CN102440432A - 制备烟草浸出液的两步微生物发酵法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及烟草加工技术领域，具体公开了一种制备烟草浸出液的两步微生物发酵法以及添加了该烟草浸出液的烟草薄片。两步微生物发酵法为：酶解型微生物对烟草原料进行微生物发酵及酶解；除去酶解产物中的不溶性固形物质，取酶解液进行浓缩，获得浓缩酶解液；增香型微生物对浓缩酶解液进行微生物发酵，获得烟草浸出液。本发明的制备方法以烟梗和烟叶等烟草原料为原材料，通过微生物酶解和微生物增香两步微生物发酵处理，将烟草原料中的大分子物质降解成易溶于水的小分子物质，得到含大量水溶性组分的、高质量的烟草浸出液，该两步微生物发酵法所制备的烟草浸出液比现有的造纸法烟草浸出液水溶性低分子量物质的总收率要高，综合质量更好。
Description
技术领域
本发明涉及烟草加工技术领域，具体涉及一种烟草浸出液的微生物制备方法。
背景技术
烟草薄片(tabacco sheet)又称为重组烟叶，主要由烟末、烟叶碎片、烟梗或者低次烟叶制备而成，现有的烟草薄片生产方法，包括辊压法、稠浆法和造纸法等，其中造纸法最为流行。造纸法是烟草原料先用水萃取，不溶性物质制成浆后进入造纸机，初步形成纸网；水溶性萃取物经浓缩后与添加剂一并加入纸网中，干燥后得到成品。因此，造纸法薄片工艺技术是包括有废水处理工艺在内的湿法造纸工艺与化工生产中萃取浓缩工艺相结合的工艺流程。
现有的烟草薄片原料萃取工艺条件包括萃取剂种类的选择、萃取方式、萃取时间、萃取条件等；为改善萃取液的质量，还采取萃取成分的富集、外加非薄片生产过程中的烟草萃取液等措施。在造纸法烟草薄片的生产过程中，常采用水作为溶剂，各种烟草原料(以烟梗为主)通过浸取，再通过压滤、浓缩制备烟草浸出浓缩液。浓缩液通过涂布或浸渍法施予薄片纸基上。为更充分地提取烟草原料中的香味物质，也有的采用有机溶剂萃取。
目前一般认为进口薄片品质优于国产薄片，由于进口薄片中的香味成分含量要远远高于国产薄片，引入的杂气(木质气、枯焦气)少，刺激性小，余味舒适。影响国产薄片品质的因素被认为是烟草的浸取技术不过关，导致烟草浸取液质量不佳。
在以水为溶剂的浸取过程中，虽然烟草原料中的大部分小分子物质可直接溶于水中，但大分子物质(如蛋白质、果胶、淀粉等)不能直接溶于水溶液，需采用磨浆法对烟草滤渣再次进行打浆(机械磨浆)。但在机械磨浆过程中，蛋白质、果胶、淀粉等大分子物质大部分仍无法有效降解成水溶性物质，有的与纤维素类物质紧密结合从而残留于片基中，残留在烟草薄片中的高含量蛋白质使得烟气有烧焦的蛋白味，使烟气带有不良气味。因此，现有的以物理-化学处理方法为特征的造纸法，导致烟草原料中蛋白质、果胶、淀粉等大分子物质的残留从而影响烟草薄片的质量，造成烟草薄片香气不足，杂气较大。
另外，造纸法烟草薄片生产过程中还需采用动力消耗极大的压辊式机械挤压式磨浆设备和浸提、浓缩工艺，不仅能耗较高，增加生产成本，还对环境有污染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种以烟草原料为反应物，采用生物法制备烟草浸出液的两步微生物发酵法。
本发明一方面公开了一种制备烟草浸出液的两步微生物发酵法，所述的两步微生物发酵，包括第一步微生物酶解发酵和第二步微生物增香发酵，具体步骤如下：
1.酶解发酵：酶解型微生物对烟草原料的微生物发酵及酶解；
2.固液分离：除去酶解产物中的不溶性固形物质，取酶解液进行浓缩，获得浓缩酶解液；
3.增香发酵：增香型微生物对浓缩酶解液进行微生物发酵，获得烟草浸出液。
较优的，所述烟草原料选自烟梗、烟叶和烟末中的一种或多种；更优的，所述烟草原料选自粉碎后的烟梗粉末、粉碎后的烟叶粉末和烟末中的一种或多种；最优的，所述烟草原料的烟梗粉末、烟叶粉末和烟末经过筛处理，选择粒度为36～60目的烟草原料，即烟草原料的粒度大于等于60目，小于等于36目。
所述烟末是烟草企业的下脚料，是在整个烟草加工过程中筛分下来的细粒或粉末状的烟草物料，包括烟梗加工过程中的颗粒或粉末状物料。
进一步的，步骤1所述的酶解发酵，包括以下两步：
A.酶解型微生物的菌种活化，利用烟草原料制备的种子培养基逐级扩大培养酶解型微生物种子；
B.采用固态或液态发酵法，将步骤A制备的酶解型微生物种子接种于烟草原料制备的发酵培养基中，在适宜条件下进行发酵和烟草原料的酶解，获得酶解产物。
较优的，所述酶解型微生物可以选自黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、或者木霉(Trichoderma spp.)中的一种；更优的，所述酶解微生物为黑曲霉(Aspergillus niger)。
较优的，酶解型微生物的菌种活化的方法为：采用PDA斜面培养基活化酶解型微生物，待培养结束后，制备酶解型微生物孢子悬浮液，其中，酶解型微生物孢子悬浮液中孢子的浓度不低于107个/ml。
较优的，酶解型微生物种子培养基由烟草原料加水配置而成，其中烟草原料干基的重量百分比为6-8％。
更优的，一级种子培养基是由烟叶粉末加水配置而成，其中烟叶粉末的重量百分比为6-8％，所述重量百分比是以培养基总重量为基数的重量百分比。
配制好的一级种子培养基灭菌后，以一定的接种量将酶解型微生物孢子悬浮液接入到所述一级种子培养基中，在适宜的温度下培养，获得一级种子液。
