CN102426234B

CN102426234B - 一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法

Info

Publication number: CN102426234B
Application number: CN201210000614.0A
Authority: CN
Inventors: 乔宁; 李美芹; 竺晓平; 刘永光; 王兴翠; 国家进
Original assignee: SHANDONG VEGETABLES ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER; Shandong Agricultural University; Weifang University of Science and Technology
Current assignee: SHANDONG VEGETABLES ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER; Shandong Agricultural University; Weifang University of Science and Technology
Priority date: 2012-01-04
Filing date: 2012-01-04
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2032-01-04
Also published as: CN102426234A

Abstract

本发明涉及基因工程中病毒检测技术领域一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法：从病叶总DNA中克隆得到TYLCV-CP基因片段，与pET-32a连接转化受体菌，对阳性菌落诱导表达并纯化出目的蛋白；免疫家兔制备抗血清，对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记，使用DAS-ELISA方法对待检病株进行检测。本发明检测番茄黄化曲叶病毒的方法，其灵敏度高，可用于定性、定量分析，最低检测限为9.75ng/mL；操作简单快速，可在数小时内完成；特异性强，重复性好，针对番茄黄化曲叶病毒有非常明显的免疫学反应；可靠性高，其检出准确率与PCR法非常接近；检测成本低廉，试剂用量少并可以较长时间保存，非常适合大规模的常规检测。

Description

一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法

技术领域

本发明涉及基因工程中病毒检测技术领域，特别涉及一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法。

背景技术

番茄是我国主要的蔬菜品种之一，在全国各蔬菜产区均有大面积的种植，而且在蔬菜周年供应中占有非常重要的地位。随着温室大棚蔬菜种植技术的推广以及蔬菜反季节栽培经济效益的提高，温室番茄栽培面积连年增长。与此同时，其病害的发生也呈现逐步加重的趋势：番茄花叶病毒病(Tomato mosaic virus，TMV)和黄瓜花叶病毒病(Cucumber mosaic virus，CMV)一直是番茄生产中的主要病毒病，但近年来，在番茄主产区相继发现了一种新的病毒病--番茄黄化曲叶病毒病。

番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV)属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，主要通过烟粉虱(Bemisia tabaci) 传播, 可以侵染茄科、豆科等多种植物，是分布广泛的世界性番茄病毒之一。由TYLCV引起的番茄黄化曲叶病毒病是一种毁灭性病害，自1964年发现以来，已给许多国家和地区造成了严重危害。低密度烟粉虱就可以导致病毒扩散与流行，且可以终生传毒。番茄在开花前感染黄化曲叶病毒病造成的减产幅度很大，一般减产在80%以上，严重的甚至绝收，坐果后染病会有一定的产量，但果实品质很差。番茄植株感染病毒后，初期主要表现为生长点叶片叶缘先变黄色，后整个叶片黄化，生长迟缓甚至停滞生长，茎节间明显变短，植株矮化现象明显，叶片变小变厚、有褶皱、叶缘向上卷曲，叶质脆硬，这些症状主要表现在植株上部叶片上，下部老叶症状不明显；如果在苗期染病则植株严重矮化，无法正常开花结果；在生长发育后期染病植株仅上部叶片和新芽表现症状，但坐果数量明显减少，果实膨大速度慢、果实小，成熟期果实着色不均匀是该病在果实上的表现症状，果实产量和商品价值均大幅度下降，经济效益受到严重损失。此病一旦发生，除了砍掉染病的植株，尚未寻找到有效诊治和防止病害扩散的方法，而且将会给当地的番茄生产带来巨大的损失，因此能否有效及时地诊断番茄病害已成为制约番茄高产的关键因素。

番茄黄化曲叶病毒病在全世界广泛分布，目前至少有39个国家的棉花、木薯和番茄等作物正在遭受此病毒的毁灭性危害，因而成为各国学者的研究热点。近年来，番茄黄化曲叶病毒病在我国的上海、广西、陕西、云南、江苏、浙江、重庆、广东等地广泛发生，并对上述地区的番茄生产构成了严重威胁，而且有向北方扩展的可能性和趋势。2007年10月河南开封市开封县1000多亩温室番茄普遍发生病毒病，症状和番茄黄化曲叶病毒病相同，毁种面积大约占五分之一，勉强没有毁种的大棚预计减产都在30%；2007年11月山东济宁报告温室番茄发生疑似的番茄黄化曲叶病毒病，另外，自2005年以来在山东潍坊、菏泽及寿光等部分地区也发现类似的病毒病症状。可见对于保护地番茄种植地区来说，建立长期有效的番茄病毒检测体系，完善检测技术已是迫在眉睫，要严防该病发生，如若控制不当，将造成灾难性的后果。

