CN105548543A - 一种花生黄色斑点病毒检测试剂盒及其检测方法与应用 - Google Patents
一种花生黄色斑点病毒检测试剂盒及其检测方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种花生黄色斑点病毒检测试剂盒及其检测方法与应用。花生黄色斑点病毒检测试剂盒包括盒体、硝酸纤维素膜、显色液试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶；所述的显色液试剂瓶包括显色试剂瓶A和显色液试剂瓶B；所述的抗体试剂瓶包括一抗试剂瓶和二抗试剂瓶；所述的对照试剂瓶包括GYSV标准阳性对照试剂瓶和GYSV标准阴性对照试剂瓶。应用为所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒在检测花生黄色斑点病毒中的应用。
Description
技术领域
本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种花生黄色斑点病毒检测试剂盒及其检测方法与应用。
背景技术
花生黄色斑点病毒（Groundnutyellowspotvirus，GYSV）属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）成员。GYSV最早在印度花生上报道，随后在云南辣椒上也发现该病毒，该病毒在花生和辣椒上的症状均表现为初期叶片上有黄色斑点，后期黄色斑点逐渐扩大成为坏死斑块，辣椒果实上的症状主要表现为黄化和坏死斑块。GYSV在云南辣椒上检出率不高，主要原因可能与该病毒只能由茶黄硬蓟马传播，而茶黄硬蓟马在云南报道尚少，但是一旦具备适宜的条件该病毒也能大面积爆发，引起辣椒等作物的产质量损失，因此研究并获得一种快速鉴定该病毒病原的检测方法对于该病害的防控技术具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种花生黄色斑点病毒检测试剂盒；第二目的在于提供所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒的检测方法；第三目的在于提供所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，包括盒体、硝酸纤维素膜、显色液试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶；
所述的显色液试剂瓶包括显色试剂瓶A和显色液试剂瓶B；
所述的抗体试剂瓶包括一抗试剂瓶和二抗试剂瓶；
所述的对照试剂瓶包括GYSV标准阳性对照试剂瓶和GYSV标准阴性对照试剂瓶。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
1）根据检测样品数量剪下硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜的一角剪去，用以指示膜方向。
2）检测样品加入洗涤缓冲液研磨，移液器取2.5μl研磨液点至硝酸纤维膜方框中，同时点上标准阳性对照和标准阴性对照，室温放置或37℃放置至膜彻底干燥；
3）将膜移至容器，加入封闭缓冲液，室温或37℃封闭1h；
4）在封闭缓冲液中加入一抗，室温摇床摇匀，37℃培育1h或4℃培育过夜；
5）弃去一抗培育液，洗涤缓冲液洗膜3次，每次5min；
6）弃去洗涤缓冲液，加入封闭缓冲液，再在封闭缓冲液中加入二抗，室温摇床摇匀，37℃培育1h或4℃培育过夜；
7）弃去二抗培育液，洗涤缓冲液洗膜3次，每次5min；
8）弃去洗涤缓冲液，显色缓冲液洗膜1次，每次5min；
9）弃去显色缓冲液，加入显色液黑暗处显色，充分显色后将膜移至清水中终止显色，分析并记录检测结果。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒在检测花生黄色斑点病毒中的应用。
本发明的优点：
通过原核表达的方法制备了云南辣椒上新topoviruses分离物花生黄色斑点病毒N蛋白，免疫家兔获得了高效价的花生黄色斑点病毒兔抗血清，优化并组装了该新分离物的dot-ELISA检测试剂盒，并应用于田间样品的快速检测，通过该试剂盒的研制，可快速、准确、大量的检测田间疑似样品中携带花生黄色斑点病毒的带毒情况，为病害防控提供检测技术保障。
