CN102353783B - 一种检测猪伪狂犬病毒抗体的试剂盒及阻断elisa检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测猪伪狂犬病毒抗体的试剂盒及阻断ELISA检测方法，包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒单克隆抗体、猪伪狂犬病毒单克隆抗体是以猪伪狂犬病毒为免疫原得到的单克隆抗体、猪伪狂犬病毒为伪狂犬病毒鄂A株；试剂盒还包括酶标板、样品稀释液、阴（阳）性对照、显色液、洗涤液、终止液；其步骤：a、从试剂盒中取出预包被有病毒抗原的检测板，将稀释好的待检血清加入抗原包被板中，同时设阴、阳性对照孔；b、振匀孔中样品，甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗；c、每孔加酶标单抗，洗涤，加显色液，室温避光显色，加终止液，用酶标仪测定每孔OD_630nm读值。该方法特异性好，灵敏度高。检测时间短；结果判定采用S/N比值法，准确性高。

Description

一种检测猪伪狂犬病毒抗体的试剂盒及阻断ELISA检测方法

技术领域

本发明涉及动物疫病检测，具体涉及一种检测猪伪狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，同时还涉及一种猪伪狂犬病毒抗体的阻断ELISA检测方法。适用于检测猪血清中的伪狂犬病毒抗体水平。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV)引起的包括家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒及脑脊髓炎为症状的重要传染病。该病给养猪业造成了巨大的经济损失，猪是本病的天然宿主和储存者。预防、控制和最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。在伪狂犬病的防制工作中，监测和检测猪血清中伪狂犬病病毒抗体的水平是非常重要的一个环节。对于尚未接种的猪只，血清中的猪伪狂犬病病毒抗体既可能反映了母源抗体的影响，也可能反映了隐性感染的迹象。这两种情况都会影响到减毒活疫苗的接种效果，甚至可能使疫苗无效，无法产生对病毒的免疫保护，导致免疫失败。对于已经接种的猪只，血清中的猪伪狂犬病病毒抗体水平则反映了免疫的效果。

目前国内检测猪伪狂犬病毒抗体一般采用乳胶凝集、间接ELISA方法等，这些方法敏感性不高，对抗原纯度要求却比较高，而真正意义上的纯抗原很难获得。因此不可避免会产生非特异性反应，对结果造成误判。

本发明应用针对伪狂犬病毒的单克隆抗体及阻断ELISA检测技术，使试剂盒具有很好的敏感性和特异性。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种检测猪伪狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，该试剂盒的优点是使用了辣根过氧化物酶(HRP)标记的的单克隆抗体，提高了检测的灵敏性和特异性。

本发明的另一个目的是在于提供了一种猪伪狂犬病毒抗体的检测方法。该方法将猪伪狂犬病毒作为抗原包被于ELISA板上，然后加待检血清孵育，再加入酶标记的猪伪狂犬病毒单抗，显色时应出现两种情况，如果待检血清是阳性，那么此时加入的酶标单抗就会被阳性血清中的抗体阻断，酶标仪检测数值就会越低。如果是待检血清阴性，那么酶标单抗就会继续与ELISA板上猪伪狂犬病毒抗原反应，得到的数值就会越高。其检测方法特异性好、敏感性高。与美国IDEXX公司猪伪狂犬抗体ELISA试剂盒的检测符合率为97％。有着良好的应用前景。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种检测猪伪狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒的单克隆抗体，所述的猪伪狂犬病毒单克隆抗体是以猪伪狂犬病毒为免疫原得到的单克隆抗体，所述的猪伪狂犬病毒为伪狂犬病毒鄂A株(该伪狂犬病毒鄂A株来源见参考文献：陈焕春等，猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定，畜牧兽医学报，1998年02期)。

所述的试剂盒还包括酶标板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、洗涤液、终止液。

所述的酶标板是以猪伪狂犬病毒在包被酶标板时用0.1mol/L，pH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液。所述的阳性对照为猪伪狂犬疫苗免疫的猪阳性对照血清，所述的阴性对照为未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪阴性血清。

所述的洗涤液为含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液；所述终止液为含0.25％体积比氢氟酸溶液。