TYLCV的早期诊断主要依赖于感病作物的症状，但症状往往随着土壤、生长条件和气候的变化而出现差异；加之基层农技人员对该番茄病害的症状了解得不够清楚，易于与其他番茄病害产生混淆，从而误诊误治，延误病情，甚至造成病害的大面积传播。因此，寻找一种大众型、经济型、实用型、快捷型的检测方法显得尤为重要。

目前，植物病毒检测的主要方法是以PCR为基础的分子生物学检测法和以ELISA为代表的免疫学检测法。虽然PCR法是业界公认的准确性比较高的检测方法，但该法专业性强、技术含量高，检测试剂昂贵，而且还需要PCR仪等贵重仪器，造成检测成本居高不下，因此，只能局限在实验室内进行专业检测，难以作为一种常规检测技术进行推广应用。

运用血清学检测是一种既准确直观又经济简便的途径，最经典的方法当属Clark和Adams于l977年建立的双抗体夹心法。1976年由Voller、Clark和Adanls引入植物病毒的检测。它将酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度；同时它又是一种非均相分析过程，即在反应中的每一步之后都有洗涤过程，从而排除了未反应物质的干扰。现在该法被普遍应用于各种植物的病毒检测上。Ellis采用该法进行了PVY的鉴定和PVY血清型的地理分布工作；崔荣昌等运用双抗体夹心法对PVX^O，PVY^N, PVA, PVS, PVM, PLRV和TRV，进行了检测，并首次查明了黑龙江省内存在PVY^N 和PVM病毒；杨元军等通过该技术检测了单株组培苗不同茎段的PVX、PVY病毒浓度。研究结果表明运用DAS-ELISA方法（酶联免疫吸附测定）检测病毒，特异性强，重复性好，灵敏度高，非常适合大规模的检测。但在国内外尚未见应用DAS-ELISA技术来检测番茄黄化曲叶病毒的报道。

据报道，病毒外壳蛋白具有良好的抗原特异性。利用基因工程技术克隆病毒外壳蛋白，并以此为抗原制备抗血清，能够克服常规途径的诸多困难，已成为病毒抗血清制备的新途径，该途径现成功应用于多种植物病毒的血清学检测，但关于番茄黄化曲叶病毒的相关研究还比较少。

发明内容

为了解决以上无快捷、准确检测番茄黄化曲叶病毒方法的问题，本发明提供了一种大众、经济、实用、快捷的使用酶联免疫吸附法快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法。

本发明是通过以下方式实现的：

一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法，包括以下步骤：

（1）从感染黄化曲叶病毒病的番茄病叶中提取总DNA，以此为模板通过PCR扩增获得TYLCV-CP基因的特异性DNA片段，所用引物为：

TYCP1：5’-GCGGAATTCATGTCGAAGCGACCAGGCGAT-3’下划线为EcoRI酶切位点，

TYCP2：5’-GCGCTCGAGATTTGATATTGAATCATAG-3’下划线为Xho I酶切位点；

（2）将TYLCV-CP基因片段与表达载体pET-32a连接，转化受体菌获得抗性菌落，筛选出阳性克隆，然后在含有0.1-0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的条件下进行诱导表达，离心收集菌体，菌体破碎后纯化目的蛋白；

（3）以纯化的目的蛋白为抗原免疫家兔，效价为1:16000时取血收集抗血清，将抗血清纯化，获得纯度为95-98%，浓度为20-24.3mg/mL的抗体IgG；

（4）用戊二醛一步法对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记，获得碱性磷酸酶标记抗体IgG-AP，其中 IgG浓度为0.822-1.145mg/mL；