更优的，二级种子培养基干基包括烟叶粉末和烟梗粉末，两者的质量比为烟叶粉末∶烟梗粉末＝3～4∶1；所述二级种子培养基配料的烟叶粉末和烟梗粉末混合干基为自然粒度，或者也可将混合干基过筛，选择粒度为36目～60目之间的混合干基，即采用粒度大于等于60目小于等于36目的烟叶粉末和烟梗粉末混合配置二级种子培养基干基。
较优的，将二级种子培养基干基以6-8％(以培养基总重量为基数的重量百分比)的加入量加入到70℃的水中，保温30min制得二级种子培养基。
将用于配置二级种子培养基的反应容器预先进行灭菌处理，在灭菌后的容器中制备得到二级种子培养基，以一定的接种量将一级种子液接入到所述二级种子培养基中，在适宜的条件下培养，获得二级种子液。
较优的，步骤B所述的发酵培养基干基配料比(质量比)为：烟叶粉末∶烟梗粉末＝1∶9；更优的，发酵培养基干基配料比(质量比)为：烟叶粉末∶烟末∶烟梗粉末＝0.5∶0.5∶9；最优的，所述发酵培养基干基粒度为36～60目。
采用固态法发酵时，可采用三角瓶发酵法、浅盘发酵法或者固态通风发酵池法；较优的，采用通风发酵池法时，通风量为1～3vvm，且无需搅拌。
较优的，固态发酵时，发酵培养基的料水比(质量比)为发酵培养基干基∶水＝10∶9～12。
采用固态法发酵时，发酵结束后，分离除去发酵产生的大量酶解型微生物的孢子，然后向发酵培养基中加入一定量水，在适宜温度下保温，酶解一定时间获得酶解产物。
较优的，固态发酵结束后向发酵培养基加入的水量是培养基(湿基)重量的1～3倍；较优的，酶解条件为45～50℃保温，酶解16～34h。
所述液态发酵法可采用分批发酵法或补料分批发酵法；液体发酵的设备可采用三角瓶摇瓶发酵、气升式发酵罐、机械搅拌通风发酵罐。
较优的，所述液态培养基的料水比(质量比)为发酵培养基干基∶水＝1∶8～14，优选1∶10～12。
采用液态发酵法时，在适宜条件下进行发酵反应，发酵结束后直接获得酶解产物。
较优的，所述液态发酵法时，培养温度为30～33℃，培养4～6天。
酶解产物中的不溶性固形物质可以通过过滤、离心、抽滤或者压滤等方法除去。
进一步的，所述浓缩可采用真空浓缩或者超滤浓缩；较优的，浓缩酶解液中可溶性固形物含量(质量百分比)为8～50％，优选10-30％。
进一步的，步骤3所述的增香发酵，具体包括如下步骤：
a.种子的制备：增香型微生物菌种活化，利用烟草原料制备的种子培养基逐级扩大培养增香型微生物种子，收集细胞沉淀；
b.发酵：增香型微生物在适宜条件下对浓缩酶解液的生物转化；
c.分离：发酵结束后，分离增香型微生物菌体与发酵液，收集增香后的发酵液；
d.再次发酵：向分离的增香型微生物菌体中加入新鲜烟草浓缩酶解液，重复步骤b和c的操作；
e.发酵液合并：不同批次增香后的发酵液合并得到烟草浸出液。
较优的，所述增香型微生物为酵母菌；更优的，所述增香型微生物为酵母属微生物(Saccharomyces spp.)，可以选自面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的一种；最优的，所述增香型微生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
较优的，所述增香型微生物种子培养基由麦芽汁和烟草原料溶液配制而成，其组成及配比为：烟草原料溶液∶8％麦芽汁＝1∶1(体积比)。
较优的，所述烟草原料溶液的原料组成及配比为：烟叶粉末∶烟末∶水＝0.5∶0.5∶9(重量比)；更优的，所述烟叶粉末和烟末粒度为36～60目。
较优的，所述种子培养基的制备方法如下：
(1)制备8％麦芽汁：取一份麦芽加入其四倍的水(质量比)，在65℃水浴锅中保温3～4h，使其自行糖化直至糖化完全。糖化液用4～6层纱布过滤，将过滤液用水稀释到麦芽汁中可溶性固形物质浓度为8％，调pH至6.4，制备成8％麦芽汁；
(2)制备烟叶粉末溶液：向烟叶粉末及烟末构成的粉末中加入温度为65～75℃的水，萃取30min获得所述的烟草原料溶液；
(3)制备种子培养基：按照烟草原料溶液∶(可溶性固形物质浓度含量)8％的麦芽汁＝1∶1(体积比)的配比制备种子培养基。
向灭菌后的种子培养基中接入斜面种子，在适宜条件下培养获得一级种子和二级种子。培养规模较大时，还可以继续培养三级种子或采用发酵罐培养。
种子培养成熟后离心收集细胞沉淀，获得增香型微生物湿细胞沉淀(酵母泥)，4℃冰箱保存备用。
进一步的，增香型微生物种子的要求为种子液中增香型微生物细胞数达到107-108个/mL。
较优的，步骤b的发酵是向所述浓缩酶解液中加入增香型微生物湿细胞沉淀(酵母泥)，制备成细胞悬液后进行生物转化。
较优的，增香型微生物湿细胞沉淀的加入量为酶解浓缩液的5～25％(质量百分比)；较优的，增香微生物的转化时间为0.5～6h。
步骤c是在发酵结束后，待细胞自然沉降，分离并收集增香后发酵液，增香型微生物细胞仍然留在反应容器中；步骤d是向酵母湿细胞沉淀中再次加入新鲜的浓缩酶解液进行发酵、分离，循环5～10次。以不染菌，并能持续进行微生物转化为度；最终，将不同批次增香后的发酵液合并，得到烟草浸出液。
本发明另一方面公开了一种烟草薄片，该烟草薄片中添加了本发明所述两步微生物发酵法制备的烟草浸出液。
