CN101928704A - 黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物,聚乙二醇和黄曲霉尿酸氧化酶以共价键连接,每个黄曲霉尿酸氧化酶分子亚基平均结合2~10个聚乙二醇分子,聚乙二醇分子的平均分子量为4kd-9kd,聚乙二醇修饰黄曲霉尿酸氧化酶的酶比活性为5.0-10.0U/mg。其制备方法是采用以下技术方案实现的:纯度大于95%的重组黄曲霉尿酸氧化酶蛋白,采用平均分子量为4kd-9kd的活化聚乙二醇分子在pH值5~10、温度4~37℃、时间0.1~10小时进行修饰,聚乙二醇分子和黄曲霉尿酸氧化酶的质量比为3∶1~20∶1。本发明的聚乙二醇修饰的黄曲霉尿酸氧化酶实现了高比活、长半衰期、低免疫原性、高稳定性、低成本等诸方面的均衡,具有产业化价值。
Description
技术领域
涉及一种治疗痛风和高尿酸血症的黄曲霉尿酸氧化酶修饰物,尤其涉及一种活性高的黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物及其制备方法。
背景技术
人体嘌呤代谢的最终产物是尿酸,与其他自身表达有活性尿酸氧化酶的物种不同,尿酸不能被进一步氧化分解为容易排除体外的尿囊素。在疾病、遗传或者饮食等因素的影响下,尿酸会在血液、尿液及组织液中积累,浓度逐渐升高,当超过了其溶解度时,就会增加肾脏负担,造成肾功能的损伤,特别是长期的尿酸水平升高,会导致尿酸盐结晶在血流相对不太丰富的关节、皮下组织沉积,形成痛风石。不定期的痛风发作,不但病人非常痛苦,还有可能造成关节畸形、致残。
目前治疗痛风主要使用抗炎药物和降尿酸药物,代表性药物有秋水仙碱、非甾体抗炎药、肾上腺皮质激素、别嘌呤醇、丙磺舒、溴苯马龙等,这些药物都需要长期服药,而且具有明显的副作用。尿酸氧化酶(Urate Oxidase,UOX)能够有效分解尿酸为更容易排除体外的尿囊素,其降低尿酸水平的作用方式与其他药物不同,给药后迅速发挥降尿酸作用,副作用小。2002年美国食品药品监督管理局批准原型重组尿酸氧化酶Rasburicase用于治疗儿童肿瘤放化疗引起的高尿酸血症。近几年有尿酸氧化酶用于痛风治疗的临床研究报道,特别是不能耐受别嘌呤醇治疗的患者(Rasburicase for tophaceus gout treatment,Ribeiro A et al,ActaReumatol Port.2009 Jul-Sep;34(3):551-4;Urate oxidase(rasburicase)for treatment ofsevere acute gout:a case report,Wipfler-Freiβmuth E.et al,Clin Exp Rheumatol.2009Jul-Aug;27(4):658-660),取得了很好的治疗效果。但是原型重组尿酸氧化酶在体内半衰期短,免疫原性强,限制了其在痛风治疗中的应用。
用聚乙二醇(Polyethlene glycol,PEG)修饰尿酸氧化酶来降低免疫原性、延长半衰期已有多份报道。中国专利CN1322141A中,发明人对早期的研究作了总结,见说明书第6-8 页“表1:先前研究中PEG-尿酸氧化酶的特征”。上述表1共总结了14份先前的研究文件,其中采用假单丝酵母来源地尿酸氧化酶的文献11份,来源于猪肝的尿酸氧化酶的文献1份,未报道尿酸氧化酶来源的文献2份。表1所列文献采用的PEG分子类型包括5KD线形PEG(9份)、2*5KD分支PEG(3份)以及0.7、7.5、10KD线形PEG各1份。表1所列文献总体上揭示了PEG修饰活性蛋白质的一股性规律,即随着PEG修饰程度的增高,所修饰的尿酸氧化酶的活性相对于天然酶活性降低,同时修饰产物的免疫原性降低。但是,上述文献并没有揭示出一种技术方案,该技术方案制备的PEG-尿酸氧化酶的剩余酶活性、半衰期、免疫原性能够满足临床用药的要求。
在CN1322141A中,发明人公开了修饰的尿酸氧化酶活性保持在原型酶75%以上的修饰方案,PEG的修饰程度(以每个尿酸氧化酶亚基偶联的PEG分子的数量计)随不同来源地的尿酸氧化酶、不同分子量的PEG分子而不同。例如,猪-狒狒嵌合UOX,PEG分子量在2-10条/亚基,酶活性均能保持在75%以上,然而,大豆UOX仅在2条/亚基时,才能保持75%以上的活性;对于黄曲霉UOX,当5KD的PEG为12条/亚基或30KD的PEG为7条/亚基,能保持75%以上的活性;对于球形节杆菌UOX,则仅在30KD的PEG为2条/亚基时,才能保持75%以上的活性。发明人的研究结果揭示了一种趋势,随着修饰程度的增加,尿酸氧化酶的活性总体上趋于下降。发明人研究结果显示的另一方面是:大分子量的PEG(10-30KD)相对于小分子量的PEG(5KD)修饰物,能保持更高的活性。发明人的研究结果还显示,相对于单假丝酵母、黄曲霉、大豆来源地尿酸氧化酶,来源于猪的尿酸氧化酶,尤其是一种猪-狒狒嵌合的尿酸氧化酶,经PEG修饰后能保持更高的酶活性。见图1-图5、实施例4-12。
Savient Pharmaceuticals Inc.正在开发PEG修饰的猪-狒狒嵌合尿酸氧化酶新药,用于痛风治疗。该产品用分子量10KD的PEG进行修饰,每个尿酸氧化酶亚基结合9±1个PEG分子(Briefing Document for KRYSTEXXATM(pegloticase)for IV infusion,BLA 125293,Savient Pharmaceuticals Inc.,Page 27 of 161),产品比活性为其原型蛋白活性(2.3-5.6U/mg)的95%(Pegloticase,a polyethylene glycol conjugate of uricase for thepotential intravenous treatment of gout,Biggers K,Scheinfeld N.,Curr Opin Investig Drugs. 2008Apr;9(4):422-9)。
