CN106367491A - 检测耳聋易感基因的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种检测耳聋易感基因的试剂盒，即利用MALDI‑TOF质谱技术提供一种快速和准确检测GJB2、SLC26A4、12SrRNA耳聋易感基因的试剂盒。其主要的成分为PCR扩增引物SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32和质谱延伸引物SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:48，本发明所述试剂盒，采用质谱技术与多引物延伸技术相结合，使用的试剂耗材相对简单、成本低且稳定，且在一次反应中分析数十至数千份样本，减少配制试剂带来的损耗；具有高的灵敏度；准确性，检测一致性，提高了检测通量。

Description

检测耳聋易感基因的试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别涉及多重PCR扩增技术和基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术(MALDI-TOF-MS)结合，用以检测耳聋易感基因的方法和试剂盒。
背景技术
耳聋是一种严重影响人类生活质量的常见先天性疾病，它可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起，也可以由环境因素(如药物)或基因和环境两者共同作用。研究表明，遗传性耳聋具有高度的遗传异质性，基因诊断对耳聋患者及其家庭的临床评估具有十分重要的意义，耳聋责任基因鉴定工作是对患者进行分子诊断、检测基因携带者及产前诊断的前提之一。也是我们更好的理解潜在蛋白生理功能和疾病发生机制的第一步,反过来,这又是有效干预遗传性耳聋的起点。
1、GJB2的耳聋易感基因
GJB2突变为最常见的致聋基因，主要参与编码缝隙连接蛋白，在细胞间交流起重要作用，由该基因突变致聋的比例高达15％。对此基因检测不仅对遗传性听力损害、临床诊断和遗传咨询有重要帮助，还可对听力康复措施的选择有指导作用。
2、SLC26A4的耳聋易感基因
SLC26A4为另一常见的致聋基因突变，其在氯离子转移蛋白中起重要作用，由该基因突变致聋的比例高达12％。对于临床上颞骨CT提示前庭导水管扩大的耳聋患者应进行SLC26A4基因突变检测，在此类患者中，约95％可找到明确的致病突变。
3、线粒体12SrRNA的耳聋易感基因
线粒体12SrRNA基因A1555G和C1494T突变为常见的母系遗传药物性听觉发育缺陷致病突变，此突变检测在对患者明确病因的基础上，可对其他未患病的母系成员起到警示及预防的作用。需要注意的是，对于很多检测到线粒体A1555G和C1494T点突变的耳聋患者，A1555G和C1494T突变并非是他们耳聋的致病原因，因为近年来氨基糖甙类抗生素的临床应用在我国已受到严格控制，如果没有氨基糖甙类抗生素史，携带线粒体A1555G和C1494T突变的个体听力可长期保持正常。
遗传耳聋有很高的遗传异质性，与耳聋相关的基因至少有100个，目前传统基因检测包括酶切、限制性片段长度多态性等。这些传统方法或者不能定性，或者耗时费力，更重要的是这些方法难以同时对不同基因的多个突变位点进行检测。
MassArray分子量阵列技术是世界上领先的基因突变分析技术。MassArray结合了简单、可靠的引物延伸反应和先进的MALDI-TOF质谱技术，可以快速经济地进行基因型分析，达到目前市场上最高的准确率和性价比。基于MassArray分子量阵列平台的iPLEX GOLD技术可以便捷的设计多达40种的基因型检测。实验设计灵活，价格低廉。
发明内容
本发明的目的是利用MALDI-TOF质谱技术提供一种快速和准确检测GJB2、SLC26A4、12SrRNA耳聋易感基因的试剂盒。
本发明提供的一种检测耳聋易感基因的试剂盒。其中，所述耳聋易感基因选自GJB2、SLC26A4、线粒体12SRRNA中，所述耳聋易感基因由上述所列的耳聋易感基因组成。
具体的，所述检测耳聋易感基因的试剂盒中主要的成分为PCR扩增引物和质谱延伸引物(本发明所使用的引物均合成自上海生工生物)
1)PCR扩增引物：
PCR扩增引物为根据所选择的待检测的耳聋易感基因设计的特异性针对每种耳聋易感基因的扩增引物，所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列。所述扩增引物在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的15-25个碱基，在5'端具有标签序列，以区分扩增引物与延伸引物。
本发明的扩增引物选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32中；优选地，本发明的扩增引物包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32；最优选地，本发明的扩增引物由SEQ ID NO:1～SEQID NO:32组成。
2)质谱延伸引物：
质谱延伸引物的长度为15-28个碱基并且其3'端位于耳聋易感基因突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为耳聋易感基因突变位点。其中，延伸引物的野生型延伸产物与突变型延伸产物之间的分子量差异不小于9Da(Da＝道尔顿)，且各个相关突变位点的延伸产物间的分子量差异不小于30Da。按照引物间，引物与扩增产物/延伸产物间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物。特别地，用于质谱检测的延伸引物按照下列原则设计：各延伸产物的分子量相互间的差别不小于30Da，各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9Da，延伸引物与延伸产物的分子量在4500—8500Da之间。
本发明的延伸引物选自SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:48中；优选地，本发明的延伸引物包括SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:48；最优选地，本发明的延伸引物由SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:48组成。
优选地，根据本发明的检测耳聋易感基因的试剂盒包括：
PCR反应液Mix(购自Agena Bioscience公司)：10×PCR反应缓冲液、dNTP Mix(25mM)、MgCl2(25mM)。
PCR反应Taq酶(购自Agena Bioscience公司)；