附图说明
图1为辣椒植株上GYSV的检测点样图；
图2为辣椒植株上GYSV的检测检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的花生黄色斑点病毒花生黄色斑点病毒（Groundnutyellowspotvirus，GYSV）检测试剂盒，包括盒体、硝酸纤维素膜、显色液试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶；
所述的显色液试剂瓶包括显色试剂瓶A和显色液试剂瓶B；
所述的抗体试剂瓶包括一抗试剂瓶和二抗试剂瓶；
所述的对照试剂瓶包括GYSV标准阳性对照试剂瓶和GYSV标准阴性对照试剂瓶。
所述的硝酸纤维素膜设有方格，方格中空白处用以点样。
所述的显色液试剂瓶A含有NBT显色液；显色液试剂瓶B含有BCIP显色液。
所述的NBT显色液是将0.5gNBT溶于10ml70%的二甲基甲酰胺；BCIP显色液是将0.5gBCIP溶于10ml100%的二甲基酰胺。
所述的一抗试剂瓶含有花生黄色斑点病毒特异性多克隆抗体；二抗试剂瓶含有特异性羊抗兔。
所述的含有花生黄色斑点病毒特异性克隆抗体的制备是采用其N基因原核表达的方法得到免疫源，免疫家兔获得，使用效价为1:500～20000；花生黄色斑点病毒N基因PCR扩增引物根据丁铭（Ding.M.）注册报道的GYSV甜椒分离物N基因全序列设计（注册号为：EF528556），引物序列及其退火温度具体见下表：
所述的GYSV标准阳性对照试剂瓶含有感染GYSV的本氏烟植物干粉；GYSV标准阴性对照试剂瓶含有健康本氏烟植物干粉。
本发明所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1）根据检测样品数量剪下硝酸纤维素膜（例如检测样品有5个，加1个阳性对照和1个阴性对照，应剪7个方格的硝酸纤维素膜），将硝酸纤维素膜的一角剪去，用以指示膜方向。
2）检测样品加入洗涤缓冲液研磨（1:10~50倍w/v），移液器取2.5μl研磨液点至硝酸纤维膜方框中，同时点上标准阳性对照和标准阴性对照，室温放置或37℃放置至膜彻底干燥；
3）将膜移至适当容器，加入适量封闭缓冲液（根据膜转入容器确定，例如直径为20cm的培养皿加入25ml封闭缓冲液），室温或37℃封闭1h；
4）在封闭缓冲液中加入一抗（加入量根据一抗使用说明书算得），室温摇床摇匀，37℃培育1h或4℃培育过夜；
5）弃去一抗培育液，适量洗涤缓冲液洗膜3次，每次5min（摇床匀摇）；
6）弃去洗涤缓冲液，加入适量封闭缓冲液，再在封闭缓冲液中加入二抗（加入量根据二抗使用说明书算得），室温摇床摇匀，37℃培育1h或4℃培育过夜；
7）弃去二抗培育液，适量洗涤缓冲液洗膜3次，每次5min（摇床匀摇）；
8）弃去洗涤缓冲液，适量显色缓冲液洗膜1次，每次5min（摇床匀摇）；
9）弃去显色缓冲液，加入适量显色液（按显色液试剂瓶A和显色液试剂瓶B说明书配制）黑暗处显色，充分显色后将膜移至清水中终止显色。分析并记录检测结果。
本发明所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒的应用为所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒在检测花生黄色斑点病毒中的应用。
结果分析方法：
标准阳性对照斑点变为红色、***或黑色，标准阴性对照斑点不变色，表明实验过程正确无误。检测样品斑点变为红色、***或黑色表明该样品带有GYSV，计作阳性样品；检测样品斑点不变色表明该样品不带有GYSV，计作阴性样品。
洗涤缓冲液配方（1L）：
封闭缓冲液配方：
洗涤缓冲液按质量体积比（W/V）加入5%脱脂奶粉混匀。
显色缓冲液配方(100ml)：
显色液配制方法：
每10ml显色缓冲液中加入66μl显色液A和33μl显色液B混匀。
显色液A配方：0.5gNBT溶于10ml70%的二甲基甲酰胺。
显色液B配方：0.5gBCIP溶于10ml100%的二甲基甲酰胺。
一抗试剂瓶使用说明:一抗试剂瓶保存在4℃，使用效价为1:3000。
二抗试剂瓶使用说明:二抗试剂瓶保存在4℃，使用效价为1:8000。
对照试剂瓶使用说明：使用前加入2ml洗涤缓冲液混匀。
