CN102406943B - 人成纤维细胞生长因子-21的聚乙二醇化学修饰物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质修饰物领域，具体而言，本发明公开了人成纤维细胞生长因子-21的聚乙二醇化学修饰物，所述修饰物的活性是等摩尔量的未缀合的FGF-21的活性的40%以上。本发明还公开了该修饰产物的制备方法，其不但能制备该修饰产物，而且还能够回收未修饰的FGF-21。另外，本发明还公开了该修饰产物在制备用于调节糖代谢的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质修饰物领域，具体而言，本发明涉及用聚乙二醇修饰的人成纤维细胞生长因子-21的修饰产物及其制备方法和应用。
背景技术
成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，简称为FGF）-21是FGF家族的一个新成员，是一种分泌蛋白，最早从鼠胚胎中分离出来。人的FGF-21cDNA编码209个氨基酸，与鼠的FGF-21的氨基酸序列大约有75%的同源性。迄今为止FGF-21的生物活性作用方式主要体现在降低血糖、改善血脂方面（降低血糖的同时不导致低血糖），可用于治疗Ⅱ型糖尿病，并且对药物引发的早期肝癌有一定的治疗作用，另外在胚胎发育中的也能起到一定作用。
FGF-21的广泛的生物学活性表明其在医疗上有广泛的应用前景。但大量研究和临床实践表明FGF-21存在稳定性差、体内半衰期短以及存在免疫原性等缺陷。因此如何提高FGF-21稳定性、延长其体内半衰期成为一个重要的课题。因此，美国礼来公司等利用聚乙二醇(polyethylene glycol，简称为PEG)来对FGF-21进行修饰，用以提高FGF-21稳定性、延长其体内半衰期（可参见WO2009020802A、WO2008011633A、WO2006091727A、WO2006050247A、WO2005091944A等）。但是这些技术多数属于定点PEG化，甚至为了PEG化而突变FGF-21蛋白本身的氨基酸残基，除了部分实验验证的意外，将导致突变后的FGF-21蛋白是否能具有原有功能的不可预料性。
然而，非定点PEG化蛋白质尽管相对于定点PEG化蛋白质的制备方式简单些，成本通常也较低，但是，PEG通过活性基团与蛋白质的末端或侧链连接，理论上将造成蛋白质本身折叠构型的改变，因此，该蛋白质经PEG化是否仍旧具有原有蛋白功能并起相应作用，是难以预料的。Harris等（Clinical Pharmocokinetics，2001，40（7）：539-551）明确指出，PEG的大小、几何特征和连接位点等均对最终PEG化的产物构成关键的影响，有众多因素可能影响蛋白质的PEG化，包括但不限于：
1，不同的氨基酸序列所能提供的连接位点数目不同；
2，蛋白质结构可能会将连接位点包埋在内部，从而在一定条件下的PEG化将使蛋白质结构翻转；
3，蛋白质结构可能会使PEG在连接位点处形成空间位阻，造成蛋白质折叠的不可逆转变；
4，可能在PEG化后破坏蛋白质的配体-受体结合界面；
5，不同的PEG化模式可能导致不同程度的抗原性；
6，不同的PEG化模式可能导致不同的清除率；
7，不同的清除机制需要不同程度的PEG连接和/或不同的PEG连接位点；
8，不同的PEG化模式可能导致不同的半衰期以满足蛋白质在生理环境下发挥其功能的要求。
因此，蛋白质的PEG化是不可预测的。另外，Clark等（Journal of Biological Chemistry， 1996， 271（36）：21969-21977）也公开了PEG化后蛋白质功能的不可预测性的例证。
因此，本发明人经过长期努力，发现某些FGF-21的非定点PEG化模式将导致FGF-21本身的蛋白活性极大降低，甚至蛋白功能消失，而必须采用一些经过实验验证的FGF-21的非定点PEG化模式才能具有原有蛋白功能，不大幅降低原有蛋白活性，从而可以调节血糖、血脂代谢，用于实际的II型糖尿病等治疗用途中。当然，这些经过实验验证的FGF-21的非定点PEG化模式仍旧保留了PEG化本身的优点，如热稳定性好、抗酶解能力高、体内半衰期长、免疫原性低和安全性好等。另外，这些经过实验验证的FGF-21的非定点PEG化模式，产物均一性好、分离纯化工艺简单，尤其还可以方便地回收未与PEG缀合的FGF-21。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种热稳定性好、抗酶解能力高、体内半衰期长、免疫原性低和安全性好的FGF-21的修饰物，其不大幅降低原有未修饰的蛋白活性，从而具有FGF-21蛋白功能，可以调节血糖、血脂代谢。本发明另一个要解决的技术问题还在于提供上述修饰物的制备方法，其产物均一性好、分离纯化工艺简单，尤其还可以方便地回收未与PEG缀合的FGF-21。
为实现上述目的，本发明提供了一种人成纤维细胞生长因子-21的聚乙二醇化学修饰物，也即聚乙二醇（简称为PEG）与人成纤维细胞生长因子-21（简称为FGF-21）的缀合物，所述修饰物的活性是等摩尔量的未缀合的FGF-21的活性的40%以上，优选70%以上，更优选80%以上。
其中优选的连接基团是马来酰亚胺或丁醛，更优选其中的聚乙二醇是甲（氧）基聚乙二醇（简称为mPEG），这样聚乙二醇一端的羟基被甲基封闭，只有一端可以连接到连接基团上并进而连接到FGF-21上，从而不形成多个FGF-21蛋白的交联形式的产生，防止FGF-21交联凝集而变性。因此，在本发明的缀合物优选是由FGF-21与mPEG-马来酰亚胺缀合而成的，或者是由FGF-21与mPEG-丁醛缀合而成的。其中，mPEG-马来酰亚胺是mPEG与连接基团马来酰亚胺结合的物质，mPEG-丁醛是mPEG与连接基团丁醛结合的物质，这些物质都可以从市场渠道购买。
更优选在本发明的缀合物中，mPEG的分子量介于4kDa-22kDa，如5kDa、10kDa、15kDa、或20kDa。也优选本发明的缀合物是由包括以下步骤的制备方法制备而得的：
（1）FGF-21与mPEG-马来酰亚胺或mPEG-丁醛混合，避光反应后，终止反应；
（2）将步骤（1）中的反应产物过Sephedax G-25柱除盐，然后上样于QAE-Sephadex A50阴离子交换柱并用含200mM NaCl的PB 缓冲液洗脱，收集洗脱峰。优选其中FGF-21与mPEG-马来酰亚胺或mPEG-丁醛的摩尔比介于1∶8-1∶65，如1∶10、1∶20、1∶30、或1∶60；也优选其中步骤（1）和/或（2）的pH介于5.5-9.5，如6、7、8、或9。
为了在制备的缀合物的同时回收未修饰的FGF-21，节约生产成本，在上述制备步骤之后还可以加上以下回收步骤：
（3）用含500mM NaCl的PB缓冲液洗脱步骤（2）中的QAE-Sephadex A50阴离子交换柱，收集洗脱峰，得未修饰的FGF-21。
