CN102409089A - 检测dna样品中预定位点的突变的试剂盒、方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测DNA样品中预定位点的突变的引物、试剂盒、方法及应用。检测DNA样品中预定位点的突变的方法包括以下步骤：使用扩增引物对DNA样品进行PCR扩增反应，使用延伸引物以及ddNTP，以所述扩增产物为模板，进行寡核苷酸延伸反应，以便获得在所述延伸引物的3’端连接一个碱基的延伸产物；以及基于延伸产物的分子量，确定所述预定位点的突变类型。可以有效地确定在预定位点是否发生了突变，以及所发生突变的类型。
Description
技术领域
本发明涉及检测DNA样品中预定位点的突变的试剂盒、引物组合、方法及应用。
背景技术
在特定位点形成突变是分子生物学实验中常用的研究手段，可以有助于分析特定位点的点突变对于基因功能的作用。通常而言，在构建了目标突变体后，如何对该位点是否正确发生了突变，是本领域技术人员所面临的问题。
然而，目前分子生物学领域中，对于特定位点突变的检测仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效检测DNA样品中预定位点的突变的方法。
根据本发明的第一方面，本发明提出了一种检测DNA样品中预定位点的突变的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：使用扩增引物对所述DNA样品进行PCR扩增反应，以便获得扩增产物，所述扩增产物包含所述预定位点；使用延伸引物以及ddNTP，以所述扩增产物为模板，进行寡核苷酸延伸反应，以便获得在所述延伸引物的3’端连接一个碱基的延伸产物，其中，所述延伸引物的3’端紧邻所述预定位点；对所述延伸产物进行分子量检测，以便获得所述延伸产物的分子量；以及基于所述延伸产物的分子量，确定所述预定位点的突变类型。由于延伸反应是以包含预定位点的扩增产物为模板，并且进行延伸反应的延伸引物的3’端紧邻所述预定位点，并且在进行延伸反应时使用ddNTP作为原料，因而可以保证延伸反应可以仅延伸一个碱基，即对应预定的位点，基于各个不同碱基的分子量存在较为显著的区别，因而，通过对延伸产物的分子量进行检测，可以通过所获得的延伸产物的分子量，来确定在预定位点是否发生了突变，以及所发生突变的类型。由此，可以广泛应用于分子生物领域，例如检测是否成功构建了相应的突变体。
根据本发明的实施例，上述检测DNA样品中预定位点的突变的方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例，所述DNA样品为人全基因组DNA。由此，可以有效地对人类中的基因突变进行检测。
根据本发明的一个实施例，所述预定位点的突变为选自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一种基因的突变。由此，可以有效地检测与耳聋相关的基因突变。
根据本发明的一个实施例，所述GJB2基因的突变为选自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一种，所述GJB3基因的突变为选自位点538C＞T和547G＞A的至少一种，所述SLC26A4基因的突变为选自281C＞T、589G＞A、919-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G和IVS15+5G＞A的至少一种，以及所述mt DNA的突变为选自1494C＞T和1555A＞G的至少一种。由此，可以有效地检测遗传性耳聋相关的基因突变。
根据本发明的一个实施例，所述扩增引物包括第一引物和第二引物，其中，针对所述GJB2基因的35delG突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：1所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：2所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：33所示；针对所述GJB2基因的167delT突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：3所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：4所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：34所示；针对所述GJB2基因的176-191del16突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：5所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：6所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：35所示；针对所述GJB2基因的299_300delAT突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：7所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：8所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：36所示；针对所述GJB2基因的235delC突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：9所示，所述第二引物为如SEQID NO：10所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：37所示；针对所述GJB3基因的538C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：11所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：12所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：38所示；针对所述GJB3基因的547G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：13所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：14所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：39所示；针对所述SLC26A4基因的281C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：15所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：16所示，所述延伸引物为如SEQID NO：40所示；针对所述SLC26A4基因的589G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：17所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：18所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：41所示；针对所述SLC26A4基因的919-2A＞G突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：19所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：20所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：42所示；针对所述SLC26A4基因的1174A＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：21所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：43所示；针对所述SLC26A4基因的1226G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：21所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：44所示；针对所述SLC26A4基因的1229C＞T突变，所述第一引物为如SEQID NO：21所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：45所示；针对所述SLC26A4基因的1975G＞C突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：25所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：26所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：47所示；针对所述SLC26A4基因的2027T＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：25所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：26所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：48所示；针对所述SLC26A4基因的2162C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：27所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：28所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：49所示；针对所述SLC26A4基因的2168A＞G突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：27所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：28所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：50所示；针对所述SLC26A4基因的IVS15+5G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：23所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：24所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：46所示；针对所述mtDNA基因的1494C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：29所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：30所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：51所示；以及针对所述mt DNA基因的1555A＞G突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：31所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：32所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：52所示。
为方便表述，将上述引物组合分别总结与下表1和2中。
表1：针对上述20个耳聋基因突变位点的扩增引物。
*：对于每一个突变类型，自上至下，分别为各扩增引物对(在本文中有时也称为扩增引物)的第一引物(有时也称为上游引物)和第二引物(有时也称为下游引物)。
**：根据本发明的一个实施例，在扩增引物的第一引物和第二引物5′端还可以都具有10个碱基acgttggatg(SEQ ID NO：53)的标签序列，发明人发现，通过采用上述标签序列，可以使得上述第一引物和第二引物的分子量不在质谱的检测范围内，由此，能够进一步提高检测的精确度和效率。
表2：针对上述20个耳聋基因突变位点的延伸引物。