本发明所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒设有盒体、硝酸纤维素膜、显色液试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶和检测试剂盒说明书，所述硝酸纤维素膜、显色液试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶和检测试剂盒说明书设在盒体内。制备方法：1）制备硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上划有方格，方格中空白处用以点样；2）制备显色液试剂瓶，所述显色液试剂瓶包括显色液试剂瓶A和显色液试剂瓶B；3）制备抗体试剂瓶，所述抗体试剂瓶包括一抗试剂瓶和二抗试剂瓶，所述一抗为花生黄色斑点病毒特异性多克隆抗体，采用花生黄色斑点病毒N基因原核表达的方法得到免疫源，免疫家兔获得，使用效价为1:500～20000；所述二抗为特异性羊抗兔；4）制备对照试剂瓶，所述对照试剂瓶包括GYSV标准阳性对照试剂瓶和GYSV标准阴性对照试剂瓶；5）制备检测试剂盒说明书，所述检测试剂盒说明书包括检测方法，洗涤缓冲液配方、封闭缓冲液配方、显色缓冲液配方、显色液配制方法、一抗试剂瓶使用说明、二抗试剂瓶使用说明和对照试剂瓶使用说明。所述花生黄色斑点病毒检测试剂盒可在检测花生黄色斑点病毒中应用。具体包括：
A、花生黄色斑点病毒检测试剂盒：花生黄色斑点病毒检测试剂盒设有盒体、硝酸纤维素膜、显色液试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶和检测试剂盒说明书，所述硝酸纤维素膜、显色液试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶和检测试剂盒说明书设在盒体内。
B、花生黄色斑点病毒检测试剂盒制备方法：
1）制备硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上划有方格，方格中空白处用以点样；
2）制备显色液试剂瓶，所述显色液试剂瓶包括显色液试剂瓶A和显色液试剂瓶B；
3）制备抗体试剂瓶，所述抗体试剂瓶包括一抗试剂瓶和二抗试剂瓶，所述一抗为花生黄色斑点病毒特异性多克隆抗体，采用花生黄色斑点病毒N基因原核表达的方法得到免疫源，免疫家兔获得，使用效价为1:500～20000；所述二抗为特异性羊抗兔；
4）制备对照试剂瓶，所述对照试剂瓶包括GYSV标准阳性对照试剂瓶和GYSV标准阴性对照试剂瓶；
5）制备检测试剂盒说明书，所述检测试剂盒说明书包括检测方法，洗涤缓冲液配方、封闭缓冲液配方、显色缓冲液配方、显色液配制方法、一抗试剂瓶使用说明、二抗试剂瓶使用说明和对照试剂瓶使用说明。
具体为：
所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒设有盒体、硝酸纤维素膜、显色液试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶和检测试剂盒说明书，所述硝酸纤维素膜、显色液试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶和检测试剂盒说明书设在盒体内。具体包括：
A、硝酸纤维素膜。膜上划有方格，方格中空白处用以点样。
B、显色液试剂瓶，所述显色液试剂瓶包括显色液试剂瓶A和显色液试剂瓶B。显色液试剂瓶A含有1mlNBT显色液；显色液试剂瓶B含有500μlBCIP显色液。
C、抗体试剂瓶，所述抗体试剂瓶包括一抗试剂瓶和二抗试剂瓶。一抗试剂瓶含有500μl花生黄色斑点病毒特异性多克隆抗体，采用花生黄色斑点病毒N基因原核表达的方法得到免疫源，免疫家兔获得，使用效价为1:500～20000；二抗试剂瓶含有500μl特异性羊抗兔。
D、对照试剂瓶，所述对照试剂瓶包括GYSV标准阳性对照试剂瓶和GYSV标准阴性对照试剂瓶。GYSV标准阳性对照试剂瓶含有1g带GYSV的本氏烟植物干粉；GYSV标准阴性对照试剂瓶含1g健康本氏烟植物干粉。
E、检测试剂盒说明书。检测试剂盒说明书包括检测方法，洗涤缓冲液配方、封闭缓冲液配方、显色缓冲液配方、显色液配制方法、一抗试剂瓶使用说明、二抗试剂瓶使用说明和对照试剂瓶使用说明。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
