CN102382758B - 基于细胞打印和多参数传感阵列集成技术的三维细胞芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于细胞打印技术和多传感器集成型芯片技术的细胞芯片技术及其在高内涵药物筛选中的应用。通过在玻璃或硅基底上，用微电子加工技术，构建集成细胞微电极阵列(Microelectrode array，MEA)、电阻抗传感器(Eletric Cell-substrate Impedance System，ECIS)包括圆盘型ECIS和叉指型电阻抗分析器(Interdigitated Array，IDA)。通过三个传感单元的阵列化芯片。将不同细胞和特殊的仿细胞外基质材料混合，通过多喷头细胞打印设备定位打印在微电极阵列传感器阵列中的指定位置，构建细胞芯片。通过芯片上的细胞传感器传输并记录细胞动作电位频率、幅度、波形、网络间信号传播速度以及细胞贴附、迁移状态等静态及动态参数。并提供一种应用上述的三维细胞芯片用于药物筛选的方法。

Description

基于细胞打印和多参数传感阵列集成技术的三维细胞芯片

技术领域

本发明属于生物信息技术领域，具体的说，涉及一种新的用多细胞打印技术和多参数传感阵列集成芯片技术构建三维细胞芯片，构建方法及其在高内涵药物筛选中应用。

发明背景

生命科学、信息科学与制造科学相结合，是二十一世纪科技发展的重要趋势。基于先进制造理论和组织工程理论的细胞三维打印技术，以及基于微加工技术和传感器技术的细胞芯片技术，为组织工程、药物筛选、环境监测等研究领域拓展了新的理论和技术空间。

建立在计算机3D建模和先进制造离散堆积理论基础上的细胞三维组装技术，是在组织器官的解剖学数字模型直接驱动下，定位装配活细胞/材料单元，制造组织或器官的多细胞前体的技术。如哈佛大学Lee W等人开发的3D bio-printer技术，可喷射细胞和材料，逐层打印纤维原细胞和角质细胞形成多层皮肤结构(Lee W，et al.Biomaterials.2009；30：1587-95)。南卡罗来纳大学Mironovf F和Clemson大学Boland R等人开发的3D-cell printer技术，通过改装打印机喷头喷射细胞和特殊的基质材料，打印出有活性的三维细胞***(Zhang C，et al.Biomaterials，2008；29(28)：3781-91)。亚利桑那大学Smith CM开发的3D bioassembly，基于直写技术组装细胞，并***研究了各种环境因素对组装细胞的活性影响(Smith CM，et al.Tissue Eng.2007；13(2)：373-83)。MIT的Vacanti JP和德雷珀实验室Borenstein J等，也以细胞为装配材料，结合芯片制造工艺，制造出微血管***(Fidkowski C，et al.Tissue Eng.2005；11(1-2)：302-9)。国内清华大学颜永年等开发了基于快速成型(RP)原理的细胞三维受控组装技术，组装了能保持3个月活性的人工肝、人工脂肪等组织(Yan YN，et al.Biomaterials.2005；26(29)：5864-71)。

然而，由于器官结构的精细和复杂性，细胞组装技术面对制造肝、肾、心脏等复杂器官还有很多问题亟待解决。与此同时，细胞组装技术由于可以构建复杂的3D细胞培养模型，在生命科学其它领域显示了重要的理论和应用价值。研究者近年来利用组织工程技术制造的三维多细胞体开展研究，取得显著成果。比如普林斯顿大学的Basu S等人，利用人造三维多细胞体，研究了发育生物学的模式建成问题(Basu S，et al.Nature.2005，28；434(7037)：1130-4)。Hotary KB等利用三维多细胞体，发现MT1-MMP通过改变细胞空间几何形状，影响肿瘤细胞在3D基质中的增殖(Hotary KB，et al.Cell.2003；114(1)：33-45)。Basu S指出，构造和研究三维多细胞体，可以提高对生物发育和功能的了解，并可应用于生物材料，生物感测研究中。这些研究利用简单的技术构建三维多***，在生物学和药物筛选等领域取得了有效的成果，证明细胞组装技术在药物研发、细胞芯片领域有重要的研究和应用价值。

在药物研发领域，90年代以来全球药物研发机构广泛应用的高通量筛选技术(High-Throughput Screening，HTS)，面临成功率低的困境——筛选出的先导药物多数在整体实验中无药理活性[Bleicher KH，et al.Nat Rev Drug Discov.2003；2(5)：369-78.]。这是由于整体是多种细胞在三维空间有序排列，细胞间进行信号传导、调控的复杂***；而HTS技术的基础是研究单个药物靶标分子、单一环境、细胞二维培养。这种差异对细胞结构和功能造成显著影响，Kang X证明相比二维培养，细胞在三维环境中的形态、增殖、分化，基因表达等生理特性存在显著差异[Kang X，et al.Tissue Eng.2005；11(3-4)：458-68.]。HTS发展为高成功率的高内涵筛选(High ContentScreening，HCS)已成为药物研究领域的共识。HCS的前提是保持细胞结构、功能完整性和同步检测样品对细胞多个生理生化参数的影响。为模拟细胞在体内真实环境，研究者尝试构建三维细胞***进行药物研究。W.Sun和NASA合作，用Multi-nozzle depositio技术组装细胞，构建了三维的微肝组织，用于药物代谢研究[9]。HorningJL等将细胞培养于支架上，建立三维肿瘤模型用于药物筛选，并证明筛选的有效性[Horning JL，et  al.Mol Pharm.2008；5(5)：849-862.]。这些研究证明，简单的三维细胞培养***有比二维***更好的药物评价筛选效果，将进一步推动药物筛选技术的发展。