| 序列编号 | 引物序列 | 引物说明 |
| SEQ ID NO：33 | TTTGTTCACACCCCC | 位点35delG的延伸引物 |
| SEQ ID NO：34 | gggcCTTTGTCTGCAACACCC | 位点167delT的延伸引物 |
| SEQ ID NO：35 | ctccGCAACACCCTGCAGCCAG | 位点176_191del16的延伸引物 |
| SEQ ID NO：36 | gcTGAACTTCCTCTTCTTCTC | 位点299_300delAT的延伸引物 |
| SEQ ID NO：37 | ggATCCTGCTATGGGCC | 位点235delC的延伸引物 |
| SEQ ID NO：38 | ccctaGTGGACTGCTACATTGCC | 位点538C＞T的延伸引物 |
| SEQ ID NO：39 | ctgcAGTAGGTGAAGATTTTCTTCT | 位点547G＞A的延伸引物 |
| SEQ ID NO：40 | GTCATTTCGGGAGTTAGTA | 位点281C＞T的延伸引物 |
| SEQ ID NO：41 | CTTGTAAGTTCATTACCTGTATAATTC | 位点589G＞A的延伸引物 |
| SEQ ID NO：42 | GCAGTAGCAATTATCGTC | 位点919-2A＞G的延伸引物 |
| SEQ ID NO：43 | GCCTTTGGGATCAGC | 位点1174A＞T的延伸引物 |
| SEQ ID NO：44 | CACCACTGCTCTTTCCC | 位点1226G＞A的延伸引物 |
| SEQ ID NO：45 | ttCCACCACTGCTCTTTCCCCCA | 位点1229C＞T的延伸引物 |
| SEQ ID NO：46 | AAAACAAATTTCTAGGGATAAAATA | 位点IVS15+5G＞A的延伸引物 |
| SEQ ID NO：47 | CTCCACAGTCAAGCA | 位点1975G＞C的延伸引物 |
| SEQ ID NO：48 | AGAACCTTACCACCCGC | 位点2027T＞A的延伸引物 |
| SEQ ID NO：49 | CAGAGTATAGCATCAAGGACC | 位点2162C＞T的延伸引物 |
| SEQ ID NO：50 | TCTGTAGATAGAGTATAGCATCA | 位点2168A＞G的延伸引物 |
| SEQ ID NO：51 | CGTACACACCGCCCGTCAC | 位点1494C＞T的延伸引物 |
| SEQ ID NO：52 | ACTTACCATGTTACGACTTG | 位点1555A＞G的延伸引物 |
如表1和表2所示，扩增引物的长度为大约30个碱基，延伸引物的长度为17-28个碱基。另外，发明人发现，基于前述引物组合，不同位点的延伸引物与延伸产物、延伸产物与延伸产物间的分子量差异不小于30D。本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组合，能够非常有效地检测所列出的突变类型，并且适于同时检测多种位点的多种突变类型，根据本发明的实施例，可以同时对上述20种突变类型进行精确快速地检测。
根据本发明的一个实施例，在进行所述寡核苷酸延伸反应之前，进一步包括：使用碱性磷酸酶对所述扩增产物进行处理的步骤。由此，通过碱性磷酸酶对扩增产物进行处理，可以除去扩增产物中残存的dNTP，从而可以提高后续延伸反应的效率，进而能够实现高效地检测DNA样品中预定位点的突变。
根据本发明的一个实施例，通过MALDI-TOF质谱检测对所述延伸产物进行分子量检测。由此，能够精确、高效地对延伸产物进行分子量检测，发明人惊奇地发现通过MALDI-TOF质谱检测甚至可以实现对DNA样品中杂合突变或纯合突变的检测。
根据本发明的一个实施例，在对所述延伸产物进行MALDI-TOF质谱检测之前，进一步包括对所述延伸产物进行纯化的步骤。由此，可以进一步提高MALDI-TOF质谱检测的精确度，从而提高检测DNA样品中预定位点的突变的效率和精确度。
根据本发明的具体示例，利用阴离子树脂对所述延伸产物进行纯化。由此，能够更进一步提高MALDI-TOF质谱检测的精确度，从而提高检测DNA样品中预定位点的突变的效率和精确度。
根据本发明的第二方面，本发明提出了一种用于检测DNA样品中预定位点的突变的***。根据本发明的实施例，该用于检测DNA样品中预定位点的突变的***包括：DNA样品扩增装置，所述DNA样品扩增装置，用于对所述DNA样品进行PCR扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物包含所述预定位点；扩增产物延伸装置，所述扩增产物延伸装置与所述DNA样品扩增装置相连，以便从所述DNA样品扩增装置接收扩增产物，并且对所述扩增产物进行寡核苷酸延伸反应，以便获得在所述延伸引物的3’端连接一个碱基的延伸产物，其中，所述延伸引物的3’端紧邻所述预定位点；分子量检测装置，所述分子量检测装置与所述扩增产物延伸装置相连，以便确定所述延伸产物的分子量；以及突变分析装置，所述突变分析装置基于所述延伸产物的分子量，确定所述预定位点的突变类型。利用该***，能够有效地实施根据本发明实施例的检测DNA样品中预定位点的突变的方法，从而有效地确定DNA样品中预定位点的突变。
根据本发明的实施例，上述检测DNA样品中预定位点的突变的***还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例，所述DNA样品扩增装置内设置有扩增引物对，所述扩增产物延伸装置内设置有延伸引物。由此，便于DNA样品扩增装置和扩增产物延伸装置分别对DNA样品进行扩增，和进行寡核苷酸延伸反应。
根据本发明的一个实施例，所述预定位点的突变为选自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一种基因的突变，所述GJB2基因的突变为选自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一种，所述GJB3基因的突变为选自位点538C＞T和547G＞A的至少一种，所述SLC26A4基因的突变为选自281C＞T、589G＞A、919-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G和IVS15+5G＞A的至少一种，以及所述mt DNA的突变为选自1494C＞T和1555A＞G的至少一种，所述扩增引物包括第一引物和第二引物，其中，针对这些突变，可以采用表1和表2中所列出的引物组合(前面已有详细描述，在此不再赘述)。本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组合，能够非常有效地检测所列出的突变类型。
根据本发明的一个实施例，进一步包括：扩增产物净化装置，所述扩增产物净化装置分别与所述DNA样品扩增装置和所述扩增产物延伸装置相连，以便对所述扩增产物进行净化处理，并将经过净化的扩增产物输入至所述扩增产物延伸装置。由此，可以除去扩增产物中残存的dNTP，从而可以提高后续延伸反应的效率，进而能够实现高效地检测DNA样品中预定位点的突变。
根据本发明的一个实施例，所述分子量检测装置为MALDI-TOF质谱装置。
根据本发明的一个实施例，进一步包括延伸产物纯化装置，其中，所述延伸产物纯化装置分别与所述扩增产物延伸装置和所述MALDI-TOF质谱装置相连，以便对所述延伸产物进行纯化处理，并将经过纯化的延伸产物输入至所述MALDI-TOF质谱装置。
根据本发明的一个实施例，所述延伸产物纯化装置为阴离子树脂。
根据本发明的第三方面，本发明提出了一种用于确定DNA样品中预定位点的突变的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：扩增引物对，所述扩增引物对适于对所述DNA样品进行PCR扩增反应，以便获得扩增产物，所述扩增产物包含所述预定位点；以及延伸引物，所述延伸产物适于利用ddNTP，以所述扩增产物为模板，进行寡核苷酸延伸反应，以便获得在所述延伸引物的3’端连接一个碱基的延伸产物，其中，所述延伸引物的3’端紧邻所述预定位点。利用该试剂盒，所制备的延伸产物，可以有效地用于确定DNA样品中预定位点的突变，从而实施根据本发明实施例的确定DNA样品中预定位点的突变的方法。
根据本发明的实施例，上述用于确定DNA样品中预定位点的突变的试剂盒还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例，所述预定位点的突变为选自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一种基因的突变，所述GJB2基因的突变为选自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一种，所述GJB3基因的突变为选自位点538C＞T和547G＞A的至少一种，所述SLC26A4基因的突变为选自281C＞T、589G＞A、919-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G和IVS15+5G＞A的至少一种，以及所述mt DNA的突变为选自1494C＞T和1555A＞G的至少一种，所述扩增引物包括第一引物和第二引物，所述扩增引物包括第一引物和第二引物，其中，针对这些突变，可以采用表1和表2中所列出的引物组合(前面已有详细描述，在此不再赘述)。本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组合，能够非常有效地检测所列出的突变类型。
根据本发明的第四方面，本发明提出了一种诊断遗传性耳聋的方法。根据本发明的实施例，包括以下步骤：提取怀疑患有遗传性耳聋的受试者的DNA样品；根据前述确定DNA样品中预定位点的突变的方法，对所述DNA样品中预定位点的突变进行分析；以及基于所述DNA样品中存在所述预定位点的突变，确定所述受试者患有遗传性耳聋，其中，所述预定位点的突变为选自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一种基因的突变，所述GJB2基因的突变为选自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一种，所述GJB3基因的突变为选自位点538C＞T和547G＞A的至少一种，所述SLC26A4基因的突变为选自281C＞T、589G＞A、919-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G和IVS15+5G＞A的至少一种，以及所述mt DNA的突变为选自1494C＞T和1555A＞G的至少一种。由此，根据本发明实施例的诊断遗传性耳聋的方法，能够有效地诊断受试者是否属于遗传性耳聋，并且能够辅助确认耳聋的病因，进而能够针对病因采用相应的治疗和辅助措施。
根据本发明的实施例，上述诊断遗传性耳聋的方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例，所述扩增引物包括第一引物和第二引物，其中，针对前述突变，可以采用表1和表2中所列出的引物组合(前面已有详细描述，在此不再赘述)。本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组合，能够非常有效地检测所列出的突变类型，从而可以高效地确定受试者是否患有遗传性耳聋。
根据本发明的第五方面，本发明提出了一种产前诊断遗传性耳聋的方法。根据本发明的实施例，该产前诊断遗传性耳聋的方法包括以下步骤：分离胎儿DNA样品；根据前述确定DNA样品中预定位点的突变的方法，对所述胎儿DNA样品中预定位点的突变进行分析；以及基于所述胎儿DNA样品中存在所述预定位点的突变，推测所述胎儿患有遗传性耳聋，其中，所述预定位点的突变为选自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一种基因的突变，所述GJB2基因的突变为选自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一种，所述GJB3基因的突变为选自位点538C＞T和547G＞A的至少一种，所述SLC26A4基因的突变为选自281C＞T、589G＞A、919-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G和IVS15+5G＞A的至少一种，以及所述mt DNA的突变为选自1494C＞T和1555A＞G的至少一种。由此，根据本发明实施例的诊断遗传性耳聋的方法，能够辅助推测胎儿患有遗传性耳聋，并且能够辅助确认耳聋的病因，进而能够针对病因采用相应的治疗和辅助措施。
