CN102379984A - 一种延缓衰老美白肌肤的组合物、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种延缓衰老美白肌肤的组合物，其组分以重量计为芍药花36～46份，银杏叶16～26份，黄芪19～29份，枸杞子9～19份，优选芍药花为经过脱除其中所含苯甲酸处理的芍药花，并优选银杏叶为经过脱除其中所含银杏酸处理的银杏叶，本发明还公开了该组合物的制备方法与应用；本发明采用了四种中药作为组成成分，组成简单，材料易于取得，成本低廉，并且取得了延缓衰老肌肤美白的协同增效效果；本发明的组合物安全可控，对于健康没有危害，且本组合物制备方法简单易行，便于工业化生产，并且成本低廉，易于推广，能产生较大的经济效益。

Description

一种延缓衰老美白肌肤的组合物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种由中药组合而成的延缓衰老美白肌肤的组合物、其制成的保健食品或药品，其制备方法及其在延缓衰老美白肌肤中的应用。 

背景技术

医药界人士所共知，去斑养颜、美白肌肤、延缓衰老、永葆青春是人们梦寐以求的事情，人们总在想各种办法来解决这个问题。随着年龄的增长，人体天然抗自由基的能力，亦即抗氧化的能力不断下降，人的细胞会衰老，人的外表上也会产生皮肤粗糙、色素沉着等问题，人体组织器官也会迅速衰老。随着我国经济的发展及人们生活水平的提高，人们对生活质量有了更高的要求，去斑养颜、美白肌肤、延缓衰老、永葆青春这一世界性医学课题在我国也日益受到关注。

而很多中药具有药食同源的优势，被广泛应用于延缓衰老和美白肌肤等。比如，芍药（Paeonia lactiflora）花中的芍药苷、羟基芍药苷等均具有抗氧化作用，能清除自由基、抑制过氧化脂质形成，它们均具有去斑养颜、抗衰老的作用；银杏（ginkgo）叶中的银杏双黄酮、异银杏双黄酮、去甲基银杏双黄酮、槲皮素等具有很强的抗氧化活性，能够清除自由基，抵抗脂质过氧化损伤，延长细胞寿命，抑制黑色素生长，保持皮肤光泽与弹性；黄芪（Radix Astragali）中含有的黄酮类成分毛蕊异黄酮、3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷以及皂甙类成份黄芪皂甙Ⅰ、Ⅴ、Ⅲ等均具有较强的抗氧化作用，可降低血清中过氧化脂质和肝脏脂褐素含量，黄芪总黄酮还有回升SOD活性的作用，可减少脂质过氧化物对生物膜的损害，它们均能够起到去斑养颜、抗衰老的作用；枸杞子（Lycii fructus）中含有的很多抗氧化物，如维生素E、维生素C、胡萝卜素、甜菜碱、黄酮类的芦丁等，它们均能很好地抑制过氧化脂质的生成，具有很强的抗氧化功能，能够起到去斑养颜、延缓衰老的作用。

目前，也有很多关于延缓衰老美白肌肤的组合物的报道，这些报道中公开了使用上述一种或者多种中药制备的用于抗衰老和美白等的组合物，如公开号为101744756A的中国专利申请，又如公开号为101797208A的中国专利申请。

目前报道的这些组合物，往往具有一个共同特点即组成成分复杂，如公开号为101744756A的中国专利申请的组成成分达20种之多，其他现有的组合物也是至少七种以上，这也成为这些组合物的一个最大缺点。具体而言，首先，中药的成分复杂，很多重要的成分尚未完全弄清楚，过多的中药混合，相互之间会发生复杂反应，增加了中药的不确定性风险，尤其对于用于延缓衰老和肌肤美白使用的药物或保健品，往往需要长期服用，从而增加了副反应甚至致病致畸致癌的风险；其次，种类繁多，对于生产成本、原料的采集也带来困难，尤其对于中药资源欠丰富的生产厂家，增大了其生产成本，直接影响企业经济效益。

    另外，虽然目前有一些药物用到芍药花和/或银杏叶，但是据报道并根据本申请发明人的验证，芍药花中一般含有1.5％以上的苯甲酸，它具有很强的肝肾毒性及致癌危险，没有去除这些苯甲酸，会对人体造成很大的危害；银杏叶中含有1％～2%的银杏酸，它具有很强的细胞毒性，有极大的致敏、致突变和致癌的危害，如果没有去除，会给人体造成极大的危害，尤其对于需要长期服用的延缓衰老和美白肌肤的药物，更会加大有害物质的累积并造成健康损害的风险。 