所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有0.2mg/mL TMB pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。

所述的样品稀释液液为含2.5mg/mL的明胶的DMEM培养基。

所述的单克隆抗体，其制备过程是采用杂交瘤细胞技术，用纯化的猪伪狂犬病毒(鄂A株)免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，再用纯化的猪伪狂犬病毒包被板进行间接ELISA筛选，筛选的阳性细胞株经有限稀释法克隆，再用猪伪狂犬疫苗免疫的猪阳性对照血清和未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪阴性血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选到一株具有阻断效果的单克隆抗体，分泌此抗体的细胞株命名为PRV-GB。

一种猪伪狂犬病毒抗体的阻断ELISA检测方法，其步骤是：

1)从试剂盒中取出预包被有病毒抗原的检测板(根据样品多少，可拆开分次使用)，将稀释好的待检血清(1∶1稀释)100μL加入抗原包被板中，同时设阴、阳性对照孔，各设2孔，每孔100μL。

2)轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37℃温育30分钟。甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板5次，200μL/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次在吸水纸上拍干。

3)每孔加酶标单抗100μL，置37℃温育30分钟。洗涤5次，方法同步骤2。每孔加显色液A、显色液B各一滴(50μL)，混匀，室温(18～25℃，以下相同)避光显色10分钟。每孔加终止液一滴(50μL)，15分钟内用酶标仪测定每孔OD_630nm读值。

本发明试剂盒判定标准为：试验成立条件是阴性对照孔平均OD_630nm值与阳性对照孔平均OD_630nm值之差大于或等于0.4。S＝样品孔OD_630nm值，N＝阴性对照孔平均OD_630nm值。若S/N比值小于或等于0.6，样品判为PRV抗体阳性。若S/N比值小于或等于0.7但大于0.6，该样品必须重测，如果结果相同，则过一段时间后重新从动物取样进行检测。若S/N比值大于0.7，样品判为PRV抗体阴性。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.由于酶标单克隆抗体的使用，特异性好，灵敏度高。

2.检测时间短，一般1.5个小时内即可出结果；

3.结果判定采用S/N比值法，科学合理，准确性高。

具体实施方式

实施例1：抗原包被板的制备：

病毒培养及纯化：BHK细胞用含10％小牛血清的DMEM于37℃培养，细胞长成单层后，倒掉上清，接种50分之1原体积的病毒，加维持液(含3％体积比小牛血清的DMEM)，液体刚盖住细胞层即可，37℃吸附1小时后，添加维持液至原来培养细胞时的体积，37℃温箱继续培养，待80％以上细胞出现病变时，将细胞瓶置-20℃冰箱中，反复冻融3次，收集病毒液。收集的病毒液5000r/min 4℃离心30min去沉淀。上清用27000r/min 4℃离心1小时，沉淀用2ml pH7.2 0.01mol/L PBS重悬。以PBS制备20％(W/V，以下同)、35％、45％和60％的不连续梯度蔗糖，加样品至梯度界面上，4℃27000r/min离心90min。收集45％浓度处的蛋白带至离心管中，用30ml PBS稀释重悬，27000r/min离心2小时脱糖。最后用2ml PBS悬浮沉淀。-20℃保存备用。

将病毒抗原用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为500ng/mL，按100μL/孔加于聚苯乙烯微孔板中，4℃放置过夜.甩干；按150μL/孔用含5mg/mL BSA pH7.4的磷酸盐缓冲液4℃封闭1小时、甩干；按100μL/孔用含20％蔗糖pH7.4的磷酸盐缓冲液室温保护3小时；置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装中密封保存。

实施例2：抗伪狂犬病毒单克隆抗体的制备及标记：

抗伪狂犬病毒单克隆抗体的制备步骤：

1)饲养细胞的制备：在融合前一天，取一只7周龄雌性BALB/c鼠，颈椎脱臼处死，75％体积比酒精消毒5min，甩干后移入超净工作台内，固定于经紫外消毒的泡沫板上，用灭菌眼科剪、弯头镊子剪开皮肤(不可损伤腹膜)，经钝性剥离使腹膜充分暴露。用10mL一次性注射器吸满含HAT选择性培养基注入小鼠腹腔，右手固定注射器不动，左手用镊子夹取酒精棉轻揉小鼠腹部，再用注射器抽出腹腔内的培养基，注入灭菌平皿中，加上述培养基调整细胞密度至10⁶个/mL，用多道移液器分种至4块96孔细胞培养板，每孔100uL，置37℃，二氧化碳培养箱中培养待第4步骤使用。