根据本发明的一个实施例，所述扩增引物包括第一引物和第二引物，其中，针对前述突变，可以采用表1和表2中所列出的引物组合(前面已有详细描述，在此不再赘述)。本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组合，能够非常有效地检测所列出的突变类型，从而可以推测胎儿是否患有遗传性耳聋。
根据本发明的一个实施例，所述胎儿DNA是从孕妇的绒毛膜、羊水或脐带血中提取的。由此，可以在孕早期既能够推测胎儿是否患有遗传性耳聋，并且不会由于直接从胎儿组织提取样本，而造成胎儿流产等事故。
根据本发明的第六方面，本发明提出了一种预测电子耳蜗效果的方法。根据本发明的实施例，该预测电子耳蜗效果的方法包括以下步骤：提取耳聋患者的DNA样品；根据前述确定DNA样品中预定位点的突变的方法，对所述DNA样品中预定位点的突变进行分析；基于所述DNA样品中存在所述预定位点的突变，确定所述耳聋患者患有遗传性耳聋；基于所述耳聋患者患有遗传性耳聋，预测电子耳蜗对于所述耳聋患者有效，其中，所述预定位点的突变为选自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一种基因的突变，所述GJB2基因的突变为选自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一种，所述GJB3基因的突变为选自位点538C＞T和547G＞A的至少一种，所述SLC26A4基因的突变为选自281C＞T、589G＞A、919-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G和IVS15+5G＞A的至少一种，以及所述mt DNA的突变为选自1494C＞T和1555A＞G的至少一种。由此，可以通过确定耳聋患者的病因，来确定是否可以采用电子耳蜗来辅助耳聋患者获得听力。
根据本发明的实施例，上述预测电子耳蜗效果的方法可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例，所述扩增引物包括第一引物和第二引物，其中，其中，针对前述突变，可以采用表1和表2中所列出的引物组合(前面已有详细描述，在此不再赘述)。本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组合，能够非常有效地检测所列出的突变类型，从而可以高效地推测胎儿是否患有遗传性耳聋。
根据本发明的第七方面，本发明提出了一种试剂盒，其特征在于，包括：扩增引物对，所述扩增引物对适于对DNA样品进行PCR扩增反应，以便获得扩增产物，所述扩增产物包含所述预定位点；以及延伸引物，所述延伸产物适于利用ddNTP，以所述扩增产物为模板，进行寡核苷酸延伸反应，以便获得在所述延伸引物的3’端连接一个碱基的延伸产物，其中，所述延伸引物的3’端紧邻所述预定位点，所述预定位点的突变为选自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一种基因的突变，所述GJB2基因的突变为选自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一种，所述GJB3基因的突变为选自位点538C＞T和547G＞A的至少一种，所述SLC26A4基因的突变为选自281C＞T、589G＞A、919-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G和IVS15+5G＞A的至少一种，以及所述mt DNA的突变为选自1494C＞T和1555A＞G的至少一种，所述扩增引物包括第一引物和第二引物，其中，针对前述突变，可以采用表1和表2中所列出的引物组合(前面已有详细描述，在此不再赘述)。本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组合制备的延伸产物，能够非常有效地用于检测所列出的突变类型，从而可以高效地确定遗传性耳聋。
根据本发明的一个实施例，所述试剂盒可以用于选自诊断遗传性耳聋、产前诊断遗传性耳聋、以及预测电子耳蜗效果的至少一种。由此，利用该试剂盒，可以有效地实施前述的根据本发明实施例的诊断遗传性耳聋、产前诊断遗传性耳聋、以及预测电子耳蜗效果的方法。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明一个实施例的检测DNA样品中预定位点的突变的方法的流程示意图；
图2是本发明一个实施例的用于检测DNA样品中预定位点的突变的***的示意图；
图3-14是根据本发明实施例的检测遗传性耳聋相关基因突变的质谱检验结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明中使用的术语“第一”和“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：对于已知位点的基因突变，因其突变类型是已知的，因而通过检测包含该已知位点的一段特定长度的寡核苷酸序列的分子量，可以基于该分子量的数值判断出在该位点是否存在突变，并且通过计算，可以获知该突变的类型。
检测DNA样品中预定位点的突变的方法
根据本发明的第一方面，本发明提出了一种检测DNA样品中预定位点的突变的方法。在本文中所使用的术语“预定位点”是指DNA样品突变分析的目标位点，通常指的是已经对该位点的突变类型进行充分研究，其功能已经明了的位点。在本文中，所使用的术语“突变”，指的是与野生型DNA序列有区别的情况，其可以包括***、置换、缺失一个或者多个碱基，即可以是点突变，也可以一段序列的整体改变。
参考图1，根据本发明的实施例，检测DNA样品中预定位点的突变的方法包括以下步骤：
S100：使用扩增引物对DNA样品进行PCR扩增反应，以便获得扩增产物，扩增产物包含预定位点。根据本发明的实施例，可以采用的DNA样品的来源，不受特别限制。根据本发明的一个示例，可以采用的DNA样品为人全基因组DNA。根据本发明的一个实施例，可以采用含有待测位点的DNA片段作为DNA样品进行检测，这样可以提高检测的效率和精度。例如，可以首先提取生物样本中的全部DNA，然后通过常规的分离方法，获得含有特定位点的DNA片段。
根据本发明的实施例，可以通过本发明的方法进行研究的预定位点的突变不受特别限制。根据本发明一些实施例，可以通过本发明的方法，进行检测的预定位点的突变是为选自人类GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一种基因的突变。本发明的发明人惊奇地发现，借助本发明实施例的方法，可以有效地对上述基因中的突变位点进行检测根据本发明的一个具体示例，可以进行检测的突变位点以及常见的突变类型为下表3中所列出的任意一种：
表3人类遗传性耳聋的相关基因突变
需要说明的是，这些突变位点的表示方法均为本领域技术人员已知的表达方式。鉴于突变位点既可以发生在cDNA序列上，也有可能发生在内含子上。为此，发明人提供突变说明，以对突变的精确位点进行描述。其中，说明规则为：
1)在位点前面加字母以区分所参考序列的类型：
①“c.”表示参考cDNA的序列，如：c.235delC，表示cDNA序列的第25个碱基C缺失
②“m.”表示参考线粒体的序列，如：m.1494C＞T，表示线粒体DNA序列第1494个碱基C被置换为T。
2)以内含子开始：外显子序号+该位点在内含子的位置如：IVS15+5G＞A，表示在SLC26A4基因第15个外显子的下游的第5个碱基G置换为A。
关于人类野生型的上述基因，可以通过NCBI索取号获得。人类野生型GJB2的NCBI索取号为NG_008358.1、GJB3的NCBI索取号为NG_008309.1、SLC26A4的NCBI索取号为NG_008489.1、mt DNA(线粒体DNA)的NCBI索取号为NC_012920。
为方便理解，下面对GJB2、GJB3、SLC26A4、mt DNA(线粒体DNA)进行简要介绍。
GJB2基因：该基因定位于常染色体13q11-12区域，DNA全长4804bp，含2个外显子，编码区为678bp，编码由266个氨基酸残基组成的缝隙连接蛋白Connexin 26，属于β-2蛋白，是钾离子循环通路的一部分。GJB2基因突变为遗传性耳聋最常见的病因，GJB2基因突变导致的耳聋为语前、双侧、对称性耳聋，听力损失程度变异较大，可由轻度到极重度，但多数为重度或极重度耳聋。在中国人群中，常见GJB2基因突变类型主要有235delC、299_300delAT、176_191del16等，可占GJB2基因突变人群的80％以上。关于该基因的详细描述，可以参见Dai P，Yu F，Han B，et al.GJB2mutation spectrum in 2，063Chinesepatients with nonsyndromic hearing impairment[J].J Transl Med，2009，7：26，在此通过参照并入本文。
GJB3基因：该基因定位在1p33-p35，有2个外显子，编码含有270个氨基酸的缝隙连接蛋白Connexin31。GJB3基因突变可引起常染色体显性或隐性遗传性非综合征性耳聋，被认为与高频听力下降有关。关于该基因的详细描述，可以参见Xia JH，Liu CY，Tang BS，et al.Mutat ions in the gene encoding gapjunction protein beta-3 associated with autosomal dominant hearing impairment.NatGenet，1998，20：370-373，在此通过参照并入本文。
SLC26A4基因：也被称为PDS基因，该基因定位于常染色体7q31区域，含21个外显子，编码1个由780个氨基酸残基组成的多次跨膜蛋白Pendrin，属于离子转运体家族，主要与碘/氯离子转运有关。临床上表现为先天性或后天性耳聋，耳聋发生或加重与外伤、感冒有关。PDS基因突变种类较多，但919--2A＞G、2168A＞G、1226G＞A、1975G＞C、1229C＞T、1174A＞T、1687_1692insA、IVS15+5G＞A、2027T＞A、589G＞A与281C＞T突变体频率高达82.51％。关于该基因的详细描述，可以参见袁永一，王国建，黄德亮，等.大前庭水管相关SLC26A4基因热点突变区域筛查方案探讨.中华耳科学杂志；2010，8(3)：292-295，在此通过参照并入本文。
线粒体DNA基因：线粒体基因突变与氨基糖甙类抗生素(AmAn)引起的药物性耳聋有关，线粒体基因突变会导致线粒体的缺陷，影响到与听力直接相关的耳蜗毛细胞线粒体的产能不足，从而导致耳蜗与前庭细胞损伤或死亡。线粒体DNA基因突变为母系遗传，常在成年早期发生，表现为双侧对称性、以高频听力下降为主、程度不等的感音神经性耳聋。线粒体基因突变的主要位点有1555A＞G与1494C＞T。
关于上述基因突变类型的详细描述，可以见相关的研究文献，为方便描述特列表如下，通过参考将所列举的文献并入本文。
由此，利用根据本发明实施例的方法，可以有效地检测耳聋相关的基因突变，并且进而能够有效地预测受试者罹患遗传性耳聋，例如可以辅助诊断患者耳聋的发病原因，从而可以针对性地采用相应的治疗方案。
本领域技术人员能够理解的是，可以采用任何PCR方法DNA样品进行扩增，只要所得到的扩增产物中包含预定位点即可。根据本发明的具体示例，为了诊断前面表3中所列出的突变类型，可以采用表1中所列出的引物对分别作为扩增引物的第一引物和第二引物。本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的扩增引物，能够有效地实现对预定位点的扩增，并且在后续能够有效地提高检测突变类型的效率和精确性，从而可以高效地确定受试者是否患有遗传性耳聋。根据本发明的一个实施例，在表1中所示出的第一引物和第二引物5′端还可以都具有10个碱基acgttggatg(SEQ ID NO：53)的标签序列，发明人发现，通过采用上述标签序列，可以使得上述第一引物和第二引物的分子量不在后续质谱的检测范围内，由此，能够进一步提高检测的精确度和效率。