中国专利CN1561390A公开了来源于假丝酵母的尿酸氧化酶的PEG修饰,发明人的研究结果显示,结合平均19条分子量5KDPEG的PEG-尿酸氧化酶,比活性为5.8IU/mg,小鼠体内的半衰期为6小时;而结合相同数目20KDPEG的PEG-尿酸氧化酶,比活性为7.8IU/mg,小鼠体内的半衰期为3天。
中国专利CN101327327A公开了聚乙二醇修饰黄曲霉尿酸氧化酶及其制备工艺的专利,采用分子量为20kd的聚乙二醇通过半胱氨酸进行修饰,产品活性未做报道。根据YasujiKoyama等(1996)Cloning,Sequence Analysis,and Expression in Escherichia coli of theGene Encoding the Candida utilis Urate Oxidase(Uricase),J.Biochem.120,969-973,黄曲霉尿酸氧化酶分子每个亚基有三个游离半胱氨酸,其中Cys103在分子表面活性中心附近,另外两个半胱氨酸Cys35和Cys290分布在四聚体分子的内部孔道。因此,用大分子PEG修饰黄曲霉尿酸氧化酶分子表面的半胱氨酸,PEG分子影响底物与酶的结合而使酶活性大大降低。如果进行多点修饰,则首先需要使分子内部的两个半胱氨酸暴露出来,采用破坏分子内部疏水作用力的变性试剂如高浓度尿素、盐酸胍可以使半胱氨酸充分暴露进行修饰,但酶活性相应地会失去。
中国专利CN101302501A公开了N末端修饰的PEG-尿酸氧化酶,其中尿酸氧化酶为来源于黄曲霉的重组尿酸氧化酶,PEG为分子量为20KD、40KD的N末端选择性PEG,修饰反应的效率达到61%,39%的原型蛋白没有得到修饰,因此修饰产物的收率较低,制剂成本高。
现有技术中PEG修饰的尿酸氧化酶,有的活性偏低,因此给药量要提高,而尿酸氧化酶作为人体的异源蛋白,较高的用药量意味着用药的风险加大;现有技术认为用大分子量的PEG修饰产物半衰期较长和/或活性保持较好,但大分子量的PEG存在成本高等问题;有的修饰方法修饰效率不高和/或产品稳定性不理想。因此寻找一种酶活性高、半衰期长、免疫原性低、产品稳定性好且成本低的尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物对于痛风及慢性高尿酸血症患者的治疗具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种活性高、免疫原性低、稳定性好的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶制剂,用于痛风及慢性高尿酸血症特别是不能接受其他药物治疗的痛风患者的需求。
为实现上述目的,本发明采用了以下技术方案:
黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物,聚乙二醇和黄曲霉尿酸氧化酶以共价键连接,每个黄曲霉尿酸氧化酶分子亚基平均结合2~10个聚乙二醇分子,聚乙二醇分子的平均分子量为4kd-9kd,聚乙二醇修饰黄曲霉尿酸氧化酶的酶比活性为5.0-10.0U/mg。
在一个优选的方面,聚乙二醇修饰黄曲霉尿酸氧化酶与原型酶相比,黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物动物注射后产生抗体的滴度为1∶320~1∶1280。
在一个优选的方面,聚乙二醇修饰黄曲霉尿酸氧化酶与原型酶相比,黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物的在动物体内的半衰期为62小时。
本发明选用的黄曲霉尿酸氧化酶是通过基因工程技术采用大肠杆菌表达***获得的重组黄曲霉尿酸氧化酶。
本发明采用的PEG的平均分子量为4kd-9kd。特别地本发明黄曲霉尿酸氧化酶修饰物选用的PEG的平均分子量为5kd-8kd。特别优选的的本发明黄曲霉尿酸氧化酶修饰物,PEG的平均分子量为5kd。
本发明获得的尿黄曲霉酸氧化酶修饰物,酶比活性为5.0-10.0U/mg。特别优选的黄曲霉尿酸氧化酶修饰物,酶比活性为8.0-10.0U/mg。
为了实现本发明,物活化PEG分子通过胺酯键共价偶联到黄曲霉尿酸氧化酶分子上。
本发明还提供一种黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物的制备方法,聚乙二醇和黄曲霉尿酸氧化酶通过共价键连接,每个黄曲霉尿酸氧化酶分子亚基平均结合4~6个聚乙二醇分子,该方法是采用以下技术方案实现的:纯度大于95%的重组黄曲霉尿酸氧化酶蛋白,采用平均分子量为4kd-9kd的活化聚乙二醇分子在pH值5~10、温度4~37℃、时间0.1~10小时进行修饰,聚乙二醇分子和黄曲霉尿酸氧化酶的质量比为3∶1~20∶1。
优选的本发明制备黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物方法,选用的PEG的平均分子量为5kd~8kd。
特别优选的本发明制备黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物方法,选用的PEG的平均分 子量为5kd。
本发明制备黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物方法,活化PEG分子或单甲氧基PEG分子通过胺酯共价键偶联到尿酸氧化酶分子上。