本发明的有益效果为：本发明所采用的制备烟草浸出液的二步微生物发酵方法是通过两种不同功能的微生物对烟草原料进行发酵：第一步是采用产水解酶丰富的酶解微生物对烟草原料进行发酵和酶解；第二步发酵是利用具有增香作用的酵母菌对第一步发酵所获得的发酵滤液进行再次发酵。本发明的两步微生物发酵法，首先利用黑曲霉等酶解型微生物在发酵过程中合成的蛋白酶、果胶酶、木质素酶、半纤维素酶、淀粉酶等复合酶，将烟草原料中的蛋白质、木质素、淀粉、果胶质等大分子物质降解成易溶于水的氨基酸、还原糖、半乳糖醛酸等小分子物质，减少了蛋白质、果胶、淀粉等物质的残留对烟草薄片质量的影响，使燃烧时杂气更少，香气更佳；进一步的，增香微生物对发酵酶解浓缩液进行生物转化，在发酵过程中产生少量的醇类及酯类物质，进一步增加发酵液的香气，提高烟草浸出液的品质。本发明的两步微生物发酵法所制备的烟草浸出液比现有的造纸法烟草浸出液水溶性低分子量物质的总收率要高，综合质量更好；并且该生物处理的新方法比现有的烟草薄片的造纸法更加节能，工艺相对简单、设备投资较小，且与其它技术相配合可提高烟草薄片的综合质量。
附图说明
图1：造纸法烟草薄片生产工艺流程
图2：酶解型微生物种子扩大培养流程
图3：增香型微生物种子扩大培养流程
图4：先固后液发酵法生产烟草浸出液
图5：两步液态发酵法生产烟草浸出液
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
实施例1先固后液两步微生物发酵法
一、酶解发酵
1.黑曲霉种子的制备
1)斜面培养
黑曲霉(Aspergillus niger，中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of IndustrialCulture Collection)保藏并提供的40431-黑曲霉)划线接种于PDA斜面，30℃培养5天，4℃冰箱保存。
2)黑曲霉孢子悬浮液的制备
在黑曲霉斜面中加入事先灭菌的无菌水，用接种铲将孢子刮下，转移到已灭菌的三角瓶中，玻璃珠震荡打散。其中孢子悬浮液中的孢子浓度不低于107个/mL。
3)黑曲霉一级种子液的制备
在2个1000mL三角瓶中各加入粉碎后的烟叶粉末干基10g，加水150mL，121℃灭菌20min，冷却至30℃备用。接入黑曲霉孢子悬浮液10mL，摇瓶160r/min，30℃培养2天，获得黑曲霉一级种子液。
2.固态发酵
在121℃灭菌20min的1L三角瓶中(棉塞同时灭菌)，分别加入烟梗粉末(干基)90g，烟叶粉末(干基)5g，烟末(干基)5g，选择粒度大于等于60目，小于等于36目的上述烟草原料，加入70℃水90mL，搅拌均匀，保温30min，冷却至30℃后接入黑曲霉一级液体种子，接种量为30mL。30℃发酵5天。固态发酵平行样：6个。
3.酶解
固态发酵结束后，通过吸尘器分离收集孢子。将发酵后的烟草原料浸泡于水中进行酶解，加水量是发酵后的物料(湿基)重量的3倍，在45℃的保温条件下，浸泡并酶解28h。
二、固液分离
酶解后的烟草原料用4层纱布粗过滤后，得到不溶性固形物与液体，液体经抽滤后得到600mL，200mL液体留样检测，400mL液体经浓缩，得到200mL可溶性固形物含量10％的浓缩酶解液，用于后续的微生物转化增香。
三、增香发酵
1.酿酒酵母种子的制备
(1)8％麦芽汁的制备
取一份麦芽加入其四倍的水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化直至糖化完全。糖化液用4-6层纱布过滤，根据要求将过滤液用水稀释到麦芽汁中的可溶性固形物质含量为8％，调pH至6.4，制备成8％麦芽汁。
(2)烟草原料溶液的制备
按照烟叶粉末∶烟末∶水＝0.5∶0.5∶9(重量比)的配料比，在65℃的温度下萃取30min，自然过滤，制得烟草原料溶液。
(3)斜面培养基及斜面种子培养方法：6％麦芽汁琼脂培养基，将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of IndustrialCulture Collection)编号为31477)划线接种后，30℃培养24h，4℃冰箱保藏备用。
(4)酿酒酵母液体种子培养基及培养方法
种子培养基：上述烟草原料溶液50mL，再加入等体积的8％的麦芽汁。
一级种，500mL三角瓶中，加入种子培养基100mL，121℃灭菌20min。冷却至30℃备用。接入斜面菌种1环，摇瓶150r/min，30℃培养24h。
二级种，以一级种为种子液，在10个1L三角瓶中各加入200mL种子培养基，分别接入液体种子10mL，摇瓶200r/min，32℃培养24h，酵母细胞数应达到107个/mL。
酵母菌经扩大培养后，转移到灭菌后的离心管中，在无菌条件下离心，收集细胞沉淀，细胞沉淀在4℃冰箱低温保存备用。
2.发酵
采用悬浮细胞转化法：在500mL三角瓶中，加烟草浓缩酶解液200mL，其可溶性固形物含量为10％，再加入10g酿酒酵母湿细胞沉淀，搅拌匀成细胞悬浮液，进行微生物转化。转化期间间歇搅拌，转化温度为：32℃，转化时间为2小时。
3.分离
转化后待细胞自然沉降，收集增香后发酵液。
4.再次发酵
将通过步骤3分离获得的酿酒酵母泥(酿酒酵母湿细胞沉淀)中再加入新鲜的烟草浓缩酶解液180mL。如此循环5次，以不染菌，并能持续进行微生物转化为度。
5.发酵液合并
将不同批次的增香发酵液合并，制备得到烟草浸出液。
实施例2先固后液两步微生物发酵法(150L固态发酵罐)
一、酶解发酵
1.黑曲霉种子的制备
1)斜面培养
黑曲霉划线接种于PDA斜面，30℃培养5天，4℃冰箱保存。
2)黑曲霉孢子悬浮液的制备
在黑曲霉斜面中加入事先灭菌的无菌水，用接种铲将孢子刮下，转移到已灭菌的三角瓶中，玻璃珠震荡打散。其中孢子悬浮液中的孢子浓度不低于107个/mL。
3)黑曲霉一级种子液的制备
在6个1000mL三角瓶中加入粉碎后的烟叶粉末干基10g，加水115mL，121℃灭菌20min，冷却至30℃备用。接入黑曲霉孢子悬浮液10mL，摇瓶160r/min，32℃培养2天，获得黑曲霉一级种子液。
