulfolobustokodaii,基因在KEGG上的编号为ST0928,葡聚糖转移酶来源于Thermococcus litoralis,基因在KEGG上的编号为OCC_10078,上述两个基因分别用不同的引物从相应的基因组DHA中通过PCR扩增获取，并通过酶切连接方法克隆到表达载体pET21中，获得重组表达载体pET21-IA和pET21-GT。其余的酶的来源同实施例6。实验结果如下表3所示。
表3转化麦芽糊精制备果糖结果比较
为了进一步提升转化率，可在反应体系中还添加了葡萄糖异构酶、葡萄糖激酶和聚磷酸激酶。其中，葡萄糖异构酶来源于Thermus thermophilus，基因在Uniprot上的编号为P26997；葡萄糖激酶来源于Thermobifida fusca，基因在KEGG上的标号为Tfu_1811；聚磷酸激酶来源于Thermus thermophilus，基因在KEGG上的编号为TT_C0637；这些基因组DNA都可以从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。这四个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过酶切连接方法克隆到pET21载体中，获得相应的表达载体pET21-GI，pET21-PPK和pET21-PPGK。
将上述三个酶加入到反应体系中进行反应，反应条件同前，实验结果表明果糖转化率均提升至90-96％,反应体系中均未检测到葡萄糖。
实施例7体外多酶催化转化蔗糖合成果糖
建立体外多酶催化体系转化蔗糖为果糖。这些关键酶包括：(1)蔗糖磷酸化酶SP，该酶催化蔗糖转化为葡萄糖1-磷酸和果糖，(2)葡萄糖磷酸变位酶PGM，(3)葡萄糖磷酸异构酶PGI，(4)果糖6-磷酸磷酸酶M6PP。
在本发明中，蔗糖磷酸化酶来源于Bifidobacteriumadolescentis，基因在KEGG上的标号为A0ZZH6，构建至表达载体pET-21a中。这个质粒都转化至大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并进行蛋白质表达和纯化。
建立如下反应体系，30mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM氯化镁，5mM ATP,250mM聚磷酸，所述蔗糖的浓度为100g/L,蔗糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为10U/mL，果糖6-磷酸磷酸酶用量为10U/mL，在55℃进行催化反应，反应24小时，反应最终样品进行液相色谱检测。
结果如表4所示。
表4转化蔗糖制备果糖结果比较
结果表明，反应结束后，所采用的突变体最终果糖转化率均超过90％，最终产物体系中果糖含量占总糖比例超过90％，非常适合制备高果糖浆。
实施例8体外多酶催化体系转化淀粉合成阿洛酮糖
建立如下反应体系，30mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM氯化镁，所述淀粉的浓度为100g/L,葡聚糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶PGI用量为10U/mL，果糖6-磷酸磷酸酶用量为10U/mL，异淀粉酶IA用量为0.5U/mL,葡聚糖转移酶4GT用量为0.5U/mL,阿洛酮糖3-差向异构酶用量10U/mL,在55℃进行催化反应，反应24小时，反应最终样品进行液相色谱检测。
其中阿洛酮糖3-差向异构酶催化果糖转化为阿洛酮糖，该酶来源于Ruminococcussp.，其编码蛋白质的核苷酸序列如SE QID NO.3所示，经基因合成后，构建之表达载体pET21中，获得表达载体pET21-DPE，并转入大肠杆菌BL21中，并进行蛋白质表达和纯化。
结果如表5所示：
表5转化麦芽糊精制备阿洛酮糖结果比较
| 突变体 | 转化率(％) |
| M24 | 28.2 |
| M53 | 28.8 |
| M58 | 28.5 |
| M61 | 28.9 |
| M63 | 28.8 |
| M64 | 28.3 |
| M69 | 28.9 |
| M70 | 28.5 |
| M71 | 28.5 |
| M72 | 28.4 |
| M73 | 29.1 |
| M74 | 29.3 |
| M79 | 29.1 |
| M101 | 29.3 |
| M103 | 29.6 |
| M106 | 30 |
| M108 | 30.1 |
| M110 | 29.1 |
| M114 | 29.3 |
| M117 | 29.5 |
| M118 | 29.7 |