本发明黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物的制备方法,活化PEG为PEG硝基苯酯或PEG琥珀酰亚胺酯。
本发明黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物的制备方法,优选的活化PEG为PEG丙酸酯、PEG乙酸酯和PEG碳酸酯中的任意一种。
本发明制备黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物方法,优选的修饰反应的pH值值控制在8.0-9.2。
本发明制备黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物方法,优选的修饰反应的温度为10-25℃。
本发明制备黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物方法,优选的修饰反应时间为0.5-2小时。
本发明制备黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物方法,优选的聚乙二醇分子和尿酸氧化酶的质量比为5∶1~15∶1。
本发明的研究结果与现有技术不同。本发明用5KD聚乙二醇修饰的黄曲霉尿酸氧化酶,当修饰程度为2-10/亚基时,比活性为8-10U/mg;同时半衰期比原型酶增加了5-10倍,在家鸡体内半衰期T1/2为60小时;免疫原性比原型酶明显降低,豚鼠过敏反应显著低于原型酶。同时,本发明的5KD聚乙二醇修饰的黄曲霉尿酸氧化酶稳定性好,生产成本更低。因此,本发明的聚乙二醇修饰的黄曲霉尿酸氧化酶实现了高比活、长半衰期、低免疫原性、高稳定性、低成本等诸方面的均衡,具有产业化价值。本发明与现有技术对比见表一。
虽然现有技术总体上显示出大分子量的PEG修饰优于小分子量PEG修饰,10KD-30KD分子量的PEG修饰作为更优选的技术方案,但本发明不拘于任何现有的理论和假设。
表一、本专利与现有技术对比
本专利 | CN1322141A表1引用 | CN1322141A | CN1561390A | CN101327327A | CN101302501A | |
酶来源 | 黄曲霉 | 单假丝酵母等 | 单假丝酵母、球形节杆菌、猪-狒狒、 黄曲霉、大豆 | 单假丝酵母 | 黄曲霉 | 黄曲霉 |
PEG分子量 | 5KD、10KD、20KD 5KD优选 | 5KD、2*5KD | 5KD、10KD、30KD | 5KD、20KD | 20KD | 20KD、40KD |
修饰位点 | 赖氨酸 | 赖氨酸 | 赖氨酸 | 赖氨酸 | 半胱氨酸 | N末端氨基 |
修饰程度 | 每个亚基结合4-6个 PEG分子,优选是5 个。 | 黄曲霉:5KD12条;30KD7条 大豆:5KD、30KD都是2条; 球形节杆菌:30KD都是2条; 单假丝酵母:5KD6条;30KD6条; 10KD9条 猪-狒狒:各种分子量2-10均可 | 19条/亚基 | |||
活性 | 9.6U/mg 原酶18.7U/mg | 75%以上/原酶: | 5KD:5.8U/mg 20KD:7.8U/mg 原酶:约10U/mg | 无 | 8-12U/mg | |
半衰期 | 鸡60小时 | 5KD:6小时 20KD:3天 | ||||
免疫原性 | 较原型蛋白降低 | 图7及说明:多次给药后,给药24 小时的剩余酶活性来表示 |
附图说明
附图1、纯化的大肠杆菌表达黄曲霉尿酸氧化酶;
1、标准蛋白质分子量(97.4、66.2、43、31、20、14.4kd);
2-4、纯化的大肠杆菌表达尿酸氧化酶。
附图2、多分子PEG修饰尿酸氧化酶电泳分析结果;
1和8泳道:标准蛋白质分子量(97.4、66.2、43、30、20.1、14.4kd);
2、3和4泳道:未修饰黄曲霉尿酸氧化酶;
5泳道:5k PEG修饰黄曲霉尿酸氧化酶;
6泳道:10k PEG修饰黄曲霉尿酸氧化酶;
7泳道:20k PEG修饰黄曲霉尿酸氧化酶,
附图3、不同分子量PEG修饰物在动物体内的药效维持时间比较;
附图4、动物长期给药后血尿酸水平;
附图5、PEG与尿酸氧化酶不同比例修饰产品电泳分析结果;
1泳道:PEG与黄曲霉尿酸氧化酶质量比例为10∶1;
2泳道:PEG与黄曲霉尿酸氧化酶质量比例为7∶1;
3泳道:PEG与黄曲霉尿酸氧化酶质量比例为5∶1;
4泳道:PEG与黄曲霉尿酸氧化酶质量比例为3∶1;
5泳道:未修饰黄曲霉尿酸氧化酶。
附图6、PEG修饰尿酸氧化酶的不同pH值修饰产品电泳分析结果;
1-8泳道修饰反应pH值分别为6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.2。
附图7、PEG修饰尿酸氧化酶不同时间产物电泳分析结果;
1-5泳道修饰时间分别为0.5、1、2、4、8hr。
附图8、尿酸氧化酶及其PEG修饰物在不同pH值稳定性;
附图9、尿酸氧化酶及其PEG修饰物在不同温度下的稳定性;
附图10、尿酸氧化酶及其PEG修饰物大鼠药效试验;
附图11、尿酸氧化酶给药后在家鸡体内的活性变化曲线;
附图12、尿酸氧化酶PEG修饰物在家鸡体内的活性变化曲线;
附图13、PEG乙酸酯修饰尿酸氧化酶;
1泳道:活化PEG和尿酸氧化酶的质量比为4∶1;
2泳道:活化PEG和尿酸氧化酶的质量比为6∶1;
3泳道:活化PEG和尿酸氧化酶的质量比为8∶1;
4泳道:活化PEG和尿酸氧化酶的质量比为10∶1;
5泳道:活化PEG和尿酸氧化酶的质量比为15∶1。
附图14、PEG碳酸酯修饰尿酸氧化酶;
1泳道:PEG碳酸酯和尿酸氧化酶的质量比为15∶1;
2泳道:PEG碳酸酯和尿酸氧化酶的质量比为10∶1;