S200：在获得包含预定位点的扩增产物之后，可以使用延伸引物以及ddNTP，以所获得的扩增产物为模板，进行寡核苷酸延伸反应，以便获得在所述延伸引物的3’端连接一个碱基的延伸产物。根据本发明的实施例，延伸引物的3’端紧邻预定位点。由此，所获得的延伸产物的3’末端所对应的碱基包含有预定位点的突变信息，在后续可以通过分子量的分析，确定该位点是否具有突变事件，并且可以确定该突变事件的类型。本领域技术人员可以理解，可以通过任何已知的PCR方法对扩增产物进行上述寡核苷酸延伸反应。根据本发明的一个实施例，可以采用表2中所列出的引物作为延伸引物进行上述寡核苷酸延伸反应。本发明的发明人惊奇地发现通过使用表1和表2中所列出的引物组合，能够非常有效地检测所列出的突变类型。
根据本发明的一个实施例，在进行所述寡核苷酸延伸反应之前，可以进一步包括使用碱性磷酸酶对所获得的扩增产物进行处理的步骤。由此，通过碱性磷酸酶对扩增产物进行处理，可以除去扩增产物中残存的dNTP，从而可以提高后续延伸反应的效率，进而能够实现高效地检测DNA样品中预定位点的突变。
S300：在获得上述延伸产物之后，可以对延伸产物进行分子量检测，以便获得延伸产物的分子量。根据本发明的实施例，可以采用任何已知的方法对延伸产物进行分子量检测。根据本发明的一个实施例，通过MALDI-TOF质谱(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)检测对所述延伸产物进行分子量检测。MALDI-TOF质谱是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，实现对离子的检测。
由此，能够精确、高效地对延伸产物进行分子量检测，发明人惊奇地发现通过MALDI-TOF质谱检测甚至可以实现对DNA样品中杂合突变或纯合突变的检测。根据本发明的一个实施例，在对延伸产物进行MALDI-TOF质谱检测之前，进一步包括对所述延伸产物进行纯化的步骤。由此，可以进一步提高MALDI-TOF质谱检测的精确度，从而提高检测DNA样品中预定位点的突变的效率和精确度。根据本发明的具体示例，利用阴离子树脂对所述延伸产物进行纯化。由此，能够更进一步提高MALDI-TOF质谱检测的精确度，从而提高检测DNA样品中预定位点的突变的效率和精确度。
S400：最后，基于所检测获得的延伸产物分子量，确定所述预定位点的突变类型。由于延伸反应是以包含预定位点的扩增产物为模板，并且进行延伸反应的延伸引物的3’端紧邻所述预定位点，并且在进行延伸反应时使用ddNTP作为原料，因而可以保证延伸反应可以仅延伸一个碱基，即对应预定的位点，基于各个不同碱基的分子量存在较为显著的区别，因而，通过对延伸产物的分子量进行检测，可以通过所获得的延伸产物的分子量，来确定在预定位点是否发生了突变，以及所发生突变的类型。需要说明的是，这里的分析可以是通过将延伸产物的分子量与标准参照进行比较来获得。这里使用的术语“标准参照”可以是预先对具有已知突变的样品进行平行试验获得的分子量数值。
与现有技术相比，根据本发明实施例的方法至少具有下列优点之一：
(1)使用的试剂耗材相对简单且稳定，不需要荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂；
(2)反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用；
(3)由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比)且直接确定碱基的类型(即，不需要经过任何形式的信号转换)，因此，理论上只要有一个拷贝的突变片段例如单核苷酸多态性(SNP)被扩增即可识别，从而杜绝了假阳性发生的可能；
(4)质谱技术还有自动化、高通量检测等特点，因此，质谱技术与多引物延伸技术结合使用，可以在一个反应体系中同时检测多个耳聋突变位点，结合DNA自动提取设备、多重PCR引物设计软件及数据分析软件，大大减轻了工作量，提高了检测通量，并降低了检测费用；
(5)与基因序列测定相比具有操作简便、结果准确、通量高、价格低廉的优点
用于检测DNA样品中预定位点的突变的***
根据本发明的第二方面，本发明提出了一种用于检测DNA样品中预定位点的突变的***。参考图2，根据本发明的实施例，该用于检测DNA样品中预定位点的突变的***1000包括：DNA样品扩增装置100、扩增产物延伸装置200、分子量检测装置300以及突变分析装置400。
根据本发明的实施例，DNA样品扩增装置100用于对DNA样品进行PCR扩增，以便获得包含预定位点的扩增产物。根据本发明的一个实施例，DNA样品扩增装置100内设置有扩增引物对，所述扩增产物延伸装置内设置有延伸引物。由此，便于DNA样品扩增装置和扩增产物延伸装置分别对DNA样品进行扩增，和进行寡核苷酸延伸反应。如前所述，根据本发明的实施例，DNA样品扩增装置100不受特别限制，其可以是任何适于对DNA样品进行扩增的装置。根据本发明的一个实施例，可以采用已知的PCR装置作为DNA样品扩增装置100。另外，根据本发明的实施例，可以在DNA样品扩增装置100中预先设置扩增引物对，由此可以方便进行操作。本领域技术人员可以根据所要进行分析的位点来确定可以采用的扩增引物序列。根据本发明的一个实施例，所述预定位点的突变为选自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一种基因的突变，所述GJB2基因的突变为选自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一种，所述GJB3基因的突变为选自位点538C＞T和547G＞A的至少一种，所述SLC26A4基因的突变为选自281C＞T、589G＞A、919-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G和IVS15+5G＞A的至少一种，以及所述mt DNA的突变为选自1494C＞T和1555A＞G的至少一种。关于这些突变，在前面已经进行了详细描述，在此不再赘述。针对这些突变，可以采用表1和表2中所列出的引物组合(前面已有详细描述，在此不再赘述)作为扩增引物对。本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组合，能够非常有效地检测所列出的突变类型。需要说明的是，在本发明中所使用的术语“相连”应做广义理解，其可以是直接相连，也可以是通过媒介间接相连，只要可以实现功能上的衔接即可。
根据本发明的实施例，扩增产物延伸装置300与DNA样品扩增装置100相连，以便从DNA样品扩增装置100接收扩增产物，并且对扩增产物进行寡核苷酸延伸反应，以便获得在所述延伸引物的3’端连接一个碱基的延伸产物，其中，延伸引物的3’端紧邻所述预定位点。根据本发明的一个实施例，可以进一步包括扩增产物净化装置(图中未示出)，扩增产物净化装置可以分别与DNA样品扩增装置100和扩增产物延伸装置200相连，以便对扩增产物进行净化处理，并将经过净化的扩增产物输入至扩增产物延伸装置200。由此，可以除去扩增产物中残存的dNTP，从而可以提高后续延伸反应的效率，进而能够实现高效地检测DNA样品中预定位点的突变。
根据本发明的实施例，分子量检测装置300可以与扩增产物延伸装置200相连，以便确定所述延伸产物的分子量。根据本发明的一个实施例，所述分子量检测装置为MALDI-TOF质谱装置。由此，能够精确、高效地对延伸产物进行分子量检测，发明人惊奇地发现通过MALDI-TOF质谱检测甚至可以实现对样品中杂合突变或纯合突变的检测。根据本发明的一个实施例，进一步包括延伸产物纯化装置(图中未示出)。延伸产物纯化装置可以分别与扩增产物延伸装置200和MALDI-TOF质谱装置300相连，以便对延伸产物进行纯化处理，并将经过纯化的延伸产物输入至所述MALDI-TOF质谱装置。由此，可以进一步提高MALDI-TOF质谱检测的精确度，从而提高检测DNA样品中预定位点的突变的效率和精确度。根据本发明的一个实施例，所述延伸产物纯化装置为阴离子树脂。由此，能够更进一步提高MALDI-TOF质谱检测的精确度，从而提高检测DNA样品中预定位点的突变的效率和精确度。
根据本发明的实施例，突变分析装置400可以与分子量检测装置300相连，基于所得到的延伸产物的分子量，确定所述预定位点的突变类型。根据本发明的实施例，突变分析装置400可以与存有标准参照，通过将延伸产物的分子量与标准参照进行比较可以得出是否存在突变以及突变类型的结论。这里使用的术语“标准参照”可以是预先对具有已知突变的样品进行平行试验获得的分子量数值。另外，根据本发明的实施例，突变分析装置400还可以适于进行各种统计检验分析，以便实现更精确更准确地分析。
由此，利用根据本发明实施例的***，能够有效地实施根据本发明实施例的检测DNA样品中预定位点的突变的方法，从而有效地确定DNA样品中预定位点的突变。需要说明的是，上面所提到的各个装置的功能可以在相同的容器内完成，只要能够实现上述功能即可。
应用
根据本发明的实施例的确定DNA样品中预定位点的突变的方法可以应用于各种与基因突变相关的检测。例如，可以有效地对实验室中构建的突变体的突变类型进行检测。
根据本发明的实施例，还可以将上述方法应用于诊断遗传性耳聋的方法、产前诊断遗传性耳聋的方法、产前诊断遗传性耳聋的方法。
具体地，根据本发明的一个方面，本发明提出了一种诊断遗传性耳聋的方法。根据本发明的实施例，诊断遗传性耳聋的方法包括以下步骤：提取怀疑患有遗传性耳聋的受试者的DNA样品；根据前述确定DNA样品中预定位点的突变的方法，对所述DNA样品中预定位点的突变进行分析；以及基于DNA样品中存在所述预定位点的突变，确定所述受试者患有遗传性耳聋，其中，所述预定位点的突变为表3中所列出的突变的至少一种。由此，根据本发明实施例的诊断遗传性耳聋的方法，能够有效地诊断受试者是否属于遗传性耳聋，并且能够辅助确认耳聋的病因，进而能够针对病因采用相应的治疗和辅助措施。根据本发明的实施例，可以采用的DNA样品的类型并不受特别限制，可以采用受试者的全基因组DNA，也可以采用来自于包含特定基因的DNA片段，这里所说的特定基因指的是耳聋相关基因。根据本发明的实施例，针对表3中所列出的突变，可以采用表1和表2中所列出的引物组合(前面已有详细描述，在此不再赘述)。本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组合，能够非常有效地检测所列出的突变类型，从而可以高效地确定受试者是否患有遗传性耳聋。关于各步骤的细节，可以参见前面的相关描述，在此不再赘述。
进一步，本发明提出了一种产前诊断遗传性耳聋的方法。根据本发明的实施例，该产前诊断遗传性耳聋的方法包括以下步骤：分离胎儿DNA样品；根据前述确定DNA样品中预定位点的突变的方法，对所述胎儿DNA样品中预定位点的突变进行分析；以及基于所述胎儿DNA样品中存在所述预定位点的突变，确定所述胎儿患有遗传性耳聋，其中，所述预定位点的突变为表3中所列出的突变的至少一种。由此，根据本发明实施例的诊断遗传性耳聋的方法，能够辅助推测胎儿患有遗传性耳聋，并且能够辅助确认耳聋的病因，进而能够针对病因采用相应的治疗和辅助措施。针对表3中所列出的突变，可以采用表1和表2中所列出的引物组合(前面已有详细描述，在此不再赘述)。本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组合，能够非常有效地检测所列出的突变类型，从而可以推测胎儿是否患有遗传性耳聋。根据本发明的实施例，可以采用的DNA样品的类型并不受特别限制，可以采用胎儿的全基因组DNA，也可以采用来自于胎儿的包含特定基因的DNA片段，这里所说的特定基因指的是耳聋相关基因。根据本发明的实施例，胎儿基因组DNA的来源不受特别限制。根据本发明的一个实施例，胎儿全基因组DNA是从孕妇的绒毛膜、羊水或脐带血中提取的。由此，可以在孕早期就能够有效推测胎儿是否患有遗传性耳聋。另外，根据本发明的一个实施例，也可以通过从孕妇的外周血中分离来自于胎儿的游离核酸，作为进行耳聋相关检测的DNA样品。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种预测电子耳蜗效果的方法。根据本发明的实施例，该预测电子耳蜗效果的方法包括以下步骤：提取耳聋患者的DNA样品；根据前述确定DNA样品中预定位点的突变的方法，对所述DNA样品中预定位点的突变进行分析；基于所述DNA样品中存在所述预定位点的突变，确定所述耳聋患者患有遗传性耳聋；基于所述耳聋患者患有遗传性耳聋，预测电子耳蜗对于所述耳聋患者有效，其中，所述预定位点的突变为表3中所列出的突变的至少一种。由此，可以通过确定耳聋患者的病因，来确定是否可以采用电子耳蜗来辅助耳聋患者获得听力。针对表3中所列出的突变，可以采用表1和表2中所列出的引物组合(前面已有详细描述，在此不再赘述)。本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组合，能够非常有效地检测所列出的突变类型，从而可以预测耳聋患者是否具有残余的螺旋神经节，以便在没有对疾病进行治疗的前提下，采用电子耳蜗绕过受损的毛细胞直接利用电流刺激听神经从而重建听觉。根据本发明的实施例，可以采用的DNA样品的类型并不受特别限制，可以采用胎儿的全基因组DNA，也可以采用来自于胎儿的包含特定基因的DNA片段，这里所说的特定基因指的是耳聋相关基因。