在生物芯片研究领域，将细胞与芯片结合构建细胞芯片用于疾病研究和药物筛选，是当前研究开发的热点。其中以替代实验动物进行药物研发为目标的细胞芯片研究，是高内涵药物筛选技术的重要发展方向，将细胞三维培养***和芯片技术相结合是该领域研究热点。Kloss D等最近建立了一个底部有电极的微孔阵列芯片，和三维肿瘤细胞微球结合后，成为可以进行肿瘤药物筛选的细胞芯片，这种细胞芯片具备高内涵的药物筛选能力[Kloss D，et al.Lab Chip.2008；8(6)：879-84.]。Minseok S.Kim开发了整合微流控技术和三维细胞培养的芯片平台，可用于基于细胞效应的化学药物检测[KimMS，et al.Biomed Microdevices.2007；9：25-34.]。Khetani SR等利用半导体微加工技术和细胞三维培养技术，构建符合实现肝组织功能要求的单元阵列，成功用于药物筛选[Khetani SR，et al.NatBiotechnol.2008；26(1)：120-126.]。Khetani SR指出芯片技术和细胞三维培养技术的结合将能够开发出完整的组织模型，可能最终实现“human on a chip”。这些研究，将简单的三维细胞***培养到芯片上，已经显示了巨大的研究价值和良好的应用前景。

在细胞芯片研究中，基于微电极阵列传感器的细胞电生理检测芯片，已成为后基因时代生物科学研究的重要工具。经典的神经电生理检测方法，采用的微电极信号采集或共聚焦荧光成像方式等进行细胞内记录，存在的问题主要在于：用微电极刺入、钳制细胞，或采用荧光染料成像等方式，都会对细胞造成一定的损害，并导致细胞在较短时间内死亡，限制了对动作电位及离子通道电流记录的实时检测；同时，可供选择采集信号的细胞数较少。而集成多种传感器的集成型细胞芯片，通过传感器件的网络化和集成化，将细胞的电学信息、化学信息、动力学信息等生理活动信息转换为可检测的信号，并细化为微观信息量进行实时分析，实现快速微量的细胞功能信息和待测物质性质的检测，在细胞生物学、环境监测和药物开发等领域有广泛应用前景。

通过以上分析可见，组织工程学的先进技术可应用于其它研究领域取得成果，特别是在细胞芯片和药物筛选研究领域，如果在细胞芯片研究中能准确控制细胞在细胞芯片上的生长位置，并实时检测不同细胞的生理过程和它们间的相互影响；对三维细胞芯片的发展应用，“human on a chip”这样的目标的实现，将产生巨大的推动作用，该技术具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的基于细胞打印技术和微电极阵列传感器技术的细胞芯片及其在高内涵药物筛选中的应用。

本发明所述的细胞芯片，包括细胞微电极阵列(Microelectrodearray，MEA)和电阻抗传感器(Electric Cell-substrate ImpedanceSystem，ECIS)，以及固定在传感器上的具有三维空间结构的细胞组合物，所述的细胞组合物为包括细胞和基质材料的共混物。

本发明的细胞芯片中，微电极阵列传感器(MicroelectrodeArray，MEA)是指在玻璃或硅基底上，用微电子加工技术将Au、Ir或Pt等金属沉积其上形成电极和引线，采用钝化层保护引线，在电极上暴露与细胞接触位点，传输并记录细胞动作电位频率、幅度、波形以及细胞网络间信号传播速度等参数的细胞传感器。具有制作简单、生物相容性佳、可与传统显微镜观察并行使用等优点，目前在细胞传感器研究领域得到了广泛应用。

集成芯片上的MEA部分可根据需要设计成任意的m*n阵列(n，m分别为整数)，每排电极直径和电极间距可设计为10-50μm，优选为20-30μm，基本与细胞大小接近。出于简化设计，本发明设计成3*3阵列，每排电极直径均为30μm，尺度基本与细胞大小接近，电极间距也为30μm  (除左下脚电极因布线原因间距6μm)，便于形成一个均一、微型的测试网络单元。由于金属传感点位需暴露出，并和细胞接触用于传感，而金属引线则和外界隔离，所以因在制作工艺允许的条件下，设计出与细胞直径相当的微电极阵列孔，尽量避免几何尺寸对于细胞动作电位和电生理的影响，但引线及焊盘因考虑阻抗因素尽量增大。在本制作过程中，本方法采用标准半导体制作工艺，步骤简述为：四英寸硅片(厚度450μm)经标准清洗后进行初次氧化，厚度1μm，以形成一层薄绝缘层；然后在硅片表面溅射一层Cr薄膜，厚度100nm，作为粘附Au的中间层，再磁控溅射Au薄膜，厚度500nm，作为电极层。用AZ光刻胶S1912光刻出电极图形后，采用湿法刻蚀将暴露出的金属层刻蚀，电极最小线宽为20μm；刻蚀完成后，采用PECVD在硅片上淀积SiO2/Si3N4/SiO2绝缘层各500nm，用光刻胶保护后，再用反应离子刻蚀技术(Reactive IonEtching，RIE)刻蚀出电极孔(最小直径30μm)和芯片上的焊点(500μm)。