（5）以健康的幼苗为阴性对照，以感病幼苗为阳性对照，纯化的IgG进行包被后与碱性磷酸酶标记抗体IgG-AP对待检样品进行DAS-ELISA检测，最后加入PNPP配成的底物溶液进行显色；其中IgG包被浓度为6.25μg/mL，酶标抗体稀释度为1:400；IgG包被条件为4℃过夜，封闭时间为60min，酶标抗体作用时间为120min，底物显色条件为37℃条件下30min。

步骤（4）对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记时，将1mg纯化的IgG与800IU的碱性磷酸酶混匀，加PBS缓冲液到0.5mL；在其混合液中加入4μL 25%戊二醛，室温放置2h，每30min上下颠倒一次；4℃中用PBS缓冲液透析过夜，透析物转移至离心管中，加入5mg牛血清白蛋白（BSA），4℃保存备用。

步骤（2）纯化目的蛋白为使用蛋白纯化柱HiTrap Chelating HP 纯化。

抗血清纯化时使用抗体纯化柱：lmL的HiTrap Protein A 抗体纯化柱。

步骤（2）中受体菌为E.coliBL21(DE3)。

底物溶液为将5mg对硝基苯磷酸二钠溶于7.5mL的含11.6%二乙醇胺的pH为9.8的底物缓冲液中。

TYLCV-CP基因的特异性DNA片段的PCR扩增的反应体系为：2x Taq MasterMix 12.5μL，TYCP1 (10 pmol/L)1.0 μL， TYCP2 (10 pmol/L)1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，加双蒸水至终体积25.0 μL；PCR反应条件为94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环，72℃继续延伸10min。

步骤（2）中诱导表达步骤如下：将获得的阳性菌落接种到LB液体培养基中，37℃培养过夜，将该培养物以1:100的比例转入新鲜的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.8时，分组加入IPTG使其终浓度分别为0.1mmol/L、0.3mmol/L和0.5mmol/L，37℃诱导表达4 h。

本发明的有益效果：

使用DAS-ELISA检测番茄黄化曲叶病毒，检测灵敏度高，可用于定性、定量分析，最低检测限为9.75ng/mL；此检测方法操作简单快速，可在数小时内完成；特异性强，重复性好，针对番茄黄化曲叶病毒有非常明显的免疫学反应；可靠性高，其检出准确率与PCR法非常接近；检测成本低廉，试剂用量少并可以较长时间保存，非常适合大规模的常规检测。

附图说明

图1为不同浓度IPTG诱导表达的SDS-PAGE检测结果图，其中，M为蛋白质分子质量标准，1和5为未加IPTG的细菌裂解物；2～4为使用p32a-CP的诱导表达产物，IPTG浓度依次为0.1，0.3，0.5 mmol/L；6为使用p28a-CP的诱导表达产物，IPTG浓度为0.5 mmol/L；7为使用p22b-CP的诱导表达产物，IPTG浓度为0.5 mmol/L；8为使用pE2-CP的诱导表达产物，IPTG浓度为0.5 mmol/L；

图2为TYLCV-CP基因表达产物的纯化分析图，其中，M为低分子量蛋白marker；1~2为无IPTG诱导；3~4为IPTG诱导的全菌裂解液；5为超声破碎后上清液；6为流穿收集液；7~9为目的蛋白洗脱液；

图3为重组蛋白的Western blot分析图，M为低分子量蛋白marker；1~2为目的蛋白洗脱液，3为无IPTG诱导；4为pET-32a空载体；5为0.5 mmol/L IPTG诱导的表达产物；

图4为IgG的纯化结果，M为蛋白质分子质量标准；1为未诱导的细菌裂解物：2为IPTG(0.5mmol/L)诱导的表达产物；3为纯化的IgG；

图5为酶标抗体活性曲线；

图6为建立的DAS-ELISA操作步骤图；

图7为ELISA正交试验因素水平检测结果图；

图8为检测灵敏度结果图；

图9为标准抗原浓度与吸光值的相关性图；

图10为田间病样的DAS-ELISA检测结果；

图11为5个样品不同体积提取液的检测结果图。

具体实施方式

所用到的工具酶及化学试剂来源及配制方法如下：

XhoI和EcoR I限制性内切酶、碱性磷酸酶购自宝生物工程有限公司，植物基因组DNA提取试剂盒、凝胶快速纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒、pEASY-T1 Simple克隆试剂盒、蛋白定量试剂盒等购自北京全式金生物技术有限公司，蛋白纯化柱HiTrap Chelating HP(1 mL) 、抗体纯化柱HiTrap Protein A (1 mL)均购自美国GE公司。2x Taq MasterMix、DNA Marker、中等分子量标准蛋白购自MBI公司；抗His标签单克隆抗体、HRP标记羊抗兔IgG购自北京康为世纪生物科技有限公司；IPTG、弗氏完全佐剂（货号F5881）、弗氏不完全佐剂（货号F5506）、PNPP等均购自Sigma公司。