试剂盒
本发明还提出了一种试剂盒，其特征在于，包括：扩增引物对以及延伸引物。根据本发明的实施例，扩增引物对适于对DNA进行PCR扩增反应，以便获得包含预定位点的扩增产物，延伸产物适于利用ddNTP，以所得到的扩增产物为模板，进行寡核苷酸延伸反应，以便获得在所述延伸引物的3’端连接一个碱基的延伸产物，其中，延伸引物的3’端紧邻所述预定位点，所述预定位点的突变为表3中所列出的突变的至少一种。针对表3中所列出的突变，可以采用表1和表2中所列出的引物组合(前面已有详细描述，在此不再赘述)分别作为扩增引物对和延伸引物。本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组合制备的延伸产物，能够非常有效地用于检测所列出的突变类型，从而可以高效地确定遗传性耳聋。根据本发明的一个实施例，利用该试剂盒，可以有效地实施前述的根据本发明实施例的检测DNA样品中预定位点的突变、诊断遗传性耳聋、产前诊断遗传性耳聋、以及预测电子耳蜗效果的方法。根据本发明的实施例，本发明还提出了一组可以用于上述试剂盒的引物组合。利用该引物组合，可以有效地检测DNA样品中预定位点的突变、诊断遗传性耳聋、产前诊断遗传性耳聋、以及预测电子耳蜗效果的方法。
下面根据具体的实施例对本发明进行说明。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式解释为对本发明的限制。另外，除非特别说明，在下面的实施例中所涉及的方法为常规方法，所涉及的材料和制剂也为市售可得的。
实施例1
①引物设计
根据所选择的待检测和/或分型的耳聋基因突变位点20个，包括4个基因，分别是：GJB2基因(包含位点35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT与235delC)、GJB3基因(包含位点538C＞T与547G＞A)、SLC26A4基因(包含位点281C＞T、589G＞A、919-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G与IVS15+5G＞A)与mt DNA的1494C＞T与1555A＞G。
根据突变位点的位置和基因型设计扩增引物对和一条延伸引物，其中扩增引物的长度在30个碱基左右，其扩增引物在5′端具有10个碱基acgttggatg的标签序列；延伸引物的长度为17-28个碱基，允许5′端有1-5个碱基与模板不完全配对，并且3′末端碱基与突变位点3′端相邻碱基完全匹配。另外，不同位点的延伸引物与延伸产物、延伸产物与延伸产物间的分子量差异不小于30D。本发明设计的针对上述20个耳聋基因突变位点的扩增引物参见表1(在第一序列和第二序列的5’端均带有标签序列acgttggatg)，延伸引物参见表2。
②DNA提取
临床收集的8份临床血液样品，使用磁珠法提取DNA。
③PCR扩增
通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物。PCR扩增反应体系参见表4。其中，所有试剂购买自美国Sequenom公司，PCR仪为
PCR System 9700Dual 384-Well Sample Block Module。
表4
PCR反应条件为94℃，2分钟；94℃变性20秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增45循环；最终72℃延伸5分钟。在本实施例中，使用的模板是已知位点299_300delAT、281C＞T、1229C＞T、IVS15+5G＞A、2168A＞G与1494C＞T出现突变的人类基因组DNA，阳性对照是已知序列的正常的人类基因组DNA，阴性对照是无菌双蒸水。
④SAP处理
通过SAP酶(虾碱性磷酸酶)处理，除去步骤②获得的扩增产物中含有的dNTP，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。SAP酶反应体系见下表5。所有试剂购买自美国Sequenom公司，PCR仪为
PCRSystem 9700Dual 384-Well Sample Block Module。
表5
| 试剂 | 体积/反应 |
| 水(HPLE级) | 1.53微升 |
| SAP酶缓冲液 | 0.17微升 |
| SAP酶 | 0.30微升 |
| PCR扩增产物 | 5.0微升 |
| 总体积 | 7.0微升 |
SAP酶反应条件为37℃温育40分钟，以去除PCR扩增反应中剩余的dNTP；85℃温育5分钟，以使SAP酶失活。
⑤延伸反应
以③中获得的扩增产物为模板，通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。延伸反应所使用的原料是经过质量修饰的ddNTP，它既保证了延伸反应只连接一个碱基，又能使整个***的分辨率提高。延伸反应体系见表6。所有试剂购买自美国Sequenom公司，PCR仪为
PCRSystem 9700Dual 384-Well Sample Block Module。。
表6
*其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大小进行线性关系调整(即，根据每种延伸引物的分子量计算每种引物的使用量)。以达到最优的延伸反应，获得最优的质谱峰图。
延伸反应条件为94℃，30秒；94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72℃延伸3分钟。
⑥树脂纯化
采用树脂(型号08040，购买自美国Sequenom公司)纯化步骤④中获得的延伸产物。在延伸产物中加入6mg树脂，18.00微升水，垂直摇匀40min。经过本步反应后，树脂将与反应体系中的阳离子充分结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4℃保存数天，也可在-20℃保存数周。所得的纯化产物在4000rpm离心5分钟后，取上清直接用于质谱检测。
⑦质谱检测
通过点样仪(型号MassARRAY Nanodispenser RS1000，购买自美国Sequenom公司)把经步骤⑤纯化后的延伸产物转移到384孔spectroCHIPII芯片上，芯片基质与产物共结晶，该芯片在Sequenom MALDI-TOF质谱仪(型号MassARRAY Analyzer Compact，购买自美国Sequenom公司)上进行质谱检测，从而确定待检测突变位点的基因型。
质谱检测结果显示于图3-8中，
图3显示了使用延伸引物SEQ ID NO：36对测试样本位点299_300delAT进行检测的结果。从图3-1可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6545.3处检测到峰，所述峰经分析确认为野生型AT(样本来源于正常人)，结果与实际一致。从图3-2可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6545.3和6561.3处检测到峰，所述峰经分析确认为杂合缺失突变(样本来源于临床样本1)，结果与实际一致。从图3-3可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6561.3处检测到峰，所述峰经分析确认为纯合缺失突变(样本来源于临床样本2)，结果与实际一致。
图4显示了使用延伸引物SEQ ID NO：40对测试样本位点281C＞T进行检测的结果。从图4-1可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6121处检测到峰，所述峰经分析确认为野生型C(样本来源同图3-1的样本来源)，结果与实际一致。从图4-2可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6121与6200.9处检测到峰，所述峰经分析确认为杂合CT(样本来源于临床样本3)，结果与实际一致。
图5显示了使用延伸引物SEQ ID NO：41对测试样本位点1229C＞T进行检测的结果。从图5-1可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量7053.6处检测到峰，所述峰经分析确认为野生型C(样本来源同图3-1的样本来源)，结果与实际一致。从图5-2可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量7053.6与7133.5处检测到峰，所述峰经分析确认为杂合CT(样本来源于临床样本4)，结果与实际一致。
图6显示了使用延伸引物SEQ ID NO：46对测试样本位点IVS15+5G＞A进行检测的结果。从图6-1可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量7961.3处检测到峰，所述峰经分析确认为野生型G(样本来源同图3-1的样本来源)，结果与实际一致。从图4-2可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量7961.3与8041.2处检测到峰，所述峰经分析确认为杂合GA(样本来源于临床样本5)，结果与实际一致。
图7显示了使用延伸引物SEQ ID NO：50对测试样本位点2168A＞G进行检测的结果。从图7-1可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量7413.7处检测到峰，所述峰经分析确认为野生型A(样本来源同图3-1的样本来源)，结果与实际一致。从图7-2可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量7333.8与7413.7处检测到峰，所述峰经分析确认为杂合AG(样本来源于临床样本6)，结果与实际一致。
图8显示了使用延伸引物SEQ ID NO：51对测试样本位点1494C＞T进行检测的结果。从图8-1可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5925.9处检测到峰，所述峰经分析确认为野生型C(样本来源同图3-1的样本来源)，结果与实际一致。从图8-2可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6005.8处检测到峰，所述峰经分析确认为突变纯合T(样本来源于临床样本7)，结果与实际一致。
实施例2
①引物设计
根据所选择的待检测和/或分型的耳聋基因突变位点14个，分布于3个基因中，分别是：GJB2基因(包含位点299_300delAT与235delC)、SLC26A4基因(包含位点281C＞T、919-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G与IVS15+5G＞A)与mt DNA的1494C＞T与1555A＞G。本发明设计的针对上述14个耳聋基因突变位点的扩增引物选自实施例1的引物参见表7。本发明设计的针对上述14个耳聋基因突变位点的延伸引物选自实施例1的引物参见表8。
表7：针对上述14个耳聋基因突变位点的扩增引物。
表8：针对上述14个耳聋基因突变位点的延伸引物。
后续实验步骤(即：DNA提取、PCR扩增、SAP处理、延伸反应、树脂纯化和质谱检测)与实施例1相同，不同的是使用的模板是已知位点235delC、1226G＞A、2027T＞A与1555A＞G出现突变的人类基因组DNA。
质谱检测结果显示于图9-12中。