| M119 | 29.2 |
| M123 | 29.8 |
| M124 | 29.9 |
| M134 | 29.9 |
| M143 | 29.8 |
| M144 | 29.9 |
| M145 | 29.5 |
| M146 | 29.1 |
| M147 | 29.9 |
| M148 | 30.2 |
| M149 | 30.1 |
上述反应体系中实现淀粉直接制备阿洛酮糖，反应平衡后，转化率均维持在28-30％之间。
实施例9体外多酶催化转化蔗糖合成阿洛酮糖
建立体外多酶催化体系转化蔗糖为阿洛酮糖。这些关键酶包括：(1)蔗糖磷酸化酶SP，该酶催化蔗糖转化为葡萄糖1-磷酸和果糖，(2)葡萄糖磷酸变位酶PGM，(3)葡萄糖磷酸异构酶PGI，(4)果糖6-磷酸磷酸酶M6PP，(5)阿洛酮糖3-差向异构酶。
建立如下反应体系，30mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM氯化镁，5mM ATP,250mM聚磷酸，所述蔗糖的浓度为100g/L,蔗糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为10U/mL，果糖6-磷酸磷酸酶用量为10U/mL，阿洛酮糖3-差向异构酶用量10U/mL,在55℃进行催化反应，反应24小时，反应最终样品进行液相色谱检测。
结果如表6所示。
表6转化蔗糖制备果糖结果比较
上述反应体系中实现淀粉直接制备阿洛酮糖，反应平衡后，转化率均维持在27-30％之间。
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种磷酸酶的突变体及其在果糖和阿洛酮糖制备中的应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 268
<212> PRT
<213> Thermotoga sp. 38H
<400> 1
MYRVFVFDLDGTLLNDNLEISEKDRKVIERLSRKCHVVFASGRMLVSTLNVEKKYFGRTFPTIAYNGAMVYIPEEGVILNEKISPEVAKDIVEYIKPFNVHWQAYIDDVLYSERDNEEIRGYAKHSSVEYRVEPNLLELVSKVGTTKILLIDTPERLDELKKILSEKFNDVVKVFKSFPTYLEIVPENVDKGKALRFLRERMGWKKEEIVVFGDNENDLFMFEEAGLRVAMGNAIDKVKEAADVVTLTNNDSGVSYVLELISTDCLDG 268
<210> 2
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ATGTACCGTGTTTTCGTTTTCGACCTGGACGGTACCCTGCTGAACGACAACCTGGAAATCTCTGAAAAAGACCGTAAAGTTATCGAACGTCTGTCTCGTAAATGCCACGTTGTTTTCGCTTCTGGTCGTATGCTGGTTTCTACCCTGAACGTTGAAAAAAAATACTTCGGTCGTACCTTCCCGACCATCGCTTACAACGGTGCTATGGTTTACATCCCGGAAGAAGGTGTTATCCTGAACGAAAAAATCTCTCCGGAAGTTGCTAAAGACATCGTTGAATACATCAAACCGTTCAACGTTCACTGGCAGGCTTACATCGACGACGTTCTGTACTCTGAACGTGACAACGAAGAAATCCGTGGTTACGCTAAACACTCTTCTGTTGAATACCGTGTTGAACCGAACCTGCTGGAACTGGTTTCTAAAGTTGGTACCACCAAAATCCTGCTGATCGACACCCCGGAACGTCTGGACGAACTGAAAAAAATCCTGTCTGAAAAATTCAACGACGTTGTTAAAGTTTTCAAATCTTTCCCGACCTACCTGGAAATCGTTCCGGAAAACGTTGACAAAGGTAAAGCTCTGCGTTTCCTGCGTGAACGTATGGGTTGGAAAAAAGAAGAAATCGTTGTTTTCGGTGACAACGAAAACGACCTGTTCATGTTCGAAGAAGCTGGTCTGCGTGTTGCTATGGGTAACGCTATCGACAAAGTTAAAGAAGCTGCTGACGTTGTTACCCTGACCAACAACGACTCTGGTGTTTCTTACGTTCTGGAACTGATCTCTACCGACTGCCTGGACGGTTAA 807
<210> 3
<211> 876
<212> DNA
<213> Ruminococcus sp.