发明内容

本发明的发明目的之一，在于针对上述存在的问题，提供一种组成成分简单、成本低廉且延缓衰老美白肌肤效果好的药物组合物。

本发明采用的技术方案是这样的：一种延缓衰老美白肌肤的组合物，其组分以重量计为：芍药花36～46份，银杏叶16～26份，黄芪19～29份，枸杞子9～19份。

发明人经过大量实验，筛选了芍药花、银杏叶、黄芪、枸杞子这四种最为常见的中药，组成新的组合物，并确定了其合适的比例范围，并通过实验验证了其延缓衰老美白肌肤的有效性，同时证明其延缓衰老美白肌肤的作用强于单独采用上述任意一种、两种、三种中药的作用，即本发明是组合物之间具有延缓衰老美白肌肤的协调增效作用。

作为优选：其组分以重量计为：芍药花41份，银杏叶21份，黄芪24份，枸杞子14份。通过大量实验，得到了四种组分的最佳延缓衰老美白肌肤效果的比例。

本发明的发明目的之二，在于提供一种更为安全的延缓衰老美白肌肤的组合物。

采用的技术方案为：所述芍药花为经过脱除其中所含苯甲酸处理的芍药花。

作为优选：所述芍药花中苯甲酸含量控制在质量百分比为0.075%以下。

作为优选：所述银杏叶为经过脱除其中所含银杏酸处理的银杏叶。

作为优选：所述银杏叶中银杏酸含量控制在质量百分比为0.001％以下。

脱除芍药花中苯甲酸的方法为：选择初开或者盛开的芍药花，用清水洗净，摊放均匀，阴干到花瓣自然脱落或者一触动即脱落，除去花盘、花蕊、萼片等杂质，将花瓣置杀青机中，保持杀青机上部气流畅通，在280℃～320℃的温度下持续50～70秒瞬间杀青和去除苯甲酸，取出，放冷，然后将花瓣置烘箱中，保持烘箱上部气流畅通，于180℃～220℃的温度下烘烤2～3分钟，以进一步除去苯甲酸，取出，放冷，置烘箱中于104℃～106℃的温度烘烤至水份为8％～12％，取出，放冷即可。

脱除银杏叶中的银杏酸的方法：

选择秋天成熟自然脱落的银杏叶，用清水洗净，摊放均匀，晾干表面粘附的水份，然后将银杏叶置杀青机中，在340℃～380℃的温度下持续50～70秒瞬间杀青，取出，放冷，于200℃～240℃的温度下烘烤3～5分钟，使银杏叶初步干燥，取出，放冷，置烘箱中于103℃～105℃的温度烘烤至水份为9％～14％时即可；

然后将上述烘干的银杏叶进行脱酸处理，脱酸处理的药剂为3％～5％的氢氧化钠溶液或者4.5％～6.5％的氢氧化钾溶液或者其它适宜的无机碱性溶液。

脱酸方法是：将以上烘干的银杏叶用3％～5％的氢氧化钠溶液或者4.5％～6.5％的氢氧化钾溶液或者其它适宜的无机碱性溶液浸泡30～50分钟，取出，晾干表面粘附的脱酸溶液，置烘箱中于103℃～105℃的温度烘烤至水份为9％～14％，然后再次用3％～5％的氢氧化钠溶液或者4.5％～6.5％的氢氧化钾溶液或者其它适宜的无机碱性溶液浸泡20～40分钟，取出，用清水浸泡8～10分钟，取出即可。

本发明采用简单的处理方法，即可将苯甲酸含量控制在质量百分比为0.075%以下、银杏叶中银杏酸含量控制在质量百分比为0.001％以下，同时，其他有效成分得到充分保留，在保证服用本发明的组合物的安全性的同时，保证了延缓衰老美白肌肤的效果。

本发明的目的之三在于，提供一种上述组合物的制备方法，采用的技术方案为：分别制备芍药花、银杏叶、黄芪和枸杞子，然后按照所述的重量比例进行混合即可，其中芍药花的处理和制备、银杏叶的处理和制备如前所述。

黄芪薄片的制备：

    取黄芪，用清水快速洗净，放置，让水份浸入黄芪内部以使黄芪湿润，切成厚度为2～3mm的薄片，置烘箱中于102℃～105℃的温度烘烤至含水量为8％～12％，密封保存；

枸杞子的制备：

取枸杞子，用清水快速洗净，放置，晾干表面粘附的水份，置烘箱中于102℃～105℃的温度烘烤至含水量为10％～14％，密封保存。

本发明的目的之四在于，提供上述组合物的应用，采用的技术方案为：将以上通过处理的芍药花、银杏叶、黄芪和枸杞子通过制备茶的方法制成茶，或者用水煎的方法或者用超临界的方法分别提取浸膏，然后加适宜的辅料制成颗粒剂、片剂、糖浆剂、口服液等适宜的剂型。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