4)黑曲霉二级种子液的制备
将黑曲霉一级种子液接入到二级培养基中扩大培养黑曲霉二级种子液。种子罐为2个5L发酵罐。在每个发酵罐中(预先121℃灭菌20min)中加入粒度大于等于60目，小于等于36目的碎烟叶粉末140g、36目筛的烟梗粉末35g，加入2.75L水。接入黑曲霉一级种子液400mL，搅拌160r/min，通气量为1vvm，30℃培养2天。2个发酵罐共获得黑曲霉二级种子液约7L。
2.固态发酵
在一蒸汽灭菌过的容器内，加入混合的烟草原料作为发酵培养基，其配料(干基计)为：粒度为36目～60目的烟梗粉末18kg，粒度为36目～60目的烟叶粉末和烟末各1kg。在混合烟草原料中加入100℃水24L，搅拌均匀，维持30min，冷却至30℃后加入二级液体种子7L，拌匀。
在蒸汽灭菌30min的150L固体发酵罐的不锈钢筛板上铺上4层纱布，其上加入上述接种后的烟草物料，其厚度约为15cm。30℃，发酵5天。发酵期间经罐底不锈钢筛板下的气室，向不锈钢筛板上的发酵物料中通入无菌空气，通风量：150L/min。压力：1kg/cm2。
3.酶解
固态发酵结束后，通过吸尘器分离收集发酵物料上的黑曲霉孢子。将发酵后的烟草物料浸泡于水中进行酶解，加水量是发酵后的物料(湿基)重量的2.5倍，在50℃的保温条件下，浸泡并酶解16h。浸泡期间，间歇地将发酵罐底部气室内的滤液循环返回到不锈钢筛板上的发酵烟草物料中。
二、固液分离
发酵并酶解后的烟草原料用4层纱布在发酵罐内进行粗过滤，发酵残渣再经压滤，分离得到不溶性固形物与液体，所得到的液体再经多层纱布过滤后得到110L酶解液，酶解液再经浓缩得到30L可溶性固形物含量为30％的浓缩酶解液。浓缩酶解液用于后续的微生物转化增香。
三、增香发酵
1.酿酒酵母种子的制备
(1)8％麦芽汁的制备
取一份麦芽加入其四倍的水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化直至糖化完全。糖化液用4-6层纱布过滤，根据要求将过滤液用水稀释到麦芽汁中的可溶性固形物质含量为8％，调pH至6.4，制备成8％麦芽汁。
(2)烟草原料溶液的制备
按照烟叶粉末∶烟末∶水＝0.5∶0.5∶9(重量比)的配料比，在75℃的温度下萃取30min，自然过滤，制得烟草原料溶液。
(3)斜面培养基及斜面种子培养方法：6％麦芽汁琼脂培养基，将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of IndustrialCulture Collection)编号为31477)划线接种后，30℃培养24h，4℃冰箱保藏备用。
(4)酿酒酵母液体种子培养基及培养方法
种子培养基：上述烟草原料溶液50mL，再加入等体积的8％的麦芽汁。
一级种，500mL三角瓶中，加入种子培养基100mL，121℃灭菌20min，冷却至30℃备用。接入斜面菌种1环，摇瓶150r/min，31℃培养24h，酵母细胞数应达到108个/mL。
二级种子培养，在10个1L三角瓶中各加入200mL培养基，121℃灭菌20min灭菌并冷却后，分别接入一级液体种子6mL，，摇瓶150r/min，30℃培养24h，酵母细胞数应达到107个/mL。酵母菌经扩大培养后，转移到灭菌后的离心管中，在无菌条件下离心，收集细胞沉淀。4℃冰箱低温保存备用。
三级种，在30L发酵罐中加入20L上述烟草原料溶液和麦芽汁混合而制成的培养基，121℃灭菌20min灭菌并冷却后，接入液体种子1000mL，搅拌转速150r/min，通气量为1vvm，30℃培养24h。酵母菌经扩大培养后，在无菌条件下离心，收集细胞沉淀。4℃冰箱低温保存备用。
2.发酵
悬浮细胞转化法：在2L可溶性固形物含量为30％的烟草浓缩酶解液加入0.2kg湿细胞沉淀，制备成悬浮液，置于容器中，进行微生物转化。转化温度为31℃，转化时间为2.5小时。
3.分离
转化后待细胞自然沉降，从溢流口放出增香后发酵液体并收集发酵液。
4.再次发酵
将通过步骤3分离获得的酿酒酵母泥(酿酒酵母湿细胞沉淀)中再加入新鲜的烟草浓缩酶解液2L，循环10次，以不染菌，并能持续进行微生物转化为度。
5.发酵液合并
将不同批次的增香发酵液合并，制备得到烟草浸出液。
实施例3先固后液两步微生物发酵法
一、酶解发酵
1.米曲霉种子的制备
1)斜面培养
米曲霉划线接种于PDA斜面，30℃培养4天，4℃冰箱保存。
2)米曲霉孢子悬浮液的制备
在米曲霉斜面中加入事先灭菌的无菌水，用接种铲将孢子刮下，转移到已灭菌的三角瓶中，玻璃珠震荡打散。其中孢子悬浮液中的孢子浓度不低于107个/mL。
3)米曲霉一级种子液的制备
在2个1000mL三角瓶中加入粉碎后的烟叶粉末干基10g，加水157mL，121℃灭菌20min，冷却至30℃备用。接入米曲霉孢子悬浮液12mL，摇瓶160r/min，30℃培养2天，获得米曲霉一级种子液。
2.固态发酵
在121℃灭菌20min的6个1L三角瓶中(棉塞同时灭菌)，分别加入烟梗粉末(干基)72g，烟叶粉末(干基)4g，烟末(干基)4g，加入70℃水80mL，搅拌均匀，保温30min，冷却至30℃后接入米曲霉一级液体种子，接种量为24mL。32℃发酵5天。
3.酶解
固态发酵结束后，通过吸尘器分离收集孢子。将发酵后的烟草原料浸泡于水中进行酶解，加水量是发酵后的物料(湿基)重量的1倍，在48℃的保温条件下，浸泡并酶解34h。
二、固液分离