3泳道:PEG碳酸酯和尿酸氧化酶的质量比为8∶1;
4泳道:PEG碳酸酯和尿酸氧化酶的质量比为6∶1;
5泳道:PEG碳酸酯和尿酸氧化酶的质量比为4∶1。
附图15、PEG硝基苯酯修饰尿酸氧化酶。
1泳道:活化PEG和尿酸氧化酶的质量比为10∶1;
2泳道:活化PEG和尿酸氧化酶的质量比为8∶1;
3泳道:活化PEG和尿酸氧化酶的质量比为6∶1;
4泳道:活化PEG和尿酸氧化酶的质量比为4∶1;
5泳道:活化PEG和尿酸氧化酶的质量比为2∶1。
具体实施例
下面结合具体实施例进一步说明本发明,但是并非限定本发明。实施例一、黄曲霉尿酸氧化酶的制备及活性测定
1、黄曲霉尿酸氧化酶的制备
重组黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法,包括如下步骤:(1)、黄曲霉尿酸氧化酶基因的获得;(2)表达载体的构建及转化大肠杆菌工程菌:将合成的黄曲霉尿酸氧化酶cDNA片段插 入到表达载体质粒的酶切位点,然后直接转化大肠杆菌宿主菌;(3)、阳性克隆的筛选、培养、诱导表达:筛选出阳性克隆在培养基上进行培养,经诱导使目标蛋白表达;(4)、融合蛋白的分离、纯化:将大肠杆菌工程菌菌体收集、破菌,经离心得到破菌液上清,然后对破菌液上清用层析技术纯化;(5)、融合蛋白的酶切及进一步的分离纯化。
黄曲霉尿酸氧化酶基因的获得是通过全基因合成和通过设计引物,再PCR获得,表达载体质粒是pET-32a,宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3),酶切位点是Nde I/BamH I,用氨苄青霉素做抗性筛选,培养基培养的温度控制在37,诱导表达使用浓度为0.5~1.0mmol/L的IPTG作为诱导剂,层析技术是离子交换层析、分子筛层析、疏水层析和亲和层析,酶切所用的酶是肠激酶。
根据文献报道(Genebank A32839、A32840、A32841)的黄曲霉尿酸氧化酶cDNA序列,合成30段互补的寡核苷酸,并在5’端和3’端分别引入酶切位点Nde I、BamH I,按分子克隆的常规方法,首先用T4噬菌体多核苷酸激酶37℃处理30min,磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩尔混合,94℃变性5min,立即65℃退火10min,然后加入T4连接酶,16℃连接过夜。
pET-32a质粒用Nde I、BamH I双酶切回收大片段,与合成的黄曲霉尿酸氧化酶cDNA片段连接,20μL反应体系基因片段与载体大片段的比例为10∶1,加T4DNA连接酶300单位,15℃连接过夜,取10μL连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,涂布于氨苄青霉素抗性平板,37℃培养过夜,获得工程菌。
氨苄青霉素做抗性筛选,得到阳性克隆pET-32a-Uox。提取质粒,用限制性内切酶进行鉴定。阳性转化子用通用引物进行序列分析,结果克隆序列与设计序列完全一致。接种阳性克隆进行培养,经1.0mmol/L的IPTG诱导。
取100ml培养菌液离心收集菌体,再用10ml 20mmol/L PB缓冲液悬浮,进行超声破碎,然后收集上清和沉淀,取上清50ul,用2X SDS-PAGE上样缓冲液处理后用12%SDS-PAGE电泳分析,上样20ul,结果目标蛋白主要存在于破菌后的上清液中,目标蛋白的表达量在30%以上。
将收集到的破菌上清液用离子交换层析法分离纯化,其过程为用pH值为8.5的 20mmol/L Tris.CL缓冲液稀释,使其电导率小于5mS/cm。用同样的缓冲液平衡SP柱,上样后用平衡缓冲液洗至基线,用0.01~0.5mol/LD NaCL梯度洗脱,收集目标蛋白峰。
将离子交换目标蛋白峰稀释后使目标蛋白的浓度达到1mg/mL,样品对肠激酶切割缓冲液(50mmol/L Tris.CL,150mmol/L NaCL,2.5mmol/L CaCL2,pH值7.5)透析进行缓冲液交换,然后加入20U/mL的肠激酶,16℃保温过夜酶切,12%SDS-PAGE电泳分析。经酶切后的目标蛋白补加(NH4)2SO4使终浓度为1.0-1.5mol/L,样品上用1.2mol/L(NH4)2SO4,20mmol/L PB,pH值7.4的缓冲液平衡的Phenyl-Sepharose Fast Flow柱,通过降低盐浓度梯度洗拖,收集目标蛋白峰。
得到的疏水层析峰经Sephadex G-25脱盐,平衡液为20mmol/L PB,pH值7.4。样品脱盐后即为精细纯化的黄曲霉尿酸氧化酶,SDS-PAGE分析产品纯度,结果见图一,样品纯度大于95%。
2、黄曲霉尿酸氧化酶的活性测定
取测活缓冲液2.0ml,加入尿酸贮液1.5ml,混匀后置30℃水浴平衡5min,向上述反应液中加入1.0ml供试品,混合均匀后于30℃反应5min,反应结束后加入0.5ml反应终止液终止反应,用紫外-可见分光光度法在波长292nm处测定吸收度。取测活缓冲液2.0ml,加入尿酸贮液1.5ml和0.5ml反应终止液,再加入1.0ml供试品,混合均匀后于30℃反应5min后做为反应管尿酸起始值,取测活缓冲液3.5ml和0.5ml反应终止液,再加入1.0ml供试品,混合均匀后做为样品空白。
取尿酸标准液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml分别置于试管中,分别加测活缓冲液4.0ml、3.5ml、3.0ml、2.5ml、2.0ml使终体积为4.5ml。混匀后置30℃水浴平衡5min。加入0.5ml反应终止液,测定吸收值。量取4.5ml测活缓冲液,30℃水浴平衡5min,加入0.5ml反应终止液作为空白对照。所得数据用于指定标准曲线。