LB液体培养基：LB培养基：胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，950mL去离子水溶解，调节pH至7.0.用去离子水定容至1L，121℃高压下蒸汽灭菌20min。

ELISA所用试剂：

包被缓冲液(碳酸盐缓冲液 0.05M pH 9.6 ) ：NaCO₃1.59g，NaHCO₃2.9g，加蒸馏水至1000mL。

PBS缓冲液：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO_4。

封闭液：牛血清白蛋白(BSA)3克溶于100mL的PBS中。

洗涤液（PBST）：Tween-20 0.5mL溶于1000mL的PBS中，混匀。

抗体稀释液：牛血清白蛋白（BSA）1g溶于洗涤液至100mL。

提取缓冲液：2gPVP-40000，1gBSA溶于洗涤液至100mL。。

底物溶液：将5mg对硝基苯磷酸二钠(PNPP)溶于7.5mL的含11.6%二乙醇胺的底物缓冲液（pH9.8）中。

载体及宿主菌：

原核表达载体pET-32a、pET-28a和pET-22b购自美国Merck公司，原核表达载体pEASY-E2和E.coli BL21 (DE3) 感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法，包括以下步骤：

（1）从感染黄化曲叶病毒病的番茄病叶中提取总DNA，并以此为模板通过PCR扩增获得TYLCV-CP基因的特异性DNA片段，其序列如序列表中序列6所示，所用引物为：

TYCP1：5’-GCG GAATTCATGTCGAAGCGACCAGGCGAT-3’，下划线为EcoRI酶切位点，

TYCP2：5’-GCG CTCGAGATTTGATATTGAATCATAG-3’，下划线为Xho I酶切位点；

（3）以纯化的目的蛋白为抗原免疫家兔，效价为1:16000时采血收集抗血清，将抗血清纯化，获得纯度为95-98%，浓度为20-24.3mg/mL的抗体IgG；

（5）以健康的幼苗为阴性对照，以感病幼苗为阳性对照，纯化的IgG进行包被后与碱性磷酸酶标记抗体IgG-AP对待检样品进行DAS-ELISA检测，最后加入PNPP配成的底物溶液进行显色；

其中IgG包被浓度为6.25μg/mL，酶标抗体稀释度为1:400；IgG包被条件为4℃过夜，封闭时间为60min，酶标抗体作用时间为120min，底物显色条件为37℃条件下30min。

一、TYLCV-CP基因特异性DNA片段的扩增

步骤（1）中，使用引物TYCP1与TYCP2进行PCR扩增，以得到TYLCV-CP基因片段的具体操作步骤是本领域普通技术人员可以不花费创造性劳动能够实现的，下面列举一下其中一种操作步骤：

PCR扩增的反应体系为：2x Taq MasterMix 12.5 μL，TYCP1 (10 pmol/L)1.0 μL， TYCP2 (10 pmol/L)1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，加双蒸水至终体积25.0 μL；

PCR反应条件为94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环，72℃继续延伸10min。

二、TYLCV-CP基因原核表达载体的构建

步骤（2）中，将步骤（1）中的PCR产物纯化后，经EcoR I和Xho I双酶切定向***到同样双酶切的pET-32a、pET-28a和pET-22b载体中，转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，在分别含有20μg/mL 氨卞青霉素（Amp）或60μg/mL卡那霉素（Kan）抗性的平板上进行培养，获得阳性菌落。

根据pEASY-E2表达载体的结构特点和TYLCV-CP基因序列，设计并合成引物TYCP3和TYCP4，PCR扩增产物直接与pEASY-E2载体相连接，转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，在含有20μg/mL Amp抗性的平板上进行培养，获得阳性菌落。所用引物为：

TYCP3:5’-ATGTCGAAGCGACCAGGCGAT-3’

TYCP4:5’-ATTTGATATTGAATCATAG-3’