发酵并酶解后的的烟草原料用搅拌器打成含纤维渣的浆液，通过压滤分离出烟草纤维素和烟草浸出液，液体经2层滤纸抽滤后得到6×500mL，6×100mL液体留样检测，6×400mL液体经浓缩得到6×160mL可溶性固形物含量为20％浓缩酶解液，用于后续的微生物转化增香。
三、增香发酵
1.啤酒酵母种子的制备
(1)8％麦芽汁的制备
取一份麦芽加入其四倍的水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化直至糖化完全。糖化液用4-6层纱布过滤，根据要求将过滤液用水稀释到麦芽汁中的可溶性固形物质含量为8％，调pH至6.4，制备成8％麦芽汁。
(2)烟草原料溶液的制备
按照烟叶粉末∶烟末∶水＝0.5∶0.5∶9(重量比)的配料比，在65℃的温度下萃取30min，自然过滤，制得烟草原料溶液。
(3)斜面培养基及斜面种子培养方法：6％麦芽汁琼脂培养基，将啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen，中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center ofIndustrial Culture Collection)编号为31362)，划线接种后，30℃培养24h，4℃冰箱保藏备用。
(4)啤酒酵母液体种子培养基及培养方法
种子培养基：上述烟草原料溶液50mL，再加入等体积的8％的麦芽汁。
一级种，500mL三角瓶中，加入种子培养基100mL，121℃灭菌20min，冷却至30℃备用。接入斜面菌种1环，摇瓶150r/min，32℃培养24h。酵母细胞数应达到108个/mL。
二级种，以一级种为种子液，在10个1L三角瓶中各加入200mL培养基，分别接入液体种子10mL，摇瓶180r/min，31℃培养24h，酵母细胞数应达到108个/mL。
酵母菌经扩大培养后，转移到灭菌后的离心管中，在无菌条件下离心，收集细胞沉淀，细胞沉淀在4℃冰箱低温保存备用。
2.发酵
采用悬浮细胞转化法：在500mL三角瓶中，加烟草浓缩酶解液100mL，其可溶性固形物含量为20％，再加入10g啤酒酵母湿细胞沉淀，搅拌匀成细胞悬浮液，进行微生物转化。转化温度为30℃，转化时间为3.5小时。
3.分离
转化后待细胞自然沉降，收集增香后发酵液。
4.再次发酵
向步骤3分离获得的啤酒酵母泥(啤酒酵母湿细胞沉淀)中再加入新鲜的浓缩酶解液100mL。如此循环7次继续进行增香发酵。
5.发酵液合并
将不同批次的增香发酵液合并，制备得到烟草浸出液。
实施例4两步液态微生物发酵法(一次性投料)
一、酶解发酵
1.黄孢原毛平革菌种子液的制备
1)斜面培养
黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium，中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection)编号为40719)划线接种于PDA试管斜面，30℃培养5天，4℃冰箱保存。
2)孢子悬浮液的制备
在黄孢原毛平革菌试管斜面中加入事先灭菌的无菌水，用接种铲将孢子刮下，转移到已灭菌的三角瓶中，玻璃珠震荡打散。其中孢子悬浮液中的孢子浓度不低于107个/mL。
3)黄孢原毛平革菌一级种子液的制备
在3个1000m L三角瓶中加入粉碎后的烟叶粉末干基10g，加水150mL，121℃灭菌20min。冷却至30℃备用。接入黄孢原毛平革菌孢子悬浮液15mL，摇瓶160r/min，32℃培养3天，获得黄孢原毛平革菌一级种子液。
2.液态发酵及酶解
在121℃灭菌20min的1L三角瓶中(棉塞同时灭菌)，加入混合的烟草原料作为发酵培养基，其配料(36～60目，干基计)为：烟梗粉末18g，烟叶粉末1g，烟末1g。加入280mL70℃水，保温30min，接入一级液体种子40mL。摇瓶160r/min，33℃发酵4天，得烟草发酵酶解液。液态发酵平行样共6个。
二、固液分离
烟草发酵液用4层纱布粗过滤后，得到不溶性固形物与液体，液体经抽滤后得到210mL液体浓缩得到100mL可溶性固形物含量为8％的浓缩酶解液，用于后续的微生物转化增香。
三、增香发酵
1.面包酵母种子的制备
(1)8％麦芽汁的制备
取一份麦芽加入其四倍的水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化直至糖化完全。糖化液用4-6层纱布过滤，根据要求将过滤液用水稀释到麦芽汁中的可溶性固形物质含量为8％，调pH至6.4，制备成8％麦芽汁。
(2)烟草原料溶液的制备
按照烟叶粉末∶烟末∶水＝0.5∶0.5∶9(重量比)的配料比，在70℃的温度下萃取30min，自然过滤，制得烟草原料溶液。
(3)斜面培养基及斜面种子培养方法：6％麦芽汁琼脂培养基，将面包酵母(Saccharomyces cerevisiae，中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of IndustrialCulture Collection)编号为30326)划线接种后，30℃培养24h，4℃冰箱保藏备用。
(4)面包酵母液体种子培养基及培养方法
种子培养基：上述烟草原料溶液50mL，再加入等体积的8％的麦芽汁。
一级种，500mL三角瓶中，加入种子培养基100mL，121℃灭菌20min。冷却至30℃备用。接入斜面菌种1环，摇瓶150r/min，30℃培养24h。