首先，采用了四种中药作为组成成分，组成简单，材料易于取得，成本低廉，并且取得了延缓衰老肌肤美白的协同增效效果；

其次，本发明的组合物安全可控，对于健康没有危害。具体而言，一方面由于材料为常见中药，其所含化学成分清楚可控，另一方面，将已知的有害成分苯甲酸和银杏酸采用简单的方法脱除，进一步保证了长期服用本组合物的安全性，其中，利用芍药花中所含有的苯甲酸是以游离态形式存在的特点及其在温度为100℃时迅速升华的特点，采用简单方便、成本低廉的方法将其脱除，并且很好地保留了其中的芍药苷、羟基芍药苷等具有抗氧化作用、能清除自由基、抑制过氧化脂质形成的成份，通过本发明的加工处理，这些有益成份更容易溶解出来；同时利用银杏叶中含有的有害成份银杏酸具有较强的水溶性和易和碱反应生成更易溶解于水的盐而其有益成份黄酮类物质在低温下不易溶解于水的特点，采用简单方便、成本低廉的方法将其去除，并且很好地保留了其中的银杏双黄酮、异银杏双黄酮、去甲基银杏双黄酮、槲皮素等具有很强的抗氧化活性，能够清除自由基、抵抗脂质过氧化损伤、延长细胞寿命、抑制黑色素生长、保持皮肤光泽与弹性的成份，通过本发明的加工处理，这些有益成份更容易溶解出来；

最后，本发明的组合物制备方法简单易行，便于工业化生产，并且成本低廉，易于推广，能产生较大的经济效益。

具体实施方式

下面结合具体实验和数据，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：分别制备芍药花、银杏叶、黄芪和枸杞子

芍药花的制备：

选择盛开的芍药花，用清水洗净，摊放均匀，阴干到花瓣自然脱落或者一触动即脱落，除去花盘、花蕊、萼片等杂质，将花瓣置杀青机中，保持杀青机上部气流畅通，在300℃的温度下持续60秒瞬间杀青和去除苯甲酸，将杀青后的花瓣自然放置回软到花瓣揉而不碎的程度，将回软的花瓣用揉捻机揉捻到自然紧凑的卷曲为止，将揉捻后的花瓣置烘箱中，保持烘箱上部气流畅通，于220℃的温度下烘烤2分钟，以使花瓣成型和进一步除去苯甲酸，取出，放冷，置烘箱中于105℃的温度烘烤至水份为10％时即可。

银杏叶的制备：

选择秋天成熟自然脱落的银杏叶，用清水洗净，摊放均匀，晾干表面粘附的水份，然后将银杏叶置杀青机中，在360℃的温度下持续60秒瞬间杀青，取出，放冷，于220℃的温度下烘烤4分钟，使银杏叶初步干燥，取出，放冷，置烘箱中于104℃的温度烘烤至水份为12％时即可。

然后将上述烘干的银杏叶进行脱酸处理，脱酸处理的药剂为,4％的氢氧化钠溶液或脱酸方法是：将以上烘干的银杏叶用4％的氢氧化钠溶液浸泡30～50分钟，取出，晾干表面粘附的脱酸溶液，置烘箱中于104℃的温度烘烤至水份为12％，然后再次用5％的氢氧化钠溶液浸泡30分钟，取出，用清水浸泡10分钟，取出。

然后进行成型处理：晾干表面粘附的脱酸溶液，然后置杀青机中，在310℃的温度下持续60秒瞬间干燥，然后倒出，自然放置回软到叶片揉而不碎的程度，将回软的银杏叶用揉捻机揉捻到自然紧凑的卷曲为止，将揉捻后的银杏叶置烘箱中，于200℃的温度下烘烤3分钟，取出，放冷，置烘箱中于106℃的温度烘烤至水份为10％时即可。

黄芪薄片的制备：

    取黄芪，用清水快速洗净，放置，让水份浸入黄芪内部以使黄芪湿润，切成厚度为3mm的薄片，置烘箱中于103℃的温度烘烤至含水量为10％，密封保存。

枸杞子的制备：

取枸杞子，用清水快速洗净，放置，晾干表面粘附的水份，置烘箱中于103℃的温度烘烤至含水量为12％，密封保存。

将以上制备好的芍药花、银杏叶、黄芪和枸杞子按照干品重量计，芍药花40份，银杏叶22份、黄芪24份，枸杞子14份的比例，混合均匀，分装成每袋10克即可

实施例2：

一种延缓衰老美白肌肤的组合物，其组分以重量计为：芍药花36份，银杏叶16份，黄芪29份，枸杞子19份。本实施例的制备方法与实施例1类似，不同点仅在于不脱除苯甲酸和银杏酸。

实施例3：完整花瓣和叶片茶的制备

将实施例2的组分均匀混合，分装成每袋10g即可。

实施例4：

一种延缓衰老美白肌肤的组合物，其组分以重量计为：芍药花46份，银杏叶26份，黄芪19份，枸杞子9份。本实施例的制备方法与实施例1类似，不同点仅在于不脱除苯甲酸和银杏酸。