ECIS***是检测细胞在电极表面的贴附、迁移等时的细胞-电极贴附阻抗的变化，一般用交流阻抗谱来表征。本发明芯片中的ECIS***可设计为叉指型细胞电阻抗分析器件(Interdigitated array，IDA)，也可以设计为圆盘形ECIS，或同时包括IDA和圆盘形ECIS。优选的ECIS***为同时包括IDA和圆盘形ECIS。

叉指型细胞电阻抗分析器件(Interdigitated array，IDA)可对细胞迁移、繁殖等引起阻抗变化进行测试并分析，属于ECIS中的一种，在细胞阻抗测试时灵敏度较高，可对不同条件中细胞状态进行实时监测。细胞-阻抗电特性分析传感器是主要用于分析不同细胞的电阻变化、膜电容变化、和细胞层-基底膜空间变化的电生理研究仪器。其研究对象主要是肾细胞、上皮细胞、大部分肿瘤细胞等贴壁型细胞，也可用于一些具有电生理活性、能产生动作电位的贴壁型细胞，如心肌细胞等。

在本设计中，单个叉指电极的宽度和间距可设计为10-50μm，优选设计为20-30μm。叉指长度根据器件单元排布设计为2.4mm，由30对微带电极组成，单个叉指电极有效电极测试区面积约为3mm²，为提高对比度和重复性，同一芯片上设计两对叉指单元。为了减小相邻两电极间的耦合电容等对测量所造成干扰，可选择玻璃或硅基底材料，若同时为了考虑多个传感单元的集成芯片并行设计，可采用硅基底；而为便于细胞观察及提高生物耦合等因素，可采用玻璃基底。本设计中分别采用了两种基底进行了加工制作。使用多层光刻工艺加工电极时，电极表面的叉指对为暴露出的金电极，引线部分除了焊盘外均覆盖了由PECVD技术形成的SiO2/Si3N4/SiO2的绝缘层，同时需暴露出2对面积分别为8mm²的有效细胞贴附区。

在ECIS***中，另一种有效的结构是圆盘形结构。圆盘形ECIS是一种能够同时测量多种不同细胞的电阻变化、膜电容变化和细胞层基底膜空间变化的电生理阻抗测试器件。其测试原理主要采用2电极电路，即工作电极和对电极，电极的大小可从微米级到毫米级，用于在电极上贴附多个细胞。当输入某个频率的交流电压，测量输出的交流电流(大小为u A级)，可得到一个交流阻抗值，经过几个小时的阻抗动态变化过程分析，对细胞的生理状态进行定量评估。

ECIS圆形电极阵列芯片可根据需要设计成n组(n为整数)，各模块共享参考电极。电极的大小可从微米级到毫米级，例如10μm-1mmμm，更优选为20μm-250μm。出于优化设计，本发明将四部分大圆盘电极在空间上进行接地隔离。表1为圆盘电极各部分参数，共为4个具有微阵列点的金圆盘电极。其中圆盘电极1为单个直径1.5mm的金电极，用于细胞与电极贴附后的初步电生理阻抗测试；圆盘电极2直径1mm，阵列的单个电极点直径为25μm，和普通细胞大小10-30μm大小相匹配，主要用于测试贴壁性细胞的迁移及电生理活性等动态参数，圆盘电极3和4直径均为1mm，阵列点直径和间距分别为100um，250um，等间隔排布，工作电极表面加工出暴露出与细胞的接触位点，传输并记录细胞的交流阻抗变化，主要用于分析细胞形态、细胞贴附等相对静态参数，并尽量减小相邻电极之间的电场干扰问题。

表1.ECIS圆盘电极阵列芯片各模块参数

表2集成芯片各模块参数

现有的细胞芯片技术是以单种细胞、二维培养为基础的，细胞在平面上的分布没有差异性，这为生理仿真性、信号采集和数据处理带来巨大问题。而我们开发的细胞打印技术，可在组织器官的解剖学数字模型直接驱动下，准确定位装配活细胞/材料单元，制造组织或器官的多细胞前体的技术。因此，以细胞组装技术组装和诱导多种细胞并控制它们的精确位置，构建多种细胞的三维结构体在理论和技术上都是可行的，这也使得在阵列传感器芯片上定位装配细胞成为可能。

通过将细胞和基质材料混合，我们得到了可与细胞芯片结合的细胞组合物。其中，优选的，细胞的数量为10⁶-10⁸个/1ml基质材料，优选1-5×10⁷个/1ml基质材料。优选地，细胞可为心肌细胞或肾上腺素嗜铬细胞。细胞来源于已经有的动物细胞系，例如大鼠、小鼠、兔子、猪、牛或人等，优选来源于大鼠或人的细胞系。