二级种，以一级种为种子液，在10个1L摇瓶200mL培养基中分别接入液体种子10mL(接种量为5％)，摇瓶150r/min，30℃培养24h，酵母细胞数应达到107个/mL。酵母菌经扩大培养后，转移到灭菌后的离心管中，在无菌条件下离心，收集细胞沉淀。4℃冰箱低温保存备用。
2.发酵
悬浮细胞转化法：在100mL可溶性固形物含量为8％的烟草浓缩酶解液加入20g湿细胞沉淀，制备成悬浮液，置于500mL三角瓶中，进行微生物转化。转化温度为30℃，转化时间为0.5小时。
3.分离
细胞自然沉降后，倒出增香后发酵液体并收集增香后发酵液。
4.再次发酵
向步骤3分离获得的面包酵母泥(面包酵母湿细胞沉淀)中，再加入新鲜的浓缩酶解液100mL，如此循环5次，继续进行增香发酵。
5.发酵液合并
不同批次的增香发酵液合并成本专利所述的发酵烟草浸出液。
实施例5两步液态微生物发酵法(补料分批发酵)
一、酶解发酵
1.木霉种子液的制备
1)斜面培养
木霉划线接种于PDA试管斜面，30℃培养5天，4℃冰箱保存。
2)孢子悬浮液的制备
在木霉试管斜面中加入事先灭菌的无菌水，用接种铲将孢子刮下，转移到已灭菌的三角瓶中，玻璃珠震荡打散。其中孢子悬浮液中的孢子浓度不低于107个/mL。
3)木霉一级种子液的制备(4个三角瓶)
在1000mL三角瓶中加入粉碎后的烟叶粉末干基10g，加水150mL，121℃灭菌20min。冷却至30℃备用。接入木霉孢子悬浮液10mL，摇瓶160r/min，30℃培养3天，获得木霉一级种子液。
2.液态发酵及酶解
在121℃灭菌20min的1L三角瓶中(棉塞同时灭菌)，加入烟梗粉末、烟叶粉末和烟末(均为干基)各15g、1.5g和1.5g，加入70℃水216mL。冷却至30℃后接入一级液体种子40mL。摇瓶160r/min，30℃发酵2天。在瓶内加入上述烟梗粉末7.5g(预先加15mL水浸润)，30℃再发酵2天。再在瓶内加入上述烟梗粉末4.5g(预先加9mL水浸润)，30℃再发酵6天，得到烟草发酵液。
表1液态发酵分批加料量及加水量
二、固液分离
上述发酵液10瓶，合并后用4层纱布粗过滤后，得到不溶性固形物与液体，液体经抽滤后得到2400mL，液体经浓缩得到480mL可溶性固形物含量为50％的浓缩酶解液，浓缩酶解液用于后续的微生物转化增香。
三、增香发酵
1.酿酒酵母种子液的制备
(1)8％麦芽汁的制备
取一份麦芽加入其四倍的水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化直至糖化完全。糖化液用4-6层纱布过滤，根据要求将过滤液用水稀释到麦芽汁中的可溶性固形物质含量为8％，调pH至6.4，制备成8％麦芽汁。
(2)烟草原料溶液的制备
按照烟叶粉末∶烟末∶水＝0.5∶0.5∶9(重量比)的配料比，在75℃的温度下萃取30min，自然过滤，制得烟草原料溶液。
(3)斜面培养基及斜面种子培养方法：6％麦芽汁琼脂培养基，将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of IndustrialCulture Collection)编号为31477)划线接种后，30℃培养24h，4℃冰箱保藏备用。
(4)酿酒酵母液体种子培养基及培养方法
种子培养基：上述烟草原料溶液50mL，再加入等体积的8％的麦芽汁。
一级种，500mL三角瓶中，加入种子培养基100mL，121℃灭菌20min。冷却至30℃备用。接入斜面菌种1环，摇瓶150r/min，30℃培养24h。
二级种，以一级种为种子液，在10个1L摇瓶中，加入种子培养基200mL，分别接入液体种子4mL(接种量为2％)，摇瓶150r/min，30℃培养24h。酵母菌经扩大培养后，转移到灭菌后的离心管中，在无菌条件下离心，收集细胞沉淀，4℃冰箱低温保存备用，酵母细胞数应达到107个/mL。
2.发酵
悬浮细胞转化法：在100mL可溶性固形物含量为50％的烟草浓缩酶解液加入25g湿细胞沉淀，制备成悬浮液，置于500mL三角瓶中，进行微生物转化。转化温度为31℃，转化时间为5小时。
3.分离
细胞自然沉降后，倒出增香后发酵液体并收集发酵液。
4.再次发酵
向步骤3分离获得的酿酒酵母泥(酿酒酵母湿细胞沉淀)中，再加入新鲜的浓缩酶解液100mL，如此循环10次，继续进行增香发酵。
5.发酵液合并
不同批次的增香发酵液合并成本专利所述的烟草浸出液。
实施例6两步液态微生物发酵法(150L补料分批发酵)
一、酶解发酵
1.黑曲霉种子的制备
1)斜面培养
黑曲霉划线接种于PDA试管斜面，30℃培养5天，4℃冰箱保存。
2)孢子悬浮液的制备
在黑曲霉试管斜面中加入事先灭菌的无菌水，用接种铲将孢子刮下，转移到已灭菌的三角瓶中，玻璃珠震荡打散。其中孢子悬浮液中的孢子浓度不低于107个/mL。
3)黑曲霉一级、二级种子液的制备
在8个1000mL三角瓶中各加入粉碎后的烟叶粉末干基10g，加水150mL，121℃灭菌20min。冷却至30℃备用。接入黑曲霉孢子悬浮液10mL，摇瓶160r/min，32℃培养2天，获得黑曲霉一级种子液。
将黑曲霉一级种子液接入到二级培养基中扩及培养获得黑曲霉二级种子液：
①在10个1000m L三角瓶(预先121℃灭菌20min)中各加入粒度为36～60目的烟叶粉末15g、烟梗粉末5g，加入230mL70℃的水，保温30min。接入黑曲霉一级种子液35mL，摇瓶160r/min，30℃培养2天。得到黑曲霉二级种子液。
②在2个5L发酵罐中(预先121℃灭菌20min)中，每罐加入过36目筛的烟叶粉末150g、36目筛的烟梗粉末50g，加入2.3L水。各接入黑曲霉一级种子液400mL，搅拌160r/min，通气量为1vvm，30℃培养2天。2个发酵罐共获得黑曲霉二级种子液。