图9显示了使用延伸引物SEQ ID NO：37对测试样本位点235delC进行检测的结果。从图9-1可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5449.6处检测到峰，所述峰经分析确认为野生型C(样本来源同图3-1的样本来源)，结果与实际一致。从图9-2可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5449.6与5529.5处检测到峰，所述峰经分析确认为杂合缺失突变(样本来源于临床样本8)，结果与实际一致。
图10显示了使用延伸引物SEQ ID NO：44对测试样本位点1226G＞A进行检测的结果。从图10-1可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5304.5处检测到峰，所述峰经分析确认为野生型G(样本来源同图3-1的样本来源)，结果与实际一致。从图10-2可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5288.5与5304.5处检测到峰，所述峰经分析确认为杂合GA(样本来源于临床样本9)，结果与实际一致。
图11显示了使用延伸引物SEQ ID NO：48对测试样本位点2027T＞A进行检测的结果。从图11-1可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5355.5处检测到峰，所述峰经分析确认为野生型G(样本来源同图3-1的样本来源)，结果与实际一致。从图11-2可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5355.5与5411.4处检测到峰，所述峰经分析确认为杂合GA(样本来源于临床样本10)，结果与实际一致。
图12显示了使用延伸引物SEQ ID NO：52对测试样本位点1555A＞G进行检测的结果。从图12-1可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6394.1处检测到峰，所述峰经分析确认为野生型A(样本来源同图3-1的样本来源)，结果与实际一致。从图12-2可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6314.2处检测到峰，所述峰经分析确认为突变纯合G(样本来源于临床样本11的样本来源)，结果与实际一致。
实施例3
①引物设计
根据所选择的待检测和/或分型的耳聋基因突变位点4个，分布于3个基因中，分别是：GJB2基因(包含位点235delC)、SLC26A4基因(包含位点919-2A＞G)与mt DNA的1494C＞T与1555A＞G。本发明设计的针对上述4个耳聋基因突变位点的扩增引物参见表9，延伸引物参见表10。
表9：针对上述4个耳聋基因突变位点的扩增引物。
表10：针对上述4个耳聋基因突变位点的延伸引物。
| 序列编号 | 引物序列 | 引物说明 |
| SEQ ID NO：37 | ggATCCTGCTATGGGCC | 位点235delC的延伸引物 |
| SEQ ID NO：42 | GCAGTAGCAATTATCGTC | 位点919-2A＞G的延伸引物 |
| SEQ ID NO：51 | CGTACACACCGCCCGTCAC | 位点1494C＞T的延伸引物 |
| SEQ ID NO：52 | ACTTACCATGTTACGACTTG | 位点1555A＞G的延伸引物 |
后续实验步骤(即：DNA提取、PCR扩增、SAP处理、延伸反应、树脂纯化和质谱检测)与实施例1相同，不同的是使用的模板是已知位点919-2A＞G与1555A＞G出现突变的人类基因组DNA。
质谱检测结果显示于图13-14中。
图13为使用延伸引物SEQ ID NO：42对测试样本位点919-2A＞G进行检测的结果。从图13-1可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5825.7处检测到峰，所述峰经分析确认为野生型A(样本来源同图3-1的样本来源)，结果与实际一致。从图13-2可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5745.8与5825.7处检测到峰，所述峰经分析确认为杂合AG，结果与实际一致。从图13-3可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5745.8处检测到峰，所述峰经分析确认突变纯合G(样本来源于临床样本12)，结果与实际一致。
图14为使用延伸引物SEQ ID NO：52对测试样本位点1555A＞G进行检测的结果。从图13-1可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6394.1处检测到峰，所述峰经分析确认为野生型A(样本来源同图3-1的样本来源)，结果与实际一致。从图13-2可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6314.2处检测到峰，所述峰经分析确认为突变纯合G(样本来源于临床样本11)，结果与实际一致。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种检测DNA样品中预定位点的突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用扩增引物对所述DNA样品进行PCR扩增反应，以便获得扩增产物，所述扩增产物包含所述预定位点；
使用延伸引物以及ddNTP，以所述扩增产物为模板，进行寡核苷酸延伸反应，以便获得在所述延伸引物的3’端连接一个碱基的延伸产物，其中，所述延伸引物的3’端紧邻所述预定位点；
对所述延伸产物进行分子量检测，以便获得所述延伸产物的分子量；以及
基于所述延伸产物的分子量，确定所述预定位点的突变类型，
其中，
优选所述DNA样品为人全基因组DNA，
优选所述预定位点的突变为选自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一种基因的突变，
更优选，所述GJB2基因的突变为选自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一种，所述GJB3基因的突变为选自位点538C＞T和547G＞A的至少一种，所述SLC26A4基因的突变为选自281C＞T、589G＞A、919-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G和IVS15+5G＞A的至少一种，以及所述mt DNA的突变为选自1494C＞T和1555A＞G的至少一种，
所述扩增引物包括第一引物和第二引物，优选，针对所述GJB2基因的35delG突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：1所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：2所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：33所示；针对所述GJB2基因的167delT突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：3所示，所述第二引物为如SEQID NO：4所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：34所示；针对所述GJB2基因的176-191del16突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：5所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：6所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：35所示；针对所述GJB2基因的299_300delAT突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：7所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：8所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：36所示；针对所述GJB2基因的235delC突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：9所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：10所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：37所示；针对所述GJB3基因的538C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：11所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：12所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：38所示；针对所述GJB3基因的547G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：13所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：14所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：39所示；针对所述SLC26A4基因的281C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：15所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：16所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：40所示；针对所述SLC26A4基因的589G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：17所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：18所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：41所示；针对所述SLC26A4基因的919-2A＞G突变，所述第一引物为如SEQID NO：19所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：20所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：42所示；针对所述SLC26A4基因的1174A＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：21所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：43所示；针对所述SLC26A4基因的1226G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：21所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：44所示；针对所述SLC26A4基因的1229C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：21所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：45所示；针对所述SLC26A4基因的1975G＞C突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：25所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：26所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：47所示；针对所述SLC26A4基因的2027T＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：25所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：26所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：48所示；针对所述SLC26A4基因的2162C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：27所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：28所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：49所示；针对所述SLC26A4基因的2168A＞G突变，所述第一引物为如SEQID