2)制备免疫脾细胞：

取浓度为1mg/mL的PRV病毒抗原150μL与等体积佐剂充分混匀，免疫5周龄的BALB/c小鼠，每间隔两周皮下免疫一次、连续免疫三次后，融合前3天腹腔加强免疫。第一次免疫时使用弗式完全佐剂，第二、三次使用弗式不完全佐剂，加强免疫时不使用佐剂。取经最后加强免疫的BALB/c鼠。将小鼠按上述方法进行消毒和剥离皮肤，无菌取出脾脏，放入已盛有基础培养液的平皿中清洗，剥离***。将脾脏移入另一盛有10mL基础培养液的平皿中，用针头在顶端穿孔，用一次性无菌注射器吸取5mL基础培养液，从脾脏一端缓慢注入，使液体从脾脏另一端针孔流出，重复3次。将脾细胞悬液转至10mL无菌离心管中，1000rpm离心10min，细胞沉淀用基础培养基离心洗涤一次，然后将细胞重悬，计数后待第4步骤使用。

3)制备骨髓瘤细胞：

在融合前两周将在液氮中冻存的SP2/0骨髓瘤细胞取出复苏，用加有8-氮鸟嘌呤的1640完全培养基选择培养三代，以保持HGPRT缺陷型。选择生长旺盛，形态良好的细胞作种子细胞用1640完全培养基进行扩大培养。融合当天，取刚好处于对数生长期，形态良好的细胞(细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐，呈半致密分布)，1000rpm离心10min，弃去培养液，用1640培养基洗2次后将细胞重悬，记数后待第4步骤使用。

4)细胞融合：

将上述制备的免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按10∶1比例混匀于50mL离心管中，1000r/min离心5min去掉上清。用灭菌的滤纸吸干管壁，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的PEG0.8mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌，加完继续搅拌1min。然后慢慢加入37℃预温的1640培养基40mL。具体方法为第一分钟逐滴滴入1mL。第二分钟加1mL，第3-4分钟加3mL，第5分钟加5mL，最后加入30mL 1640培养基，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。然后800r/min离心5min，去上清。用40mLHAT培养基悬浮沉淀细胞，分种于上述第一步的含饲养细胞的96孔培养板中。于37℃二氧化碳培养箱中培养。融合后第二天开始观察，有无污染，于第5天补加1滴HAT培养基，第8天吸去100μL培养基换HT培养基100μL。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，此时细胞分泌较多抗体，可以进行阳性细胞的筛选和克隆。

5)阳性细胞的筛选和克隆：

在包被有猪伪狂犬病毒抗原的酶标板上加入96孔细胞培养板上的细胞上清，于37℃温育1小时，洗涤液洗三次后，加入1∶5000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30min，洗涤三次后，加入显色液显色，终止反应之后，用酶标仪测每孔OD630nm读值。同时设SP2/0细胞的培养上清作为阴性对照，OD630值2.1倍于阴性对照，判为阳性。选取生长旺盛，形态良好的阳性细胞孔用有限稀释法进行克隆。

6)阻断作用单抗的筛选鉴定：

将初步筛选的阳性细胞孔的上清收集起来，在包被好抗原的酶标板上加100μL稀释好的阴、阳性猪血清，于37℃温育30min，洗涤三次后，再加上述阳性细胞孔的上清100μL，37℃反应30min，洗涤三次，加稀释好的羊抗鼠IgG-HRP，再洗板三次，加入显色液，10分钟后用酶标仪测每孔OD630nm读值。当加入阳性血清孔的OD值低于加入阴性血清孔OD值一半左右时，此单抗既为具有阻断作用的单抗。分泌此抗体的细胞命名为PRV-GB。