实施例5：粉碎成粗粉的芍药花和银杏叶茶

将实施例4的组分分别粉碎成粗粉，然后混合均匀，分装成每袋10g即可。

实施例6：

一种延缓衰老美白肌肤的组合物，其组分以重量计为：芍药花41份，银杏叶21份，黄芪24份，枸杞子14份。本实施例的制备方法与实施例1类似，不同点仅在于不脱除苯甲酸和银杏酸。

实施例7：

一种延缓衰老美白肌肤的组合物，其组分以重量计为：芍药花41份，银杏叶21份，黄芪24份，枸杞子14份。本实施例的制备方法与实施例1的方法完全一致。

实施例8：一种延缓衰老美白肌肤的组合物制成的颗粒剂

芍药花浸膏的制备：

选择初开的芍药花，用清水洗净，摊放均匀，阴干到花瓣自然脱落，除去花盘、花蕊、萼片等杂质，将花瓣置杀青机中，保持杀青机上部气流畅通，在280℃的高温下持续70秒瞬间杀青和去除苯甲酸，取出，放冷，然后将花瓣置烘箱中，保持烘箱上部气流畅通，于180℃的温度下烘烤2分钟，以进一步除去苯甲酸，然后倒出，放冷置烘箱中于106℃的温度烘烤至水份为12％，取出，放冷。

  　取以上烘干和去除苯甲酸后的芍药花，加干花重量8倍的水煎煮1小时，滤过，收集滤液备用，芍药花再加干花重量6倍的水煎煮0.5小时，滤过，收集滤液，与前面的滤液合并，静置，取上清液，浓缩至相对密度为1.18，即得芍药花浸膏。

银杏叶浸膏的制备：

选择秋天成熟自然脱落的银杏叶，用清水洗净，摊放均匀，晾干表面粘附的水份，将银杏叶置杀青机中，在380℃的温度下持续50秒瞬间杀青，取出，放冷，于220℃的温度下烘烤5分钟，使银杏叶初步干燥，取出，放冷，置烘箱中于103℃的温度烘烤至水份为14％时即可。

然后将以上烘干的银杏叶进行脱酸处理。脱酸处理的药剂为4.5％的氢氧化钾溶液，脱酸方法是：将以上烘干的银杏叶用4.5％的氢氧化钾溶液或者其它适宜的无机碱性溶液浸泡50分钟，取出，晾干表面粘附的脱酸溶液，置烘箱中于103℃的温度烘烤至水份为14％，然后再次用4.5％的氢氧化钾溶液浸泡20分钟，取出，用清水浸泡10分钟，取出。

取上述用清水浸泡后的银杏叶，加原鲜叶净重8倍的水煎煮1小时，滤过，收集滤液备用，银杏叶再加原鲜叶净重6倍的水煎煮0.5小时，滤过，收集滤液，与前面的滤液合并，静置，取上清液，浓缩至相对密度为1.15，即得银杏叶浸膏。

黄芪浸膏的制备：

    取黄芪，取黄芪，用清水快速洗净，放置，让水份浸入黄芪内部以使黄芪湿润，切成厚度为2～3mm的薄片，加黄芪重量10倍的水煎煮1.5小时，滤过，收集滤液备用，黄芪再加7倍重量的水煎煮1小时，滤过，收集滤液，与前面的滤液合并，静置，取上清液，浓缩至相对密度为1.23，即得黄芪浸膏。

枸杞子浸膏的制备：

取枸杞子，用清水快速洗净，加枸杞子重量12倍的水煎煮1.5小时，滤过，收集滤液备用，枸杞子再加7倍重量的水煎煮1小时，滤过，收集滤液，与前面的滤液合并，静置，取上清液，浓缩至相对密度为1.22，即得枸杞子浸膏。

取芍药花浸膏2份，银杏叶浸膏1份，黄芪浸膏1份，枸杞子浸膏1份，加蔗糖粉10份，制成颗粒，干燥，分装成10克/袋，避光密封保存即可。

实施例9：一种延缓衰老美白肌肤的组合物制成的片剂

采用实施例8所述的方法制备四种成分的浸膏，其中取芍药花浸膏2份，银杏叶浸膏1份，黄芪浸膏1份，枸杞子浸膏1份，加蔗糖粉10份，制成颗粒，干燥，分装成10克/袋，避光密封保存即可。

实施例10：实施例1中方法制得的芍药花中苯甲酸的含量测定： 

照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版附录 Ⅵ D ）测定。 

色谱条件与***适用性试验 　用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.02mol/L乙酸铵（5:95）为流动相；检测波长为230nm。理论板数按苯甲酸峰计算应不低于2000 。 

对照品溶液的制备　精密称取苯甲酸标准品20mg，置50ml量瓶中，加少量甲醇溶解并用水稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含苯甲酸0.4mg）。

供试品溶液的制备　　取芍药花粉碎，过３号筛，精密称取3g，置100ml容量瓶中，加入1.0mol/L的NaOH溶液1.0ml，加水20ml，于超声波清洗器中超声振荡10min后加水至刻度。