细胞外基质构成细胞生存的外环境，它们是发育过程中从细胞内分泌到细胞外的各种大分子，然后在细胞周围构成高度水合的凝胶或纤维性网络，起支持、保护、营养细胞的作用，对细胞的分化、运动、通讯有重要影响。应用于细胞组装的人工基质材料应有助于三维组装结构的形成和稳定，有助于细胞在适宜的三维开放环境内形成细胞群，并传输化学和力学信号至细胞。此外，细胞基质材料要有助于细胞/材料复合物于传感器芯片表面的结合。

本发明优选的基质材料为包含明胶和海藻酸钠的共混物。明胶∶海藻酸钠的配比优选为1∶0.2-1，更优选为1∶1。可以将明胶和海藻酸钠分别溶于PBS缓冲液中，临用时将两种材料以1∶0.2-1均匀共混，优选以1∶1共混。由于基质材料是共混物，因此，其凝胶化方式比单一材料的凝胶化方式多，既可以通过控制温度(明胶)实现凝胶化，也可以通过引入交联剂(如Ca²⁺)凝胶化。

将基质材料和培养的细胞混合，得到浓度约为10⁶-10⁸个细胞/mL基质材料的细胞组合物，优选为1-5×10⁷个细胞/1ml基质材料。

可通过细胞组装技术将混合于基质材料内的细胞打印到细胞传感器芯片表面形成具有三维空间结构的细胞组合物。用于细胞三维受控组装的专用实验***主要包括专用数据处理软件，例如Solidworks，Cark分层软件等，基于四轴运动控制卡和步进电机驱动的三维成形平台，材料输运子***，及独立温控的成形室及分体式设计的成形底板。通过整个***的协调控制，实现了对组装过程的精确控制，打印完成后得到细胞定点准确固定在细胞芯片上。例如，可将具有三维结构的心肌细胞组合物固定在细胞微电极阵列(Microelectrode array，MEA)表面，具有三维结构的肾上腺素嗜铬细胞组合物单独或同时固定在叉指型细胞电阻抗分析器件(Interdigitated array，IDA)和/或圆盘形ECIS表面。

上述步骤中，明胶/海藻酸钠/细胞通过低温堆积成形，再经Ca2+离子交联，结构稳定，既具有一定的硬度，也具有一定的抗拉特性，结构可稳定维持1个月以上，设计的通道始终保持清晰可辩。

优选的，根据上述步骤获得一种细胞芯片，所述的细胞芯片包括细胞微电极阵列(Microelectrode array，MEA)和电阻抗传感器(Electric Cell-substrate Impedance System，ECIS)，其中具有三维结构的心肌细胞组合物固定在细胞微电极阵列(Microelectrodearray，MEA)表面，具有三维结构的肾上腺素嗜铬细胞组合物固定在电阻抗传感器(Electric Cell-substrate Impedance System，ECIS)表面。

更优选的，根据上述步骤获得一种细胞芯片，所述的细胞芯片包括细胞微电极阵列(Microelectrode array，MEA)、叉指型细胞电阻抗分析器件(Interdigitated array，IDA)和圆盘形ECIS，其中具有三维结构的心肌细胞组合物固定在细胞微电极阵列(Microel ectrode array，MEA)和叉指型细胞电阻抗分析器件(Interdigitated array，IDA)表面，具有三维结构的肾上腺素嗜铬细胞组合物固定在另一区域的叉指型细胞电阻抗分析器件和圆盘形ECIS表面。

上述细胞芯片中，各元器件如细胞微电极阵列(Microelectrodearray，MEA)、叉指型细胞电阻抗分析器件(Interdigitated array，IDA)、圆盘形ECIS、细胞组合物及基质材料的定义如前所述。

因此，本发明一方面工作是面向细胞定位打印技术，设计了一种新型的集成了细胞微电极阵列(Microelectrode array，MEA)和电阻抗传感器(Electric Cell-substrate Impedance System，ECIS)等传感单元的阵列化芯片。这种集成芯片设计，采用细胞微电极阵列传感器、电阻抗传感器(ECIS)集成型器件，对照地进行细胞电生理重要参数的分析，可同时检测细胞动作电位、细胞电阻抗及细胞生长状态的贴附性、迁移性等变化，实现细胞多种电生理参数的实时无损测量。

本发明的另一目的是提供了一种制备三维细胞芯片的方法，该方法包括如下步骤：

(1)将细胞和基质材料混合得到细胞组合物；

(2)将细胞组合物经三维受控组装的专用实验***固定在芯片

传感器表面形成具有三维结构的细胞组合物。

上述方法中，细胞、基质材料、芯片传感器的定义如前所述。

上述方法中细胞三维受控组装的专用实验***主要包括专用数据处理软件，例如Solidworks，Cark分层软件等，基于四轴运动控制卡和步进电机驱动的三维成形平台，材料输运子***，及独立温控的成形室及分体式设计的成形底板。通过整个***的协调控制，实现了对组装过程的精确控制，打印完成后得到细胞定点准确固定在细胞芯片上。优选的设备如殷华公司的Cell Assembly II设备。

