CN102443031B - 一种c-di-GMP的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种c-di-GMP的分离纯化方法，是将c-di-GMP粗产物溶液直接上样于配有离子交换色谱柱的快速蛋白液相色谱，用pH8.0缓冲液梯度洗脱，紫外检测器254nm检测，收集出峰位置处洗脱液，用质谱确证结构，然后将含目标化合物洗脱液冻干，即制得固体c-di-GMP。本发明方法制得的c-di-GMP经反相高效液相色谱检测其纯度达95％以上，并实现了一步法直接从c-di-GMP粗产物溶液中分离纯化c-di-GMP，且本发明工艺简单，周期短，不使用毒性有机溶剂，是一种高效、环保、适合工业化生产的新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种环鸟苷二磷酸(Cyclic diguanylate，c-di-GMP)的分离纯化方法，具体地说，是涉及用配有离子交换色谱柱的快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography，FPLC)分离纯化c-di-GMP的方法。
背景技术
环鸟苷二磷酸(Cyclic diguanylate，c-di-GMP)是一种具有细菌特异性的新型第二信使，它广泛存在于各种真细菌中，但不存在于真核生物中。c-di-GMP参与调控细菌的多种生理过程，包括生物膜的形成、运动性的调节、毒力因子的表达等。生物膜作为自然界中细菌主要的生存方式，给人类的生产生活带来了严重危害。除了危害环境和工业生产以外，根据NIH的调查报告，80％以上的细菌性感染与生物膜有关，生物膜可以使细菌大幅度提高对抗生素的耐受性并抵抗机体的免疫防御，从而导致严重的临床耐药问题。
c-di-GMP在相关科研工作中有重要用途，但市场价格昂贵使其使用受限，2009年12月份价格调整为原价十分之一后，1μmol(0.7mg)仍需150欧元(Biolog Life Science Institute)。它可以用多种方法来制备，例如组织提取法、化学合成法或者酶促合成法，影响质量和成本的主要因素是其分离纯化。
现有技术通常采用反相高效液相色谱(High performance Liquid Chromatography，HPLC)来分离纯化c-di-GMP。以酶促合成c-di-GMP为例，步骤为：酶与底物GTP反应生成含c-di-GMP的混合液→煮沸、加入酸碱等方法使酶变性沉淀→离心→滤膜过滤除酶→冻干浓缩→反相HPLC分离纯化→冻干→得固体c-di-GMP。其中，HPLC所用流动相分别为乙腈和乙酸胺水溶液(pH4.8)，用紫外检测器在254nm下检测产物。
由此可见，传统方法的分离纯化工艺复杂，耗时耗能。反相色谱柱对样品要求比较严，要先除去可能会在柱子上沉积的杂质(如酶)，不然会降低色谱柱使用寿命；冻干过程既需要有冻干仪又会耗费大量时间，致使生产效率低下。并且由于在制备过程中使用大量有机溶剂，会对操作者和环境造成危害，环保效果差。因此，开发新的简便、高效、绿色的分离纯化技术是非常有必要的。
发明内容
针对现有技术中分离纯化c-di-GMP所存在的不足，本发明提供了一种新型的分离纯化c-di-GMP的方法。
本发明所述c-di-GMP的分离纯化方法，步骤是：
(1)取含c-di-GMP的粗产物溶液，以1～5mL/min的流速，直接上样于配有离子交换色谱柱的快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography，FPLC)，上样量为1～1000mL；
(2)上样结束后，用洗脱液A和洗脱液B梯度洗脱，流速为1～5mL/min；其中所述洗脱液A为pH8.0的缓冲液，所述缓冲液为Tris-HCl、Na2HPO4-NaH2PO4或K2HPO4-KH2PO4；所述洗脱液B为A液中加入1M NaCl；
(3)用紫外检测器在254nm下检测，收集出峰位置处洗脱液，用质谱确证结构，然后将含目标化合物洗脱液冻干，制得固体c-di-GMP；
(4)以反相高效液相色谱(High performance Liquid Chromatography，HPLC)检测，确定固体c-di-GMP纯度。