附图说明
图1为修饰产物的SDS-PAGE分析图，其中M为分子量标记，E为未修饰的FGF-21，A为实施例三的修饰的FGF-21和回收的未修饰的FGF-21的混合样品，B为实施例七的修饰的FGF-21和回收的未修饰的FGF-21的混合样品，C为实施例八的修饰的FGF-21和回收的未修饰的FGF-21的混合样品，D为实施例九的修饰的FGF-21和回收的未修饰的FGF-21的混合样品。
图2显示了20KdPEG修饰对FGF-21在大鼠血清中热稳定性的影响，在上的曲线表示PEG修饰的FGF-21随保温时间的延长而保留的活性百分比，在下的曲线表示未经PEG修饰的FGF-21随保温时间的延长而保留的活性百分比，结果表明FGF21经PEG修饰后热稳定性显著提高。
图3显示了20Kd PEG修饰对FGF-21抗胰蛋白酶解能力的影响，实心表示PEG修饰的FGF-21随保温时间的延长而在胰蛋白酶溶液中保留的活性百分比，空心柱表示未经PEG修饰的FGF-21随保温时间的延长而在胰蛋白酶溶液中保留的活性百分比，结果表明表明FGF21经PEG修饰后抗胰蛋白酶稳定性显著提高。
图4显示了20Kd PEG修饰后的FGF21对Ⅱ型糖尿病大鼠模型的血糖水平的影响，斜状柱表示给药前的Ⅱ型糖尿病大鼠血糖水平，黑色实心柱表示给药后的Ⅱ型糖尿病大鼠血糖水平，结果显示PEG-FGF21对Ⅱ型糖尿病具有潜在的治疗作用。
具体实施方式
本发明实施例所用的试剂均为现有技术，如，FGF-21为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白质；带有活性接头分子的PEG可购自美国Shearwater公司。
实施例一 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10mlPB缓冲液（10mM，PH=6.0）中的10mgFGF-21与mPEG-马来酰亚胺（PEG分子量：5000Da）以摩尔比1∶10混合，放置于4℃，避光反应2小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用10mM PB缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，10mM PB缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用10mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的10mM PB 缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM PB缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施例二 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10ml PB缓冲液（10mM，PH=7.0）中的10mg FGF-21与mPEG-马来酰亚胺（PEG分子量：10000Da）以摩尔比1∶20混合，放置于4℃，避光反应2小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用10mM PB缓冲液（pH=7.0）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，10mM PB缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用10mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的10mM PB 缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM PB缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施三 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10mlPB缓冲液（10mM，PH=8.0）中的10mg FGF-21与mPEG-马来酰亚胺（PEG分子量：20000Da）以摩尔比1：30混合，放置于4℃，避光反应2小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用10mM PB缓冲液（pH=8.0）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，10mM PB缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用10mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的10mM PB 缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM PB缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施四 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10mlPB缓冲液（10mM，PH=9.0）中的10mg FGF-21与mPEG-马来酰亚胺（PEG分子量：15000Da）以摩尔比1：60混合，放置于4℃，避光反应2小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用10mM PB缓冲液（pH=9.0）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，10mM PB缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用10mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的10mM PB 缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM PB缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施五 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10mlPB缓冲液PB缓冲液（10mM，PH=6.0）中的10mg FGF-21与mPEG-马来酰亚胺（PEG分子量：5000Da）以摩尔比1：30混合，放置于4℃，避光反应4小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用10mM