测定法 　分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 

试验用以上方法，分别对未处理的芍药花和用本发明的方法处理后的芍药花各4个样品，结果其苯甲酸的含量如下表1：

表1：苯甲酸检测结果

                                                           

由以上实验数据可以看出，经本发明的加工方法处理后，芍药花中的苯甲酸的含量大大降低，基本被完全除去，证明本发明是可行的。

 

实施例11：测定芍药花中的主要成份芍药苷、羟基芍药苷

照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版附录 Ⅵ D ）测定。

   色谱条件与***适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%磷酸溶液（14：86）为流动相；检测波长为230nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。

   对照品溶液的制备  精密称取芍药苷和羟基芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含芍药苷60μg和羟基芍药苷30μg的溶液，即得。

   供试品溶液的制备  取芍药花，粉碎成粗粉，取约0.1g，精密称定，置50ml量瓶中，加稀乙醇35ml，超声处理（功率240W，频率45kHz)30分钟，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

   测定法   分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

表2：芍药苷、羟基芍药苷检测结果

           

由以上实验数据可以看出，经本发明的加工方法处理后，芍药花中的主要有效成份芍药苷、羟基芍药苷没有受到影响，证明本发明的方法是可行的。

 

实施例12：银杏叶中银杏酸的代表成份银杏酸的含量测定

测定方法：照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版附录 Ⅵ D ）测定。  

色谱条件与***适用性试验　 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸（85:15:0.5）为流动相；检测波长为310nm。理论板数按银杏酸峰计算应不低于2000 。 

对照品溶液的制备　精密称取银杏酸对照品5mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含银杏酸酸8μg）。

供试品溶液的制备　　取银杏叶粉碎，过３号筛，精密称取0.5g，置索氏提取器中，以石油醚（30～60℃）20ml回流提取3h，挥干石油醚，残渣加甲醇适量使溶解，并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。

测定法 　分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 

用以上方法，分别测定了未处理的银杏叶和用本发明的方法处理后的银杏叶各３个样品，其银杏酸的含量结果如下表3：

表3：银杏酸检测结果

          

注：处理后的样品的银杏酸的含量很低，在与对照品相同的保留时间处仅有很小的峰，计算出的含量不足0.001％，所以用未检出表示。

由以上实验数据可以看出，经本发明的加工方法处理后，银杏叶中的银杏酸含量大大降低，基本完全除去，证明本发明是可行的。

实施例13：银杏叶中的黄酮类成份的含量测定

    照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版附录Ⅵ D)测定。

    色谱条件与***适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4％磷酸溶液(50:50)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。

    对照品溶液的制备  分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品，各加甲醇制成每 1ml分别含30μg、30μg、20μg的混合溶液，即得。

    供试品溶液的制备  取银杏叶，粉碎成中粉，称取约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取2小时，弃去溶剂，药渣挥干，加甲醇回流提取4小时，提取液蒸干，残渣加甲醇-25％盐酸溶液(4:1) 混合液25ml，加热回流30分钟，放冷，转移至50ml量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，即得。

    测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算槲皮素、山柰素和异鼠李素含量，按下式换算成总黄酮醇苷的含量。

   总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量＋山柰素含量＋异鼠李素含量)×2.51

用以上方法，分别测定了未处理的银杏叶和用本发明的方法处理后的银杏叶各３个样品，其总黄酮的含量结果如下表4：

表4：总黄酮的含量测定结果

         

由以上实验数据可以看出，经本发明的加工方法处理后，银杏叶中的总黄酮类成份的含量没有显著变化，证明本发明是可行的。

 

实施例14

本发明的组合物的抗氧化清除自由基活性实验：

一、抑制酪氨酸酶活性的实验

1、仪器与试剂 

UV762紫外可见分光光度计（上海分析仪器厂）

FA2004电子分析天平(上海良平仪器有限公司)

酪氨酸酶、Vc乙基醚、熊果苷为成都德莱生物科技有限公司提供。 

2、样品的制备

称取芍药花41g、银杏叶21g、黄芪24、枸杞子14g(芍药花和银杏叶均经过实施例1的方法处理)，加水1000ml，置烧瓶中加热，保持微沸1.5小时，滤过，收集滤液备用，再加水1000ml，保持微沸1小时，滤过，收集滤液，与前面的滤液合并，静置，取上清液，浓缩至200ml，即得。

  　 3、测试方法

   　取四只试管分别标上1#、2#、3#、4#；参照表2的试剂用量和浓度，在四只试管内分别加入各列所列的相应反应液，振摇混和均匀，于37??C预热10min，然后在各试管内分别加入酪氨酸酶溶液，于37??C准确反应5min，迅速转移至比色皿中，于475nm处测吸光度值（A）；