分别挑取阳性克隆进行PCR和酶切鉴定（如表1所示），将连接方向正确的重组质粒分别命名为p32a-CP、p28a-CP、p22b-CP和pE2-CP。

表1 构建的各表达载体的比较表

分别将获得的阳性菌落接种到含有20μg/mL Amp或60μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃培养过夜，将该培养物以1:100的比例转入新鲜的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀约为0.8时，分组加入IPTG使其终浓度分别为0.1mmol/L、0.3mmol/L和0.5mmol/L，37℃诱导表达4 h，取1mL离心收集菌体，12%SDS-PAGE电泳检测表达结果如图1所示。

由图1可见IPTG能较好地诱导重组质粒p32a-CP中TYLCV-CP基因的表达，表达产物分子量约为50kD，是19kD硫氧还蛋白与推测的31kD的外壳蛋白分子量之和，与预期结果相符合，而且随着IPTG终浓度的增加，融合蛋白的表达量亦增加并趋向稳定；而重组质粒p28a-CP、p22b-CP和pE2-CP中TYLCV-CP基因在IPTG的诱导下虽然能表达，但其表达量非常低，即使IPTG终浓度为0.5 mmol/L时仍没有较高的表达量。

将PCR产物定向***以上几种载体之后，蛋白表达结果的差异非常明显，可以看出TYLCV-CP基因并不是在所有的载体上都能够高效表达，而通过上述筛选得到了表达效果较好的重组质粒p32a-CP，为以下的操作的可能实现奠定基础，这种表达载体选择的过程是非显而易见的，是付出了创造性劳动的。

将转有重组质粒p32a-CP的 E.coli BL21(DE3)大量培养，经IPTG诱导后超声破菌，通过分析全菌蛋白和裂解上清的电泳图谱（图2）发现，泳道5相比泳道3和4而言，菌液经超声破碎后的上清液中几乎不含有目的蛋白，说明TYLCV-CP基因的表达产物主要以包涵体的形式存在；用BANDSCAN软件对泳道4进行分析，发现其中目的蛋白的表达量约占细菌总蛋白的25%。经蛋白纯化柱HiTrap Chelating HP 纯化后，泳道7显示洗脱物中有清晰单一的特异性蛋白条带，随着纯化柱中结合蛋白量的减少，泳道8和9显示的目的蛋白量也逐渐减少，可以看出获得了高纯度的目的蛋白。

将表达产物转至硝酸纤维素膜上进行Western Blot检测，通过图3可以看出泳道2和5所表达的蛋白带位置上有明显的杂交带，而菌体蛋白带的位置（泳道3和4）没有出现杂交带；另外，泳道1中的目的蛋白含量非常少，故未出现较明显的杂交带。表明TYLCV-CP基因在E. coli BL21 (DE3)中得到了融合表达，具有良好的免疫原性。

上述表达载体的构建、大肠杆菌的转化及细菌的培养，都是本领域中惯用的技术手段，并不仅限于上述操作，只要能够将TYLCV-CP基因定向***表达载体pET-32a，实现目的蛋白的高效表达即可。

三、制备抗血清及其纯化

用PBS缓冲液将纯化的目的蛋白稀释为1mg/mL，取1mL蛋白液加入等体积弗氏完全佐剂混合研磨、乳化，并以此为抗原免疫2只健康新西兰白兔（雄性，体重2.0-2.5Kg），采取颈背部皮下多点（至少8点）注射；第二周再次进行基础免疫，剂量与第1次相同；第三周取1mL蛋白液加入等体积弗氏不完全佐剂混合研磨、乳化，进行一次加强免疫，免疫后1周于兔耳缘静脉采血测抗体效价，待到第五周颈动脉取血，分离抗血清。采用间接ELISA法检测抗血清效价，测定OD₄₅₀nm值，取P/N≥3时的抗体溶液最大稀释倍数为其效价，其中P为待检血清的吸光值，N为免疫前血清（阴性对照）的吸光值。经测定免疫的两只兔抗体效价均达到1:16000，能够满足后续试验的要求。