PB缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，10mM PB缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用10mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的10mM PB 缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM PB缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施六 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10mlPB缓冲液（10mM，PH=6.0）中的10mg FGF-21与mPEG-马来酰亚胺（PEG分子量：10000Da）以摩尔比1∶30混合，放置于25℃，避光反应4小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用10mM PB缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，10mM PB缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用10mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的10mM PB 缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM PB缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施七 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10mlPB缓冲液（10mM，PH=7.0）中的10mg FGF-21与mPEG-马来酰亚胺（PEG分子量： 20000Da）以摩尔比1∶30混合，放置于25℃，避光反应4小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用10mM PB缓冲液（pH=7.0）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，10mM PB缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用10mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的10mM PB 缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM PB缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施例八 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10ml醋酸钠缓冲液（20mM，PH=6.0）中的10mg FGF-21与mPEG-丁醛（PEG分子量：20000Da）以摩尔比1∶30混合，放置于25℃，避光反应4小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用20mM醋酸钠缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，20mM醋酸钠缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用20mM醋酸钠缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的20mM 醋酸钠缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM醋酸钠缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施例九 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10ml醋酸钠缓冲液（20mM，PH=6.0）中的10mg FGF-21与mPEG-丁醛（PEG分子量：20000Da）以摩尔比1∶10混合，放置于25℃，避光反应4小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用20mM醋酸钠缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，20mM醋酸钠缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用20mM醋酸钠缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的20mM 醋酸钠缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM醋酸钠缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施例十 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10ml醋酸钠缓冲液（20mM，PH=7.0）中的10mgFGF-21与mPEG-丁醛（PEG分子量：5000Da）以摩尔比1∶20混合，放置于4℃，避光反应2小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用20mM醋酸钠缓冲液（pH=7.0）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，20mM醋酸钠缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用20mM醋酸钠缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的20mM 醋酸钠缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM醋酸钠缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施例十一 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10ml醋酸钠缓冲液（20mM，PH=8.0）中的10mg