SAP反应缓冲液(购自Agena Bioscience公司)；
SAP酶(购自Agena Bioscience公司)；
Extension反应液Mix(购自Agena Bioscience公司)：10×iplex反应缓冲液、iplex Termination Mix。
Extension反应Taq酶(购自Agena Bioscience公司)
MassARRAY芯片(购自Agena Bioscience公司)。
本发明上文所述的试剂盒的使用方法如下：
3)检测模板的制备：提取待测样本DNA。
本领域技术人员可以根据样本种类的不同，采用相应的商业化试剂盒提取样本DNA，如：临床样本(如口腔拭子、皮肤表面擦拭取样等)可采用Tiangen口腔拭子基因组DNA提取试剂盒，血液样本可采用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒等。
4)以步骤3)中提取的DNA为模板，使用步骤1)中的PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物。
5)通过SAP酶处理，除去步骤4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP。
6)以步骤5)中获得的扩增产物为模板，使用步骤2)中的质谱延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。
7)纯化步骤6)中获得的延伸产物。
8)将纯化后的产物在质谱仪上进行质谱检测。所得到的质谱峰图通过分析软件进行分析，得到分型结果。
与现有检测单核苷酸变异/多态性(SNP)、***缺失(indels)和拷贝数变异(CNV)技术相比，本发明具有以下优点：
1)质谱使用的试剂耗材相对简单且稳定，不需要特定荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂；在一次反应中分析数十至数千份样本，减少配制试剂带来的损耗；反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用。
2)由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比)且直接确定碱基的类型(即，不需要经过任何形式的信号转换)，因此，理论上只要有一个拷贝的扩增DNA片段被扩增即可识别，从而具有高的灵敏度；质谱技术检测准确性大于99％，检测一致性大于99.7％，检测基因分型灵敏度可达5％
3)自行设计PCR引物和探针，配制PCR反应混合物，一次反应可放大和扩展40条靶特异性DNA片段。进行一次完整的反应仅需要8个小时，使整个检测周转时间特别快速。
4)质谱技术还有自动化、高通量检测等特点。单次反应为96孔，每个反应孔实现多重反应(高达40重)，日检测样本可达300个，大大提高了检测通量。
5)快速有效的PCR样本处理后，运用质谱技术的样本自动化技术，可最大程度缩短手动操作时间，从而降低了手动操作相关的污染风险，在减少样本操作的同时获得高质量结果。
附图说明
图1表示以临床样本提取的DNA为模板，对12SrRNA基因进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6394Da的A峰位置，此数据表明该样本为纯合A，为野生纯合型样本的质谱峰图结果。
图2表示以临床样本提取的DNA为模板，对12SrRNA基因进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6314.2Da的G峰和6394Da的A峰位置，此数据表明该样本为杂合GA，为杂合型样本的质谱峰图结果。
图3表示以临床样本提取的DNA为模板，对12SrRNA基因进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6314.2Da的G峰位置，此数据表明该样本为纯合G，为突变纯合型样本的质谱峰图结果。
图4表示以临床样本提取的DNA为模板，对GJB2基因进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为4913.2Da的C峰位置，此数据表明该样本为纯合C，为GJB2基因第235位的没有缺失的野生纯合型样本的质谱峰图结果。
图5表示以临床样本提取的DNA为模板，对GJB2基因进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为4873.2Da的del峰位置，此数据表明该样本为纯合del，为GJB2基因第235位的缺失的突变纯合型样本的质谱峰图结果。
图6表示以临床样本提取的DNA为模板，对GJB2基因进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为4873.2Da的del峰和4913.2Da的C峰位置，此数据表明该样本为杂合del/C，为GJB2基因第235位的没有缺失的杂合型样本的质谱峰图结果。
图7表示以临床样本提取的DNA为模板，对SLC26A4基因进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5825.7Da的A峰位置，此数据表明该样本为纯合A，为野生纯合型样本的质谱峰图结果。
图8表示以临床样本提取的DNA为模板，对SLC26A4基因进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5825.7Da的A峰和5748Da的G峰位置，此数据表明该样本为杂合A，为杂合型样本的质谱峰图结果。
图9表示以临床样本提取的DNA为模板，对SLC26A4基因进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5748Da的G峰位置，此数据表明该样本为纯合G，为突变纯合型样本的质谱峰图结果。
具体实施方式
下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法。
引物序列由上海生工合成，PCR扩增试剂、SAP酶、Extension反应液和MassARRAY芯片均购自Agena Bioscience公司，PCR扩增仪为AB公司9700型号，质谱分析仪为AgenaBioscience公司MassARRAY Compact Analyzer。
实施例1引物的设计
(1)PCR扩增引物：
根据所选择的耳聋易感基因，设计出特异性针对每种耳聋易感基因的扩增引物，扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列。所述扩增引物在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的至少15个碱基，在5'端具有10个碱基(acgttggatg)的标签序列，以区分扩增引物与延伸引物。