抗体纯化步骤也是采用本领域的常用步骤，下面介绍其中一种：

准备lmL的HiTrap Protein A 抗体纯化柱，用至少6倍柱体积的去离子水洗出保护剂溶液；然后用2倍柱体积的PBS缓冲液平衡柱，待流出液与起始缓冲液pH相同时，注入血清样品，同时收集流出液；用至少8倍柱体积的PBS缓冲液洗脱杂蛋白后加入6mL的洗脱液（0. lmol/ L, pH 3. 0柠檬酸缓冲液），收集洗脱液，每管收集1mL，加入中和液（1mol/ L Tris溶液，pH 9.0）至溶液pH为7.0；4℃于PBS缓冲液中透析过夜，测其280nm和260nm下的吸光值，计算抗体浓度；并采用SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定。

纯化的IgG在SDS-PAGE图谱上可见清晰的抗体重链和轻链带，如图4所示，通过Bandscan 5.0软件分析泳道3可知其纯度高达95-98%。紫外吸收法测得纯化抗体在280nm和260nm下的吸光值，得出其浓度分别为24.3mg/mL（1号兔）和20mg/mL（2号兔）。

四、酶标抗体IgG-AP的制备

采用戊二醛一步法标记抗体，具体步骤为：将1mg纯化的1号兔或2号兔IgG与800IU的碱性磷酸酶混匀，加PBS缓冲液到0.5mL；在其混合液中加入4μL 25%戊二醛，室温放置2h，每30min上下颠倒一次；4℃中用PBS缓冲液透析过夜；透析物转移至新的离心管中，加入5mg牛血清白蛋白（BSA），4℃保存备用。紫外吸收法计算其中IgG的浓度，并采用直接ELISA检测酶标抗体活性，以能产生吸光值约为1.0的稀释度为结合物的最适浓度。

经紫外分光光度计检测，得出标记物中IgG浓度为0.822～1.145mg/mL；ELISA检测结果（如图5所示）表明酶标抗体的稀释度为1:800时其吸光值约为1.0，可见该酶标抗体IgG-AP具有较强的抗原结合活性与酶活性。

五、最佳工作浓度及检测条件的优化

采用ELISA方阵试验。将IgG用包被缓冲液稀释成100 μg/mL,然后倍比稀释至1.56 μg/mL，150 μL/孔加至酶标板，4℃过夜；洗板后加入封闭液进行封闭，200 μL/孔，37℃孵育1.5h，洗涤3次；以1 μg/mL的外壳蛋白为阳性对照，1%BSA/PBST作阴性对照，100 μL/孔，37℃孵育1h，洗涤3次；将酶标抗体作1:25至1:1600倍比稀释，100 μL/孔，37℃孵育2h，洗涤3次；加入新鲜配制的底物溶液，100μL/孔，37℃放置30min，于405nm波长下测各孔的吸光值，以阳性对照约为1.0，阴性对照小于0.1，且P/N≥2的条件作最适条件，以此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。具体操作步骤如图6所示。

ELISA方阵试验结果如表2所示，随着包被抗体浓度和酶标抗体工作浓度的增加，阳性及阴性OD值都呈上升趋势。为了提高检测灵敏度和特异性，最终确定DAS-ELISA的最佳工作浓度为酶标抗体作1:400倍稀释，IgG包被浓度为6.25 μg/mL。

表2 不同包被浓度和酶标抗体作用浓度对方阵ELISA的结果（P/N）

在包被抗体和酶标抗体最适浓度确定的情况下，对IgG包被条件、封闭时间、酶标抗体作用时间和底物显色条件设计四因素三水平正交试验，如下表3所示，并用DPS数据处理软件对其进行分析，从而筛选出DAS-ELISA的最佳检测条件。

表3 ELISA正交试验因素水平表

水平	IgG包被条件（A）	封闭时间（B）	酶标抗体作用时间（C）	底物显色条件（D）
					1	4℃、过夜	30 min	90 min	室温、60 min
2	37℃、1h	60 min	120 min	37℃、30 min
					3	37℃、3h	90 min	150 min	37℃、60 min

表4 四因素三水平九个组合列表

处理号	因素A	因素B	因素C	因素D
					1	A1	B1	C1	D1
2	A1	B2	C2	D2
					3	A1	B3	C3	D3
4	A2	B1	C2	D3
					5	A2	B2	C3	D1
6	A2	B3	C1	D2
					7	A3	B1	C3	D2
8	A3	B2	C1	D3
					9	A3	B3	C2	D1