合并①②得到黑曲霉二级种子液10L。
2.液态发酵及酶解
在蒸汽灭菌30min的150L液态发酵罐中加入混合的烟草原料作为发酵培养基，其配料总量(干基计)为：烟梗粉末15.55kg，烟叶粉末0.86kg，烟末0.86kg。发酵初期加入烟梗粉末8.64kg，烟叶粉末0.86kg，烟末0.86kg，加入110L水，接入黑曲霉二级液体种子10L。通气量为1.25vvm，30℃发酵2天。2天后加入烟梗粉末4.32kg及水6L，30℃再发酵2天。然后再加入烟梗粉末5.59kg及水4L，30℃再发酵5天。得到烟草发酵液。
表1液态发酵分批加料量及加水量料水比
二、固液分离
烟草发酵液用4层纱布粗过滤后，得到不溶性固形物与液体，所得到的液体再经多层纱布过滤后得到液体110L，浓缩得到19.2L可溶性固形物含量为40％的浓缩酶解液，浓缩酶解液用于后续的微生物转化增香。
三、增香发酵
1.酿酒酵母种子液的制备
(1)8％麦芽汁的制备
取一份麦芽加入其四倍的水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化直至糖化完全。糖化液用4-6层纱布过滤，根据要求将过滤液用水稀释到麦芽汁中的可溶性固形物质含量为8％，调pH至6.4，制备成8％麦芽汁。
(2)烟草原料溶液的制备
按照烟叶粉末∶烟末∶水＝0.5∶0.5∶9(重量比)的配料比，在65℃的温度下萃取30min，自然过滤，制得烟草原料溶液。
(3)斜面培养基及斜面种子培养方法：6％麦芽汁琼脂培养基，将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of IndustrialCulture Collection)编号为31477)划线接种后，30℃培养24h，4℃冰箱保藏备用。
(4)酿酒酵母液体种子培养基及培养方法
种子培养基：上述烟草原料溶液50mL，再加入等体积的8％的麦芽汁。
一级种，500mL三角瓶中，加入上述烟草浸出液和麦芽汁混合而制成的种子培养基100mL，121℃灭菌20min。冷却至30℃备用。接入斜面菌种1环，摇瓶150r/min，31℃培养24h。
二级种子培养，在10个1L三角瓶中各加入种子培养基200mL，121℃灭菌20min灭菌并冷却后，分别接入一级液体种子6mL(接种量为3％)，摇瓶150r/min，30℃培养24h。酵母菌经扩大培养后，转移到灭菌后的离心管中，在无菌条件下离心，收集细胞沉淀。4℃冰箱低温保存备用。
三级种，在30L发酵罐中加入20L上述，烟草原料溶液和麦芽汁混合而制成的培养基，121℃灭菌20min灭菌并冷却后，接入液体种子1000mL(接种量为5％)，搅拌转速150r/min，通气量为1vvm，30℃培养24h。酵母菌经扩大培养后，在无菌条件下离心，收集细胞沉淀。4℃冰箱低温保存备用。
2.发酵
悬浮细胞转化法：取2L可溶性固形物含量为40％的烟草浓缩酶解液，加入0.3kg湿酵母细胞，制备成悬浮液，置于容器中，进行微生物转化。转化温度为32℃，转化时间为6小时。
3.分离
细胞自然沉降后，从溢流口放出增香后发酵液体并收集发酵液。
4.再次发酵
再加入新鲜的烟草浓缩酶解液2L，如此循环5次，继续进行增香发酵。
5.发酵液合并
不同批次的增香发酵液合并成本专利所述的发酵浸出液。
实施例7
为了检验本发明的两步微生物发酵法制备烟草浸出液的质量，将本发明的两步微生物发酵法第一步酶解发酵制备的酶解液与现有的水溶剂萃取法制备烟草浸出液的成分进行比较，实验方法如下：
1.两步微生物发酵法制备发酵酶解液(实验组)
黑曲霉一级种子液的制备：向黑曲霉种子液培养基中接入黑曲霉孢子悬浮液12mL，摇瓶160r/min，30℃培养2天，获得黑曲霉一级种子液。
烟草原料的液态补料发酵：在121℃灭菌20min的2个1L三角瓶中(棉塞同时灭菌)，初期各加入烟梗粉末(干基)12.5g、烟叶粉末(干基)1.25g、烟末(干基)1.25g，加入70℃水180mL，搅拌均匀，保温30min，冷却至30℃后接入一级液体种子50mL。30℃摇瓶发酵2天。再每瓶加入6.25g烟梗粉末(预先用12.5mL水浸泡)，30℃摇瓶发酵2天。再每瓶加入3.75g烟梗干基(预先用7.5mL水浸泡)，30℃摇瓶发酵2天。
烟草原料发酵后的固液分离：发酵后的的烟草原料通过压滤分离出烟草纤维素和发酵液，发酵液经2层滤纸抽滤，获得发酵酶解液(实验组)。
2.水溶液萃取法制备烟草浸出液(对照组)
萃取：称取烟梗粉末(干基)45g、烟叶粉末(干基)2.5g、烟末(干基)2.5g，加入70℃水180ml，30℃，密闭浸泡6天。
固液分离：用搅拌器将上述烟草萃取液进一步打成含纤维渣的浆液，经2层滤纸抽滤后获得烟草纤维素和烟草浸出液(对照组)。
3.发酵酶解液及烟草浸出液成分及含量分析
分别对两步微生物发酵法(实验组)和水溶剂萃取法(对照组)获得的水不溶性滤渣，以及制备得到的发酵酶解液和烟草浸出液成分进行分析，实验结果见表1。
表1两步微生物发酵法(实验组)和水溶剂萃取法(对照组)产物分析
由表1可见，本发明的两步微生物发酵法(实验组)经过第一步酶解发酵，滤渣干重减少，滤液中可溶性固形物质含量增加；发酵酶解滤液中明显增加了氨基酸、还原糖及半乳糖醛酸等小分子物质的含量，说明本发明的两步微生物发酵法利用水解酶丰富的酶解微生物(如黑曲霉)可将烟草原料中的蛋白质、木质素、淀粉、果胶质等大分子物质降解成易溶于水的小分子物质，减少了蛋白质、果胶、淀粉等物质的残留对烟草薄片质量的影响，使燃烧时杂气更少，香气更佳，提高了烟草浸出液的品质。可见，本发明的两步微生物发酵法所制备的烟草浸出液比现有的造纸法烟草浸出液水溶性低分子量物质的总收率要高，综合质量更好。