4、结果计算与统计

按下式计算对酪氨酸酶的抑制率：

    抑制率=[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100%

式中：A1、A2、A3、A4分别代表表5中1#、2#、3#、4#四个试管中反应后于475nm处所测得的吸光度值。

表5：待测液的组成（单位：ml）

  

以导致酪氨酸酶活力下降50%的抑制剂浓度（IC50）来表征抑制剂的功效。抑制酪氨酸酶活性检测结果见表6。

表6：各样品抑制酪氨酸活性检测结果

            

以上结果表明本发明的组合物提取液有较强的酪氨酸酶活性抑制能力，其活性亦与Vc乙基醚、熊果苷相当。

同时，进行了对比实验

本对比实验采用的实验样品如下：（比例均为质量比），采用的各样品的质量都一样

1#：芍药花；2#：银杏叶；3#：黄芪；4#：枸杞子；5#:芍药花+银杏叶（1:1）；6#:芍药花+黄芪（1:1）；7#:芍药花+枸杞子（1:1）；8#:银杏叶+枸杞子（1:1）；9#：银杏叶+黄芪（1:1）；10#：枸杞子+黄芪（1:1）； 11#：芍药花+银杏叶+黄芪（1:1:1）； 12#：芍药花+黄芪+枸杞子（1:1:1）；13#：芍药花+银杏叶+枸杞子（1:1:1）；14#：黄芪+银杏叶+枸杞子（1:1:1）；15#：实施例2的组合物；16#：实施例4的组合物；17#：实施例7的组合物；

采用上述方法进行实验，实验结果如表7：

表7：各样品抑制酪氨酸活性检测结果（单位：mg/ml）

二、对DPPH自由基的清除实验

1.     仪器与试剂 

FA2004电子分析天平(上海良平仪器有限公司)

UV762紫外可见分光光度计（上海分析仪器厂）

自由基(DPPH)、Vc乙基醚、熊果苷为成都德莱生物科技有限公司提供，乙醇为成都金山试剂有限公司提供。 

2.样品的制备

称取芍药花41g、银杏叶21g、黄芪24、枸杞子14g(芍药花和银杏叶均经过本发明的方法处理)，加水1000ml，置烧瓶中加热，保持微沸1.5小时，滤过，收集滤液备用，再加水1000ml，保持微沸1小时，滤过，收集滤液，与前面的滤液合并，静置，取上清液，浓缩至200ml，即得。

3.抗氧化性实验

3.1样品对DPPH自由基的清除实验

DPPH溶液的配制：

准确称取DPPH7.88mg，置于100ml容量瓶中，用无水乙醇溶解至刻度，即得浓度为2×10-4mo1/l的DPPH溶液，避光保存(0～4℃)。

供试液的制备：

取本发明的组合物的提取液20ml，置于100ml容量瓶中，用乙醇稀释至刻度。

测定方法：

分别取样品溶液5ml与2×10-4mo1/l DPPH溶液5ml均匀混合，在黑暗中放置30min，以甲醇为空白在525nm处测定其吸光度A，并以下式计算其清除率：

 清除率（%）=［1－（Ai－Aj）/Ac］×100% 

式中：Ac：5ml乙醇加5mlDPPH溶液的吸光度；

Ai：5ml待测液加5mlDPPH溶液的吸光度；

Aj：5ml待测液加5ml乙醇的吸光度。

按照上面公式计算清除率。

以清除DPPH自由基50%的活性物浓度（IC50）来表征自由基清除剂的功效。抗DPPH自由基活性检测结果见表8。

表8：各样品抗DPPH自由基活性检测结果

  

结果表明本发明的组合物提取液有较强的DPPH自由基清除能力，其活性与Vc乙基醚、熊果苷相当。

同时，进行了对比实验

本对比实验采用的实验样品如下：（比例均为质量比），采用的各样品的质量都一样，

1#：芍药花；2#：银杏叶；3#：黄芪；4#：枸杞子；5#:芍药花+银杏叶（1:1）；6#:芍药花+黄芪（1:1）；7#:芍药花+枸杞子（1:1）；8#:银杏叶+枸杞子（1:1）；9#：银杏叶+黄芪（1:1）；10#：枸杞子+黄芪（1:1）； 11#：芍药花+银杏叶+黄芪（1:1:1）； 12#：芍药花+黄芪+枸杞子（1:1:1）；13#：芍药花+银杏叶+枸杞子（1:1:1）；14#：黄芪+银杏叶+枸杞子（1:1:1）；15#：实施例2的组合物；16#：实施例4的组合物；17#：实施例7的组合物；

采用上述方法进行实验，实验结果如表9：

表9：各样品抑制酪氨酸活性检测结果（单位：μg/ml）

           

三、黑色素细胞测试

1、仪器与试剂 

DHP－9052恒温培养箱（上海精密仪表公司）

XSP－2C生物显微镜上海恒磁电子科技有限公司

SK2200H超声波清洗器 （上海科导超声仪器有限公司）

酶联免疫检测仪（上海精密仪表公司）

LD4－2A离心机（北京医用离心机厂）

FA2004电子分析天平(上海良平仪器有限公司)