在IgG包被浓度和酶标抗体工作浓度选用最佳值时，采用表4中的九个处理进行检测，得到P、N及P/N（如图7），可以看出2号处理的P/N值最大，因此确定IgG包被条件为4℃过夜，封闭时间为60min，酶标抗体作用时间为120min，底物显色条件为37℃条件下30min。用DPS对上述正交试验的结果进行方差分析，结果见表5。由表可以看出，IgG包被条件、酶标抗体作用时间及底物显色条件对DAS-ELISA试验结果的影响达到极显著水平（P＜0.01），该试验条件下，封闭时间的影响达到显著水平（P＜0.05）。

表5 正交试验优化DAS-ELISA结果方差分析表

变异来源	平方和	自由度	均方	F值	p-值
						IgG包被条件	1.5781	2	0.7891	401.3580	0.0001**
封闭时间	0.0234	2	0.0117	5.9565	0.0117*
						酶标抗体作用时间	0.1099	2	0.0549	27.9407	0.0001**
底物显色条件	0.1731	2	0.0865	44.0132	0.0001**
						误差	0.0315	16	0.0020
总和	1.9304

注：*为显著(P＜0.05),**为极显著水平（P＜0.01）

六、抗原最低检出量的确定

将纯化的外壳蛋白作系列倍比稀释，确定该方法的最低检出量，检测结果如图8所示，随着抗原浓度的降低，ELISA检测的吸光度值也随之下降，最终确定本方法对抗原的最低检出浓度为9.75ng/mL（取P/N＞2作为阳性判断标准），其线性检测范围在9.75ng/mL-5000ng/mL之间。数据分析结果如图9，回归方程为y = 0.0001x + 0.3449，相关系数R²=0.9501，可见标准抗原浓度与其OD值显著相关，表明双抗夹心法ELISA定量测定病毒含量是可行的。

检测效果验证

1、定性检测

从寿光市蔬菜研究院番茄种植基地及寿光市稻田镇、田柳镇的番茄种植区采集不同程度感染番茄黄化曲叶病毒的植株，液氮冷冻后保存于-80℃。从中选取10份样品，每份称取1 g病叶，加入2 mL提取缓冲液，于研钵中匀浆。4 ℃，10,000 rpm离心 5 min，吸取上清液100μL加入各样品孔中，采用已建立的DAS-ELISA体系对其进行检测，同时设空白对照、阴性对照（健康植株）和阳性对照（外壳蛋白纯化液），每个处理设3个重复。测定OD₄₀₅值，设P为感病样品吸光值，N为阴性对照吸光值，取P/N＞2作为阳性判断标准。检测结果见图10，通过比较发现，样品的外观表现症状与测得的OD₄₀₅值基本一致：发病重的植株其对应的OD值也偏大，反之较小。该实验说明建立的DAS-ELISA方法可以用于番茄黄化曲叶病毒的定性检测。

2、定量检测

从上述处理的样品中任取5个，每个样品分别取160 μL，80 μL，40 μL，20 μL，10 μL，5 μL，2.5 μL，1.25 μL，0.625 μL的提取液依次加入待测孔中，采用上述同样的DAS-ELISA法进行检测，测定OD₄₀₅值。通过加入不同体积的样品提取液来改变其中的病毒含量，检测结果如图11所示，数据处理结果显示OD值与样品提取液的加入体积有良好的线性关系（如表6），其相关系数都较高且较为稳定，可见该DAS-ELISA法可以用于番茄黄化曲叶病毒的定量测定。

表6样品提取液的加入体积与OD₄₀₅值的线性关系

3、检测准确性

为了检验本发明方法的准确性，从采集的感染番茄黄化曲叶病毒的病叶中选取80份样品，分别提取植物总DNA，并以此为模板，利用双生病毒简并引物PA/PB分别进行PCR检测；同样用建立的DAS-ELISA方法也分别进行检测，分析比较检测结果，观察ELISA方法的可靠性。PCR法和DAS-ELISA法的检出阳性率分别为100%和97.5% （78/80），可见这两种方法的检测准确率非常接近，同时也证明了DAS-ELISA有较高的可靠性；另外，DAS-ELISA法较PCR法检测时间短，数小时内即可完成。通过综合分析比较，虽然PCR法有相对较高的准确率，但技术及设备的高要求限制了该法不适合大量样品的田间检测，而DAS-ELISA法的快捷及操作程序简单灵活等优点更适宜作为一种常规检测手段进行推广应用。