<400> 3
ATGAAATATGGTATTTATTACGCTTATTGGGAAAAGGAATGGAATGGAGATTACAAATATTATATAGATAAAATTTCAAAATTAGGTTTTGATATTCTGGAAATTTCTTGCGGCGCTTTTTCTGACTATTACACGAAAGATCAGGAGTTAATTGATATTGGAAAATATGCGAAAGAAAAAGGCGTAACATTGACAGCAGGGTATGGACCTCATTTTAATGAAAGCCTGTCATCTTCAGAACCCAATACGCAGAAACAAGCAATCAGTTTTTGGAAAGAGACGCTCCGGAAATTGAAGTTAATGGATATTCATATTGTTGGAGGCGCACTCTATGGTTATTGGCCTGTAGATTATTCCAAACCTTTTGATAAGAAAAGGGATTTAGAGAATTCCATTAAAAACATGAAAATTATTAGTCAGTATGCTGAAGAATATGACATAATGATGGGGATGGAAGTTCTTAACCGTTTTGAAGGCTATATGTTGAATACATGCGATGAAGCGTTGGCATACGTTGAAGAGGTTGGCTCTTCTAATGTTGGTGTTATGTTAGATACTTTTCACATGAATATAGAGGAAGATAATATAGCAGCAGCCATTCGTAAAGCAGGAGATAGGCTTTATCACTTCCATATAGGAGAAGGAAATCGTAAAGTACCAGGAAAAGGTATGCTTCCTTGGAATGAGATAGGACAGGCATTGCGAGATATAAACTACCAACATGCAGCAGTTATGGAGCCATTTGTAATGCAGGGAGGAACAGTAGGGCATGACATTAAAATATGGAGAGATATCATTGGAAACTGTTCTGAAGTTACATTAGATATGGACGCTCAAAGTGCGTTGCACTTTGTAAAACATGTATTTGAAGTCTAA 876
Claims (10)
1.一种磷酸酶的突变体，其特征在于，其相对于SEQ ID NO.1存在下述氨基酸位点的突变：第122、126、149、178、181和175中的单个位置存在取代突变，或多个位置存在取代突变。
2.一种磷酸酶的突变体，其特征在于，其相对于SEQ ID NO.1存在下述氨基酸位点：第122位突变为Y、H或Q，或第126位突变为T、H、E或F，或第149位突变为M或E，或第178位突变为H或S，第181位突变为M、H、F或K，第175位突变为A或R。
3.如权利要求1或2所述的磷酸酶的突变体，其特征在于，其相对于SEQ ID NO.1仅存在下述氨基酸位点组合的突变：第122位和第126位同时存在突变，第122位和第149位同时存在突变，第122位和第178位同时存在突变，第122位和第181位同时存在突变，第122位和第175位同时存在突变；第126位和第149位同时存在突变，第126位和第178位同时存在突变，第126位和第181位同时存在突变，第126位和第175位同时存在突变；第149位和第1178位同时存在突变，第149位和第181位同时存在突变，第149位和第175位同时存在突变；第178位和第181位同时存在突变，第178位和第1175位同时存在突变；第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位和第149位同时存在突变，第126位、第149位和第178位同时存在突变；第178位、第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位、第149位和第178位同时存在突变；第126位、第149位、第178位和第181位同时存在突变；第149位、第178位、第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位、第149位、第178位和第181位同时存在突变；第126位、第149位、第178位、第181位和第175位同时存在突变；第122位、第126位、第149位、第178位、第181位和第175位同时存在突变。
4.如权利要求1至3任一项所述磷酸酶的突变体在合成果糖中的应用，优选地以淀粉、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖为底物。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，当以淀粉底物,其反应体系为含有下述酶：
（1）葡聚糖磷酸化酶，该酶催化麦芽糊精转化为葡萄糖1-磷酸，（2）葡萄糖磷酸变位酶,该酶催化1-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖；（3）葡萄糖磷酸异构酶：葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶，以及如权利要求1-3任一项所述的磷酸酶突变体；优选地，其反应体系中含有淀粉、Mg2+、葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶，以及如权利要求1-3任一项所述的磷酸酶突变体；更优选地，葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的标号为TM1168，葡萄糖磷酸变位酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的编号为TM0769；葡萄糖磷酸异构酶PGI选择来源于Thermus thermophilus,其在UniProt上的标号为A3DBX9。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，反应体系中还含有葡萄糖异构酶、葡萄糖激酶和聚磷酸激酶；优选地，葡萄糖异构酶来源于Thermus thermophilus，基因在Uniprot上的编号为P26997；葡萄糖激酶来源于Thermobifida fusca，基因在KEGG上的标号为Tfu_1811；聚磷酸激酶来源于Thermus thermophilus，基因在KEGG上的编号为TT_C0637。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，当以蔗糖为底物,其反应体系含有下述酶：蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶以及如权利要求1至3任一项所述磷酸酶突变体；优选反应体系为含有蔗糖、Mg2+、ATP，以及蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶以及如权利要求1至4任一项所述磷酸酶突变体；优选地，蔗糖磷酸化酶来源于Bifidobacteriumadolescentis，基因在KEGG上的标号为A0ZZH6。
8.如权利要求1至3任一项所述磷酸酶的突变体在合成阿洛酮糖中的应用，优选地以淀粉、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖为底物。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，当以淀粉底物,其反应体系为含有下述酶：葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，异淀粉酶, 葡聚糖转移酶,阿洛酮糖3-差向异构酶以及如权利要求1-4任一项所述的磷酸酶突变体；优选地，其反应体系中含有淀粉、Mg2+、葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，异淀粉酶, 葡聚糖转移酶,阿洛酮糖3-差向异构酶以及如权利要求1-4任一项所述的磷酸酶突变体；
当以蔗糖为底物,其反应体系含有下述酶：蔗糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶,葡萄糖磷酸异构酶,阿洛酮糖3-差向异构酶以及如权利要求1至3任一项所述磷酸酶突变体；优选反应体系为含有蔗糖、Mg2+、ATP，以及蔗糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶,葡萄糖磷酸异构酶,阿洛酮糖3-差向异构酶以及如权利要求1至3任一项所述磷酸酶突变体。
10.如权利要求4至9任一项所述的应用，其特征在于，于50-60℃反应16-32h；反应结束后，沸水浴加热终止反应。
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