UV762紫外可见分光光度计（上海分析仪器厂）

酪氨酸酶、Vc乙基醚、熊果苷为成都德莱生物科技有限公司提供。 

2、样品的制备

称取芍药花41g、银杏叶21g、黄芪24、枸杞子14g(芍药花和银杏叶均经过本发明的方法处理)，加水1000ml，置烧瓶中加热，保持微沸1.5小时，滤过，收集滤液备用，再加水1000ml，保持微沸1小时，滤过，收集滤液，与前面的滤液合并，静置，取上清液，浓缩至200ml，即得。

    3、小鼠B16黑色素细胞培养

    用含质量分数为10%小牛血清的1640培养液在37℃、5%CO2的条件下培养B16黑色素细胞，细胞接种量为3×106个/L，每3d传一次代。

    4、细胞增殖率的测定

    选择对数生长期的B16黑色素细胞，用0.25%胰酶消化，调整细胞浓度为2×104个/ml，接种于96孔培养板，每孔180uL，置于37℃、5%CO2的培养箱内培养24h。镜下观察生长状态良好，分别加入受试物20ul/孔，继续培养48h。于结束前4h加入MTT30uL/孔，4h后弃上清液，再加入DMSO150uL/孔，振荡10min左右，用酶联免疫检测仪测定475nm波长处的吸光度。

    测试结果为三种活性物对黑色素细胞的增殖几乎均无抑制作用，对细胞增殖的抑制率均低于10%，即三种活性物基本无细胞毒性。

    5、细胞内酪氨酸酶活力测定

取B16黑色素细胞接种于25㎝2的培养瓶，接种量为2×105个/瓶，培养48h后更换成加有受试物的培养基，继续培养48h，以不加活性物作为对照。0.25%胰酶消化后，用pH6.8的PBS（磷酸缓冲液）吹打成细胞悬液，低温离心后弃上清液，收获细胞团块。加入1mL0.5%的脱氧胆酸钠，冰浴15min，裂解细胞制备含酪氨酸酶提取液。取该提取液0.5ml，于37℃预温后加入0.3%多巴溶液0.5ml，37℃水浴反应5min，用紫外分光光度计在475nm处测定吸光度。

测试结果为本发明的组合物提取液对酪氨酸酶的抑制率与Vc乙基醚、熊果苷相当。

通过以上体外活性检测，发现：本发明的组合物提取液的美白、抗衰老活性，与Vc乙基醚、熊果苷相当。

 

本发明组合物的“双盲法”效果测试：

按照有关保健食品检验与评价的要求，我们进行了如下试验：

1、材料与方法

受试样品及使用方法：

受试者原生活、饮食不变，对照组服用安慰剂，试食组服用按照本发明实施例7所述的组合物制成的茶（每袋重10g），受试者每人每天随机服用3袋，每袋用150ml热水冲泡3次，共450ml水，饮水弃渣。试食周期为3个月。

检测仪器：

皮肤测试仪（香港众权有限公司）

皮肤弹性测试仪（上海建恒仪器有限公司）

皮肤显微镜（上海光学仪器厂）

皮肤检测分析***（广州溥天经贸有限公司）

2、受试对象与分组

受试对象：

受试者纳入标准：

选择年龄在28～58岁，身体健康状况良好，无明显脑、心、肝、肺、肾、血液疾病，无长期服药史，志愿受试保证配合的人群。受试人群排除如下对象：年龄在28岁以下或58岁以上、妊娠或哺乳期妇女、对保健食品过敏者；有心、肝、肾和造血***等严重疾病者；短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。试食前参加病例人数为86例，试食后有效病例人数为64例(其中对照组30例，试食32例)，失访病例人数为2例。

分组：

对受试对象随机分为试食组和对照组，两组在性别、年龄、生活饮食习惯上都具有均衡性。

 3、观察指标与分析

 对试食组和对照组的每个人每周用皮肤测试仪测定皮肤亮度变化、皮肤黑色素含量变化，用皮肤弹性测试仪测试皮肤弹性，用皮肤显微镜及皮肤检测分析***测试皮肤的皱纹的深浅。

结果，从受试对象服用第二周开始，试食组的皮肤即能检测出亮度增加、黑色素下降，从第三周开始，试食组的皮肤即能检测出弹性增强，皱纹变浅，而对照组没有变化。以后每周检测，试食组的皮肤的以上各项指标都有有益的好转，而对照组没有变化。从第9周开始，试食组的皮肤的以上各项指标的变化开始逐渐减小直至不能测出。试验证明本发明的组合物有美白皮肤，延缓衰老的效果。

本发明的有益效果是通过对自由基清除作用、酪氨酸酶抑制作用、黑色素细胞黑色素产生的抑制作用达成的，测试数据以及人体实验验证结果表明，本发明的组合物具有皮肤美白抗衰老功效。 