FGF-21与mPEG-丁醛（PEG分子量：10000Da）以摩尔比1∶30混合，放置于4℃，避光反应2小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用20mM醋酸钠缓冲液（pH=8.0）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，20mM醋酸钠缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用20mM醋酸钠缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的20mM 醋酸钠缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM醋酸钠缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施例十二 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10ml醋酸钠缓冲液（20mM，PH=9.0）中的10mg FGF-21与mPEG-丁醛（PEG分子量： 20000Da）以摩尔比1∶60混合，放置于4℃，避光反应2小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用20mM醋酸钠缓冲液（pH=9.0）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，20mM醋酸钠缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用20mM醋酸钠缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的20mM 醋酸钠缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM醋酸钠缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施例十三 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10mlPB缓冲液（10mM，PH=9.0）中的10mg FGF-21与mPEG-马来酰亚胺（PEG分子量：15000Da）以摩尔比1∶65混合，放置于4℃，避光反应2小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用10mM PB缓冲液（pH=9.5）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，10mM PB缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用10mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的10mM PB 缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM PB缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施例十四 聚乙二醇-FGF-21的制备
1、修饰反应：将溶解于10mlPB缓冲液（10mM，PH=6.0）中的10mgFGF-21与mPEG-马来酰亚胺（PEG分子量：5000Da）以摩尔比1∶8混合，放置于4℃，避光反应2小时。加入1M甘氨酸1ml终止修饰反应。
2、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用10mM PB缓冲液（pH=5.5）平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，10mM PB缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用10mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的10mM PB 缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物；用含500mM NaCl的10mM PB缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白。然后，将FGF-21的PEG修饰物按前述步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
实施例十五 聚乙二醇-FGF-21的SDS-PAGE分析
将上述实施例三、七和十收集到的修饰纯品，采用SDS-PAGE电泳法检测，分离胶12％，浓缩胶5％。电泳结束后，将胶体放入装有50ml固定液的培养皿中（甲醇16ml，甲醛20μl,重蒸水24ml），在摇动下固定10-30分钟；取出胶体，水洗两次，每次5分钟;再放入0.02％的硫代硫酸钠溶液中，1分钟;水洗两次，每次20秒；放入装有30ml左右的0.1％的硝酸银溶液中，在摇动下染色10-30分钟；取出胶体，水洗一次，加入小体积的硫代显影液（无水碳酸钠1.5g,2％硫代硫酸钠200μl，甲醛25μl），再转入30-50ml的硫代显影液中，缓慢摇动至足够的显影强度。结果如图1所示，根据图像分析，纯度均达到95%以上。
实施例十六 聚乙二醇-FGF-21的促进糖吸收水平检测
小鼠3T3-L1细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基培养和维持3T3-L1成纤维细胞（即前脂肪细胞）。用脂肪细胞分化液进行分化，当脂肪细胞分化成功后，用KRPH缓冲液（15 mmol/L Hepes, 118 mmol/L NaCl, 4.8 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L MgSO4, 1.3 mmol/L CaCl2, 1.2 mmol/L KH2PO4, 0.1% BSA, pH 7.4）稀释未修饰的FGF-21（对照）和PEG-FGF-21，用不同摩尔浓度的蛋白作用细胞24小时，用KRPH缓冲液洗2次，每孔加入KRPH 缓冲液100微升[含100 μmol/L 14C 标记的 2-脱氧-D-葡萄糖（中国同位素公司）]。在37oC反应1小时后，加入Cytochlasin B（20 μmol/L，Sigma）终止反应。用小容量液体闪烁计数器检测葡萄糖吸收效率。结果表明，FGF-21经PEG修饰后，实施例一、三、七和十一收集到的修饰纯品的生物活性保存率均达到40%以上，其中实施例一制备的PEG-FGF-21的生物活性保存率可达到82%，实施例三制备的人成纤维细胞生长因子-21的聚乙二醇化学修饰物（即PEG-FGF-21）的生物活性保存率可达到72.3%。