上述洗脱结束后的离子交换色谱柱，经洗脱液B彻底清除柱上吸附物，再经洗脱液A平衡后还可用于下一轮c-di-GMP的分离纯化。
上述c-di-GMP分离纯化方法中，优选的实施条件是：
所述快速蛋白液相色谱优选GEAKTAFPLC；
所述离子交换色谱柱为Mini Q 4.6/50PE时，优选上样量为1～10mL，优选上样流速和洗脱流速均为1～2mL/min；所述离子交换色谱柱为Source Q HP 10/10时，优选上样量为10～100mL，优选上样流速和洗脱流速均为3～4mL/min；所述离子交换色谱柱为SourceQ HP 16/10时，优选上样量为50～1000mL，优选上样流速和洗脱流速均为4～5mL/min；
所述梯度洗脱优选以0→20倍柱体积进行，所述洗脱液A的浓度值以100％→0进行，同时洗脱液B的浓度值以0→100％进行；
所述缓冲液优选Tris-HCl；
所述高效液相色谱为Shimadzu LC-10AD/AT，反相色谱柱为Agela Venusil MP C184.6mm×250mm，洗脱液A为pH4.8的10mM乙酸胺水溶液，洗脱液B为乙腈，流速为1mL/min；梯度洗脱运行时间30分，洗脱液A的浓度值以100％→50％进行，同时洗脱液B的浓度值以0→50％进行；目标产物c-di-GMP保留时间在12.0～12.5min。
利用本发明方法分离纯化后的c-di-GMP产物经反相HPLC检测，纯度达95％以上，符合生物学、动物药理学等科研工作需要。
快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography，FPLC)是一种新型、快速、高效色谱技术，目前主要用于分离纯化蛋白质，目前尚没有利用FPLC分离纯化核苷酸的报导。本发明采用离子交换FPLC装置作为主要设备来分离纯化c-di-GMP，不仅能够获得纯净的产物，且待分离纯化的原料在进入离子交换FPLC装置之前不需经过除酶、冻干浓缩等处理，实现了一步法直接从酶反应液或组织提取液中分离纯化c-di-GMP。并且，离子交换FPLC装置柱容量大、回收效率高且不易使生物分子失活，一次可以处理较多的原料，进一步缩减了分离纯化时间，提高了分离纯化速度。
与传统反相HPLC分离纯化技术相比，本发明在简化步骤、节省时间的同时，还避免了毒性有机溶剂乙腈的大量使用，显著提高了c-di-GMP分离纯化的效率，消除了乙腈对操作者和环境造成的危害。生产成本的降低、环境污染的减轻无疑给该工作带来了广阔的工业应用前景。
附图说明
图1.采用离子交换FPLC分离纯化c-di-GMP的图谱。
其中：FPLC为GE AKTA FPLC，离子交换色谱柱为Mini Q 4.6/50PE，两种洗脱液分别为25mM Tris-HCl(pH8.0)(A)和25mM Tris-HCl(pH8.0)+1M NaCl(B)。目标产物c-di-GMP在洗脱液电导为35.97mS/cm时出峰。
图2.本发明所得c-di-GMP经HPLC纯度鉴定图谱。
其中：HPLC为Shimadzu LC-10AD/AT，反相色谱柱为Agela Venusil MP C184.6mm×250mm，两种洗脱液分别为10mM乙酸胺水溶液(pH4.8)(A)和乙腈(B)；目标产物c-di-GMP保留时间在12.3min。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的描述，但本发明保护内容不仅限于此。
实施例1c-di-GMP的粗产物溶液的制备(酶促反应法)
将GTP(购自Sigma)和具有c-di-GMP合成活性的酶VCA0956以摩尔比1000∶2的比例加入到反应缓冲液(75mM Tris-HCl pH 8.0，250mM NaCl，25mM KCl，10mM MgCl2)中，室温下反应过夜，得含c-di-GMP的粗产物溶液。
其中：上述VCA0956的表达纯化及c-di-GMP的粗产物溶液制备的详细方法及步骤请参阅文献：Rita Tamayo，Anna D.Tischler，and Andrew Camilli.The EAL domain protein VieAis a cyclic diguanylate phosphodiesterase.J.Biol.Chem.，2005，280，33324-33330.