标准曲线尿酸浓度对应其吸收度,求直线回归方程,将测得供试品反应管吸收度代入直线回归方程,即得供试品反应管尿酸的浓度。根据酶分解引起的尿酸降低值和蛋白浓度计算酶的比活性。纯化的黄曲霉尿酸氧化酶的比活性为18.7U/mg。
实施例二、不同分子量PEG修饰尿酸氧化酶
1、修饰产物的制备
纯化的大肠杆菌表达黄曲霉尿酸氧化酶纯度大于95%,浓度2.0mg/ml,用G25柱交换缓冲液,配制平衡缓冲液0.1mol/L Na2PO4-20mmol/L NaCl,流速10ml/min,待柱流出液达到平衡后上样,收集蛋白峰。将不同分子量的单甲氧基PEG丙酸酯按质量比7∶1加入到改变缓冲体系的尿酸氧化酶中,室温搅拌修饰2小时后终止反应。用50KD的超滤膜将尿酸氧化酶PEG反应混合物对20mmo/L PB,pH值8.0缓冲液超滤去除游离PEG即为尿酸氧化酶PEG修饰物原液。
对修饰产物进行SDS-PAGE分析,电泳结果表明该修饰物为多分子PEG修饰的尿酸氧化酶,见图二。
参考Habeeb A.F.等(1966)Determination of free amino groups in proteins byTrinitrobenzenesulfonic acid.Analytical Biochemistry(14:328-336)方法测定修饰后蛋白的PEG修饰率。用20mmol/L PB缓冲液,pH值8.0透析处理尿酸氧化酶和PEG修饰尿酸氧化酶,准确测定蛋白质浓度,精确配制成1.0mg/ml。精确量取1,0mg/ml的尿酸氧化酶溶液0、40、80、120、200、300、400μl分别置于试管中,加pH值8.0的20mmol/L PB缓冲液至1ml,然后加入pH值9.16的NaHCO3-Na2CO3缓冲液1ml,再加入0.1%TNBS溶液1ml,在混合振荡器上剧烈振荡。对1mg/ml的PEG修饰尿酸氧化酶溶液重复以上操作。40℃反应2hr,然后分别加入10%SDS溶液1ml,再分别加入1N HCl 0.5ml。测定OD335nm的吸收值,绘制标准曲线。计算修饰的蛋白斜率/未修饰的蛋白斜率。
PEG修饰尿酸氧化酶伯胺残基的数量=[1-(PEG修饰尿酸氧化酶的斜率/尿酸氧化酶斜率)]×尿酸氧化酶伯胺残基的总数量。
修饰率=[1-(PEG修饰尿酸氧化酶的斜率/尿酸氧化酶斜率)]×100%。
实验结果见表二。
表二、PEG尿酸氧化酶的修饰度测定结果
2、修饰产物的体外活性测定
按照实施例1的方法测定修饰产物的酶活性,结果见表三。
表三、尿酸氧化酶PEG多分子修饰活性结果
编号 | 1 | 2 | 3 | 4 |
聚乙二醇分子量 | 5kd | 10kd | 20kd | 40kd |
尿酸氧化酶比活性 | 9.6U/mg | 4.1U/mg | 2.0U/mg | 0.7U/mg |
活性残留百分数 | 51.3% | 21.9% | 10.7% | 3.7% |
3、修饰产物的体内药效持续时间比较
以SD大鼠为试验动物造模,比较分子量为5k、10k、20k的PEG修饰的重组尿酸氧化酶降尿酸作用在动物体内持续时间的差别。空白对照组10只动物,不给药;模型组10只动物,剂量150mg/kg/day的腺嘌呤和,250mg/kg/day的乙胺丁醇造模;阳性对照组10只动物,用150mg/kg/day腺嘌呤,250mg/kg/day乙胺丁醇造模的同时用20mg/kg/day别嘌醇治疗;5kPEG尿酸氧化酶组10只动物用150mg/kg/day腺嘌呤,250mg/kg/day乙胺丁醇造模,5kPEG修饰尿酸氧化酶用药剂量0.5mg/kg;10kPEG尿酸氧化酶组10只动物,150mg/kg/day腺嘌呤,250mg/kg/day乙胺丁醇造模,10kPEG尿酸氧化酶治疗剂量0.5mg/kg;20kPEG尿酸氧化酶组10只动物造模的同时用20kPEG尿酸氧化酶0.5mg/kg的剂量治疗。给药前,大鼠眼眶采血,肝素抗凝,测定血浆尿酸浓度的初始值。.三组PEG尿酸氧化酶治疗组动物给药剂量均为0.5mg/kg,给药一次。别嘌醇组每天给药一次治疗,给药后半小时灌胃给予造模剂腺嘌呤和乙胺丁醇,两小时后眼眶采血,测定血浆尿酸浓度,实验结果见附图三,5kPEG修饰的产物在动物体内维持药效的时间更长。
4、修饰产物给药后动物产生抗体的情况
目的:比较不同分子量5k、10k、20kPEG修饰的的重组尿酸氧化酶长期注射后产生抗体的情况。
试验方法:实验动物为SD大鼠,每组动物10只,空白对照组不给药,模型组150mg/kg/day腺嘌呤和250mg/kg/day乙胺丁醇造模,阳性对照组造模的同时用150mg/kg/day别嘌呤醇灌胃治疗,5kPEG尿酸氧化酶组、10kPEG尿酸氧化酶组和20kPEG尿酸氧化酶组用药剂量均为0.5mg/kg。给药前,大鼠眼眶采血,肝素抗凝,测定血浆尿酸浓度的初始值。两小时后眼眶采血,测定血浆尿酸浓度。
开始用药三组PEG尿酸氧化酶治疗组给药剂量均为0.5mg/kg。别嘌呤醇灌胃给药,给药后半小时灌胃给予造模剂腺嘌呤和乙胺丁醇。两小时后眼眶采血,测定血浆尿酸浓度。
40天后再次给药,三组PEG尿酸氧化酶治疗组给药剂量均为0.5mg/kg。别嘌醇灌胃给与。给药后半小时灌胃给予造模剂腺嘌呤和乙胺丁醇。两小时后眼眶采血,测定血浆尿酸浓度。
过2周用完全福氏佐剂分别与三种分子量的PEG尿酸氧化酶混合成乳剂,皮下注射入各组大鼠。三组PEG尿酸氧化酶治疗组给药剂量均为0.5mg/kg。
4周后三组PEG尿酸氧化酶治疗组给药剂量均为0.5mg/kg。别嘌醇灌胃给与。给药后半小时灌胃给予造模剂腺嘌呤和乙胺丁醇。两小时后眼眶采血,测定血浆抗体滴度,试验结果见表四,动物血尿酸测定结果见附图四。