Claims (10)

1.一种延缓衰老美白肌肤的组合物，其组分以重量计为：芍药花36～46份，银杏叶16～26份，黄芪19～29份，枸杞子9～19份。

2.根据权利要求1所述的延缓衰老美白肌肤的组合物，其特征在于：其组分以重量计为：芍药花41份，银杏叶21份，黄芪24份，枸杞子14份。

3.根据权利要求1所述的延缓衰老美白肌肤的组合物，其特征在于：所述芍药花为经过脱除其中所含苯甲酸处理的芍药花。

4.根据权利要求3所述的延缓衰老美白肌肤的组合物，其特征在于所述芍药花中苯甲酸含量控制在质量百分比为0.075%以下。

5.根据权利要求1所述的延缓衰老美白肌肤的组合物，其特征在于：所述银杏叶为经过脱除其中所含银杏酸处理的银杏叶。

6.根据权利要求5所述的延缓衰老美白肌肤的组合物，其特征在于所述银杏叶中银杏酸含量控制在质量百分比为0.001％以下。

7.权利要求1至6任意一项所述的延缓衰老美白肌肤的组合物所制成的茶。

8.权利要求1至6任意一项所述的延缓衰老美白肌肤的组合物与药学上可接受的赋形剂制成的剂型。

9.权利要求1至6任意一项所述的延缓衰老美白肌肤的组合物的应用，其特征在于，用所述的延缓衰老美白肌肤的组合物制成茶，或用所述的延缓衰老美白肌肤的组合物与药学上可接受的赋形剂制成相应的剂型。

10.权利要求1至6任意一项所述的延缓衰老美白肌肤的组合物的制备方法，其特征在于：分别制备芍药花、银杏叶、黄芪和枸杞子，然后按照所述的重量比例进行混合即可，其中，

芍药花的制备：

选择初开或者盛开的芍药花，用清水洗净，摊放均匀，阴干到花瓣自然脱落或者一触动即脱落，除去花盘、花蕊、萼片等杂质，将花瓣置杀青机中，保持杀青机上部气流畅通，在300℃的温度下持续60秒瞬间杀青和脱除苯甲酸，将杀青后的花瓣自然放置回软到花瓣揉而不碎的程度，将回软的花瓣用揉捻机揉捻到自然紧凑的卷曲为止，将揉捻后的花瓣置烘箱中，保持烘箱上部气流畅通，于220℃的温度下烘烤2分钟，以使花瓣成型和进一步除去苯甲酸，取出，放冷，置烘箱中于105℃的温度烘烤至水份为8％～12％时即可；

银杏叶的制备：

选择秋天成熟自然脱落的银杏叶，用清水洗净，摊放均匀，晾干表面粘附的水份，然后将银杏叶置杀青机中，在360℃的温度下持续60秒瞬间杀青，取出，放冷，于220℃的温度下烘烤4分钟，使银杏叶初步干燥，取出，放冷，置烘箱中于104℃的温度烘烤至水份为9％～14％时即可，

然后将上述烘干的银杏叶进行脱除银杏酸处理：采用的试剂为3％～5％的氢氧化钠溶液或者4.5％～6.5％的氢氧化钾溶液或者其它适宜的无机碱性溶液，脱除银杏酸的方法为：将以上烘干的银杏叶用3％～5％的氢氧化钠溶液或者4.5％～6.5％的氢氧化钾溶液或者其它适宜的无机碱性溶液浸泡30～50分钟，取出，晾干表面粘附的脱酸溶液，置烘箱中于103℃～105℃的温度烘烤至水份为9％～14％，然后再次用3％～5％的氢氧化钠溶液或者4.5％～6.5％的氢氧化钾溶液或者其它适宜的无机碱性溶液浸泡20～40分钟，取出，用清水浸泡8～10分钟，取出；

然后进行成型处理：晾干表面粘附的脱酸溶液，然后置杀青机中，在300℃～320℃的温度下持续50～70秒瞬间干燥，然后倒出，自然放置回软到叶片揉而不碎的程度，将回软的银杏叶用揉捻机揉捻到自然紧凑的卷曲为止，将揉捻后的银杏叶置烘箱中，于180℃～220℃的温度下烘烤2～3分钟，取出，放冷，置烘箱中于104℃～106℃的温度烘烤至水份为8％～12％时即可；

黄芪薄片的制备：

    取黄芪，用清水快速洗净，放置，让水份浸入黄芪内部以使黄芪湿润，切成厚度为2～3mm的薄片，置烘箱中于102℃～105℃的温度烘烤至含水量为8％～12％，密封保存；

枸杞子的制备：

取枸杞子，用清水快速洗净，放置，晾干表面粘附的水份，置烘箱中于102℃～105℃的温度烘烤至含水量为10％～14％，密封保存。