本发明的另一目的是提供一种应用上述的三维细胞芯片模型用于药物筛选的方法。

本发明以细胞打印技术和微电极阵列传感器技术建立三维定位细胞芯片。通过多喷头细胞打印设备定位打印在微电极阵列传感器阵列中的指定位置，构建细胞芯片。通过芯片上的细胞传感器传输并记录细胞动作电位频率、幅度、波形以及细胞网络间信号传播速度等参数。

本发明建立了以心肌细胞和肾上腺嗜铬细胞为主的体外心肌-肾上腺素调控***建模框架。设计了用以指导构建细胞芯片的结构模型。应用细胞组装技术，完成了设计芯片的组装。研究表明模型比平面培养于芯片表面的细胞能更好的仿真体内的生理病理情况。

从心肌节律性和传导性在心血管疾病中的重要性出发，选择了以MEA传感器检测细胞芯片中心肌的动作电位和细胞网络间的信号传播速度，从而实时监测心肌的自动节律性和传导特性。

从肾上腺素嗜铬细胞的繁殖和迁移在代谢性心肌疾病中的重要性出发，选择了以IDA传感器检测细胞芯片中肾上腺嗜铬细胞组装位置的阻抗变化，从而实时监测肾上腺嗜铬细胞的生长、迁移、变形。

构建定位组装心肌细胞和肾上腺素能细胞的细胞芯片后，加入待测药物，检测模型在正常和病理条件下的监测数据，通过分析待测药物的药理活性可进行药物筛选。

心肌细胞和肾上腺素嗜铬细胞的细胞芯片的一种用途是可以作为心血管疾病的病理模型，在体外模拟心血管疾病的病理特征。心肌细胞的收缩性与自律性、兴奋性、传导性等生理特性共同决定着心脏的活动，是心功能和心血管功能的重要生理基础。当心肌细胞的搏动发生异常时可以导致心率不齐、高血压、房颤、室颤、心绞痛和心肌梗死等一系列心血管疾病。心肌细胞的功能受多种因素调节，其中肾上腺嗜铬细胞分泌的肾上腺素起重要的调节作用，当肾上腺嗜铬细胞分泌的紊乱时，会导致心肌功能紊乱和一系列心血管疾病的发生。

细胞芯片中在MEA器件部位组装的心肌细胞相当于体内的心脏，在IDA和/或圆盘ECIS传感器部位组装的肾上腺嗜铬细胞相当于体内的肾上腺分泌细胞。而培养液中的各种物质包括药物，模拟体内的正常和病理情况。通过检测细胞芯片中心肌细胞的动作电位和细胞网络间的信号传播速度，可以实时监测心肌的自动节律性和传导特性。通过检测细胞芯片中肾上腺嗜铬细胞组装位置的阻抗变化，可以实时监测肾上腺嗜铬细胞的生长、迁移、变形。由此该细胞芯片可以再现并实时检测体内肾上腺嗜铬细胞分泌肾上腺素调控心肌功能的过程，对多种心血管疾病进行研究和药物筛选，特别是腺嗜铬细胞瘤引起的一系列心血管疾病。

本模型和建立模型的技术，在细胞芯片领域和药物研究领域有广泛的应用前景：其中对三维细胞芯片的发展应用，“human on a chip”这样的目标的实现，将产生巨大的推动作用；也将使体外药物实验更***、准确接近体内实验，降低药物开发成本和风险，加快新药研发的进程。该技术具有广泛的应用前景。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，本发明的保护范围并不局限于实施例，凡是根据本发明公开的内容或原理实施的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为细胞芯片组装图，其中图1-1为原理流程，图1-2为组装完成后的细胞芯片。

图2为芯片表面结构。其中图2-1为金属层(采用Cr/Au材料制作的电极及焊盘层)，图2-2为绝缘层阴版(采用SiO2/Si3N4/SiO2制作的绝缘层所暴露出的电极有效位点及焊盘区)

图3为集成芯片加工工艺过程流程图

图4金圆盘电极交流阻抗图谱

图5细胞阻抗变化图。结果显示在抗癌药物5-FU的作用下，芯片上的两种细胞都发生了死亡，其中5-FU对肿瘤来源的细胞PC-12的杀伤作用比对心肌细胞的作用更强。结果证明芯片对细胞生长的检查灵敏性，也显示筛选肿瘤药物的潜力。

图6芯片检测到的心肌细胞的自动节律活动

图7不同药理机制的药物对打印细胞芯片***内的心肌跳动频率影响。在三种不同机制的心血管药物作用下，细胞芯片的检测结果显示，β肾上腺素受体拮抗药***可显著降低心肌细胞跳动频率、α肾上腺素能受体阻滞剂酚苄明对心肌细胞的跳动频率无显著影响、儿茶酚胺的生物合成抑制剂α-甲基酪氨酸也可以显著降低心肌细胞跳动频率。该细胞芯片可以同时筛选出，作用于心肌β肾上腺素受体和抑制儿茶酚胺的合成的两大类药物。结果证明了该细胞芯片进行心血管药物筛选的能力。