结果表明,三种分子量PEG修饰的尿酸氧化酶用药后加强免疫,再用药后动物抗体滴度没有明显区别,即大分子量PEG修饰尿酸氧化酶后在免疫原性方面没有表现出明显优势。血尿酸测定结果表明产生抗体后PEG修饰尿酸氧化酶组尿酸水平比较低,抗体没有影响酶的活性
表四、SD大鼠用药后血浆抗体滴度
对比例一、单分子PEG修饰尿酸氧化酶
将不同分子量的单甲氧基PEG丙酸酯按质量比5∶1加入到缓冲体系pH值6.0的尿酸氧化酶中,室温搅拌修饰1小时后终止反应。用50KD的超滤膜将尿酸氧化酶PEG反应混合物对20mmo/L PB,pH值8.0缓冲液超滤去除游离PEG,获得单分子PEG修饰的尿酸氧化酶。
按照实施例1的方法测定修饰产物的酶活性,活性测定结果见表五。
表五、尿酸氧化酶PEG单分子修饰活性结果
编号 | 5 | 6 | 7 | 8 |
聚乙二醇分子量 | 5kd | 10kd | 20kd | 40kd |
尿酸氧化酶比活性 | 13.9U/mg | 10.7U/mg | 10.1U/mg | 8.2U/mg |
活性残留百分数 | 74.3% | 57.2% | 54.1% | 43.9% |
实施例2制备的1-4号样品以及对比例1制备的5-8号样品于37℃放置一天进行稳定性考察的加速试验,样品活性保留情况见表六。
表六、PEG尿酸氧化酶稳定性加速试验结果
编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
酶活性(U/mg) | 8.9 | 3.1 | 1.2 | 0 | 0.8 | 3.3 | 1.8 | 2.2 |
稳定性加速试验结果表明单点PEG修饰的黄曲霉尿酸氧化酶在37℃酶活性很快丧失,而多点修饰样品具有较高酶活性的5K分子量PEG修饰的黄曲霉尿酸氧化酶能保持较好的稳定性,37℃放置一天,活性还能保持92.7%。
对比例二、聚乙二醇修饰尿酸氧化酶分子半胱氨酸
大肠杆菌表达黄曲霉尿酸氧化酶纯度大于95%,浓度2.0mg/ml,用G25柱交换缓冲液,配制平衡缓冲液0.05mol/L PB-20mmol/L NaCl,流速10ml/min,待柱流出液达到平衡后上样,收集蛋白峰。将分子量为5k、10k、20k的单甲氧基PEG马来酰亚胺按质量比2∶1加入到尿酸氧化酶中,室温搅拌反应8小时,电泳分析修饰产物并测定酶活性,结果酶活性低于1.0U/mg,修饰产物是单分子PEG修饰,表明PEG修饰半胱氨酸后尿酸氧化酶的活性受到很大的影响,活性基本丧失,说明PEG与活性中附近的半胱氨酸结合后干扰底物与酶的结合。
将单甲氧基PEG马来酰亚胺与尿酸氧化酶的质量比提高到5∶1加入到尿酸氧化酶中,室温搅拌反应8小时,电泳分析修饰产物是单分子修饰物,酶活性0.3U/mg。
为了使PEG充分修饰尿酸氧化酶分子中半胱氨酸,用0.05mol/L PB--8mol/L Urea作为平衡缓冲液用G25柱交换缓冲液,收集的蛋白峰,按5k单甲氧基PEG马来酰亚胺与尿酸氧化酶的质量比7∶1加入到尿酸氧化酶中,室温搅拌反应10小时,电泳分析修饰产物是多分子修饰物,酶活性0,酶活性完全丧失。
实施例三、PEG(5KD)与尿酸氧化酶修饰反应的优化
1、活化PEG与尿酸氧化酶的比例选择
尿酸氧化酶浓度2.0mg/mL,取0.25mL尿酸氧化酶原液,加入等体积0.2mol/LNa2HPO4-0.02mol/L NaCL缓冲液是蛋白终浓度为0.5mg/0.5mL,然后分别加入150mg/mL的分子量为5kd的活化PEG丙酸NHS酯15μL、25μL、35μL和50μL,使活化PEG丙酸NHS酯与尿酸氧化酶的质量比分别达到3∶1、5∶1、7∶1和10∶1,迅速混合均匀,室温反应4小时终止反应,取样进行SDS-PAGE电泳分析,结果见附图五,7∶1和10∶1的修饰物均一性好。
2、活化PEG修饰尿酸氧化酶的pH值选择
尿酸氧化酶浓度2.0mg/mL,取0.25mL尿酸氧化酶原液,加入等体积pH值分别为6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.2的0.2mol/L NaH2PO4-Na2HPO4-0.02mol/L NaCL缓冲液,使蛋白终浓度为0.5mg/0.5mL,然后分别加入150mg/mL的分子量为5kd的活化PEG丙酸NHS酯25μL,使活化PEG丙酸酯与尿酸氧化酶的质量比分别达到5∶1,迅速混合均匀, 室温反应4小时终止反应,取样进行SDS-PAGE电泳分析,结果见附图六,在pH值8-9.2的范围内修饰产品均一度较好。
3、修饰反应时间的选择
尿酸氧化酶浓度2.0mg/mL,取0.25mL尿酸氧化酶原液,加入等体积0.2mol/LNaH2PO4-Na2HPO4-0.02mol/L NaCL缓冲液,使蛋白终浓度为0.5mg/0.5mL,然后加入150mg/mL的分子量为5kd的活化PEG丙酸酯30μL,使活化PEG丙酸酯与尿酸氧化酶的质量比分别达到5∶1,迅速混合均匀,室温反应0.5、1、2、4、8小时终止反应,取样进行SDS-PAGE电泳分析,结果见附图七,结果表明反应速度非常快,半小时后修饰产物均一度已较好。
实施例四、PEG(5KD)多点修饰尿酸氧化酶的稳定性考察
1、尿酸氧化酶PEG修饰物的pH值稳定性
配制不同pH值值的缓冲液:50mmol/L NaAc-HAc,pH值4.0;50mmol/L NaAc-HAc,pH值6.0;50mmol/L PB,pH值7.4;50mmol/L PB,pH值8.0;50mmol/L Tris-HCL,pH值9.0;50mmol/L TEA,pH值8.9;50mmol/L Na2CO3-NaHCO3,pH值10。将重组尿酸氧化酶和PEG重组尿酸氧化酶分别用上述缓冲溶液稀释10倍,然后将样品在4℃放置不同时间取样用相应的缓冲液稀释成1μg/ml的浓度进行活性测定,结果见附图八,从图中可以看出重组尿酸氧化酶在不同pH值范围内活性变化比较大,活性保持最好的是在pH值8.5。PEG重组尿酸氧化酶在pH值7-10的范围内比较稳定,活性基本保持80%以上。同一pH值条件,4℃保存1、6、36天后酶活性接近,表明4℃保存时间对酶活性影响不大。酸性条件下酶活性的丧失主要由pH值变化引起。所以重组尿酸氧化酶经过PEG修饰后蛋白对pH值的耐受性增加,能适应较广的pH值范围。