Claims (20)
1.一种制备烟草浸出液的两步微生物发酵法，具体步骤为：
(1)酶解发酵：酶解型微生物对烟草原料的微生物发酵及酶解；
(2)固液分离：除去酶解产物中的不溶性固形物质，取酶解液进行浓缩，获得浓缩酶解液；
(3)增香发酵：增香型微生物对浓缩酶解液进行微生物发酵，获得烟草浸出液。
2.如权利要求1所述的两步微生物发酵法，其特征在于，所述烟草原料选自烟梗、烟叶和烟末中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的两步微生物发酵法，其特征在于，所述烟草原料经粉碎、过筛处理，且处理后的烟草原料粒径为大于等于60目，小于等于36目。
4.如权利要求1-3所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤(1)的酶解发酵步骤为：
A.酶解型微生物的菌种活化，利用烟草原料制备的种子培养基逐级扩大培养酶解型微生物种子；
B.采用固态或液态发酵法，将步骤A制备的酶解型微生物种子接种于烟草原料制备的发酵培养基中，在适宜条件下进行发酵和烟草原料的酶解，获得酶解产物。
5.如权利要求4所述的两步微生物发酵法，其特征在于，所述酶解型微生物为黑曲霉、米曲霉、黄孢原毛平革菌或木霉中任一。
6.如权利要求4所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤A中所述种子培养基是由烟草原料加水配置而成，其中烟草原料干基的重量百分比为6-8％。
7.如权利要求4所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤B所述的发酵培养基干基由烟叶粉末、烟末和烟梗粉末的干基组成，且三者的质量比为0.5∶0.5∶9。
8.如权利要求4所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤B所述的固态发酵法发酵培养基的料水比为发酵培养基干基质量∶水质量＝10∶9～12；所述液态发酵法发酵培养基的料水比为发酵培养基干基质量∶水质量＝1∶8～14。
9.如权利要求4所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤B所述的液态发酵法采用分批发酵法或补料分批发酵法。
10.如权利要求4所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤B固态发酵法发酵结束后，分离除去发酵产生的大量酶解型微生物的孢子，向发酵培养基中加入培养基湿基重量1～3倍的水进行酶解，酶解条件为45～50℃，酶解16～34h。
11.如权利要求4所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤B液态发酵法发酵培养条件为温度30～33℃，培养4～6天。
12.如权利要求1所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤(2)所述浓缩酶解液中可溶性固形物质含量的质量百分比为8～50％。
13.如权利要求1-3所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤(3)的增香发酵步骤为：
a.种子的制备：增香型微生物菌种活化，利用烟草原料制备的种子培养基逐级扩大培养增香型微生物种子，收集细胞沉淀；
b.发酵：增香型微生物在适宜条件下对浓缩酶解液的生物转化；
c.分离：发酵结束后，分离增香型微生物菌体与发酵液，收集增香后的发酵液；
d.再次发酵：向分离的增香型微生物菌体中加入新鲜烟草浓缩酶解液，重复步骤b和c的操作；
e.发酵液合并：不同批次增香后的发酵液合并得到烟草浸出液。
14.如权利要求13所述的两步微生物发酵法，其特征在于，所述增香型微生物为酵母菌。
15.如权利要求13所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤a的种子培养基由麦芽汁和烟草原料溶液配制而成。
16.如权利要求13所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤a的增香型微生物种子的要求为种子液中增香型微生物细胞数达到107～108个/mL。
17.如权利要求13所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤b的发酵是向所述浓缩酶解液中加入增香型微生物湿细胞沉淀，制备成细胞悬液后进行生物转化，且增香型微生物湿细胞沉淀在酶解浓缩液中的质量百分比为5～25％。
18.如权利要求17所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤b增香微生物的转化时间为0.5～6h。
19.如权利要求13所述的两步微生物发酵法，其特征在于，步骤d是向增香型微生物湿细胞沉淀中再次加入新鲜的浓缩酶解液进行发酵、分离，循环5～10次。
20.一种烟草薄片，其特征在于，所述烟草薄片中添加了权利要求1所述两步微生物发酵法制备的烟草浸出液。
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