(2)质谱延伸引物：
设计延伸引物，所述延伸引物的长度为15-28个碱基，并且其3'端位于相关突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为相关突变位点。
本发明设计的针对所述的耳聋易感基因突变位点信息如表1所示，扩增引物参见表2，延伸引物参见表3。
表1：耳聋易感基因突变信息
表2：针对所述PCR扩增的PCR扩增引物序列
表3：针对所述延伸反应的质谱延伸引物
实施例2
样本的制备
取样方式：使用棉签在面颊内擦拭15次。
提取DNA(采用Tiangen DNA试剂盒提取，操作方法按照试剂盒说明书提取)。
实施例3耳聋易感基因的检测方法
(1)以实施例2中提取的DNA为模板，使用实施例1中的PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物。PCR扩增反应体系参见表4。其中，所有试剂购买自Agena Bioscience公司。
表4：PCR扩增反应体系
PCR反应条件为94℃，2分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增45循环；最终72℃延伸5分钟，在本实施例中，使用实施例2中提取的DNA作为PCR扩增的DNA模板。同时，将无菌双蒸水作为阴性对照。将对照样本与待测样本按照相同的反应过程进行反应和测试，以验证检测的有效性。
(2)通过SAP酶处理，除去步骤(1)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP。SAP酶反应体系见表5。所有试剂购买自Agena Bioscience公司。
表5：SAP酶反应体系
试剂 体积/反应
水(HPLE级) 1.53μl
SAP酶缓冲液 0.17μl
SAP酶 0.30μl
步骤(1)中获得PCR扩增产物 5.0μl
总体积 7.0μl
SAP酶反应条件为37℃温育40分钟，以去除PCR扩增反应中剩余的dNTP；85℃温育5分钟，以使SAP酶失活。
(3)以(2)中获得的扩增产物为模板，使用实施例1中的质谱延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。延伸反应体系见表6。所有试剂购买自Agena Bioscience公司。
表6：延伸反应体系
试剂 体积/反应
水(HPLE级) 0.619μl
iPLEX缓冲液 0.200μl
iPLEX ddNTP混合物 0.200μl
表3中的延伸引物混合物 *0.940μl
iPLEX酶 0.041μl
步骤(3)中获得的产物 7.00μl
总体积 9.00μl
*其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大小进行线性关系调整，即根据每种延伸引物的分子量计算每种引物的使用量，以及水(HPLE级)的使用量。混合不同体积的延伸引物到新管中，并加上水至目标体积，制成品就是延伸引物混合物。
表7：延伸引物混合物配制体系
基因名称 加引物量(ul) 加水量(ul)
12S_rRNA_1494 10 30.66
12S_rRNA_1555 10 19.32
GJB2_167 10 34.32
GJB2_235 10 32.15
GJB2_299 10 19.86
GJB2_35 10 17.97
SLC26A4_1174 10 28.60
SLC26A4_1229 10 23.39
SLC26A4_1975 10 34.02
SLC26A4_2027 10 22.37
SLC26A4_2162 10 20.87
SLC26A4_281 10 18.81
SLC26A4_589 10 26.14
SLC26A4_IVS15+5 10 19.22
SLC26A4_VS7-2 10 22.96
SLC26A4_1226 10 35.59
延伸反应条件为94℃，30秒；94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72℃延伸3分钟。
(4)采用洁净树脂resin(购买自Agena Bioscience公司)纯化步骤(3)中获得的延伸产物。在延伸产物中加入6mg洁净树脂，16.00μl水，垂直摇匀一小时。经过本步反应后，洁净树脂将与反应体系中的阳离子充分结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4℃保存数天，也可在-20℃保存数周。所得的纯化产物在4000rpm离心5分钟后，取上清直接用于质谱检测。
(5)将纯化后的产物在Agena Bioscience MALDI-TOF质谱仪上进行质谱检测。所得到的质谱峰图通过Typer4.0分析软件(由Agena Bioscience公司提供)进行分析，得到分型结果。
检测结果：质谱峰图分析结果如图1～9所示。

Claims (4)

1.检测耳聋易感基因的试剂盒，其特征在于：包括PCR扩增引物和质谱延伸引物，其中：所述的PCR扩增引物选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32中；所述的质谱延伸引物选自SEQ IDNO:33～SEQ ID NO:48中。
2.根据权利要求1所述的检测耳聋易感基因的试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增引物包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32；所述的延伸引物包括SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:48。
3.根据权利要求1所述的检测耳聋易感基因的试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增引物由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32组成；所述的延伸引物由SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:48组成。
4.根据权利要求1所述的检测耳聋易感基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括以下缓冲液成分：
10×PCR反应缓冲液、浓度为25mM的dNTP Mix、浓度为25mM的MgCl2、PCR反应Taq酶、SAP反应缓冲液、SAP酶、10×iplex反应缓冲液、iplex Termination Mix、Extension反应Taq酶、MassARRAY芯片。
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