NO：27所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：28所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：50所示；针对所述SLC26A4基因的IVS15+5G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：23所示，所述第二引物为如SEQ IDNO：24所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：46所示；针对所述mt DNA基因的1494C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：29所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：30所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：51所示；以及针对所述mt DNA基因的1555A＞G突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：31所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：32所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：52所示，
优选所述第一引物和第二引物的5’端均具有标签序列，所述标签序列为如SEQ ID NO：53所示，
优选在进行所述寡核苷酸延伸反应之前，进一步包括：使用碱性磷酸酶对所述扩增产物进行处理的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过MALDI-TOF质谱检测对所述延伸产物进行分子量检测，
优选在对所述延伸产物进行MALDI-TOF质谱检测之前，进一步包括对所述延伸产物进行纯化的步骤，优选利用阴离子树脂对所述延伸产物进行纯化。
3.一种用于检测DNA样品中预定位点的突变的***，其特征在于，包括：
DNA样品扩增装置，所述DNA样品扩增装置，用于对所述DNA样品进行PCR扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物包含所述预定位点；
扩增产物延伸装置，所述扩增产物延伸装置与所述DNA样品扩增装置相连，以便从所述DNA样品扩增装置接收扩增产物，并且对所述扩增产物进行寡核苷酸延伸反应，以便获得在所述延伸引物的3’端连接一个碱基的延伸产物，其中，所述延伸引物的3’端紧邻所述预定位点；
分子量检测装置，所述分子量检测装置与所述扩增产物延伸装置相连，以便确定所述延伸产物的分子量；以及
突变分析装置，所述突变分析装置基于所述延伸产物的分子量，确定所述预定位点的突变类型，
其中，
优选所述DNA样品扩增装置内设置有扩增引物对，所述扩增产物延伸装置内设置有延伸引物，
优选所述预定位点的突变为选自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一种基因的突变，更优选所述GJB2基因的突变为选自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一种，所述GJB3基因的突变为选自位点538C＞T和547G＞A的至少一种，所述SLC26A4基因的突变为选自281C＞T、589G＞A、919-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G和IVS15+5G＞A的至少一种，以及所述mt DNA的突变为选自1494C＞T和1555A＞G的至少一种，
所述扩增引物包括第一引物和第二引物，优选针对所述GJB2基因的35delG突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：1所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：2所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：33所示；针对所述GJB2基因的167delT突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：3所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：4所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：34所示；针对所述GJB2基因的176-191del16突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：5所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：6所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：35所示；针对所述GJB2基因的299_300delAT突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：7所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：8所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：36所示；针对所述GJB2基因的235delC突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：9所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：10所示，所述延伸引物为如SEQ IDNO：37所示；针对所述GJB3基因的538C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：11所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：12所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：38所示；针对所述GJB3基因的547G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：13所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：14所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：39所示；针对所述SLC26A4基因的281C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：15所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：16所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：40所示；针对所述SLC26A4基因的589G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：17所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：18所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：41所示；针对所述SLC26A4基因的919-2A＞G突变，所述第一引物为如SEQ IDNO：19所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：20所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：42所示；针对所述SLC26A4基因的1174A＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：21所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：43所示；针对所述SLC26A4基因的1226G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：21所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：44所示；针对所述SLC26A4基因的1229C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：21所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：45所示；针对所述SLC26A4基因的1975G＞C突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：25所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：26所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：47所示；针对所述SLC26A4基因的2027T＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：25所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：26所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：48所示；针对所述SLC26A4基因的2162C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：27所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：28所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：49所示；针对所述SLC26A4基因的2168A＞G突变，所述第一引物为如SEQID NO：27所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：28所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：50所示；针对所述SLC26A4基因的IVS15+5G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：23所示，所述第二引物为如SEQ IDNO：24所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：46所示；针对所述mt DNA基因的1494C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：29所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：30所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：51所示；以及针对所述mt DNA基因的1555A＞G突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：31所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：32所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：52所示，