7)单克隆抗体生产：

大量生产单克隆抗体，可采用小鼠体内诱生法：首先用1640培养基大量培养上述杂交瘤细胞PRV-GB。按每只小鼠腹腔注入10⁶个细胞量。(小鼠注入细胞前5天需经不完全弗式佐剂处理)，10天后收集腹水，离心除去固体成分，其上清液即含有抗PRV病毒单克隆抗体。

抗伪狂犬病毒单克隆抗体的标记步骤：

1)抗体的纯化：向一份腹水中加入两份0.06mol/L(pH＝5.0)的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的盐酸调pH值至4.7。室温搅拌下在30min内逐渐滴加入辛酸(每毫升稀释前的腹水加33μL)，4℃静置2小时，12000rpm离心30min，弃沉淀。上清经滤纸过滤后调pH至7.4。在4℃冰浴下缓慢加入pH为7.4的饱和硫酸铵，使硫酸铵最终饱和度不超过45％，搅拌30min，静置2～4小时或4℃过夜。4℃下12000r/min离心20min弃去上清。沉淀用0.01mol/L的PBS(pH＝7.4)重悬，用pH为8.0的10mmol/L Tris-Hcl透析过夜。收集抗体后用分光光度计检测其浓度。

2)伪狂犬病毒单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：

称取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于1mL双蒸水中，加500μL新配制的0.06mol/L的NaIO4，4℃放置30min，勿超过此时间，此时溶液呈草绿色，加入0.5mL乙二醇(0.16mol/L)室温避光反应30min。再加入5mg/mL的纯化单可隆抗体1mL，在0.05mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜。吸出后加5mg/mL新配的NaBH40.2mL，4℃放置2小时，再加等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃放置30min，7000r/min离心10min，弃上清，用生理盐水重悬，再在0.15mol/L pH7.4的PBS中透析过夜。收集透析袋中标记的抗体进行工作浓度标定，然后分装于20mL瓶中，4℃保存备用。(每个批次的酶标抗体都要进行工作浓度标定)。

实施例3：试剂盒组装：

试剂盒含96孔ELISA检测板2块，酶标抗伪狂犬病毒单克隆抗体1瓶(20mL/瓶)，阴、阳性对照各2管(1.5mL/管)，样品稀释液1瓶(50mL/瓶)，20倍浓缩洗涤液1瓶(30mL/瓶)，显色液A、显色液B、终止液各1瓶(10mL/瓶)，附说明书1份。

20倍浓缩洗涤液：160克氯化钠、10ml Tween-20溶入1000ml蒸馏水中。

封闭液：含5mg/mL BSA的磷酸盐缓冲液。

样品稀释液：含25mg/mL的明胶的DMEM培养基。

终止液：0.25％体积比氢氟酸。

阳性、阴性对照的制备：

将筛选获得的猪伪狂犬病毒标准阳性血清按1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌过滤，作为阳性对照；将筛选获得的猪标准阴性血清，按1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌过滤，作为阴性对照。

所述的10％牛血清的DMEM以及75％酒精等，由于都是液体，％表示体积比。

实施例4：检测效果实验

一种猪伪狂犬病毒抗体的检测方法，其步骤是：

1)从试剂盒中取出预包被有病毒抗原的检测板(根据样品多少，可拆开分次使用)，将稀释好的待检血清(1∶1稀释)100μL加入抗原包被板中，同时设阴、阳性对照孔，各设2孔，每孔100μL。

2)轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37℃温育30分钟。甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板5次，200μL/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次在吸水纸上拍干。

3)每孔加酶标单抗100μL，置37℃温育30分钟。洗涤5次，方法同步骤2。每孔加显色液A、显色液B各一滴(50μL)，混匀，室温(18～25℃)避光显色10分钟。每孔加终止液一滴(50μL)，15分钟内用酶标仪测定每孔OD_630nm读值。