2、尿酸氧化酶PEG修饰物的温度稳定性
重组尿酸氧化酶原液与PEG化重组尿酸氧化酶分别于4℃、室温条件下放置,到达一定时间时取样稀释成1μg/ml的浓度后进行活性测定,结果见附图九,从图中可以看出重组尿酸氧化酶在室温条件下放置10天后,活性明显下降,并有降解产生,放置60天后,活性很低。而PEG化重组尿酸氧化酶在室温放置2个月后,活性下降。重组尿酸氧化酶在4℃条 件下放置一个月较稳定,但随着放置时间增加活性下降,并有降解产生。PEG化重组尿酸氧化酶在4℃条件下放置半年活性还是保持很好。这表明,重组尿酸氧化酶经过PEG修饰后热稳定性明显增加。
实施例五、PEG(5KD)多点修饰尿酸氧化酶的大鼠药效试验
观察不同剂量的5K PEG尿酸氧化酶在SD大鼠体内的药效维持时间,动物每组10只,空白对照组不给药,模型组用150mg/kg/day腺嘌呤和250mg/kg/day乙胺丁醇造模,阳性对照组造模的同时用20mg/kg/day别嘌醇治疗,用药组分三个剂量,高剂量组2.47mg/kg 5KPEG尿酸氧化酶,中剂量组0.83mg/kg 5K PEG尿酸氧化酶,低剂量组0.27mg/kg 5K PEG尿酸氧化酶。给药前一天每只大鼠眼眶采血测定基础血浆尿酸水平后开始试验,阳性对照组灌胃给与20mg/kg/day别嘌醇,高剂量组、中剂量组和低剂量组分别尾静脉注射给与2.47mg/kg、0.83mg/kg和0.27mg/kg 5K PEG尿酸氧化酶,给药0.5小时后灌胃给与造模剂150mg/kg/day腺嘌呤,250mg/kg/day乙胺丁醇。给与造模剂2小时后每只大鼠眼眶采血,测定血浆尿酸水平。然后每隔24小时,灌胃给与阳性药和造模剂,采血测定血浆尿酸水平,高、中、低剂量组各组血浆尿酸水平与模型组相比没有统计学差异时结束试验,结果见附图十。
实施例六、PEG(5KD)多点修饰尿酸氧化酶的豚鼠过敏试验
比较分子量5kPEG修饰的的重组尿酸氧化酶及原性蛋白给药后豚鼠过敏情况,实验动物为白色豚鼠,每组6只动物,生理盐水组不给药;白蛋白组致敏剂量0.5mg/0.5ml/只,激发剂量1.0mg/ml/只;5kPEG修饰的的重组尿酸氧化酶低剂量组致敏剂量0.5mg/kg,0.5ml/只,激发剂量1.0mg/kg,1.0ml/只;5kPEG修饰的的重组尿酸氧化酶高剂量组致敏剂量2.3mg/kg,0.5ml/只,激发剂量1.0ml/只;原性蛋白高剂量组致敏剂量0.3mg/0.5mL,0.5mL/只,激发剂量0.6mg/1mL,1mL/只;原性蛋白低剂量组致敏剂量0.06mg/0.5mL,0.5mL/只,激发剂量0.12mg/1mL,1mL/只。每只豚鼠按剂量分别腹腔注射给与白蛋白或受试药物进行致敏,给药前称量体重,2周后每只豚鼠按剂量分别静脉注射给与白蛋白或受试药物激发,观察各组豚鼠的死亡情况或其他过敏症状。动物反应情况见表七,结果表明尿酸氧化酶经PEG修饰后豚鼠过敏症状减轻,说明免疫原性较原型蛋白降低。
表七、过敏试验动物反应情况
实施例七、PEG(5KD)多点修饰尿酸氧化酶的药代动力学
选取家鸡6只测定血清基础值后,随机分成2组。分别给予受试品,尿酸氧化酶剂量1.6mg/kg,5kPEG修饰黄曲霉尿酸氧化酶剂量1.28mg/kg,每组按给药剂量静脉注射给药。给药后不同时间静脉取血,自然凝结后离心收集血清进行酶活性分析。方法见本申请人的中国专利申请200610049079.2,以血清中酶反应引起的尿酸吸收值的降低来反应酶活性的变化,尿酸氧化酶及其修饰物在家鸡体内活性变化的情况见附图十一和附图十二,结果经软件分析计算的药物半衰期尿酸氧化酶原型蛋白T1/2为308分钟,5kPEG修饰尿酸氧化酶T1/2 为3697.495分钟,修饰后尿酸氧化酶半衰期延长了12倍。
实施例八、不同活化PEG修饰尿酸氧化酶
1、PEG乙酸酯修饰尿酸氧化酶
黄曲霉尿酸氧化酶浓度5.0mg/mL,取1.0mL尿酸氧化酶溶液,加入4.0ml 0.2mol/LNa2HPO4-0.02mol/L NaCL缓冲液使蛋白终浓度为1.0mg/mL,然后分别加入分子量为5kd的活化PEG乙酸酯使活化PEG乙酸酯与黄曲霉尿酸氧化酶的质量比分别达到4∶1~15∶1,迅速混合均匀,室温反应2小时终止反应,取样进行SDS-PAGE电泳分析,结果见附图十三,样品修饰的均一性好。
2、PEG碳酸酯修饰尿酸氧化酶
黄曲霉尿酸氧化酶浓度5.0mg/mL,取1.0mL尿酸氧化酶溶液,加入4.0ml 0.2mol/LNa2HPO4-0.02mol/L NaCL缓冲液使蛋白终浓度为1.0mg/mL,然后分别加入分子量为10kd的活化PEG碳酸酯使活化PEG碳酸酯与黄曲霉尿酸氧化酶的质量比分别达到4∶1~15∶1,迅速混合均匀,室温反应2小时终止反应,取样进行SDS-PAGE电泳分析,结果见附图十四,样品6∶1~10∶1的比例修饰样品的均一性好。
3、PEG硝基苯酯修饰尿酸氧化酶
黄曲霉尿酸氧化酶浓度5.0mg/mL,取1.0mL尿酸氧化酶溶液,加入4.0ml 0.2mol/LNa2HPO4-0.02mol/L NaCL缓冲液使蛋白终浓度为1.0mg/mL,然后分别加入分子量为20kd的活化PEG硝基苯酯使活化PEG硝基苯酯与黄曲霉尿酸氧化酶的质量比分别达到2∶1~10∶1,迅速混合均匀,室温反应2小时终止反应,取样进行SDS-PAGE电泳分析,结果见附图十五,样品4∶1~10∶1的比例修饰样品的均一性好。