优选进一步包括：
扩增产物净化装置，所述扩增产物净化装置分别与所述DNA样品扩增装置和所述扩增产物延伸装置相连，以便对所述扩增产物进行净化处理，并将经过净化的扩增产物输入至所述扩增产物延伸装置。
4.根据权利要求3所述的***，其特征在于，所述分子量检测装置为MALDI-TOF质谱装置。
5.根据权利要求4所述的***，其特征在于，进一步包括延伸产物纯化装置，
其中，
所述延伸产物纯化装置分别与所述扩增产物延伸装置和所述MALDI-TOF质谱装置相连，以便对所述延伸产物进行纯化处理，并将经过纯化的延伸产物输入至所述MALDI-TOF质谱装置，
优选所述延伸产物纯化装置为阴离子树脂。
6.一种诊断遗传性耳聋的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取怀疑患有遗传性耳聋的受试者的DNA样品；
根据权利要求1和2所述的方法对所述DNA样品中预定位点的突变进行分析；以及
基于所述DNA样品中存在所述预定位点的突变，确定所述受试者患有遗传性耳聋。
7.一种产前诊断遗传性耳聋的方法，其特征在于，包括以下步骤：
分离胎儿的DNA样品，优选所述胎儿的DNA样品是从绒毛膜、羊水或脐带血取样中提取的；
根据权利要求1或2所述的方法对所述胎儿的DNA样品中预定位点的突变进行分析；以及
基于所述胎儿的DNA样品中存在所述预定位点的突变，推测所述胎儿患有遗传性耳聋。
8.一种预测电子耳蜗效果的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取耳聋患者的DNA样品；
根据权利要求1或2所述的方法对所述DNA样品中预定位点的突变进行分析；
基于所述DNA样品中存在所述预定位点的突变，确定所述耳聋患者患有遗传性耳聋；
基于所述耳聋患者患有遗传性耳聋，预测电子耳蜗对于所述耳聋患者有效。
9.一种引物组合，其特征在于，包括：
扩增引物对，所述扩增引物对适于对DNA样品进行PCR扩增反应，以便获得扩增产物，所述扩增产物包含预定位点；以及
延伸引物，所述延伸产物适于利用ddNTP，以所述扩增产物为模板，进行寡核苷酸延伸反应，以便获得在所述延伸引物的3’端连接一个碱基的延伸产物，其中，所述延伸引物的3’端紧邻所述预定位点，
所述预定位点的突变为选自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因以及mtDNA的至少一种基因的突变，所述GJB2基因的突变为选自35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC的至少一种，所述GJB3基因的突变为选自位点538C＞T和547G＞A的至少一种，所述SLC26A4基因的突变为选自281C＞T、589G＞A、919-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G和IVS15+5G＞A的至少一种，以及所述mt DNA的突变为选自1494C＞T和1555A＞G的至少一种，所述扩增引物包括第一引物和第二引物，
其中，
针对所述GJB2基因的35delG突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：1所示，所述第二引物为如SEQ IDNO：2所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：33所示；针对所述GJB2基因的167delT突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：3所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：4所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：34所示；针对所述GJB2基因的176-191del16突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：5所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：6所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：35所示；针对所述GJB2基因的299_300delAT突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：7所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：8所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：36所示；针对所述GJB2基因的235delC突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：9所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：10所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：37所示；针对所述GJB3基因的538C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：11所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：12所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：38所示；针对所述GJB3基因的547G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：13所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：14所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：39所示；针对所述SLC26A4基因的281C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：15所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：16所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：40所示；针对所述SLC26A4基因的589G＞A突变，所述第一引物为如SEQ IDNO：17所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：18所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：41所示；针对所述SLC26A4基因的919-2A＞G突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：19所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：20所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：42所示；针对所述SLC26A4基因的1174A＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：21所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：43所示；针对所述SLC26A4基因的1226G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：21所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：44所示；针对所述SLC26A4基因的1229C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：21所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：22所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：45所示；针对所述SLC26A4基因的1975G＞C突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：25所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：26所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：47所示；针对所述SLC26A4基因的2027T＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：25所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：26所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：48所示；针对所述SLC26A4基因的2162C＞T突变，所述第一引物为如SEQID NO：27所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：28所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：49所示；针对所述SLC26A4基因的2168A＞G突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：27所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：28所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：50所示；针对所述SLC26A4基因的IVS15+5G＞A突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：23所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：24所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：46所示；针对所述mt DNA基因的1494C＞T突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：29所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：30所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：51所示；以及针对所述mt DNA基因的1555A＞G突变，所述第一引物为如SEQ ID NO：31所示，所述第二引物为如SEQ ID NO：32所示，所述延伸引物为如SEQ ID NO：52所示，
优选所述第一引物和第二引物的5’端均具有标签序列，所述标签序列为如SEQ ID NO：53所示。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求9所述的一种引物组合，
优选所述试剂盒用于选自检测DNA样品中预定位点的突变、诊断遗传性耳聋、产前诊断遗传性耳聋、以及预测电子耳蜗效果的至少一种。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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