本发明试剂盒判定标准为：试验成立条件是阴性对照孔平均OD_630nm值与阳性对照孔平均OD_630nm值之差大于或等于0.4。S＝样品孔OD_630nm值，N＝阴性对照孔平均OD_630nm值。若S/N比值小于或等于0.6，样品判为PRV抗体阳性。若S/N比值小于或等于0.7但大于0.6，该样品必须重测，如果结果相同，则过一段时间后重新从动物取样进行检测。若S/N比值大于0.7，样品判为PRV抗体阴性。

1、特异性试验用猪伪狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒检测猪伪狂犬病、猪瘟、猪***(O型)、猪细小病毒、猪流感和猪繁殖与呼吸综合征等标准阳性血清和猪伪狂犬病阴性血清，除PRV标准阳性血清的的S/N值显著小于0.4外，其余血清S/N值在0.84～1.08之间，符合阴性血清的判定标准，表明这种方法的特异性良好。

表1  特异性血清的比较

2、符合率试验用两种检测试剂盒平行检测来自不同猪场的800份血清，结果见表2。从表中可以看出，两种试剂盒检测样品的阳性符合率为96％，阴性样品的符合率为99％，总符合率为97％。

表2  猪伪狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒与

IDEXX公司PRV-gB ELISA试剂盒检测结果

3、敏感性的检测  用试剂盒检测不同时期的人工免疫猪伪狂犬疫苗血清，从表3中可以看出当免疫14天后，抗体大部分检测为阳性，21天后全部为阳性，说明试剂盒的灵敏度很高。

表3  不同时期人工免疫血清抗体的检测

注：当OD值大于0.902时S/N比值大于0.7判为阴性，当OD值小于0.773时S/N比值小于0.6判为阳性。

Claims (2)

1.一种检测猪伪狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒的单克隆抗体、猪伪狂犬病毒单克隆抗体是以猪伪狂犬病毒为免疫原得到的单克隆抗体、猪伪狂犬病毒为伪狂犬病毒鄂A株；

所述的试剂盒还包括酶标板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、洗涤液、终止液；

所述的酶标板是以猪伪狂犬病毒在包被酶标板时用0.1mol/L，pH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液；

所述的阳性对照为猪伪狂犬病毒免疫的高免血清；

所述的阴性对照血清为未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪血清；

所述的洗涤液为含有0.05%Tween-20的PBS缓冲液；

所述终止液为含0.25%体积比氢氟酸溶液；

所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有0.2mg/mL TMB pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液；

所述的样品稀释液液为含2.5mg/mL的明胶的DMEM培养基；

所述的酶标板中包被抗原的制备方法为：

病毒培养及纯化:BHK细胞用含10%小牛血清的DMEM于37℃培养，细胞长成单层后，倒掉上清，接种50分之1原体积的病毒，加含3%体积比小牛血清的DMEM维持液，液体刚盖住细胞层即可，37℃吸附1小时后，添加维持液至原来培养细胞时的体积，37℃温箱继续培养，待80%以上细胞出现病变时，将细胞瓶置-20℃冰箱中，反复冻融3次，收集病毒液，收集的病毒液5000r/min4℃离心30min去沉淀，上清用27000r/min4℃离心1小时，沉淀用2ml pH7.20.01mol/L PBS重悬，以PBS制备20%、35%、45%和60%的不连续梯度蔗糖，加样品至梯度界面上，4℃27000r/min离心90min，收集45%浓度处的蛋白带至离心管中，用30ml PBS稀释重悬，27000r/min离心2小时脱糖，最后用2ml PBS悬浮沉淀，-20℃保存备用。

2.权利要求1所述的一种检测猪伪狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒非诊断性检测方法，其步骤是：

1）从试剂盒中取出预包被有病毒抗原的检测板，将稀释好的待检血清1：1稀释100μL加入抗原包被板中，同时设阴、阳性对照孔，各设2孔，每孔100μL；

2）轻轻振匀孔中样品，置37℃温育30分钟，甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板5次，200μL/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次在吸水纸上拍干；

3）每孔加酶标单抗100μL，置37℃温育30分钟，洗涤5次,方法同步骤2），每孔加显色液A、显色液B各一滴50μL，混匀，室温避光显色10分钟，每孔加终止液一滴50μL，15分钟内用酶标仪测定每孔OD_630nm读值。