辣椒植株上GYSV的检测
一、按说明书配制以下缓冲液及试剂：
1.洗涤缓冲液配制：称取NaCl8g，K2HPO40.2g，Na2HPO4·12H2O7.2g，KCl0.2g溶解于1L蒸馏水中，调pH值至7.4，加0.1%吐温20混匀。
2.封闭缓冲液配制：量取100ml洗涤缓冲液，加入5g脱脂奶粉搅拌混匀。
3.对照试剂瓶配制：GYSV标准阳性对照试剂瓶和GYSV标准阴性对照试剂瓶分别加入2ml洗涤缓冲液混匀。
4.配制1mol/LTris-HCl（pH9.5）：称取12gTris溶于100ml蒸馏水中搅拌混匀，调pH值至9.5。
5.配制1mol/LNaCl：称取5.8gNaCl溶于100ml蒸馏水中搅拌混匀。
6.配制1mol/LMgCl2：称取20.3gMgCl2溶于100ml蒸馏水中搅拌混匀。
7.显色缓冲液配制：量取预先配制好的1mol/LTris-HCl（pH9.5）10ml，1mol/LNaCl10ml，1mol/LMgCl20.5ml至200ml烧杯中，补足蒸馏水至100ml混匀。
二、取22个辣椒叶片1～3g至加厚塑料自封袋中磨碎，均加入适量洗涤缓冲液混匀备用。
三、剪8个方格的硝酸纤维素膜至于直径为5.5cm的培养皿中，移液器取2.5μl研磨液点至硝酸纤维膜方框中，同一样品上下个点一点，最后点上阳性对照和阴性对照，37℃放置至膜彻底干燥。
四、加入5ml封闭缓冲液37℃封闭1h。
五、在封闭缓冲液中加入1.7μl一抗，室温摇床摇匀，37℃培育1h。
六、弃去一抗培育液，适量洗涤缓冲液水平摇床洗膜3次，每次5min。
七、弃去洗涤缓冲液，加入5ml封闭缓冲液，再在封闭缓冲液中加入0.7μl二抗，室温摇床摇匀，37℃培育1h。
八、弃去二抗培育液，适量洗涤缓冲液水平摇床洗膜3次，每次5min。
九、弃去洗涤缓冲液，适量显色缓冲液水平摇床洗膜1次，每次5min。
十、配制显色液：量取5ml显色缓冲液，加入33μl显色液A和16.5μl显色液B混匀。
十一、弃去显色缓冲液，加入5ml显色液在黑暗处显色，显色至阳性对照斑点变色，再延时10min后将膜转移到清水中终止显色。
十二、结果分析：标准阳性对照斑点变为***，标准阴性对照斑点不变色，表明实验过程正确无误。编号为3、5、6、9、11、14、20的检测样品斑点变为***，表明样品带有GYSV，计作阳性样品；其余样品斑点不变色表明该样品不带有GYSV，计作阴性样品。
检测结果见表1、表2和附图1、附图2；
表1辣椒植株上GYSV的检测样品记录表
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |
| 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |
| 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 阳性对照 | 阴性对照 |
| 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 阳性对照 | 阴性对照 |
表2辣椒植株上GYSV的检测结果统计表
| 样品编号 | 检测结果 |
| 1 | - |
| 2 | - |
| 3 | + |
| 4 | - |
| 5 | + |
| 6 | + |
| 7 | - |
| 8 | - |
| 9 | + |
| 10 | - |
| 11 | + |
| 12 | - |
| 13 | -6 --> |
| 14 | + |
| 15 | - |
| 16 | - |
| 17 | - |
| 18 | - |
| 19 | - |
| 20 | + |
| 21 | - |
| 22 | - |
| 阳性对照 | + |
| 阴性对照 | - |
注：表中“+”表示阳性，即检测样品中带有所测病毒；“—”表示阴性，即检测样品中不带有所测病毒。
SEQUENCELISTING
<110>云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所
<120>一种花生黄色斑点病毒检测试剂盒及其检测方法与应用
<130>2016
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<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>35