实施例2
(1)取实施例1制备的含c-di-GMP的粗产物溶液4mL，以1mL/min的流速，上样于配有Mini Q 4.6/50PE的离子交换色谱柱GE AKTA FPLC；
(2)上样结束后，以1.5mL/min流速，用25mM Tris-HCl(pH8.0)(A)和25mM Tris-HCl(pH8.0)+1M NaCl(B)梯度洗脱，梯度洗脱以0→20倍柱体积进行，洗脱液A的浓度值以100％→0进行，同时洗脱液B的浓度值以0→100％进行；
(3)用紫外检测器在254nm下检测；在洗脱液电导为35.97mS/cm时出峰，收集出峰位置洗脱液，用质谱确证其结构[(ESI+)：m/e(relative intensity)：[M+1]+691.2，[M+2]2+346.2]，此部分洗脱液冻干，即得固体c-di-GMP(结果如图1所示)；
(4)将步骤(3)的产物经反相HPLC检测，所用高效液相色谱为Shimadzu LC-10AD/AT，反相色谱柱为Agela Venusil MP C18 4.6mm×250mm，洗脱液A为pH4.8的10mM乙酸胺水溶液，洗脱液B为乙腈，流速为1mL/min；梯度洗脱运行时间30分，洗脱液A的浓度值以100％→50％进行，同时洗脱液B的浓度值以0→50％进行；检测结果：本实施例所制得的c-di-GMP纯度达100％(结果如图2所示)。
实施例3
(1)取实施例1制备的含c-di-GMP的粗产物溶液30mL，以3mL/min的流速，上样于配有Source Q HP 10/10离子交换色谱柱的GE AKTA FPLC；
(2)上样结束后，以3mL/min流速，用25mM Tris-HCl(pH8.0)(A)和25mM Tris-HCl(pH8.0)+1M NaCl(B)梯度洗脱，梯度洗脱以0→20倍柱体积进行，洗脱液A的浓度值以100％→0进行，同时洗脱液B的浓度值以0→100％进行；
(3)用紫外检测器在254nm下检测；在洗脱液电导为36.03mS/cm时出峰，收集出峰位置洗脱液，用质谱确证其结构，此部分洗脱液冻干，即得固体c-di-GMP；
(4)将步骤(3)的产物经反相HPLC检测，所用高效液相色谱为Shimadzu LC-10AD/AT，反相色谱柱为Agela Venusil MP C184.6mm×250mm，洗脱液A为pH4.8的10mM乙酸胺水溶液，洗脱液B为乙腈，流速为1mL/miin梯度洗脱运行时间30分，洗脱液A的浓度值以100％→50％进行，同时洗脱液B的浓度值以0→50％进行；检测结果：本实施例所制得的c-di-GMP纯度达96％。
实施例4
(1)取实施例1制备的含c-di-GMP的粗产物溶液200mL，以5mL/min的流速，上样于配有Source Q HP 16/10离子交换色谱柱的GE AKTAFPLC；
(2)上样结束后，以4mL/min流速，用25mM Tris-HCl(pH8.0)(A)和25mM Tris-HCl(pH8.0)+1M NaCl(B)梯度洗脱，梯度洗脱以0→20倍柱体积进行，洗脱液A的浓度值以100％→0进行，同时洗脱液B的浓度值以0→100％进行；
(3)用紫外检测器在254nm下检测；在洗脱液电导为36.07mS/cm时出峰，收集出峰位置洗脱液，用质谱确证其结构，此部分洗脱液冻干，即得固体c-di-GMP；
(4)将步骤(3)的产物经反相HPLC检测，所用高效液相色谱为Shimadzu LC-10AD/AT，反相色谱柱为Agela Venusil MP C184.6mm×250mm，洗脱液A为pH4.8的10mM乙酸胺水溶液，洗脱液B为乙腈，流速为1mL/min；梯度洗脱运行时间30分，洗脱液A的浓度值以100％→50％进行，同时洗脱液B的浓度值以0→50％进行；检测结果：本实施例所制得的c-di-GMP纯度达95％。
Claims (3)
1.一种c-di-GMP的分离纯化方法，步骤是：
(1)取含c-di-GMP的粗产物溶液，以1～5mL/min的流速，直接上样于配有离子交换色谱柱的快速蛋白液相色谱，上样量为1～1000mL；
(2)上样结束后，用洗脱液A和洗脱液B梯度洗脱，流速为1～5mL/min；其中所述洗脱液A为pH8.0的缓冲液，所述缓冲液为Tris-HCl、Na2HPO4-NaH2PO4或K2HPO4-KH2PO4；所述洗脱液B为A液中加入1M NaCl；
(3)用紫外检测器在254nm下检测，收集出峰位置处洗脱液，用质谱确证结构，然后将含目标化合物洗脱液冻干，制得固体c-di-GMP；
(4)以反相高效液相色谱检测，确定固体c-di-GMP纯度；
其中，
上述离子交换色谱柱为Mini Q4.6/50PE时，上样量为1～10mL，上样流速和洗脱流速均为1～2mL/min；所述离子交换色谱柱为Source Q HP10/10时，上样量为10～100mL，上样流速和洗脱流速均为3～4mL/min；所述离子交换色谱柱为Source Q HP16/10时，上样量为50～1000mL，上样流速和洗脱流速均为4～5mL/min；
上述反相高效液相色谱为Shimadzu LC-10AD/AT，反相色谱柱为Agela Venusil MP C184.6mm×250mm，洗脱液A为pH4.8的10mM乙酸胺水溶液，洗脱液B为乙腈，流速为1mL/min；梯度洗脱运行时间30分，洗脱液A的浓度值以100%→50%进行，同时洗脱液B的浓度值以0→50%进行；目标产物c-di-GMP保留时间在12.0～12.5min。
2.根据权利要求1所述c-di-GMP的分离纯化方法，其特征在于，所述快速蛋白液相色谱选GE AKTA FPLC。
3.根据权利要求1所述c-di-GMP的分离纯化方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCl。
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