Claims (18)
1.一种黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物,聚乙二醇和黄曲霉尿酸氧化酶以共价键连接,每个黄曲霉尿酸氧化酶分子亚基平均结合2~10个聚乙二醇分子,其特征在于:聚乙二醇分子的平均分子量为4kd-9kd,黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物的酶比活性为5.0-10.0U/mg。
2.如权利要求1所述的黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物,其特征在于:与未结合聚乙二醇的黄曲霉尿酸氧化酶相比,黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物动物注射后产生抗体的滴度为1∶320~1∶1280。
3.如权利要求1所述的黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物,其特征在于:与未结合PEG的黄曲霉尿酸氧化酶相比,黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物的在动物体内的半衰期为62小时。
4.如权利要求1-3任一项权利要求所述的黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物,其特征在于:黄曲霉尿酸氧化酶是通过基因工程技术采用大肠杆菌表达***获得的重组尿酸氧化酶。
5.如权利要求1-3任一项权利要求所述的黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物,其特征在于:聚乙二醇的平均分子量为5kd-8kd。
6.如权利要求5所述的黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物,其特征在于:聚乙二醇的平均分子量为5kd。
7.如权利要求1-3任一项权利要求所述的黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物,其特征在于:黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物的酶比活性为6.0-10.0U/mg。
8.如权利要求7所述的黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物,其特征在于:黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物的酶比活性为8.0-10.0U/mg。
9.如权利要求1所述的黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物,其特征在于:聚乙二醇分子通过胺酯共价键偶联到黄曲霉尿酸氧化酶分子上。
10.如权利要求1所述的黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物,其特征在于:聚乙二醇分子是分枝的。
11.一种黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物的制备方法,其特征在于:纯度大于95%的重组黄曲霉尿酸氧化酶蛋白,采用平均分子量为4kd-9kd的活化聚乙二醇分子在pH值5~10、温度4~37℃、时间0.1~10小时进行修饰,聚乙二醇分子和黄曲霉尿酸氧化酶的质量比为3∶1~20∶1。
12.如权利要求11所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物的制备方法,其特征在于:聚乙二醇分子通过胺酯键共价偶联到尿酸氧化酶分子上。
13.如权利要求11所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物的制备方法,其特征在于:活化聚乙二醇为聚乙二醇硝基苯酯或聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。
14.如权利要求13所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物的制备方法,其特征在于:聚乙二醇琥珀酰亚胺酯为聚乙二醇丙酸酯、聚乙二醇乙酸酯和聚乙二醇碳酸酯中的任意一种。
15.如权利要求11所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物的制备方法,其特征在于:修饰反应的pH值为8~9.2。
16.如权利要求11所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物的制备方法,其特征在于:修饰反应的温度为10~15℃。
17.如权利要求11所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物的制备方法,其特征在于:修饰反应时间为0.5~2小时。
18.如权利要求11所述的一种黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物的制备方法,其特征在于:聚乙二醇分子和黄曲霉尿酸氧化酶的质量比为5∶1~15∶1。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101229 |