具体实施方式

实施例1心肌细胞培养

选择来源于新生大鼠的心肌细胞作为构成***基础的种子细胞之一。

(1)一次取一只乳鼠，放在一块无菌纱布上，用70％乙醇擦洗其胸腹部，摘出心脏放进标记着1的烧杯中。每次解剖不要超过1分钟。

(2)用止血钳剔除心脏上***和血块，再转入标记为2的烧杯中，再洗一遍，转入标记为3的烧杯中。用吸管轻轻把烧杯3中的D-Hanks液吸出，然后加入2ml的0.25％胰酶溶液(37℃)，用眼科剪把心脏剪碎成沙粒大小，补加2ml胰酶溶液，混匀后37℃消化15分钟。

(3)消化后吸去上清，加入4ml新的胰酶溶液，混匀，37℃消化15分钟后再弃上清。加入2ml胰酶溶液和2ml 0.06％胶原酶(II型)溶液，混匀后37℃消化15分钟。同时取4支15ml离心管中加入6-7ml冷的接种培养基含10％FBS的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium，sigma)+)。

(4)移出上清至上述加有接种培养基的离心管中。余下的组织加入0.03％胶原酶4ml，混匀，37℃消化20分钟。重复用0.03％胶原酶消化3-5次，直至组织块消化完全或剩余少许为止。

(5)含培养基和细胞上清的离心管以1400rpm离心8分钟，吸去上清，用3ml接种培养基重悬后都收集到一支50ml离心管中，以1400rpm离心8分钟。吸去上清后，加入10ml接种培养基，吹打散开所有细胞团。

(6)将上述10ml细胞悬液转移至100mm规格的玻璃培养皿(预先用0.2％明胶处理过)中，于细胞培养箱中孵育1.5小时进行差速贴壁。

(7)孵育后培养皿中的培养液，用10ml接种培养基轻轻冲洗培养皿后收集。用接种培养基将细胞密度调整到2×10⁵-5×10⁵个/ml，制成接种液，接种到培养板35mm培养皿中。

(8)24小时后，用预温37℃的交换培养基(DMEM+10％BS)给细胞换液。换液后继续孵育，以后每两天换一次液。在接种24小时后可观察到心肌细胞的跳动，到第4天左右，大多数细胞都将跳动。一般用培养3天后的细胞进行实验。

实施例2肾上腺嗜铬细胞培养

(1)PC-12鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系(ATCC CRL-1721，AmericanType Culture Collection，美国典型菌种保藏中心)，用高糖DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，Sigma)+10％胎牛血清培养基，培养于37℃二氧化碳恒温培养一般三天左右，细胞达到单层汇合，细胞汇后，进行常规传代培养；

(2)传代：吸去培养液，加入0.2％的胰酶溶液1mL，迅速洗涤瓶壁后吸去，再加入0.2％的胰酶溶液1mL，37℃孵育约5min，显微镜观测，待80％的细胞变圆后，轻轻吸去胰酶溶液，迅速加入含15％FCS的DMEM培养基终止消化；吹打培养瓶壁，再次配成细胞悬液；调整细胞浓度到1.5～3×105cells/mL，接种于新培养瓶中。

(3)细胞可以正常传代培养，每三天传代一次。

实施例3多传感器集成芯片设计制作

在加工工艺中，MEA和ECIS单元都采用金电极并且基底结构和保护层结构均一样，因此可共享加工工艺。具体的加工工艺流程见图3中各步骤所示。加工过程以硅基底为例，加工过程简述如下：

首先器件表面绝缘层生长及沉积，采用化学气相沉积(PECVD)工艺在其上面沉积一层100nm的Si3N4。然后加工MEA及ECIS的多个功能单元。在前几步加工的基础上，芯片上利用PECVD沉积一层厚度为600nm的SiO2层，金属层采用Au/Cr复合层，Cr用于增强金和沉积SiO2的硅基底层之间的粘合度，再利用光刻胶层保护，刻蚀出MEA&IDE的电极和引线图案。由于引线部分需要和外界绝缘隔离，因此800nm厚的Si3N4沉积其上，并用光刻胶保护把电极电位和焊盘暴露。最后将正面和背面的电极、焊盘区域采用氧等离子刻蚀，对电极进行清洗工作此时MEA、ECIS两单元的三部分集成基本工艺完成。最后进行器件的封装工作，芯片表面结构如图2所示。

由于集成芯片上的MEA、ECIS各功能单元均属于电学芯片范畴，所以以ECIS中的圆盘电极为代表，以直径和间距最小、阻抗最大的圆盘微阵列电极为例(芯片图左下2)(电极阵列间距及直径均为d＝25μm)，对圆盘电极进行交流阻抗谱测试(图3)。

上图为ECIS芯片各单元中，理论阻抗值最大的圆盘电极阵列在0.9％的NaCl溶液中采用三电极电路对电镀前后的电极交流阻抗图谱(n＝10，直流偏置-0.2V，加载10mV交流电压)。在1KHz时，阻抗值约为500K Ω，已经符合微电极能测到细胞胞外电信号的要求。在具体性能测试中，交流阻抗幅值随着频率的升高稳步下降，且各电极的阻抗谱值差异不明显；但低频段内(1～100Hz)阻值随频率变化的斜率无中高频段变化显著，所以针对阻抗幅值灵敏度的测试适合在中高频段10³～10⁵Hz进行；针对圆盘电极的相位，在10³-10⁴Hz内，均为一基本恒定值(-80°左右)，因此可以判断电极主要呈容性，测试灵敏度不高。但低频和高频的相位随频率变化更明显，考虑低频区阻抗幅值较大，所以在实际测试细胞贴壁阻抗时，为说明生物膜等有机物引起的电极表面容性阻抗的变化，10⁴-10⁵Hz更适宜测试，且具有较好的灵敏度。因此，对电镀前后的圆盘电极交流阻抗测试说明电镀能有效增加电极表面积，从而改善电极的体阻抗及灵敏度。后期可针对电镀后电极所培养细胞的不同，对于多种生物素在电极表面贴附率的实验进行分析研究。