<212>DNA
<213>特异性反向引物
<400>1
acgcgtcgactcacagctctccgctgcctatagct35
<210>2
<211>61
<212>DNA
<213>特异性正向引物
<400>2
cgcggatccatgtctacaaaaggcgttattaaagacgcgtcgactcagaatccttgattc60
t61
Claims (9)
1.一种花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于包括盒体、硝酸纤维素膜、显色液试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶；
所述的显色液试剂瓶包括显色试剂瓶A和显色液试剂瓶B；
所述的抗体试剂瓶包括一抗试剂瓶和二抗试剂瓶；
所述的对照试剂瓶包括GYSV标准阳性对照试剂瓶和GYSV标准阴性对照试剂瓶。
2.根据权利要求1所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于所述的硝酸纤维素膜设有方格，方格中空白处用以点样。
3.根据权利要求1所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于所述的显色液试剂瓶A含有NBT显色液；显色液试剂瓶B含有BCIP显色液。
4.根据权利要求3所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于所述的NBT显色液是将0.5gNBT溶于10ml70%的二甲基甲酰胺；BCIP显色液是将0.5gBCIP溶于10ml100%的二甲基酰胺。
5.根据权利要求1所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于所述的一抗试剂瓶含有花生黄色斑点病毒特异性多克隆抗体；二抗试剂瓶含有特异性羊抗兔。
6.根据权利要求5所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于所述的含有花生黄色斑点病毒特异性克隆抗体的制备是采用其N基因原核表达的方法得到免疫源，免疫家兔获得，使用效价为1:500～20000；花生黄色斑点病毒N基因PCR扩增引物根据丁铭（Ding.M.）注册报道的GYSV甜椒分离物N基因全序列设计（注册号为：EF528556），引物序列及其退火温度具体见下表：
。
7.根据权利要求1所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒，其特征在于所述的GYSV标准阳性对照试剂瓶含有感染GYSV的本氏烟植物干粉；GYSV标准阴性对照试剂瓶含有健康本氏烟植物干粉。
8.一种权利要求1~7任一所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1）根据检测样品数量剪下硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜的一角剪去，用以指示膜方向。
2）检测样品加入洗涤缓冲液研磨，移液器取2.5μl研磨液点至硝酸纤维膜方框中，同时点上标准阳性对照和标准阴性对照，室温放置或37℃放置至膜彻底干燥；
3）将膜移至容器，加入封闭缓冲液，室温或37℃封闭1h；
4）在封闭缓冲液中加入一抗，室温摇床摇匀，37℃培育1h或4℃培育过夜；
5）弃去一抗培育液，洗涤缓冲液洗膜3次，每次5min；
6）弃去洗涤缓冲液，加入封闭缓冲液，再在封闭缓冲液中加入二抗，室温摇床摇匀，37℃培育1h或4℃培育过夜；
7）弃去二抗培育液，洗涤缓冲液洗膜3次，每次5min；
8）弃去洗涤缓冲液，显色缓冲液洗膜1次，每次5min；
9）弃去显色缓冲液，加入显色液黑暗处显色，充分显色后将膜移至清水中终止显色，分析并记录检测结果。
9.一种权利要求1~7任一所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒的应用，其特征在于所述的花生黄色斑点病毒检测试剂盒在检测花生黄色斑点病毒中的应用。
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