实施例十七 聚乙二醇-FGF-21的热稳定性研究
取大鼠血液，4℃、8000 r/min离心，取上清制得大鼠血清，分别取含等物质量FGF-21和PEG-FGF-21各0.6 ml，与大鼠血清2.4 ml混匀，37℃保温；分别于2、4、8、24和48 h取样，– 20℃保存，以空白大鼠血清作为对照，采用上述实施例十三描述的方法法测定各样品生物活性，并以修饰前蛋白（FGF-21）为对照，以如下反应条件获得的PEG-FGF-21为例，计算活性保存率。结果如图2所示：修饰产物PEG-FGF-21在37℃保温96小时后，实施例三制备的PEG-FGF-21活性保存率为70.8%，而未修饰的FGF-21活性保存率25.1%，前者在大鼠血清中热稳定性明显高于后者。
实施例十八 聚乙二醇-FGF-21的抗酶解能力检测
分别取含等物质量的FGF-21和实施例三制备的PEG-FGF-21各0.4 ml，与2 mmol/L胰蛋白酶溶液0.4 ml混匀，最终蛋白与胰蛋白酶的物质量比为100∶1，37℃保温，于0、1、5、10、15、20、40和60 min取混合样0.1 ml，立即与无血清RPMI 1640培养基混匀（样品体积：培养基体积 = 1∶10），以终止胰蛋白酶的作用。
将处理后的各样品进行SDS-PAGE电泳分析，并将获得的凝胶采用凝胶扫描分析，观察蛋白质被胰蛋白酶的降解情况。结果如图3所示，表明保温20min后，修饰产物PEG-FGF-21的含量与酶解前相比仍然存留35.6%，而未修饰产物基本被完全降解，由此可见，修饰后的FGF-21抗胰蛋白酶水解能力明显增加。
实施例十九 聚乙二醇-FGF-21降低Ⅱ型糖尿病大鼠血糖水平检测
取Wistar大鼠64只，其中8只给予正常饮食，其余56只给予连续两个月过量饮食并形成肥胖大鼠，将56只肥胖大鼠每只注射35 mg/kg的STZ(streptozotocin)，以构建Ⅱ型糖尿病大鼠模型，将Ⅱ型糖尿病大鼠模型分成4组，第一组给予1×10-8mol/kg浓度的PEG-FGF21（低剂量组）；第一组给予2×10-8mol/kg浓度的PEG-FGF21（中剂量组）；第一组给予4×10-8mol/kg浓度的PEG-FGF21（高剂量组）；第四组为注射0.9% （w/w）NaCl的生理盐水对照组。每天给药连续一周后大鼠胃部取血，采用临床化学分析仪检测大鼠血液中的血糖水平。结果表明，相比于给药前，无论是低剂量、中剂量还是高剂量组，PEG-FGF21均能有效的降低Ⅱ型糖尿病大鼠模型的血糖水平；而生理盐水对照组，相比给药前，血糖水平反而升高，这充分说明了PEG-FGF21对Ⅱ型糖尿病具有潜在的治疗作用。
Claims (5)
1.一种人成纤维细胞生长因子-21的聚乙二醇化学修饰物，其特征是由以下制备方法制备而得的，所述方法包括以下步骤：
（1）将溶解于10mL 10mM、pH=6.0的PB缓冲液中的10mg FGF-21与PEG分子量为5000Da的 mPEG-马来酰亚胺以摩尔比1∶10混合，放置于4℃，避光反应2小时，加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应；
（2）将步骤（1）中的反应液，过20cm×1.5cm的Sephedax G-25柱除盐：采用10mM pH=6.0的PB缓冲液平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，10mM PB缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；
（3）过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用10mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的10mM PB 缓冲液洗脱，流速为1mL/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物，用含500mM NaCl的10mM PB缓冲液洗脱，流速为1mL/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白，然后，将FGF-21的PEG修饰物按步骤（2）的步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
2.一种权利要求1所述的人成纤维细胞生长因子-21的聚乙二醇化学修饰物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将溶解于10mL 10mM、pH=6.0的PB缓冲液中的10mg FGF-21与PEG分子量为5000Da的 mPEG-马来酰亚胺以摩尔比1∶10混合，放置于4℃，避光反应2小时，加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应；
（2）将步骤（1）中的反应液，过20cm×1.5cm的Sephedax G-25柱除盐：采用10mM pH=6.0的PB缓冲液平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，10mM PB缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；
（3）过Sephedax G-25柱除盐后，上QAE-Sephadex A50阴离子交换柱：用10mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，用含200mM NaCl的10mM PB 缓冲液洗脱，流速为1mL/min，收集洗脱峰，即为FGF-21的PEG修饰物，用含500mM NaCl的10mM PB缓冲液洗脱，流速为1mL/min，收集洗脱峰，得未修饰FGF-21蛋白，然后，将FGF-21的PEG修饰物按步骤（2）的步骤过Sephedax G-25柱除盐后，即得FGF-21的PEG修饰物纯品。
3.权利要求1所述的人成纤维细胞生长因子-21的聚乙二醇化学修饰物在制备用于调节糖代谢的药物中的应用。
4.权利要求1所述的人成纤维细胞生长因子-21的聚乙二醇化学修饰物在制备用于调节脂代谢的药物中的应用。
5.权利要求1所述的人成纤维细胞生长因子-21的聚乙二醇化学修饰物在制备用于预防或治疗Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。
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