实施例4细胞芯片构建过程

(1)明胶，海藻酸钠和细胞共混材料制备：将明胶溶于PBS缓冲液中，形成20％的溶液，将海藻酸钠溶解于PBS缓冲液中，形成5％溶液，分别用NaOH中和残余醋酸，调节pH值到7.1，70℃烘箱中间歇式灭菌。临用时将两种材料以1∶1均匀共混。将材料和培养的心肌细胞和肾上腺嗜铬细胞分别混合，得到浓度约为1×10⁷/mL细胞-复合材料共混材料。

(2)将细胞/复合材料共混材料注入1mL的一次性注射器，置于4℃冰箱预冷30分钟以上；

(3)选用殷华公司的Cell Assembly II设备，在成形室内固定已灭菌的成形底板，打开成形室温控开关使成形室降温，实时监测温度，待温度降低到6℃时，安装注射器及固定喷头；

(4)由Solidworks设计3D模型及选定的成形参数直接驱动喷头在阵列传感器芯片表面组装细胞。根据结构特征尺寸及材料对应不同尺寸喷头膨胀率，选用直径120u m的喷头。扫描速度30mm/s，挤出流量1.2mm³/s。

(5)控制喷头分别在MEA部分和IDA部分装配心肌细胞，在IDA部分和圆盘形ECIS装配肾上腺嗜铬细胞。

(6)成形完成后得到含有细胞的细胞芯片。将芯片储存于无菌4℃的环境内，1小时内进行成形后处理。

(7)在芯片表面滴加5％灭菌氯化钙溶液交联1分钟，用DMEM洗涤三次；

(8)加含有10％FCS，1μmol/L insulin，50ng/mL EGF-1的DMEM培养液，37℃，5％CO₂环境下培养3d，隔日换液。

实施例4细胞芯片在药物筛选中的应用

(1)组装完成后的细胞芯片***，用含10％FCS的DMEM(Dulbecco’sModified Eagle’s Medium)培养液，37℃，5％CO₂环境下培养3d，隔日换液；由于肾上腺嗜铬细胞为瘤来源，会大量增殖分泌肾上腺素，模型自发发展为代谢性心肌病的病理状态；

(2)分别选择工作频率为6kHz、8kHz、10kHz的频率点进行测试(n＝5)。对细胞在药物刺激前，首先于室温下(20℃)静置1h，进行阻抗扫频测试；

(3)在对照***中加入5-FU，然后每间隔1h加入3种不同机制的药物β肾上腺素受体拮抗药***(100μg/mL)、α肾上腺素能受体阻滞剂酚苄明(100μg/mL)、儿茶酚胺的生物合成抑制剂：α-甲基酪氨酸(α-MT)(100μg/mL)，进行20min的动作电位测试，30min后用DMEM洗脱。

芯片检测得到的两种细胞阻抗数据，可见在抗癌药物5-FU的作用下，两种细胞的阻抗都下降了，表示细胞死亡，其中肾上腺嗜铬细胞因为具有肿瘤细胞特性，药物的作用更明显。

由实验结果可知道，本***可以同时准确监测出三种不同机制药物的药理作用，实验数据包括心肌细胞和肾上腺嗜铬细胞的增殖和迁移，心肌细胞的自动节律活动，模型对药物的筛选准确快速，采集的生理数据全面多样，为后续深入的机制研究奠定了基础。研究充分证明了，本细胞芯片***进行代谢性心肌疾病研究和药物筛选的潜力，同时这些实验也提出了运用模型进行筛选的方法。

Claims (27)

1.一种细胞芯片，包括细胞微电极阵列和电阻抗传感器，以及固定在传感器上的具有三维空间结构的细胞组合物，所述的细胞组合物为包括细胞和基质材料的共混物，所述细胞组合物中基质材料为包含明胶和海藻酸钠的混合物,细胞为心肌细胞或肾上腺素嗜铬细胞；其中,所述具有三维结构的心肌细胞组合物固定在细胞微电极阵列表面；所述具有三维结构的肾上腺素嗜镉细胞组合物单独或同时固定在叉指型细胞电阻抗分析器件和/或圆盘形电阻抗传感器表面。 

2.根据权利要求1所述的细胞芯片，其特征在于：所述细胞芯片上的微电极阵列部分设计成任意的m*n阵列，n、m分别为整数，每排电极直径和电极间距设计为10‐50μm。 

3.根据权利要求2所述的细胞芯片，其特征在于：所述细胞芯片上的微电极阵列部分每排电极直径和电极间距设计为20‐30μm。 

4.根据权利要求3所述的细胞芯片，其特征在于：所述细胞芯片上的微电极阵列部分设计成3*3阵列,每排电极直径均为30μm，电极间距也为30μm，除左下脚电极因布线原因间距6μm。 