<110>潍坊科技学院，山东农业大学，山东省蔬菜工程技术研究中心

<120>一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法

<160>6

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>1

GCGGAATTCA TGTCGAAGCG ACCAGGCGAT 30

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>2

GCGCTCGAGA TTTGATATTG AATCATAG 28

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>3

ATGTC GAAGC GACCA GGCGA T 21

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<440>4

ATTTG ATATT GAATC ATAG 19

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>5

TAATACGACT CACTATAGGG 20

<210>6

<211>774

<212>DNA

<213>番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)

<220>

<221>CDS

<222>（1）...（774）

<400>6

atgtcgaagc gaccaggcga tataatcatt tccacacccg cctcgaaggt tcgccgaagg 60

ctgaacttcg acagcccata cagcagccgt gctgctgtcc ccattgtcca aggcacaaac 120

aagcgacgat catggacgta caggcccatg taccggaagc ccagaatata cagaatgtat 180

cgaagccctg atgttcctcg tggatgtgaa ggcccatgta aagtccagtc ttatgagcaa 240

cgggatgata ttaagcatac tggtattgtt cgttgtgtta gtgatgttac tcgtggatct 300

ggaattactc acagagtggg taagaggttc tgtgttaaat cgatatattt tttaggtaaa 360

gtctggatgg atgaaaatat taagaggcag aatcacacta atcaggtcat gttcttcttg 420

gttcgtgata gaaggcctta tggaaacagt ccaatggatt ttggacaggt ttttaatatg 480

ttcgataatg agcccagtac cgcaaccgtg aagaatgatt tgcgggatag gtttcaagtg 540

atgaggaaat ttcatgctac agttattggt gggccctctg gaatgaagga acaggcatta 600

gttaagagat tttttagaat taacagtcat gtaacttata atcatcagga ggcagccaag 660

tatgagaacc atactgaaaa cgccttgtta ttgtatatgg catgtacgca tgcctctaat 720

ccagtgtatg caactatgaa aatacgcatc tatttctatg attcaatatc aaat 774

Claims

1.一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征是包括以下步骤：

（2）将TYLCV-CP基因片段与表达载体pET-32a连接，转化受体菌E.coliBL21(DE3)获得抗性菌落，筛选出阳性克隆，然后在含有0.1-0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的条件下进行诱导表达，离心收集菌体，菌体破碎后纯化目的蛋白；

（5）以健康的幼苗为阴性对照，以感病幼苗为阳性对照，纯化的IgG包被后与碱性磷酸酶标记抗体IgG-AP对待检样品进行DAS-ELISA检测，最后加入PNPP配成的底物溶液进行显色；其中IgG包被浓度为6.25μg/mL，酶标抗体稀释度为1:400；

IgG包被条件为4℃过夜，封闭时间为60min；

酶标抗体作用时间为120min，底物显色条件为37℃条件下30min；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记时，将1mg纯化的IgG与800IU的碱性磷酸酶混匀，加PBS缓冲液到0.5mL；在其混合液中加入4μL 25%戊二醛，室温放置2h，每30min上下颠倒一次；4℃中用PBS缓冲液透析过夜，透析物转移至离心管中，加入5mg牛血清白蛋白，4℃保存备用。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤（2）纯化目的蛋白为使用蛋白纯化柱HiTrap Chelating HP 纯化。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于抗血清纯化时使用抗体纯化柱：l mL的HiTrap Protein A 抗体纯化柱。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于TYLCV-CP基因的PCR扩增反应体系为：2x Taq MasterMix 12.5 μL，10 pmol/L的 TYCP1 1.0 μL，10 pmol/L 的TYCP2 1.0 μL，模板DNA 1.0μL，加双蒸水至终体积25.0 μL；PCR反应条件为94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环，72℃继续延伸10min。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤（2）中诱导表达步骤如下：将获得的阳性菌落接种到LB液体培养基中，37℃培养过夜，将该培养物以1:100的比例转入新鲜的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.8时，分组加入IPTG使其终浓度分别为0.1mmol/L、0.3mmol/L和0.5mmol/L，37℃诱导表达4 h。