5.根据权利要求1所述的细胞芯片，其特征在于：所述细胞芯片上电阻抗传感器***设计为叉指型细胞电阻抗分析器件或圆盘形电阻抗传感器，或同时包括叉指型电阻抗分析器和圆盘形电阻抗传感器。 

6.根据权利要求5所述的细胞芯片，其特征在于：所述细胞芯片上电阻抗传感器***同时包括叉指型电阻抗分析器和圆盘形电阻抗传感器。 

7.根据权利要求5所述的细胞芯片，其特征在于：所述细胞芯片上 单个叉指电极的宽度和间距设计为10-50μm。 

8.根据权利要求7所述的细胞芯片，其特征在于：所述细胞芯片上单个叉指电极的宽度和间距设计为20-30μm。 

9.根据权利要求5所述的细胞芯片，其特征在于：所述细胞芯片上叉指电极选择玻璃或硅基底材料。 

10.根据权利要求5所述的细胞芯片，其特征在于：所述细胞芯片上电阻抗传感器圆形电极设计成n组，n为整数，各模块共享参考电极。 

11.根据权利要求10所述的细胞芯片，其特征在于：所述细胞芯片上电阻抗传感器圆形电极的大小从微米级到毫米级，范围为10μm-1mm。 

12.根据权利要求11所述的细胞芯片，其特征在于：所述细胞芯片上电阻抗传感器圆形电极的大小为20μm‐250μm。 

13.根据权利要求10所述的细胞芯片，其特征在于：所述细胞芯片包括4个具有微阵列点的金圆盘电极，其中圆盘电极1为单个直径1.5mm的金电极；圆盘电极2直径1mm，阵列的单个电极点直径为25μm；圆盘电极3和4直径均为1mm，阵列点直径和间距分别为100um和250um。 

14.根据权利要求1所述的细胞芯片，其特征在于：所述细胞芯片包括1组3×3阵列的微电极阵列，分布于芯片中心；4组电阻抗传感器圆形电极阵列，分布于芯片左边区域；2组叉指型电阻抗分析器阵列区域，分布于芯片右边区域，上下对称。 

15.根据权利要求1所述的细胞芯片，其特征在于：所述的细胞组合 物中细胞的数量为10⁶‐10⁸个/1ml基质材料。 

16.根据权利要求15所述的细胞芯片，其特征在于：所述的细胞组合物中细胞的数量为1‐5×10⁷个/1ml基质材料。 

17.根据权利要求15所述的细胞芯片，其特征在于：所述的细胞组合物中细胞为心肌细胞或肾上腺素嗜铬细胞。 

18.根据权利要求17所述的细胞芯片，其特征在于：所述的细胞组合物中细胞来源于大鼠、小鼠、兔子、猪、牛或人的细胞系。 

19.根据权利要求18所述的细胞芯片，其特征在于：所述的细胞组合物中细胞来源于大鼠或人的细胞系。 

20.根据权利要求1所述的细胞芯片，其特征在于：所述的细胞组合物中基质材料为包含明胶和海藻酸钠的共混物，明胶：海藻酸钠的配比为1：0.2‐1。 

21.根据权利要求20所述的细胞芯片，其特征在于：所述的细胞组合物中基质材料明胶：海藻酸钠的配比为1:1。 

22.根据权利要求21所述的细胞芯片，其特征在于：所述的细胞组合物通过控制温度或引入交联剂凝胶化。 

23.根据权利要求1所述的细胞芯片，其特征在于：通过细胞组装技术将混合于基质材料内的细胞打印到细胞传感器芯片表面形成具有三维空间结构的细胞组合物。 

24.权利要求1-23任一项所述的细胞芯片，其特征在于：所述的细胞芯片包括细胞微电极阵列和电阻抗传感器，其中具有三维结构的心肌细胞组合物固定在细胞微电极阵列表面，具有三维结构的肾上腺素嗜铬细胞组合物固定在电阻抗传感器表面。 

25.根据权利要求24所述的细胞芯片，其特征在于：所述的细胞芯片包括细胞微电极阵列、叉指型细胞电阻抗分析器件和圆盘形电阻抗传感器，其中具有三维结构的心肌细胞组合物固定在细胞微电极阵列和叉指型细胞电阻抗分析器件表面，具有三维结构的肾上腺素嗜铬细胞组合物固定在另一区域的叉指型细胞电阻抗分析器件和圆盘形电阻抗传感器表面。 

26.制备权利要求1-23任一项所述细胞芯片的方法，包括如下步骤： 

(1)、将细胞和基质材料混合得到细胞组合物； 

(2)、将细胞组合物经三维受控组装的专用实验***固定在芯片传感器表面形成具有三维结构的细胞组合物。 

27.权利要求1-23任一项所述的细胞芯片在药物筛选中的应用，其特征在于：所述细胞芯片中固定有心肌细胞和肾上腺素嗜铬细胞的细胞芯片作为心血管疾病的病理模型，在体外模拟心血管疾病的病理特征，加入待测药物，检测模型在正常和病理条件下的监测数据，通过分析待测药物的药理活性进行药物筛选。